KR102011366B1 - 암 전이 억제제의 스크리닝 방법 - Google Patents

암 전이 억제제의 스크리닝 방법

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KR102011366B1
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연세대학교 산학협력단
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Abstract

본 발명은 암 환자로부터 분리된 암-간엽 줄기 유사 세포에 있어서 히알루론산 합성 효소 2의 발현 수준을 측정함으로써 암 전이 억제제를 높은 정확도로 스크리닝할 수 있다. 또한, 본 발명은 암 환자로부터 분리된 암-간엽 줄기 유사 세포에서 히알루론산 합성 효소 2와, 히알루론산 합성 효소 1 또는 3의 발현 수준을 비교함으로써 암의 전이 가능성을 높은 정확도로 예측할 수 있다.

Description

암 전이 억제제의 스크리닝 방법{Method for screening metastasis inhibitor for cancer}
본 발명은 암 전이 억제제의 스크리닝 방법과 암의 전이 가능성의 예측에 대한 정보를 제공하는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 뇌암 전이 억제제의 스크리닝 방법과 뇌암의 전이 가능성의 예측에 대한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.
교모세포종(glioblastoma, GBM)은 성인 뇌암 중에서 가장 흔하지만 치명적인 뇌암에 속한다. 최근의 외래적 또는 의료적 치료에도 불구하고, 교모세포종은 여전히 치료율이 매우 낮다. 그 원인으로는 뇌 실질(parenchyma)로 교모세포종 세포의 침윤성에 해당하며, 상기한 침윤 과정에서 교모세포종은 다양한 세포외 기질(extracellular matrix, ECM) 분자와 상호작용을 수행한다.
간엽 줄기 유사세포(Mesenchymal stem like cells)는 다능성(multipotent) 미분화 세포로서 다양한 형태의 세포로 분화할 수 있다. 이러한 특징으로 세포 치료제로서의 가능성을 갖고 많은 연구가 진행되고 있는 실정이다. 하지만 암과의 상호작용을 통한 그 역할은 밝혀지지 않은 상태이다.
신체는 방어체계를 제어하고 자극하는 신호물질(분비인자)을 통하여 선천성 면역반응 및 적응 면역반응을 일으킨다. 이러한 분비인자들은 당단백질이며, 펩타이드 중 하나이다. 분비인자는 많은 종류의 세포에서 방출되며 신경전달물질 및 호르몬과 유사한 화학적 신호를 보내기도 한다. 각 분비인자들은 세포 표면의 특이적 수용기에 결합할 수 있으며, 세포 내의 신호를 전달함으로써 세포 기능을 바꾸는 역할을 한다. 보통 분비 인자는 면역반응에 관여를 한다고 알려져 있지만, 실질적으로 암 세포에 영향을 줄 수 있다는 보고가 최근 급격히 밝혀지고 있는 추세이다.
최근 Friedl P et al., Cancer invasion and the microenvironment: plasticity and reciprocity. Cell. 147(5):992-1009(2011)에 세포 외 기질 및 종양 조직에 혼재된 스트로마 세포, 마이엘로이드 세포 및 혈관 형성 세포 등의 다양한 세포 유형들은 종양 증식, 침윤, 이동 및 전이 등의 각 단계에 특이적인 종양 미세 환경 형성을 위하여 서로 다르게 다양한 영향을 미칠 것으로 예측되어 사이토카인을 위주로 하는 몇몇 분비인자들의 역할이 밝혀졌지만, 이들 세포 유형 각각의 악성화 단계 특이적인 미세 환경 형성 조절 기전 및 악성화 단계 특이적인 미세 환경 형성을 위한 암 줄기세포 또는 암 세포와 미세 환경 형성 세포간의 상호작용 기전은 구체적으로 규명되지 않고 있다. 또한, Mesenchymal stem cells in health and disease. NatRevImmunol. 8(9):726-36, Inflammation joins the "niche". CancerCell. 14(5):347-9 및 Deadly teamwork: neural cancer stem cells and the tumor microenvironment. CellStemCell. 8(5):482-5 등의 논문을 통하여 면역 염증세포, 스트로마 세포, 혈관 형성 세포, 간엽 세포(mesenchymal cells) 및 암 줄기세포로부터 분화된 다양한 종류의 암세포 등과의 상호작용으로 암 줄기세포 특이적인 미세 환경 (Niche)을 유지하는데, 이들 미세 환경 형성 세포들은 성장인자(growth factors)나 사이토카인(cytokine)을 포함하는 다양한 인자들을 분비하거나 혈관 신생을 유도하기도 하여 암 줄기세포가 생존하고 증식하기 적합한 환경을 제공한다고 알려져 있다.
종래의 암 치료방법은 암 세포 자체의 신호 기작과 분비 물질에 대하여 초점이 맞추어져 실험이 진행되고 있었다. 또한, 그러한 결과들로 현재 사용되고 있는 항암제의 대부분은 암 세포의 신호 또는 암 세포의 특성을 표적으로 하는 경우가 많다. 하지만 이러한 치료 방법에도 불구하고, 암은 쉽게 치료되지 못하고 재발이 일어나고 있으며 다른 부위로의 전이가 일어나고 있어 보다 본질적인 치료방법이 요구됨에 따라 암의 악성화, 전이 및 재발의 원인으로 판단되는 암 세포의 주변 환경을 타겟으로 암을 치료하고자 하는 치료 프로토콜 개발에 관심이 높아지고 있다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명의 일 목적은 암-간엽 줄기 유사 세포(tumor mesenchymal stem-like cell, tMSLC)에 있어서 히알루론산 합성 효소 2(Hyaluronic acid synthase 2, HAS 2)의 발현 수준을 측정하여 뇌암 전이 억제제를 스크리닝 하는 방법을 제공하고자 한다.
본 발명의 다른 목적은 암-간엽 줄기 유사 세포에서 히알루론산 합성 효소 1(Hyaluronic acid synthase 1, HAS 1), 히알루론산 합성 효소 2 및 히알루론산 합성 효소 3(Hyaluronic acid synthase 3, HAS 3)의 발현 수준을 측정하여 뇌암의 전이 가능성을 예측할 수 있는 정보를 제공하는 방법을 제공하고자 한다.
최근에 상기 암 진행 과정과 관련하여 상기 세포 외 기질에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 세포 외 기질의 성분에 있어서, 다른 조직에 비하여 특히 뇌에는 히알루론산(hyaluronic acid, HA)이 풍부하게 분포하며, 교모세포종 세포의 침윤에 미세 환경을 제공하는 것으로 알려져 있다. 게다가, 상기 히알루론산은 주변의 정상적인 뇌 실질보다 뇌 종양에서 특히 많이 분포하고, 그 히알루론산이 많이 분포하는 교모세포종 환자의 경우 예후가 나쁠 것으로 예측하고 있다.
한편, 히알루론산은 음전하를 띠며, 글루쿠론산과 N-아세틸글루코사민으로 이루어지는 이당류가 반복되어 이루어지는 비분지 중합체에 해당한다. 정상적인 뇌조직에서, 상기 히알루론산은 1차 세포 외 기질의 구성 성분으로, 점성과 수분을 보유하는 성질로 인하여 조직 항상성이나 구조 등에 있어서 중요한 역할을 한다.
종양을 포함하는 병리적 조건에 있어서, 히알루론산은 정상적인 조직에 비하여 손상 조직에서 풍부하게 분포하고, 뇌암에서 상기 히알루론산이 풍부하게 존재함으로써, CD44(cluster determinant 44), RHAMM(receptor for hyalunonate-mediated motility), 및 ICAM-1(intercellular adhesion molecule-1) 등과 같은 인지체 수용체(cognate receptors)를 통하여 세포간 신호 전달에서 리간드로 작용하거나, 기계적 보강(stiffening)을 제공하여 교모세포종 세포의 이동성을 증진시킨다. 이에 따라, 히알루론산의 함량은 종양 세포의 침윤성에 비례 관계에 있다.
하지만, 아직까지는 교모세포종의 침윤성과 관련된 기계적 및 세포 신호적 기능에 있어서 연구가 미흡한 편이며, 뇌암에서 히알루론산이 많이 분포하는 것과 관련하여 다양한 세포의 메커니즘에 대하여 아직 알려진 바 없다.
최근에 암-간엽 줄기 유사 세포(tumor-associated mesenchymal stem-like cells, tMSLCs)는 교모세포종 세포와 상호작용을 할 수 있는 기질 세포로, 암 진행에 있어서 잠재적인 역할에 대한 연구가 진행되고 있다. 하지만, 그 역할에 대하여 아직 충분히 알려지지 않았다.
본 발명의 발명자들은 침윤성 및 전이성이 높은 교모세포종의 경우, 상기 교모세포종에서 분리한 암-간엽 줄기 유사 세포(tumor mesenchymal stem-like cell, tMSLC)에서 히알루론산 합성 효소 2(Hyaluronic acid synthase 2, HAS 2)의 발현량이 교모세포종 세포에 비하여 두드러지게 높은 것을 발견하여 본 발명에 이르게 되었다.
본 발명의 일 구현 예에 따르면, (a) 암 환자로부터 암-간엽 줄기 유사 세포를 분리하는 단계; (b) 분리된 암-간엽 줄기 유사 세포에 약물을 처리하는 단계; (c) 상기 약물이 처리된 암-간엽 줄기 유사 세포의 히알루론산 합성 효소(Hyaluronic acid synthase, HAS) 또는 이를 코딩하는 mRNA의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (d) 상기 암-간엽 줄기 유사 세포의 히알루론산 합성 효소 또는 이를 코딩하는 mRNA의 발현 수준이 약물 처리 전에 비하여 감소된 경우, 상기 약물을 암 전이 억제제 후보물질로 판단하는 단계를 포함하는 암 전이 억제제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
본 발명의 방법을 각각의 단계 별로 상세하게 설명하면 다음과 같다:
단계 (a): 암 환자로부터 암-간엽 줄기 유사 세포를 분리하는 단계에 해당한다.
본 발명에서 상기 암 환자는, 신체 조직의 자율적인 과잉 성장에 의해 비정상적으로 자라난 덩어리인 암(cancer) 혹은 종양(tumor)의 질환이 있는 환자로서, 예를 들면, 뇌암, 폐암, 비소세포성폐암, 결장암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부 암, 피부 또는 안구내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 위암, 항문부근암, 결장암, 유방암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병(Hodgkin's disease), 식도암, 소장암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장 또는 수뇨관 암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계(CNS; central nervous system) 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 및 뇌하수체 선종으로 이루어진 군에서 선택되는 암 질환이 있는 환자일 수 있으나, 바람직하게는 뇌암 환자일 수 있고, 보다 바람직하게는 교모세포종(glioblastoma) 환자일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 침윤성 및 전이성이 높은 교모세포종 환자일 수 있다.
단, 본 발명에서 상기 환자는 포유류에 해당하는 동물을 모두 포함할 수 있으나, 바람직하게는 인간일 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 암-간엽 줄기 유사세포(tumor-associated mesenchymal stem-like cells, tMSLCs)는 제대혈과 골수에 존재하는 골 세포, 연골 세포, 근육 세포 및 섬유 세포 등 골격계 세포로 분화되는 줄기세포인 중간엽 줄기세포와 유사한 특징을 가진 세포를 의미한다. 상기 암-간엽 줄기 유사세포는 중간엽 줄기세포와 유사하게, ⅰ) 플라스틱 부착능을 갖고, ⅱ) 표면 항원 프로파일이 CD105+, CD90+, CD73+, CD45-, CD31- 및 NG2-을 나타내며, ⅲ) 지방 세포, 골 형성 및 연골 형성의 분화능을 보일 수 있다.
본 발명에서 상기 암-간엽 줄기 유사세포는 암 조직, 바람직하게는 뇌암, 보다 바람직하게는 교모세포종, 더욱 바람직하게는 침윤성 또는 전이성이 높은 교모세포종으로부터 분리된 것일 수 있다.
단계 (b): 분리된 암-간엽 줄기 유사 세포에 약물을 처리하는 단계에 해당한다.
본 발명에서는 상기 암 환자로부터 분리된 암-간엽 줄기 유사 세포에 약물로 시험 물질을 처리할 수 있다.
다만, 본 발명에서는 상기 시험 물질과 함께 시너지 효과를 얻기 위하여 항암제를 함께 처리할 수 있다. 여기서 상기 항암제로는 나이트로젠 머스타드, 이마티닙, 옥살리플라틴, 리툭시맙, 엘로티닙, 네라티닙, 라파티닙, 제피티닙, 반데타닙, 니로티닙, 세마사닙, 보수티닙, 악시티닙, 세디라닙, 레스타우르티닙, 트라스투주맙, 게피티니브, 보르테조밉, 수니티닙, 카보플라틴, 베바시주맙, 시스플라틴, 세툭시맙, 비스쿰알붐, 아스파라기나제, 트레티노인, 하이드록시카바마이드, 다사티닙, 에스트라머스틴, 겜투주맵오조가마이신, 이브리투모맙튜세탄, 헵타플라틴, 메칠아미노레불린산, 암사크린, 알렘투주맙, 프로카르바진, 알프로스타딜, 질산홀뮴 키토산, 젬시타빈, 독시플루리딘, 페메트렉세드, 테가푸르, 카페시타빈, 기메라신, 오테라실, 아자시티딘, 메토트렉세이트, 우라실, 시타라빈, 플루오로우라실, 플루다가빈, 에노시타빈, 플루타미드, 데시타빈, 머캅토푸린, 티오구아닌, 클라드리빈, 카르모퍼, 랄티트렉세드, 도세탁셀, 파클리탁셀, 이리노테칸, 벨로테칸, 토포테칸, 비노렐빈, 에토포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 테니포시드, 독소루비신, 이다루비신, 에피루비신, 미톡산트론, 미토마이신, 블레로마이신, 다우노루비신, 닥티노마이신, 피라루비신, 아클라루비신, 페프로마이신, 템시롤리무스, 테모졸로마이드, 부설판, 이포스파미드, 사이클로포스파미드, 멜파란, 알트레트민, 다카바진, 치오테파, 니무스틴, 클로람부실, 미토락톨, 레우코보린, 트레토닌, 엑스메스탄, 아미노글루테시미드, 아나그렐리드, 나벨빈, 파드라졸, 타목시펜, 토레미펜, 테스토락톤, 아나스트로졸, 레트로졸, 보로졸, 비칼루타미드, 로무스틴 및 카르무스틴으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
단계 (c): 상기 약물이 처리된 암-간엽 줄기 유사 세포의 히알루론산 합성 효소 또는 이를 코딩하는 mRNA의 발현 수준을 측정하는 단계에 해당한다.
본 발명에서는 상기와 같이 시험 물질이 처리된 암-간엽 줄기 유사 세포에서 히알루론산 합성 효소의 발현 수준을 측정할 수 있다.
본 발명에서 상기 히알루론산 합성 효소(Hyaluronic acid synthase, HAS)는 히알루론산을 합성하는 효소로, 히알루론산 합성 효소 1(Hyaluronic acid synthase 1, HAS1), 히알루론산 합성 효소 2(Hyaluronic acid synthase 2, HAS2) 및 히알루론산 합성 효소 3(Hyaluronic acid synthase 3, HAS3)이 알려져 있으며, 이들 중 히알루론산 합성 효소 2와 히알루론산 합성 효소 3은 섬유아세포와 각질형성세포에서 히알루론산 합성에 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. 다만, 본 발명에서 상기와 같이 암-간엽 줄기 유사 세포에서 상기 히알루론산 합성 효소 중에서 특히 히알루론산 합성 효소 2의 발현 수준을 측정하는 것이 암 전이 억제제를 높은 정확도로 스크리닝할 수 있어 바람직하다.
본 발명에서 상기 히알루론산 합성 효소 1은 서열번호 1로 표시될 수 있고, 상기 히알루론산 합성 효소 2는 서열번호 2로 표시될 수 있으며, 상기 히알루론산 합성 효소 3은 서열번호 3으로 표시될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 히알루론산 합성 효소의 발현 수준을 측정하는 제제는 이에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있다.
본 발명에서 상기 "항체"란, 단백질 또는 펩티드 분자의 항원성 부위에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질성 분자를 의미하는데, 이러한 항체는, 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝하여 상기 마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 상기 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함될 수 있을 뿐만 아니라, 인간화 항체 등의 특수 항체를 포함할 수도 있다. 아울러, 상기 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며 Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 항체는 상기 히알루론산 합성 효소에 특이적으로 결합할 수 있는 항체가 될 수 있고, 바람직하게는 상기 각 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 그의 일부가 될 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 히알루론산 합성 효소의 발현 수준은 당업계에 공지된 다양한 면역 분석 방법을 통해 실시될 수 있다. 예를 들어, 방사능 면역 분석, 방사능 면역 침전, 면역 침전, ELISA(enzyme-linked immunosorbentassay), 캡처-ELISA, 억제 또는 경쟁 분석, 그리고 샌드위치 분석을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 면역 분석 또는 면역 염색의 방법은 문헌(Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; Gaastra, W., Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA), in Methods in Molecular Biology, Vol. 1, Walker, J.M. ed., Humana Press, NJ, 1984; 및 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999)에 기재되어 있다. 예를 들어, 본 발명의 방법이 방사능 면역 분석 방법에 따라 실시되는 경우, 방사능 동위원소(예컨대, C14, I125, P32 및 S35)로 표지된 단백질-특이 항체가 이용될 수 있다.
또한, 본 발명의 방법이 ELISA 방식으로 실시되는 경우, 본 발명의 특정 실시예는 (i) 시료가 처리된 세포로부터 추출물을 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계 (ⅱ) 1차 항체로서의 Ire1 혹은 단백질-특이 항체와 상기 세포 추출물을 반응시키는 단계 (ⅲ) 상기 단계 (ⅱ)의 결과물을 효소가 결합된 2차 항체와 반응시키는 단계 및 (ⅳ) 상기 효소의 활성을 측정하는 단계를 포함할 수 있다. 여기서, 상기 고체 기질로 적합한 것은 탄화수소 폴리머(예컨대, 폴리스틸렌 및 폴리프로필렌), 유리, 금속 또는 젤이며, 가장 바람직하게는 마이크로타이터 플레이트이다. 상기 2차 항체에 결합된 효소는 발색 반응, 형광 반응, 발광 반응 또는 적외선 반응을 촉매하는 효소를 포함하나, 이에 한정되지 않으며, 예를 들어, 알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제, 루시퍼라아제 및 사이토크롬 P450을 포함할 수 있다. 상기한 2차 항체에 결합하는 효소로서 알칼린 포스파타아제가 이용되는 경우에는, 기질로서 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-ASB1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF(enhanced chemifluorescence)와 같은 발색 반응 기질이 이용되고, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제가 이용되는 경우에는 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), TMB(3,3,5,5-tetramethylbenzidine), ABTS(2,2'-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]) 및 o-페닐렌디아민(OPD)과 같은 기질이 이용될 수 있다. 상기 ELISA 방법에서 최종적인 효소의 활성 측정 또는 시그널의 측정은 당업계에 공지된 다양한 방법에 따라 실시될 수 있다. 만일, 레이블로서 바이오틴이 이용된 경우에는 스트렙타비딘으로, 루시퍼라아제가 이용된 경우에는 루시페린으로 시그널을 용이하게 검출할 수 있다.
또한, 본 발명에서는 상기와 같이 시험 물질이 처리된 암-간엽 줄기 유사 세포에서 히알루론산 합성 효소를 코딩하는 mRNA의 발현 수준을 측정할 수 있다.
본 발명에서 상기 히알루론산 합성 효소를 코딩하는 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제는 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 센스 및 안티센스 프라이머, 또는 프로브일 수 있다.
본 발명에서 상기 "프라이머"란, 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성이 개시될 수 있다.
본 발명에서 상기 프라이머는 상기 히알루로론산 합성 효소의 mRNA 유전자의 증폭에 사용될 수 있는 프라이머가 될 수 있고, 상기 히알루로니다제의 mRNA 유전자와 상보적으로 결합하여 PCR 방법으로 증폭시킬 수 있는 한, 상기 프라이머의 뉴클레오티드 서열은 제한되지 않는다.
본 발명에서 상기 "프로브"란, 유전자 또는 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하는데, 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있고, 보다 용이하게 검출하기 위하여 라벨링될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 프로브는 히알루로론산 합성 효소의 mRNA 유전자와 상보적으로 결합할 수 있는 프로브가 될 수 있고, 상기 히알루로니다제의 mRNA 유전자와 상보적으로 결합할 수 있는 한, 상기 프로브의 뉴클레오티드 서열은 제한되지 않는다.
본 발명에서 상기 히알루론산 합성 효소를 코딩하는 mRNA의 발현 수준은중합효소연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection assay; RPA), 마이크로어레이(microarray), 및 노던 블롯팅(northern blotting)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법을 통해 측정될 수 있다.
단계 (d): 상기 암-간엽 줄기 유사 세포의 히알루론산 합성 효소 또는 이를 코딩하는 mRNA의 발현 수준이 약물 처리 전에 비하여 감소된 경우, 상기 약물을 암 전이 억제제 후보물질로 판단하는 단계에 해당한다.
본 발명에서 상기 단계 (c)에서 측정된 것으로, 약물 처리 후 암-간엽 줄기 유사 세포에서 측정된 히알루론산 합성 효소, 바람직하게는 히알루론산 합성 효소 2의 발현 수준이 약물 처리 전보다 감소한 경우, 상기 약물을 암 치료제 중에서도 특히 암 전이 억제제의 후보물질로 판단할 수 있다.
단, 상기 단계 (b)에서 약물로 시험 물질과 함께 항암제를 병용 투여한 결과, 약물 처리 후 암-간엽 줄기 유사 세포에서 측정된 히알루론산 합성 효소 2의 발현 수준이 약물 처리 전보다 감소한 경우, 상기 시험 물질 및 항암제 모두를 암 전이 억제제의 후보물질로 판단할 수 있다.
본 발명의 다른 구현 예에 따르면, (1) 암 환자로부터 암-간엽 줄기 유사 세포를 분리하는 단계; (2) 분리된 암-간엽 줄기 유사 세포의 히알루론산 합성 효소 2와, 히알루론산 합성 효소 1 및 히알루론산 합성 효소 3 중 적어도 하나 또는 이들을 코딩하는 mRNA의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (3) 상기 암-간엽 줄기 유사 세포의 히알루론산 합성 효소 2 또는 이를 코딩하는 mRNA의 발현 수준이 상기 히알루론산 합성 효소 1 및 상기 히알루론산 합성 효소 3 중 적어도 하나의 단백질 또는 이들을 코딩하는 mRNA의 발현 수준보다 높은 경우, 암의 전이 가능성이 높은 것으로 판단하는 단계를 포함하는, 암의 전이 가능성 예측에 대한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 방법을 각각의 단계 별로 상세하게 설명하면 다음과 같다:
단계 (1): 암 환자로부터 암-간엽 줄기 유사 세포를 분리하는 단계에 해당한다.
본 발명에서 상기 암 환자는, 신체 조직의 자율적인 과잉 성장에 의해 비정상적으로 자라난 덩어리인 암(cancer) 혹은 종양(tumor)의 질환이 있는 환자로서, 예를 들면, 뇌암, 폐암, 비소세포성폐암, 결장암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부 암, 피부 또는 안구내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 위암, 항문부근암, 결장암, 유방암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병(Hodgkin's disease), 식도암, 소장암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장 또는 수뇨관 암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계(CNS; central nervous system) 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 및 뇌하수체 선종으로 이루어진 군에서 선택되는 암 질환이 있는 환자일 수 있으나, 바람직하게는 뇌암 환자일 수 있고, 보다 바람직하게는 교모세포종(glioblastoma) 환자일 수 있다.
단, 본 발명에서 상기 환자는 포유류에 해당하는 동물을 모두 포함할 수 있으나, 바람직하게는 인간일 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 암-간엽 줄기 유사세포(tumor-associated mesenchymal stem-like cells, tMSLCs)는 제대혈과 골수에 존재하는 골 세포, 연골 세포, 근육 세포 및 섬유 세포 등 골격계 세포로 분화되는 줄기세포인 중간엽 줄기세포와 유사한 특징을 가진 세포를 의미한다. 상기 암-간엽 줄기 유사세포는 중간엽 줄기세포와 유사하게, ⅰ) 플라스틱 부착능을 갖고, ⅱ) 표면 항원 프로파일이 CD105+, CD90+, CD73+, CD45-, CD31- 및 NG2-을 나타내며, ⅲ) 지방 세포, 골 형성 및 연골 형성의 분화능을 보일 수 있다.
본 발명에서 상기 암-간엽 줄기 유사세포는 암 조직, 바람직하게는 뇌암, 보다 바람직하게는 교모세포종일 수 있다.
단계 (2): 분리된 암-간엽 줄기 유사 세포의 히알루론산 합성 효소 2 또는 이를 코딩하는 mRNA와, 히알루론산 합성 효소 1 및 히알루론산 합성 효소 3 중 적어도 하나의 단백질 또는 이를 코딩하는 mRNA의 발현 수준을 측정하는 단계에 해당한다.
본 발명에서는 상기 분리된 암-간엽 줄기 유사 세포의 히알루론산 합성 효소 2와, 상기 히알루론산 합성 효소 1 및 히알루론산 합성 효소 3 중 적어도 하나의 단백질의 발현 수준을 측정할 수 있다.
본 발명에서 상기 히알루론산 합성 효소의 발현 수준을 측정하는 제제는 이에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있다.
본 발명에서 상기 "항체"란, 단백질 또는 펩티드 분자의 항원성 부위에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질성 분자를 의미하는데, 이러한 항체는, 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝하여 상기 마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 상기 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함될 수 있을 뿐만 아니라, 인간화 항체 등의 특수 항체를 포함할 수도 있다. 아울러, 상기 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며 Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 항체는 상기 히알루론산 합성 효소 1 내지 3 각각에 특이적으로 결합할 수 있는 항체가 될 수 있고, 바람직하게는 상기 각 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 그의 일부가 될 수 있다.
본 발명에서 상기 히알루론산 합성 효소 1 내지 3의 발현 수준은 당업계에 공지된 다양한 면역 분석 방법을 통해 실시될 수 있다. 예를 들어, 방사능 면역 분석, 방사능 면역 침전, 면역 침전, ELISA(enzyme-linked immunosorbentassay), 캡처-ELISA, 억제 또는 경쟁 분석, 그리고 샌드위치 분석을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 면역 분석 또는 면역 염색의 방법은 문헌(Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; Gaastra, W., Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA), in Methods in Molecular Biology, Vol. 1, Walker, J.M. ed., Humana Press, NJ, 1984; 및 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999)에 기재되어 있다. 예를 들어, 본 발명의 방법이 방사능 면역 분석 방법에 따라 실시되는 경우, 방사능 동위원소(예컨대, C14, I125, P32 및 S35)로 표지된 단백질-특이 항체가 이용될 수 있다.
또한, 본 발명의 방법이 ELISA 방식으로 실시되는 경우, 본 발명의 특정 실시예는 (i) 시료가 처리된 세포로부터 추출물을 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계; (ⅱ) 1차 항체로서의 Ire1 혹은 단백질-특이 항체와 상기 세포 추출물을 반응시키는 단계; (ⅲ) 상기 단계 (ⅱ)의 결과물을 효소가 결합된 2차 항체와 반응시키는 단계; 및 (ⅳ) 상기 효소의 활성을 측정하는 단계를 포함할 수 있다. 여기서, 상기 고체 기질로 적합한 것은 탄화수소 폴리머(예컨대, 폴리스틸렌 및 폴리프로필렌), 유리, 금속 또는 젤이며, 가장 바람직하게는 마이크로타이터 플레이트이다. 상기 2차 항체에 결합된 효소는 발색 반응, 형광 반응, 발광 반응 또는 적외선 반응을 촉매하는 효소를 포함하나, 이에 한정되지 않으며, 예를 들어, 알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제, 루시퍼라아제 및 사이토크롬 P450을 포함할 수 있다. 상기한 2차 항체에 결합하는 효소로서 알칼린 포스파타아제가 이용되는 경우에는, 기질로서 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-ASB1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF(enhanced chemifluorescence)와 같은 발색 반응 기질이 이용되고, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제가 이용되는 경우에는 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), TMB(3,3,5,5-tetramethylbenzidine), ABTS(2,2'-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]) 및 o-페닐렌디아민(OPD)과 같은 기질이 이용될 수 있다. 상기 ELISA 방법에서 최종적인 효소의 활성 측정 또는 시그널의 측정은 당업계에 공지된 다양한 방법에 따라 실시될 수 있다. 만일, 레이블로서 바이오틴이 이용된 경우에는 스트렙타비딘으로, 루시퍼라아제가 이용된 경우에는 루시페린으로 시그널을 용이하게 검출할 수 있다.
또한, 본 발명에서는 상기 분리된 암-간엽 줄기 유사 세포의 히알루론산 합성 효소 2의 mRNA와, 상기 히알루론산 합성 효소 1 및 히알루론산 합성 효소 3 중 적어도 하나의 단백질을 코딩하는 mRNA의 발현 수준을 측정할 수 있다.
본 발명에서 상기 히알루론산 합성 효소 1 내지 3를 코딩하는 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제는 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 센스 및 안티센스 프라이머, 또는 프로브일 수 있다.
본 발명에서 상기 "프라이머"란, 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성이 개시될 수 있다.
본 발명에서 상기 프라이머는 상기 히알루로론산 합성 효소 1 내지 3 각각의 mRNA 유전자의 증폭에 사용될 수 있는 프라이머가 될 수 있고, 상기 히알루로니다제의 mRNA 유전자와 상보적으로 결합하여 PCR 방법으로 증폭시킬 수 있는 한, 상기 프라이머의 뉴클레오티드 서열은 제한되지 않는다.
본 발명에서 상기 "프로브"란, 유전자 또는 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하는데, 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있고, 보다 용이하게 검출하기 위하여 라벨링될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 프로브는 히알루로론산 합성 효소 1 내지 3 각각의 mRNA 유전자와 상보적으로 결합할 수 있는 프로브가 될 수 있고, 상기 히알루로니다제의 mRNA 유전자와 상보적으로 결합할 수 있는 한, 상기 프로브의 뉴클레오티드 서열은 제한되지 않는다.
본 발명에서 상기 히알루론산 합성 효소 1 내지 3를 코딩하는 mRNA의 발현 수준은 중합효소연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection assay; RPA), 마이크로어레이(microarray), 및 노던 블롯팅(northern blotting)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법을 통해 측정될 수 있다.
단계 (3): 상기 암-간엽 줄기 유사 세포의 히알루론산 합성 효소 2 또는 이를 코딩하는 mRNA의 발현 수준이 상기 히알루론산 합성 효소 1 및 상기 히알루론산 합성 효소 3 중 적어도 하나의 단백질 또는 이를 코딩하는 mRNA의 발현 수준보다 높은 경우, 암의 전이 가능성이 높은 것으로 판단하는 단계에 해당한다.
본 발명에서 암-간엽 줄기 유사 세포의 히알루론산 합성 효소 2의 발현 수준이 동일한 암-간엽 줄기 유사 세포의 히알루론산 합성 효소 1 및 히알루론산 합성 효소 3 중 적어도 하나의 단백질의 발현 수준보다 높은 경우, 암의 침윤성 및 전이성이 높은 것으로 판단할 수 있으며, 또한 암 환자의 예후가 나쁠 것으로 예측할 수 있다. 보다 바람직하게는 상기 히알루론산 합성 효소 2의 발현 수준이 히알루론산 합성 효소 1 및 히알루론산 합성 효소 3 각각의 발현 수준 보다 높은 경우, 암의 침윤성 및 전이성이 높은 것으로 판단할 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 암-간엽 줄기 유사 세포의 히알루론산 합성 효소 2를 코딩하는 mRNA의 발현 수준이 동일한 암-간엽 줄기 유사 세포의 히알루론산 합성 효소 1 및 히알루론산 합성 효소 3 중 적어도 하나의 단백질을 코딩하는 mRNA의 발현 수준보다 높은 경우, 암의 침윤성 및 전이성이 높은 것으로 판단할 수 있으며, 암 환자의 예후가 나쁠 것으로 예측할 수 있다. 보다 바람직하게는 상기 히알루론산 합성 효소 2를 코딩하는 mRNA의 발현 수준이 히알루론산 합성 효소 1를 코딩하는 mRNA 및 히알루론산 합성 효소 3을 코딩하는 mRNA 각각의 발현 수준 보다 높은 경우, 암의 침윤성 및 전이성이 높은 것으로 판단할 수 있다.
본 발명은 암 환자로부터 분리된 암-간엽 줄기 유사 세포에 있어서 히알루론산 합성 효소 2의 발현 수준을 측정함으로써 암 전이 억제제를 높은 정확도로 스크리닝할 수 있다.
또한, 본 발명은 암 환자로부터 분리된 암-간엽 줄기 유사 세포에서 히알루론산 합성 효소 2와, 히알루론산 합성 효소 1 또는 3의 발현 수준을 비교함으로써 암의 전이 가능성을 높은 정확도로 예측할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에서, 트렌스 웰에 tMSLCs와 GBM 세포를 공동 배양한 후 GBM 세포의 이동에 관한 개략도를 나타낸 것이다.
도 2의 (a)는 본 발명의 일 실시예에서, 트렌스 웰에 tMSLCs와 GBM 세포를 공동 배양한 후 GBM 세포의 사진을 나타낸 것이다.
도 2의 (b)는 본 발명의 일 실시예에서, 트렌스 웰에 tMSLCs와 GBM 세포를 공동 배양한 후 이동한 GBM 세포의 수를 그래프로 나타낸 것이다. ***은 대조군 대비 p　<　0.001인 것을 의미한다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에서, tMSLCs에 의해 전조정된 콜라겐-기반 ECM에서 GBM 세포의 침윤성을 분석하기 위한 실험적 계획의 개략도를 나타낸 것이다.
도 4의 (a)는 본 발명의 일 실시예에서, tMSLCs에 의해 전조정된 콜라겐-기반 ECM으로 침윤한 X01 GBM 세포의 H&E 염색 사진을 나타낸 것이다.
도 4의 (b)는 본 발명의 일 실시예에서, tMSLCs에 의해 전조정된 콜라겐-기반 ECM으로 침윤한 X01 GBM 세포의 수를 그래프로 나타낸 것이다. *은 대조군 대비 p　<　0.05인 것을 의미한다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에서 X01 GBM 세포 및 tMSLCs에서 ECM 성분 및 리모델링 효소의 반정량적 RT-PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 6의 (a)는 본 발명의 일 실시예에서 VCAN 또는 HAS2에 대한 siRNA로 형질 전환된 X01 GBM 단독 세포 혹은 tMSLCs와 공동 배양 후 X01 GBM 세포의 상처 치료 분석 결과 후 사진을 나타낸 것이다.
도 6의 (b)는 본 발명의 일 실시예에서 X01 GBM 단독 세포 혹은 tMSLCs와 공동 배양된 X01 GBM 세포를 VCAN 또는 HAS2에 대한 siRNA로 형질 전환시킨 경우 상처 치유율의 변화를 그래프로 나타낸 것이다.
도 7의 (a)는 본 발명의 일 실시예에서 VCAN 또는 HAS2에 대한 siRNA로 형질 전환된 X01 GBM 단독 세포 혹은 tMSLCs와 공동 배양 후 X01 GBM 세포의 이동 사진을 나타낸 것이다.
도 7의 (b)는 본 발명의 일 실시예에서 X01 GBM 단독 세포 혹은 tMSLCs와 공동 배양된 X01 GBM 세포를 VCAN 또는 HAS2에 대한 siRNA로 형질 전환시킨 경우 이동한 XO1 GBM 세포수를 그래프로 나타낸 것이다.
도 8의 (a)는 본 발명의 일 실시예에서, 트렌스 웰에서 X01 GBM 세포에 히알루론산을 처리한 결과 X01 GBM 세포의 이동 사진을 나타낸 것이다.
도 8의 (b)는 본 발명의 일 실시예에서, 트렌스 웰에서 X01 GBM 세포에 히알루론산을 처리한 결과 이동한 XO1 GBM 세포수를 그래프로 나타낸 것이다.
도 9는 XO1 GBM 세포, tMSLCs0903 또는 이들의 공동 배양 시 HAS2의 발현 수준을 웨스턴 블럿 및 반정량적 RT-PCR로 분석한 결과를 나타낸 것이다. 단, 상기 도 9에서 'X01tMSLCs0903'은 tMSLCs0903와 공동 배양된 X01 GBM 세포를 나타낸 것이고, 'tMSLCs0903X01'은 X01 GBM 세포와 공동 배양된 tMSLCs0903를 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에서 XO1 GBM 세포, tMSLCs0903 또는 이들의 공동 배양 시 히알루론산(HA)의 발현 수준을 ELISA로 분석한 결과를 그래프로 나타낸 것이다. ***은 대조군 대비 p　<　0.001인 것을 의미한다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에서 siRNA로 처리한 tMSLCs0903에서 히알루론산(HA)의 발현 수준을 ELISA로 분석한 결과를 그래프로 나타낸 것이다. ***은 대조군 대비 p　<　0.001인 것을 의미한다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에서 XO1 GBM 세포 및 tMSLCs0903의 사이토카인 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에서 각 siRNA로 처리한 tMSLCs0903에서 HAS2의 웨스턴 블럿 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에서 각 siRNA로 처리한 tMSLCs0903에서 히알루론산(HA)의 발현 수준을 ELISA로 분석한 결과를 그래프로 나타낸 것이다. ***은 대조군 대비 p　<　0.001인 것을 의미한다.
도 15는 본 발명의 일 실시예에서 C5a 항체로 처리한 tMSLCs0903에서 히알루론산 합성 효소 2(HAS2)의 발현 수준을 웨스턴 블럿으로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 16은 본 발명의 일 실시예에서 C5a 항체로 처리한 tMSLCs0903에서 히알루론산 합성 효소 2(HAS2)의 발현 수준을 ELISA로 분석한 결과를 그래프로 나타낸 것이다. ***은 대조군 대비 p　<　0.001인 것을 의미한다.
도 17은 본 발명의 일 실시예에서 C5aR1에 대한 siRNA로 처리한 tMSLCs0903에서 히알루론산 합성 효소 2(HAS2)의 발현 수준을 웨스턴 블럿으로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 18은 본 발명의 일 실시예에서 C5aR1에 대한 siRNA로 처리한 tMSLCs0903에서 히알루론산 합성 효소 2(HAS2)의 발현 수준을 ELISA로 분석한 결과를 그래프로 나타낸 것이다. **은 대조군 대비 p　<　0.01인 것을 의미한다.
도 19는 본 발명의 일 실시예에서 rh-C5a로 처리한 X01 GBM 세포에서 히알루론산 합성 효소 2(HAS2)의 발현 수준을 웨스턴 블럿으로 분석한 결과를 나타낸 것이다. 단, 상기 도 19에서 tMSLCs0903에서 히알루론산 합성 효소 2(HAS2)는 양성 대조군으로 나타낸 것이고, 'S.E'는 단기 노출(short exposed), 'L.E'는 장기 노출(long exposed)을 의미한다.
도 20은 본 발명의 일 실시예에서 X01 GBM 세포(X01), tMSLCs0903, 및 이들의 공동 배양 조건에서 C5aR1의 발현 수준을 웨스턴 블럿으로 분석한 결과를 나타낸 것이다. 단, 상기 도 20에서 'X01tMSLCs0903'은 tMSLCs0903와 공동 배양된 X01 GBM 세포를 나타낸 것이고, 'tMSLCs0903X01'은 X01 GBM 세포와 공동 배양된 tMSLCs0903를 나타낸 것이다.
도 21은 본 발명의 일 실시예에서, C5a 중화 항체의 존재 하에서 X01 GBM 세포, 및 tMSLCs0903와 공동 배양된 X01 GBM 세포에서 이동 능력을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 22는 본 발명의 일 실시예에서, C5a 중화 항체를 처리한 후 이동한 X01 GBM 세포 및 tMSLCs0903와 공동 배양된 X01 GBM 세포의 수를 그래프로 나타낸 것이다. ***은 대조군 대비 p　<　0.001인 것을 의미한다.
도 23은 본 발명의 일 실시예에서 C5에 대한 siRNA로 처리한 tMSLCs0903에서 ERK, MAPK, AKT, JAK1 및 STAT3의 활성화 상태를 웨스턴 블럿으로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 24는 본 발명의 일 실시예에서, tMSLCs0903에 MEK 억제제(U0126), PI3K/AKT 억제제(LY294002), JAK1 억제제(P6) 또는 STAT3 억제제(WP1066)를 처리한 후 히알루론산 합성 효소 2(HAS2)의 발현 수준을 qRT-PCR로 분석한 결과를 그래프로 나타낸 것이다. ***은 대조군 대비 p　<　0.001인 것을 의미한다.
도 25는 본 발명의 일 실시예에서, tMSLCs0903에 MEK 억제제(U0126), PI3K/AKT 억제제(LY294002), JAK1 억제제(P6) 또는 STAT3 억제제(WP1066)를 처리한 후 히알루론산(HA)의 발현 수준을 ELISA로 분석한 결과를 그래프로 나타낸 것이다. ***은 대조군 대비 p　<　0.001인 것을 의미한다.
도 26은 본 발명의 일 실시예에서, tMSLCs0903에 MEK 억제제(U0126)를 처리한 후 히알루론산 합성 효소 2(HAS2)의 발현 수준을 웨스턴 블럿으로 분석한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 27은 본 발명의 일 실시예에서, tMSLCs0903에 MEK 억제제(U0126)를 처리한 후 히알루론산(HA)의 발현 수준을 ELISA로 분석한 결과를 그래프로 나타낸 것이다. ***은 대조군 대비 p　<　0.001인 것을 의미한다.
도 28은 본 발명의 일 실시예에서 C5a 항체를 처리한 후 ERK MAPK의 활성화 상태를 웨스턴 블럿으로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 29의 (a)는 본 발명의 일 실시예에서 ERK MAPK에 대한 siRNA 처리한 후 X01 GBM 세포(X01 alone), 및 tMSLCs0903와 공동 배양된 X01 GBM 세포(tMSLCs0903)에서 이동 능력을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예
화학 약제 및 항체
p-ERK1/2, ERK1/2, p-T308-AKT, AKT, p-Y705-STAT3, JAK1에 대한 항체는 Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA)에서 구입하였고, STAT3 및 p-T1022-JAK1에 대한 항체는 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)에서 구입하였으며, HAS2 및 C5R1에 대한 항체는 Abcam (Cambridge, UK)에서 구입하였다. 4,6-디아미디노-2-페닐인돌 (4,6-diamidino-2-phenylindole, DAPI)은 Sigma (St Louis, MO, USA)에서 구입하였고, rh-C5a 단백질과 CD105 및 C5a에 대한 항체는 R&D Systems (Minneapolis, MN, USA)에서 구입하였다. MEK (U0126), PI3K (LY294002), JAK1 (P6) 및 STAT3 (WP1066) 특이적 화학적 억제제는 Calbiochem (San Diego, CA, USA)에서 구입하였다. 항-염소 Alexa Fluor 488, 항-마우스 Alexa Fluor 546는 Invitrogen (Carlsbad, CA, USA)에서 구입하였다. 항-마우스 IgG-HRP, 항-염소 IgG-HRP 및 항-토끼 Ig-HRP는 Santa Cruz biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)에서 구입하였다. 히알루론산 (Low molecular weight; 15-40 kDa)은 R&D systems (Minneapolis, MN, USA)에서 구입하였다.
암- 간엽 줄기 유사 세포( tMSLC ) 및 교모세포종( GBM ) 세포의 공동 배양
포어 사이즈가 0.4㎛인 트랜스웰(transwell)을 준비한 뒤, tMSLC0903 (2.5 X 105)를 트랜스웰의 상부 챔버에 접종하고, X01 GBM cells (1.5 X 105)를 하부 챔버에 접종하여 공동 배양 후 3일 동안 세포 이동을 분석하였다.
GBM 세포 및 tMSLCs의 배양
68세 여성인 교모세포종 환자로부터 GBM 세포를 분리하여 준비하고(X01 GBM 세포), 1% 페니실린 및 스트렙토 마이신을 포함하며, 10% 열-불활성화된 소 태아 혈청 (Lonza, Basel, Switzerland)이 보충된 둘베코 변형 이글 배지 (Gibco, Korea, Seoul)에 배양하였다.
상기 동일한 환자로부터 t-MSLCs를 분리한 뒤(tMSLC09-03) 비부착 세포만을 인산 완충 식염수(phosphate-buffered saline, PBS)로 세척하고, 오직 부착 tMSLCs만을 수집하여 10% FBS (Lonza), 2 mM L-글루타민 (Mediatech), 및 항생-항진균성 용액 (Gibco, Seoul, Korea)을 포함하는 MEMα (Mediatech)에서 배양하였다.
세포 이동능의 분석
GBM 세포의 이동성을 분석하기 위하여, 포어 사이즈가 8㎛인 트랜스웰(Corning Glass, Seoul, Korea)을 이용하였다. 우선, GBM 세포 (2 X 104)를 상기 트랜스웰의 상부 웰에 로딩하고, 24시간 동안 배양하였다. 필터의 하부 표면으로 이동한 세포를 고정한 뒤 Diff Quick kit (Fisher, Pittsburgh, PA, USA)로 염색하였다. 이동한 세포의 수를 웰 당 세개의 현미경 필드(microscopic fileds)로 계수하였다.
tMSLCs 유래 세포외 기질에서 GBM 세포의 기관형 침윤성
tMSLC0903을 콜라겐 매트릭스에 접종한 후 3일 동안 배양하여 tMSLC0903-유래 ECM 리모델링을 하였다. 그 후, 퓨로마이신(puromycin)을 이용하여 tMSLC0903 세포를 사멸시킨 뒤, X01 GBM 세포를 tMSLC-분비 ECM 조성물에 도말하였다. 48시간 후, 겔을 수직으로 절단하고, H&E 염색을 하여 상기 X01 GBM 세포의 침윤성을 시각화하였다. 침윤한 세포의 수를 웰당 세개의 현미경 필드로 계수하였다.
사이토카인 분석
인간 사이토카인 어레이 (Proteome Profiler Array Human Cytokine, R&D Systems, ARY005, Minneapolis, MN, USA)를 제조자의 지시 사항에 따라 수행하였다. 사이토카인의 발현 수준은 X-레이 필름으로 시각화하였고, 이미지 J 소프트웨어를 사용하여 밀도계로 양을 측정하였다.
ELISA
X101 GBM 세포 또는 tMSLCs를 도말하고 3일이 경과한 후 조정 배지(conditioned medium)를 회수하여, 그에 포함된 히알루론산의 양을 ELISA (human HA ELISA Kit, R&D Systems)로 측정하였다.
형질 주입( transfection )
마이크로포레이터-미니 (Digital Bio Technology, Seoul, Korea)를 사용하여 세포에 siRNA를 형질 주입시켰다. 모든 siRNA는 Genolution Pharmaceuticals, Inc (Seoul, Korea)에서 구입하였다.
웨스턴 블럿 분석(western blot analysis)
프로테아즈 억제제(protease inhibitors)로 보충된 용해 완충액 (40 mM Tris-HCl (pH 8.0), 120 mM NaCl, 0.1% Nonidet-P40)을 사용하여 단백질을 추출함으로써 세포 용해물을 준비하였다. 단백질을 SDS-PAGE로 분리한 뒤, 니트로셀룰로오스 막 (Amersham, Arlington Heights, IL, USA)으로 이송시켰다. 상기 막을 트리스 생리 식염 완충액(Tris-buffered saline, TBS) 내에서 5% 무지방 분유로 블록한 뒤, 1차 항체와 함께 4℃에서 밤새 배양하였다. 페록시다제-컨쥬게이트 2차 항체를 사용하자 오염(blots)이 더욱 진해졌고, 단백질은 향상 화학 루미네센스(enhanced chemiluminescence, ECL)로 시각화하였다.
RT- PCR
트리졸 (Invitrogen)을 사용하여 총 RNA를 분리한 뒤 SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix (Invitrogen)를 사용하여 역전사 하였다. 유전자 발현 수준은 PCR using Econo Taq Plus Green (Lucigen, Seoul, Korea)를 이용하여 분석하였고, 각 샘플마다 내부 통제로 β-액틴을 사용하였다.
통계적 분석
모든 실험 데이터는 평균으로 나타내었고, 에러 막대는 표준 편차(standard deviation, SD)로 나타내었다. 다변량 분석을 위하여, 독립 표본 양측 스튜던트 테스트 (unpaired two-tailed Student's t-test) 또는 ANOVA을 이용하여 값들을 비교하였다. 모든 통계적 분석은 GraphPad Prism 7.0으로 수행하였고, p 값 <0.05 인 경우 유의한 것으로 판단하였다.
ECM 미세 환경의 리모델링(remodeling)에 의한 tMSLCs의 GBM 세포의 침윤성 증가
GBM 세포의 침윤성에 tMSLCs가 미치는 영향을 확인하기 위하여, 트랜스 웰에 환자 유래 X01 GBM 세포와 tMSLC0903을 공동 배양하였다. 공동 배양 시, 도 1에서 보는 바와 같이, GBM 세포와 tMSLCs 사이에 공간을 두고 다공성 막을 통해 상호 소통(crosstalk)이 가능하도록 하였다. 공동 배양 후, 마트리겔로 전코팅된 트랜스웰을 사용하여 GBM 세포의 침윤성을 분석하였다. 도 2에서 보는 바와 같이, tMSLCs와의 공동 배양한 X01 GBM 세포의 침윤성이 단독 배양한 X01 GBM 세포보다 침윤성이 증가한 것을 볼 수 있었다.
또한, tMSLCs에 의해 조정된 ECM에서 GBM 세포의 침윤성을 분석하였다. 이를 위하여, 도 3에서 보는 바와 같이 성장 배지에 콜라겐 Ⅰ형과 마트리겔의 혼합물을 포함하는 Millicell 삽입물(inserts) 상에 tMSLCs를 도말한 뒤, 3일 동안 상기 세포가 ECM을 재조정 하도록 하였다. 이후, 퓨로마이신을 이용하여 모든 tMSLCs를 사멸시키고, 조정된 ECM을 남겨두었다. 상기 ECM 상에 X01 GBM 세포를 도말한 뒤, 겔 메트릭스를 수직으로 절편화한 후 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색을 통하여 상기 X01 GBM 세포의 침윤성을 시각화 하였다. 그 결과 도 4에서 보는 바와 같이, tMSLCs에 의해 조정된 ECM에서 X01 GBM 세포는 대조군 ECM에 도말한 GBM 세포보다 침윤성이 증가한 것을 볼 수 있었다. 따라서, 상기 결과로부터 tMSLCs는 종양 미세 환경에서 세포 외 성분을 생산하여 GBM 세포의 침윤성을 증가시키는 것을 알 수 있다.
GBM 미세 환경에서 HAS2 유도를 통한 tMSLCs의 히알루론산 생산 증가
반정량적 RT-PCR에 의하여, GBM 세포의 진행에 관여하는 ECM 성분의 발현 수준을 확인하였다. X01 GBM 세포와 tMSLCs에서 상기 ECM 성분의 발현량을 비교한 결과, GBM 세포와 비교하여 tMSLCs에서 히알루론산 합성 효소 2(HAS2)와 베르시칸(Versican, VCAN)의 발현량이 매우 높은 것을 확인할 수 있었다(도 5). 이에, 상기 tMSLCs에서 VCAN 또는 HAS2의 양을 대폭 감소시킨 후, GBM 세포와 공동 배양하여, 상기 GBM 세포의 이동 능력을 확인하였다. 상처 치유 분석 결과, 도 6에서 볼 수 있듯이, tMSLCs와 공동 배양한 X01 GBM 세포의 경우 단독으로 배양한 세포 보다 상처 부위를 채우기 위하여 빠르게 이동한 것을 볼 수 있으나, HAS2의 양을 감소시킨 경우 tMSLCs가 GBM 세포의 이동 능력에 영향을 미치지 않는 것을 볼 수 있었다. 마찬가지로, 도 7에서 보는 바와 같이, 트랜스웰에서 GBM 세포를 tMSLCs와 공동 배양하였을 때 세포 이동 능력이 증가하였으나, HAS2에 대한 소간섭 RNA(siRNA)를 형질 주입하자 그 효과가 감소한 것을 볼 수 있었다.
이로부터 tMSLCs가 GBM 세포의 이주능을 증가시킴에 있어 HAS2가 중요한 역할을 하는 것을 알 수 있었다.
한편, HAS2는 히알루론산 합성 반응에 있어서 속도 제한적 효소에 해당하므로, GBM 세포의 이동 능력에 대한 히알루론산의 영향을 평가하였다. 그 결과 도 8에서 보는 바와 같이, 히알루론산은 농도 의존적으로 GBM 세포의 이동 능력을 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 또한, tMSLCs 및 GBM 세포로부터 얻어진 조정 배지(CM) 내 히알루론산의 함량을 분석한 결과, 도 9에서 보는 바와 같이, tMSLCs의 조정 배지 내 히알루론산의 함량이 GBM 세포의 조정 배지 내 히알루론산 함량보다 높을 것을 볼 수 있었다. 하지만, HAS2를 감소시킨 경우, HAS1 또는 HAS3를 감소시킨 경우와는 달리 tMSLCs의 조정 배지 내 히알루론산의 함량이 현저히 감소하였다(도 10). 또한, 도 11에서 보는 바와 같이, tMSLCs와 GBM 세포의 공동 배양 시 HAS2 수준은 증가하였으나, ELISA 분석 결과, 공동 배양 시 히알루론산의 함량 변화는 두드러지지 않았다(도 12).
이로부터 tMSLCs는 GBM 미세 환경에 있어서 HAS2를 통하여 히알루론산 풍부 ECM을 조성하는 것을 알 수 있었다.
자가 분비를 통한 보충 인자 C5a의 HAS2 유도
tMSLCs에서 HAS2를 조절하는 신호 메커니즘을 조사하기 위하여 사이토카인을 분석하였다. 그 결과 도 13에서 보는 바와 같이, tMSLCs와 GBM 세포에서 인터루킨-6(IL-6), 인터루킨-8(IL-8) 및 C5a가 다른 수준으로 발현되는 것을 확인할 수 있었다. 상기 인자들을 siRNA로 감소시킴으로써, tMSLCs에서 C5가 HAS2 유도에 중요한 역할을 하는 것을 알 수 있었다(도 14). 이와 함께, siRNA-중재 C5 감소는 tMSLCs에서 히알루론산의 생성을 감소시키는 것을 볼 수 있었다(도 15). 하지만, IL-6 또는 IL-8의 감소는 어떠한 영향도 미치지 않았다.
또한, C5a 중화 항체를 처리하여 히알루론산 및 HAS2의 수준을 조사하였다. 그 결과, 도 16 및 17에서 보는 바와 같이, C5a에 대한 항체 처리 시 농도 의존적으로 히알루론산 및 HAS2의 발현 수준이 감소하는 것을 볼 수 있었다. tMSLCs에 의해 분비된 C5a는 수용체 C5aR1를 통하여 HAS2 발현을 유도하므로, siRNAs로 C5aR1를 감소시켜, 히알루론산 및 HAS2 발현 수준을 조사하였다. 도 18 및 19에서 보는 바와 같이, tMSLCs에서 C5aR1 넉다운 시 HAS2 및 히알루론산의 수준이 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
하지만, 도 20에서 보는 바와 같이, GBM 세포에 재조합 인간 C5a 단백질 (rh-C5a)을 첨가하여도 HAS2 발현 수준이 증가하지는 않았다. 이로부터 GBM 세포는 C5a에 대한 반응에 있어서 tMSLCs와는 근본적으로 다른 것을 알 수 있었다.
이에, tMSLCs 및 GBM 세포에서 C5aR1의 수준을 확인한 결과, 도 21에서 보는 바와 같이, tMSLCs에서 C5aR1이 높게 발현되었으나, GBM 세포에서는 그 발현 수준이 tMSLCs에서 보다 현저히 낮은 것을 확인할 수 있었다. 이를 통하여 GBM 세포에 재조합 인간 C5a 단백질을 첨가하여도 HAS2 발현 수준에 변화가 없는 이유를 알 수 있었다. 다만, 상기 도 21에서 볼 수 있듯이, tMSLCs을 GBM과 공동 배양하여도, C5aR1 발현 수준이 증가하지 않는 것을 볼 수 있었다.
상기 결과를 고려하여, C5a 중화 항체를 처리하자 tMSLCs의 GBM 세포의 침윤성에 대한 영향이 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인할 수 있었다(도 22 및 23). 따라서, 이러한 결과로부터 C5a는 tMSLCs에서 HAS2-중재 히알루론산 생산에 있어서 C5aR1에 대하여 리간드로서 역할을 수행하는 것을 알 수 있었다.
tMSLCs에서 ERK MAPK를 통한 C5a의 HAS2 유도
tMSLCs에서 C5a에 대응하여 HAS2를 유도하는 신호의 중재 물질을 확인하기 위하여, tMSLCs에서 C5를 넉다운시킨 후, ERK, PI3K, JAK 및 STAT3를 포함하는 신호 물질들의 활성화 상태를 확인하였다. 도 24에서 보는 바와 같이, C5 siRNA를 처리하자 ERK MAPK가 억제되는 것을 확인할 수 있었다. 이와 함께, tMSLCs에서 MEK 억제제 U0126로 ERK 신호를 차단하자, qRT-PCR 결과 HAS2의 전사가 억제되었다(도 24). 하지만, PI3K, JAK 또는 STAT3 억제제를 처리한 경우, HAS2 전사에 아무런 영향을 미치지 않았다. 이와 마찬가지로 도 25에서 보는 바와 같이, ERK의 억제만이 히알루론산 생성을 감소시키는 것을 볼 수 있다.
ERK가 히알루론산 생성에 중요한 역할을 하는 것임을 확인하기 위하여, tMSLCs에 MEK 억제제인 U0126 (0~15 μM)를 다양한 농도로 처리한 후 HAS2 및 히알루론산의 발현 수준을 분석하였다. 상기 결과와 마찬가지로 U0126을 처리하자 농도 의존적으로 HAS2 및 히알루론산의 발현이 감소하는 것을 확인할 수 있었다(도 26 및 27).
또한, C5a를 중화하는 항체를 처리하자 ERK1/2의 인산화를 억제하였으며(도 28), tMSLCs에서 ERK 억제는 공동 배양 시 tMSLCs가 X01 GBM 세포에 미치는 영향을 차단하는 것을 볼 수 있었다(도 29).
상기 결과로부터, C5a는 tMSLCs에서 ERK MAPK 활성화를 통하여 HAS2를 유도함을 알 수 있다.
이상, 본 발명을 상기 실시 예를 중심으로 하여 설명하였으나 이는 예시에 지나지 아니하며, 본 발명은 본 발명의 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명한 다양한 변형 및 균등한 기타의 실시 예를 이하에 첨부한 청구범위 내에서 수행할 수 있다는 사실을 이해하여야 한다.
<110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Yonsei University <120> Method for screening metastasis inhibitor for cancer <130> DPB167251.k01 <150> KR 16/0153553 <151> 2016-11-17 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 578 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Arg Gln Gln Asp Ala Pro Lys Pro Thr Pro Ala Ala Cys Arg Cys 1 5 10 15 Ser Gly Leu Ala Arg Arg Val Leu Thr Ile Ala Phe Ala Leu Leu Ile 20 25 30 Leu Gly Leu Met Thr Trp Ala Tyr Ala Ala Gly Val Pro Leu Ala Ser 35 40 45 Asp Arg Tyr Gly Leu Leu Ala Phe Gly Leu Tyr Gly Ala Phe Leu Ser 50 55 60 Ala His Leu Val Ala Gln Ser Leu Phe Ala Tyr Leu Glu His Arg Arg 65 70 75 80 Val Ala Ala Ala Ala Arg Gly Pro Leu Asp Ala Ala Thr Ala Arg Ser 85 90 95 Val Ala Leu Thr Ile Ser Ala Tyr Gln Glu Asp Pro Ala Tyr Leu Arg 100 105 110 Gln Cys Leu Ala Ser Ala Arg Ala Leu Leu Tyr Pro Arg Ala Arg Leu 115 120 125 Arg Val Leu Met Val Val Asp Gly Asn Arg Ala Glu Asp Leu Tyr Met 130 135 140 Val Asp Met Phe Arg Glu Val Phe Ala Asp Glu Asp Pro Ala Thr Tyr 145 150 155 160 Val Trp Asp Gly Asn Tyr His Gln Pro Trp Glu Pro Ala Ala Ala Gly 165 170 175 Ala Val Gly Ala Gly Ala Tyr Arg Glu Val Glu Ala Glu Asp Pro Gly 180 185 190 Arg Leu Ala Val Glu Ala Leu Val Arg Thr Arg Arg Cys Val Cys Val 195 200 205 Ala Gln Arg Trp Gly Gly Lys Arg Glu Val Met Tyr Thr Ala Phe Lys 210 215 220 Ala Leu Gly Asp Ser Val Asp Tyr Val Gln Val Cys Asp Ser Asp Thr 225 230 235 240 Arg Leu Asp Pro Met Ala Leu Leu Glu Leu Val Arg Val Leu Asp Glu 245 250 255 Asp Pro Arg Val Gly Ala Val Gly Gly Asp Val Arg Ile Leu Asn Pro 260 265 270 Leu Asp Ser Trp Val Ser Phe Leu Ser Ser Leu Arg Tyr Trp Val Ala 275 280 285 Phe Asn Val Glu Arg Ala Cys Gln Ser Tyr Phe His Cys Val Ser Cys 290 295 300 Ile Ser Gly Pro Leu Gly Leu Tyr Arg Asn Asn Leu Leu Gln Gln Phe 305 310 315 320 Leu Glu Ala Trp Tyr Asn Gln Lys Phe Leu Gly Thr His Cys Thr Phe 325 330 335 Gly Asp Asp Arg His Leu Thr Asn Arg Met Leu Ser Met Gly Tyr Ala 340 345 350 Thr Lys Tyr Thr Ser Arg Ser Arg Cys Tyr Ser Glu Thr Pro Ser Ser 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Leu His Leu Leu Ile Gln Ser Leu Phe Ala Phe 50 55 60 Leu Glu His Arg Arg Met Gln Arg Ala Gly Gln Ala Leu Lys Leu Pro 65 70 75 80 Ser Pro Arg Arg Gly Ser Val Ala Leu Cys Ile Ala Ala Tyr Gln Glu 85 90 95 Asp Pro Asp Tyr Leu Arg Lys Cys Leu Arg Ser Ala Gln Arg Ile Ser 100 105 110 Phe Pro Asp Leu Lys Val Val Met Val Val Asp Gly Asn Arg Gln Glu 115 120 125 Asp Ala Tyr Met Leu Asp Ile Phe His Glu Val Leu Gly Gly Thr Glu 130 135 140 Gln Ala Gly Phe Phe Val Trp Arg Ser Asn Phe His Glu Ala Gly Glu 145 150 155 160 Gly Glu Thr Glu Ala Ser Leu Gln Glu Gly Met Asp Arg Val Arg Asp 165 170 175 Val Val Arg Ala Ser Thr Phe Ser Cys Ile Met Gln Lys Trp Gly Gly 180 185 190 Lys Arg Glu Val Met Tyr Thr Ala Phe Lys Ala Leu Gly Asp Ser Val 195 200 205 Asp Tyr Ile Gln Val Cys Asp Ser Asp Thr Val Leu Asp Pro Ala Cys 210 215 220 Thr Ile Glu Met Leu Arg Val Leu Glu Glu Asp Pro Gln Val Gly Gly 225 230 235 240 Val Gly Gly Asp Val Gln Ile Leu Asn Lys Tyr Asp Ser Trp Ile Ser 245 250 255 Phe Leu Ser Ser Val Arg Tyr Trp Met Ala Phe Asn Val Glu Arg Ala 260 265 270 Cys Gln Ser Tyr Phe Gly Cys Val Gln Cys Ile Ser Gly Pro Leu Gly 275 280 285 Met Tyr Arg Asn Ser Leu Leu Gln Gln Phe Leu Glu Asp Trp Tyr His 290 295 300 Gln Lys Phe Leu Gly Ser Lys Cys Ser Phe Gly Asp Asp Arg His Leu 305 310 315 320 Thr Asn Arg Val Leu Ser Leu Gly Tyr Arg Thr Lys Tyr Thr Ala Arg 325 330 335 Ser Lys Cys Leu Thr Glu Thr Pro Thr Lys Tyr Leu Arg Trp Leu Asn 340 345 350 Gln Gln Thr Arg Trp Ser Lys Ser Tyr Phe Arg Glu Trp Leu Tyr Asn 355 360 365 Ser Leu Trp Phe His Lys His His Leu Trp Met Thr Tyr Glu Ser Val 370 375 380 Val Thr Gly Phe Phe Pro Phe Phe Leu Ile Ala Thr Val Ile Gln Leu 385 390 395 400 Phe Tyr Arg Gly Arg Ile Trp Asn Ile Leu Leu Phe Leu Leu Thr Val 405 410 415 Gln Leu Val Gly Ile Ile Lys Ala Thr Tyr Ala Cys Phe Leu Arg Gly 420 425 430 Asn Ala Glu Met Ile Phe Met Ser Leu Tyr Ser Leu Leu Tyr Met Ser 435 440 445 Ser Leu Leu Pro Ala Lys Ile Phe Ala Ile Ala Thr Ile Asn Lys Ser 450 455 460 Gly Trp Gly Thr Ser Gly Arg Lys 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Claims (13)

  1. (a) 뇌암 환자로부터 암-간엽 줄기 유사 세포를 분리하는 단계;
    (b) 분리된 암-간엽 줄기 유사 세포에 약물을 처리하는 단계;
    (c) 상기 약물이 처리된 암-간엽 줄기 유사 세포의 히알루론산 합성 효소 2(Hyaluronic acid synthase 2, HAS2) 또는 이를 코딩하는 mRNA의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
    (d) 상기 암-간엽 줄기 유사 세포의 히알루론산 합성 효소 2의 발현 수준이 약물 처리 전에 비하여 감소된 경우, 상기 약물을 뇌암 전이 억제제 후보물질로 판단하는 단계를 포함하는 뇌암 전이 억제제의 스크리닝 방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서,
    상기 히알루론산 합성 효소 2의 발현 수준은 방사능 면역 분석, 방사능 면역 침전, 면역 침전, ELISA(enzyme-linked immunosorbentassay), 캡처-ELISA, 억제 또는 경쟁 분석, 및 샌드위치 분석으로 이루어진 군에서 선택되는 면역 분석 방법으로 측정되는, 뇌암 전이 억제제의 스크리닝 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 히알루론산 합성 효소 2를 코딩하는 mRNA의 발현 수준은 중합효소연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection assay; RPA), 마이크로어레이(microarray), 및 노던 블롯팅(northern blotting)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법으로 측정되는, 뇌암 전이 억제제의 스크리닝 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 (b) 단계에서 약물 처리 시 항암제를 추가로 처리하는, 뇌암 전이 억제제의 스크리닝 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 항암제는 나이트로젠 머스타드, 이마티닙, 옥살리플라틴, 리툭시맙, 엘로티닙, 네라티닙, 라파티닙, 제피티닙, 반데타닙, 니로티닙, 세마사닙, 보수티닙, 악시티닙, 세디라닙, 레스타우르티닙, 트라스투주맙, 게피티니브, 보르테조밉, 수니티닙, 카보플라틴, 베바시주맙, 시스플라틴, 세툭시맙, 비스쿰알붐, 아스파라기나제, 트레티노인, 하이드록시카바마이드, 다사티닙, 에스트라머스틴, 겜투주맵오조가마이신, 이브리투모맙튜세탄, 헵타플라틴, 메칠아미노레불린산, 암사크린, 알렘투주맙, 프로카르바진, 알프로스타딜, 질산홀뮴 키토산, 젬시타빈, 독시플루리딘, 페메트렉세드, 테가푸르, 카페시타빈, 기메라신, 오테라실, 아자시티딘, 메토트렉세이트, 우라실, 시타라빈, 플루오로우라실, 플루다가빈, 에노시타빈, 플루타미드, 데시타빈, 머캅토푸린, 티오구아닌, 클라드리빈, 카르모퍼, 랄티트렉세드, 도세탁셀, 파클리탁셀, 이리노테칸, 벨로테칸, 토포테칸, 비노렐빈, 에토포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 테니포시드, 독소루비신, 이다루비신, 에피루비신, 미톡산트론, 미토마이신, 블레로마이신, 다우노루비신, 닥티노마이신, 피라루비신, 아클라루비신, 페프로마이신, 템시롤리무스, 테모졸로마이드, 부설판, 이포스파미드, 사이클로포스파미드, 멜파란, 알트레트민, 다카바진, 치오테파, 니무스틴, 클로람부실, 미토락톨, 레우코보린, 트레토닌, 엑스메스탄, 아미노글루테시미드, 아나그렐리드, 나벨빈, 파드라졸, 타목시펜, 토레미펜, 테스토락톤, 아나스트로졸, 레트로졸, 보로졸, 비칼루타미드, 로무스틴 및 카르무스틴으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 뇌암 전이 억제제의 스크리닝 방법.
  9. (1) 뇌암 환자로부터 암-간엽 줄기 유사 세포를 분리하는 단계;
    (2) 분리된 암-간엽 줄기 유사 세포의 히알루론산 합성 효소 2(Hyaluronic acid synthase 2, HAS 2)와, 히알루론산 합성 효소 1(Hyaluronic acid synthase 1, HAS 1) 및 히알루론산 합성 효소 3(Hyaluronic acid synthase 3, HAS 3) 중 적어도 하나의 단백질 또는 이를 코딩하는 mRNA의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
    (3) 상기 암-간엽 줄기 유사 세포의 히알루론산 합성 효소 2 또는 이를 코딩하는 mRNA의 발현 수준이 상기 히알루론산 합성 효소 1 및 상기 히알루론산 합성 효소 3 중 적어도 하나의 단백질 또는 이를 코딩하는 mRNA의 발현 수준보다 높은 경우, 뇌암의 전이 가능성이 높은 것으로 판단하는 단계를 포함하는, 뇌암의 전이 가능성 예측에 대한 정보 제공 방법.
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 제9항에 있어서,
    상기 히알루론산 합성 효소 1, 상기 히알루론산 합성 효소 2 또는 상기 히알루론산 합성 효소 3의 발현 수준은 방사능 면역 분석, 방사능 면역 침전, 면역 침전, ELISA(enzyme-linked immunosorbentassay), 캡처-ELISA, 억제 또는 경쟁 분석, 및 샌드위치 분석으로 이루어진 군에서 선택되는 면역 분석 방법으로 측정되는, 뇌암의 전이 가능성 예측에 대한 정보 제공 방법.
  13. 제9항에 있어서,
    상기 히알루론산 합성 효소 1, 상기 히알루론산 합성 효소 2 또는 상기 히알루론산 합성 효소 3를 코딩하는 mRNA의 발현 수준은 중합효소연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection assay; RPA), 마이크로어레이(microarray), 및 노던 블롯팅(northern blotting)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법으로 측정되는, 뇌암의 전이 가능성 예측에 대한 정보 제공 방법.
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