KR102002094B1

KR102002094B1 - 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) G-0299 균주 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102002094B1
Application number: KR1020170134577A
Authority: KR
Inventors: 최정섭; 고영관; 김영숙; 김재덕; 김혜진
Original assignee: 한국화학연구원
Priority date: 2017-10-17
Filing date: 2017-10-17
Publication date: 2019-07-19
Also published as: KR20190042920A

Abstract

본 발명은 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) G-0299 균주 또는 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로 본 발명의 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) G-0299 균주 또는 이의 배양액은 바랭이에 제초 활성을 나타내므로, 바랭이 방제용 제초제 조성물 및 바랭이 방제 방법에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) G-0299 균주 및 이의 용도{Streptomyces sp. G-0299 strain and use thereof}

본 발명은 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) G-0299 균주 및 이의 용도에 관한 것이다.

잡초 혹은 잡풀은 절대적인 것이 아니고 상대적인 개념으로 인간이 농경생활을 시작하면서 발생한 것으로 때와 장소에 적절하지 않은 식물을 말한다. 잡초는 작물재배에서 광, 양분, 수분 등의 경합 및 탈취하여 생산성과 상품성을 크게 저하시키거나 병해충의 매개, 농작업을 곤란하게 하는 주요 방제 대상이다. 잡초는 장소, 계절, 환경 등에 상관없이 연중 발생하며, 방제에 많은 노력과 비용이 소요된다. 또한, 잡초는 많은 종류가 있고 다양하기 때문에 식물분류학적 분류, 형태학적 분류에 따라 화본과 잡초, 광엽 잡초 및 방동사니과 잡초로 구분하며, 생활형에 따라 일년생잡초, 월년생잡초 및 다년생잡초로 나누고 있다. 그러므로 일반적으로 잡초는 화본과 일년생잡초·다년생잡초, 광엽 일년생잡초·다년생잡초 그리고 방동사니과 일년생잡초·다년생잡초 등으로 분류하거나, 반대로 일년생 화본과 잡초, 광엽 잡초, 방동사니과 잡초 또는 다년생 화본과 잡초, 광엽 잡초, 방동사니과 잡초로 구분한다.

화본과(grasses) 잡초의 줄기에는 잘 구분될 수 있는 마디와 마디 사이가 있고, 잎은 마디로부터 어긋나기로 나있으며 잎은 줄기를 둘러싸서 보호하는 잎집(leaf sheath)과 잎몸(leaf blade)으로 나누어지는데 잎몸은 좁고 기다란 모양으로 잎맥(leaf vein)이 평행하게 형성된 것이 특징이다. 피, 바랭이, 뚝새풀, 강아지풀, 갈대, 억새 등이 이에 속한다. 방동사니과(sedges)에 속하는 잡초들은 화본과와 비슷한 점이 있으나 대부분 줄기 횡단면이 삼각형 모양이며 잎혀나 잎귀가 없다는 점으로 구분이 된다. 잎은 좁고 능선이 있으며 끝이 뾰족하고 소수에 작은 꽃이 달린다. 방동사니, 너도방동사니, 올방개, 매자기, 올챙이고랭이 등이 속한다. 광엽(broad leaves) 잡초란 화본과 잡초나 방동사니과 잡초에 속하지 않는 식물로서 말 그대로 잎이 비교적 넓은 잡초이다. 잎은 주로 타원형, 난형, 피침형이며 엽맥이 그물처럼 얽혀 있는 것이 특징이다. 우리 주변에서 흔히 발생하는 망초, 토끼풀, 쑥, 냉이, 비름, 물달개비, 가래, 가막사리 등 많은 잡초가 이 범주에 속한다.

현재 잡초방제를 위하여 저렴한 비용으로 높은 제초 활성을 나타내는 여러 가지 유기합성 제초제를 사용하고 있으나, 저항성 잡초 출현, 환경에 대한 유해성 및 잔류 독성이 문제로 지적되고 있다. 특히 유기합성 제초제의 장기 사용으로 인한 저항성 잡초의 출현은 심각한 사회경제적 문제로까지 인식되고 있다(Riches 등 1996). 그러나 우수한 방제효과를 나타내는 벤조비사이클론(benzobicyclon)과 메조트리온(mesotrione), 테푸릴트리온(tefuryltrione) 등과 같은 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase(DPPH) 저해제가 개발된 이후 새로운 작용점을 갖는 제초제의 개발 성과가 없는 실정이다(Prisbylla 등 1993; Schultz등 1993). 따라서 새로운 구조의 신규 작용점을 갖는 합성 제초제에 대한 개발이 요구되고 있지만, 합성 제초제가 환경이나 생태계에 미치는 영향이 심각한 수준은 아님에도 불구하고, 소득 향상과 삶의 질을 중시하는 풍토가 조성되면서 친환경 농업에 대한 관심이 높아지고 화학농약의 사용을 저감시키려는 각국의 강력한 규제 때문에 유기합성 제초제 개발 여건은 녹록하지 않은 것이 현실이다.

바랭이(Digitaria sanguinalis (L.) Scop.)는 밭, 밭둑, 과원, 도로변 및 공한지에 발생하는 대표적인 밭잡초로서 여름 밭작물 재배포장에서 가장 문제되는 잡초중의 하나로 일년생 화본과 잡초이다. 이른 봄, 기온이 13℃ 경에 발생하기 시작하여 15 내지 20℃ 조건에서도 발생하며, 7 내지 8월에도 발생하는 등 발생기간이 긴 잡초이다. 본엽이 4 내지 5매 일 때 분얼을 시작하며, 작물과의 경합이 없는 조건에서 포복형으로 생육하며 지면으로 퍼지면서 마디에서 뿌리가 나오고 방치하면 커다란 포기가 형성된다. 작물과 경합하면 직립형으로 생육하고 작물의 윗부분까지 신장한다. 또한, 이른 봄에 출아한 것은 3 내지 4개월 후에는 성숙하고 1주당 50,000립 이상의 종자를 생산하며, 늦은 여름에 출아한 것은 1 내지 2개월 후에 성숙하나 생육량과 종자형성량은 적으며, 종자는 휴면성이 있어, 겨울기간의 저온 습윤조건에서 타파되어 이듬해 봄에 발아한다. 출아 심도는 0 내지 2 cm로 낮으며, 종자의 수명은 토양 중에서는 2 내지 3년으로 비교적 짧은 잡초이다.

이에, 본 발명자들은 새로운 개념의 제초제로 친환경적인 천연물 유래 제초제를 찾고자 노력하던 중 신규한 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) G-0299 균주를 발견하고, 상기 균주 및 이의 배양액이 바랭이에 특이적으로 살초 활성을 나타냄을 확인, 상기 균주를 천연물 유래 바랭이 제초 방제제로 유용하게 사용할 수 있음을 확임으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) G-0299 균주를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 균주 및 이의 배양액을 이용한 제초제 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 균주 및 이의 배양액을 이용한 바랭이 방제 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 기탁번호 KCTC 13358BP로 기탁된 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) G-0299 균주를 제공한다.

또한, 본 발명은 기탁번호 KCTC 13358BP로 기탁된 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) G-0299 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 제초제 조성물을 제공한다.

아울러, 본 발명은 기탁번호 KCTC 13358BP로 기탁된 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) G-0299 균주 또는 이의 배양액을 바랭이, 바랭이의 종자 또는 이의 서식지에 처리하는 단계를 포함하는 바랭이 방제 방법을 제공한다.

본 발명의 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) G-0299 균주 또는 이의 배양액은 바랭이에 제초 활성을 나타내므로, 바랭이 방제용 제초제 조성물 및 바랭이 방제 방법에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 화본과잡초 5종 및 광엽잡초 5종에 대한 G-0299 균주 배양액의 살초력을 나타낸 것이다.
도 2는 바랭이에 대한 G-0299 균주 배양액의 살초력을 나타낸 것으로, 도 2의 (A)는 G-0299 균주 배양액 처리 5일 후, (B)는 G-0299 균주 배양액 처리 10일 후의 결과이다.
도 3은 광조건과 암조건에서 바랭이에 대한 G-0299 균주 배양액의 살초력을 나타낸 것이다.
도 4는 광조건과 암조건에서 G-0299 균주 배양액 처리 시, 엽 디스크 어세이(leaf disc assay)를 통해 측정한 바랭이 엽 절편의 엽색 변화를 나타낸 것이다.
도 5는 광조건과 암조건에서 G-0299 균주 배양액 처리 시, 바랭이 엽 절편의 엽록소 손실 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 G-0299 균주의 16S rRNA 염기서열 정보를 바탕으로 실시한 계통수 (phylogenetic tree) 분석 결과를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 기탁번호 KCTC 13358BP로 기탁된 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) G-0299 균주를 제공한다.

상기 균주는 16S rRNA가 서열번호 1의 염기서열로 구성된 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명에 따른 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) G-0299 균주(이하, G-0299 균주로 기재함)는 한국화학연구원에서 충청남도 대천 부근의 산림 토양으로부터 분리 및 배양을 통해 확보하여 -70℃ 초저온 냉장고(deep freezer)에 동결건조하여 보존하고 있는 균주를 분양받아 사용하였다.

상기 G-0299 균주는 16S rRNA 유전자 상동 검색에서, 스트렙토마이세스 속 CAI87(Streptomyces sp. CAI87)과 99%의 상동성을 나타내는 신규한 균주로 확인되었는 바, 상기 G-0299 균주는 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.)으로 분류되었다(도 6 참조).

본 발명자들은 상기 신규한 균주를 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) G-0299로 명명하고, 생물자원센터(Korea Collection for Type Cultures, KCTC)에 2017년 9월 29일자로 기탁하여 수탁번호 KCTC 13358BP를 부여받았다.

상기 균주 또는 이의 배양액은 바랭이(Digitaria sanguinalis)에 제초 활성을 나타낼 수 있다.

상기 균주 또는 이의 배양액은 바랭이에 광의존적 제초 활성을 나타낼 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 본 발명의 G-0299 균주의 배양액을 5종의 광엽잡초(까마중, 자귀풀, 어저귀, 도꼬마리, 메꽃)과 5종의 화본과 잡초(수수, 돌피, 개밀, 미국개기장, 바랭이)에 경엽 처리한 결과, 바랭이에 대해서만 24시간 이내에 외형적인 증상이 발현되기 시작하는 속효성의 특성을 보이며 제초력을 발휘하였다. 또한, 처리 10일 후 바랭이는 완전 고사(desiccation or leaf burn-down)되었으며, 완전 고사되지 않은 일부 개체에서는 백화증상(bleaching)이 발현됨을 확인하였다(도 1, 표 1 참조).

또한, 본 발명자들은 본 발명의 G-0299 균주 배양액을 바랭이에 처리한 후 바로 광조건에 둘 경우 3일 이후 완전 고사되나, 처리 후 암조건에 둘 경우 반응이 나타나지 않음을 확인하여, G-0299 균주 배양액은 광의존적 제초 활성을 나타냄을 확인하였다. 또한 처리 후 암조건에 있던 바랭이를 광조건으로 전환하면 약효가 바로 발현되어 광조사 1일 이후에 완전 고사됨을 확인하였다(도 3 참조). 또한, G-0299 균주 배양액 처리 후 각각 광조건과 암조건에서 48시간 경과 후 육안으로 관찰하였을 때, 암조건에서의 바랭이 엽 절편은 엽색 변화가 없었으나, 광조건에서는 바랭이 엽색이 백화되거나 갈변된 것을 확인할 수 있었다(도 4 참조). 엽록소 함량 결과에서도 광조건의 경우 무처리 대비 82% 감소되었으나 암조건에서는 거의 영향이 없는 것으로 나타났다(도 5 참조).

따라서, 본 발명의 기탁번호 KCTC 13358BP로 기탁된 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) G-0299 균주 또는 이의 배양액은 바랭이에 대하여 유의적인 제초력을 나타내므로, 제초제 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.

상기 제초제 조성물은 담체 및/또는 희석제를 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어, '담체'는 처리되어야 할 식물 또는 다른 대상체를 대상으로 이의 적용, 또는 이의 저장, 수송 및/또는 취급이 편리하도록 혼합되거나 만들어진 활성 성분을 갖는, 비활성의, 유기 또는 무기 물질을 의미한다. 상기 희석제 또는 담체의 예로는 물, 우유, 에탄올, 광유, 글리세롤을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

또한, 본 발명은 기탁번호 KCTC 13358BP로 기탁된 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) G-0299 균주 또는 이의 배양액을 바랭이, 바랭이의 종자 또는 이의 서식지에 처리하는 단계를 포함하는 바랭이 방제 방법을 제공한다.

상기 처리는 경엽처리하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명자들은 상기 G-0299 균주의 배양액을 바랭이의 줄기와 잎에 직접 살포하는 경엽처리한 결과, 바랭이에 대하여 우수한 살초력이 있음을 확인하였다.

상기 바랭이 방제 방법은 바랭이, 바랭이의 종자 또는 이의 서식지에 광조사하는 단계를 더 포함할 수 있다.

본 발명자들은 G-0299 균주 배양액은 바랭이에 대하여 암조건에서는 제초 활성이 발현되지 않고, 광조건에서는 제초 활성이 발현되는 광의존적 제초 활성을 나타내는 것을 확인하였다(도 3 내지 5 참조).

따라서, 상기 G-0299 균주 또는 이의 배양액을 바랭이, 바랭이 종자 또는 이의 서식지에 광조건 하에서 처리하거나, 상기 G-0299 균주 또는 이의 배양액을 바랭이, 바랭이 종자 또는 이의 서식지에 처리한 후에 광을 조사하여 바랭이 제초 효과를 얻을 수 있다.

상기 처리는 처리 면적 1 cm² 당 30 내지 60 ㎍ 처리하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 범위 미만으로 처리할 경우, 바랭이 제초 활성이 약하게 나타나거나 또는 제초 활성이 나타나지 않을 수 있고, 시간이 경과함에 따라 재생되는 개체가 발생할 수 있다. 상기 범위를 초과하여 처리할 경우, 바랭이 방제 효과가 더 이상 증가하지 않아 G-0299 균주 처리의 효율성이 감소할 수 있다.

본 발명자들은 표면적 38.5 cm² 포트에 생육시킨 바랭이에 상기 G-0299 균주의 배양액을 각각 2,000, 1,000, 500, 250, 125, 및 62.5 ㎍/mL 농도로 5 mL 처리한 결과, 5일 이후 250 ㎍/mL 이상의 농도에서 98% 이상의 살초력, 10일 이후 95% 이상의 살초력을 확인하였다. 125 ㎍/mL 처리농도 이하에서는 10일 이후에는 일부 재생되는 개체가 확인되었다(표 2 참조).

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 스트렙토마이세스 속 G-0299의 분리 및 배양액 제조

G-0299 균주는 충청남도 대천 부근의 산림 토양으로부터 HV한천(humic acid-vitamin agar, pH 7.0) 배지를 사용하여 분리하였으며, 베넷한천(Bennett's agar) 플레이트에 계대배양하여 순수 분리하였다. 활성배지로 GSS 액체배지를 사용하였으며 27℃, 160 rpm으로 7일간 진탕 배양한 후, 이를 원심분리(8,000 rpm, 15분)하여 균체를 제거하고, 감압농축(EYELA, N-1200A)하였다. 이를 제초활성 평가를 위한 시료로 사용하였다.

(HV한천 배지 조성: 0.2N 염화나트륨에 용해된 0.1% 휴민산(humic acid), 0.05% 제2인산나트륨(Na₂HPO₄), 0.171% 염화칼륨, 0.005% 황산마그네슘, 0.001% 황산제일철·7수화물(FeSO₄·7H₂O), 0.002% 탄산칼슘, 비타킨 B 복합체 미량(vitamin B complex trace) 및 50 ppm 시클로헥사미드(cycloheximide);

베넷한천 배지 조성: 1% 글루코스, 0.1% 효모 추출물(yeast extract), 0.2% 박토-펩톤(bacto-peptone), 0.1% 육추출물(beef extract), 2% 한천 및 1L 증류수;

GSS 배지 조성: 1% 가용성 전분(soluble starch), 2% 글루코스, 2.5% 대두박(soybean meal), 0.1% 육추출물(beef extract), 0.4% 효모 추출물(yeast extract), 0.2% 염화나트륨, 0.025% 제2인산칼륨(K₂HPO₄) 및 0.2% 탄산칼슘.)

< 실시예 2> 경엽처리 제초 활성 평가

경엽처리 살초력 평가는 바랭이를 포함한 화본과잡초 5종 및 까마중을 포함한 광엽잡초 5종, 총 10종의 잡초를 대상으로 실시하였다. 저온건조 상태로 보관 중인 종자를 파종하여 온실조건에서 10일 동안 생육시킨 식물체를 사용하였다. 실시예 1에서 얻은 배양액을 소량의 아세톤으로 용해시킨 후, 약제 조제액(50% 아세톤, Tween-20 0.1% 포함)으로 최종 처리농도가 2,000 ㎍/mL이 되도록 희석조제하였다. 이를 식물체에 14 mL를 경엽처리하였고, 동일한 온실조건에서 관리하다가 처리 10일 후에 외형적인 증상을 기준으로 달관조사(0; 효과 없음, 100; 완전고사)하였다.

G-0299 균주의 배양액 2,000 ㎍/mL처리농도에서 10종의 잡초에 대한 제초 활성 여부를 평가했을 때, 광엽잡초 5종에 대한 제초 활성은 관찰되지 않았고. 5종의 화본과잡초 중에서도 바랭이에 대해서만 살초력이 발현되는 독특한 특성이 관찰되었다(표 1, 도 1).

잡초 종류	제초 활성 (%)
수수 (Sorghum bicolor)	0
돌피 (Echinochloa crus - galli)	0
개밀 (Elymus tsukushiensis var. transiens)	0
바랭이 (Digitaria sanguinalis)	100
미국개기장 (Panicum dichotomiflorum)	0
까마중 (Solanum nigrum)	0
자귀풀 (Aeschynomene indica)	0
어저귀 (Abutilon avicennae)	0
도꼬마리 (Xanthium strumarium)	0
메꽃 (Calystegia sepium var. japonicum)	0

바랭이에 대해서는 처리 24시간 이내에 외형적인 증상이 발현되기 시작하여, 속효성의 특성을 보였으며, 주요 살초증상으로는 처리 초기에 수침상이 발현되다가 시간이 경과함에 따라 완전 고사(desiccation or leaf burn-down)되었고, 완전 고사되지 않은 일부 개체에서는 백화증상(bleaching)이 발현되었다.

< 실시예 3> 바랭이에 대한 살초력 평가

표면적 38.5 cm² 포트에 파종하여 온실조건(주·야간의 평균온도 30/25±5℃, 그리고 광주기 light/dark=14/10 h)에서 10일 동안 생육시킨 바랭이를 대상으로 2,000 ㎍/mL농도부터 1/2로 희석하여 31.3 ㎍/mL 농도까지 7단계 처리하였다. 실시예 1에서 얻은 배양액을 약제 조제액(50% 아세톤, Tween-20 0.1% 포함)으로 최종 처리농도가 되도록 희석 조제하였다. 이를 식물체에 5 mL를 경엽처리하였고, 동일한 온실조건에서 관리하다가 처리 5일 및 10일 후에 달관조사(0; 효과 없음, 100; 완전고사)하였다.

배양액 처리 5일 후 2,000, 1,000, 500, 250, 125 및 62.5 ㎍/mL 농도에서의 바랭이에 대한 살초력은 각각 100, 100, 100, 98, 70 및 40%로 아주 우수하였다(표 2). 또한, 10일 후에도 동일한 처리농도에서 각각 100, 100, 98, 95, 60 및 40%로 처리시간이 경과함에도 여전히 우수한 살초력을 유지하고 있었다(도 2A 및 도 2B). 다만, 125 ㎍/mL 처리농도 이하에서는 10일 이후에는 일부 재생되는 개체가 확인되었다. 바랭이에 대해서 농도의존적으로 살초력을 발휘하는 상기 결과로부터 G-0299 균주는 바랭이에 대해서만 특이적으로 살초력을 발현하는 2차 대사물질을 생산하는 것으로 판단하였다.

	G-0299 균주 배양액 (㎍/mL)
	2,000	1,000	500	250	125	62.5
처리 5일 후	100	100	100	98	70	40
처리 10일 후	100	100	98	95	60	40

< 실시예 4> 다양한 화본과잡초에 대한 제초 활성 평가

표면적 350 cm² 포트에 원예용상토를 충진한 후, 8종의 화본과잡초(새포아풀, 카나리그래스, 강아지풀, 금강아지풀, 호밀풀, 왕바랭이, 존슨그래스 및 바랭이)를 파종하여 온실조건에서 관리하였다. 파종 21일 후에 실시예 1에서 얻은 배양액을 최종처리 농도가 2,000, 1,000, 500 및 250 ㎍/mL가 되도록 희석조제하였다(Tween-20, 0.1%). 포트 당 14 mL 양으로 처리 후 동일한 온실조건에서 관리하였다. 처리 7일 후에 살초력을 육안으로 달관조사하였다.

G-0299 균주는 8종의 시험대상 화본과잡초 중에 다른 잡초에 대해서는 살초 효과를 나타내지 않았고, 바랭에 대해서만 살초효과를 나타내었다. 처리 7일 후 배양액 2,000, 1,000 및 500 ㎍/mL 처리농도에서의 바랭이에 대한 살초력은 모두 100%이었고, 250 ㎍/mL처리농도에서는 80%이었다(표 3). 그러나 바랭이 외 8종의 화본과잡초에 대해서는 제초활성이 없었으며, 처리 4주 후까지도 반응이 없었다. 또한, 화본과잡초 이외 금방동사니와 같은 사초과 잡초에 대해서도 살초력이 발현되지 않았다(자료 미제시). 이와 같은 G-0299 균주의 살초특성은 매우 특이한 현상으로서 기존 개발된 제초제와는 뚜렷한 차별성을 갖는 작용 메커니즘일 것으로 판단되었다.

	G-0299 균주 배양액 (㎍/mL)
	2,000	1,000	500	250
새포아풀(Poa annua)	0	0	0	0
바랭이 (Digitaria sanguinalis)	100	100	100	80
카나리그래스 (Phalaris canariensis)	0	0	0	0
강아지풀 (Setaria viridis)	0	0	0	0
금강아지풀 (Setaria glauca)	0	0	0	0
호밀풀 (Lolium perenne)	0	0	0	0
왕바랭이 (Eleusine indica)	0	0	0	0
존슨그래스 (Sorghum halepense)	0	0	0	0

< 실시예 5> 광조건에 따른 제초 활성 반응 평가

표면적 38.5 cm² 포트에 파종하여 온실에서 생육시킨 바랭이에 실시예 1에서 얻은 배양액을 2,000 ㎍/mL농도로 조제하여 한 포트당 3 mL 씩 처리하였다. 처리한 후, 0, 1, 2, 3, 4일 동안 암조건(25℃)으로 두었다가 각각을 온실조건으로 전환하여 8일 후에 살초력 정도를 육안으로 관찰하였다.

실시예 1에서 얻은 배양액을 바랭이에 처리했을 때, 암조건에서는 살초력이 발현되지 않다가 광조건으로 전환된 이후에 살초력이 발현되었다. 이로부터 G-0299 균주 배양액의 살초력은 광의존적으로 나타남을 확인할 수 있었다(도 3).

G-0299 균주 배양액을 바랭이에 처리 후 바로 광조건에 둘 경우에는 서서히 약효가 발현되기 시작, 지속적으로 살초력이 증가하여 3일 이후에 완전 고사되었다. 그러나 처리 후 1~4일 동안 암조건에 둘 경우에는 반응이 나타나지 않았으며, 광조건으로 전환하면 곧바로 약효가 발현되어 광조사 1일 이후에 완전 고사되었다. 이러한 현상은 살초력을 발휘하는 유효성분이 암상태에서 충분하게 식물체 내로 흡수되었다가 광이 조사되면 즉시 약효가 발현되기 때문으로 판단되었다. 이상의 결과로부터 G-0299 균주 배양액은 암조건에서는 약효가 발현되지 않고, 광조건에서만 살초력이 발현되는 전형적인 광의존적 제초활성을 나타내는 것을 확인하였다.

< 실시예 6> 광조건에 따른 엽록소 함량에 미치는 영향 평가

온실조건에서 생육시킨 바랭이 제 2엽을 절취하여 3 mm² 내외의 엽 절편을 만들었다. 1%의 수크로스(sucrose)를 포함하는 1 mM MES 버퍼(pH 6.8) 7 mL가 담긴 페트리 디쉬에 엽 절편 0.2 g씩 치상 한 후, 최종 처리농도를 2,000 ㎍/mL가 되도록 실시예 1의 배양액을 처리하였다. 처리 후 광조건(25℃, 120 μmol m^-2sec^- ¹)과 암조건(25℃, dark alone)으로 구분하여 관리하다가 48시간 후에 히스콕스(Hiscox)와 이스라엘스탐(Israelstam)의 방법(Hiscox and Israelstam, 1979)을 이용하여 엽록소 함량을 측정하였다. 페트리 디쉬에 있는 엽 절편을 배양액과 분리하여 여과지로 흡습시켜 시험관에 넣고 10 mL의 다이메틸술폭시드(DMSO, dimethyl sulfoxide)를 넣은 다음, 암조건으로 실온에 24시간 동안 두었다. 이때 엽절편의 엽록소는 완전히 추출되었으며, 흡광분광분석기(Beckman, UV-52)를 이용하여 645 nm와 663 nm에서 흡광도를 측정하였다.

총 엽록소의 양은 다음의 식으로 계산하였다.

엽록소(mg/L) = (20.2 × A₆₄₅ + 8.02 × A₆₆₃) × 희석배수

그 결과, G-0299 균주 배양액 처리 후 광 또는 암조건에서 48시간 경과한 후 육안으로 관찰했을 때, 암조건에서 바랭이 엽 절편의 엽색 변화는 없었으나(도 4A), 광조건에서는 바랭이 엽색이 변해서 백화되거나 갈변된 모습을 확인할 수 있었다(도 4B). 기기분석을 통해 실제로 엽록소 함량을 측정했을 때 광조건에서는 무처리 대비 82% 감소되었으나 암조건에서는 거의 영향이 없는 것으로 나타났다(도 5). 따라서 G-0299 균주 배양액의 살초효과는 반드시 광조건 하에서만 발현된다는 사실을 다시 한번 확인할 수 있었으며, 엽색 백화 또는 갈변 현상으로부터 세포막 파괴를 유도할 가능성이 있을 것으로 판단되었다.

이상의 실시예를 통해, G-0299 균주 또는 이의 배양액은 바랭이에 대해서만 강력한 살초력을 갖고 있으며(표 1, 2 및 도 1, 2), 이와 같은 바랭이에서의 살초력은 광조건하에서만 발현되는 독특한 살초특성을 확인할 수 있었다(도 3 내지 도 5). 또한, 광조건에서 경엽처리 시 24시간 이내에 외형적인 살초증상이 발현되는 현상으로부터 약효발현 속도가 매우 빠른 속효성이었으며, 주요 살초증상은 처리된 잎에서 고사가 진행되었고, 이후 완전고사 되지 않고 남아 있는 개체에서는 백화현상이 발현되었다(도 1).

상기와 같은 바랭이 특이적이고 광의존적인 방제 특성을 보이고 있는 G-0299 균주의 작용기전에 관해 화본과 선택 제초제인 지방산 생합성을 저해하는 ACCase 저해제(Lichtenthaler et al., 1989; Secor et al., 1989)와의 유사성을 고려해 볼 수 있을 것이다. 그러나 본 발명에서 발굴한 G-0299 균주의 경우 화본과 잡초 중에서도 바랭이에 대해서만 살초력을 발휘하고 있기 때문에(표 3) ACCase 저해제의 작용기전과는 다를 것으로 판단되었다. 또한, 약효발현 속도가 매우 빠를 뿐만 아니라 주요 살초증상이 고사나 백화증상이며, 광조건에서만 제초활성이 나타나고 엽록소 생합성이 저해된다고 하는 결과로부터 광합성 저해제(Wessels and van der Veen, 1956; Itoh and Iwaki, 1989) 또는 프로톡스(protox) 저해제(Derrick et al., 1988)와 동일한 작용기전을 유추해 볼 수 있을 것이다. 그런데 상기 두 유형의 제초제 살초특성은 화본과잡초에 비해 상대적으로 광엽잡초에 대한 효과가 우수하며, 처리된 부위에서만 증상이 나타나는 접촉형으로 식물체 내에서의 이행이 상당히 제한적이라서 약제처리 후 일정기간이 경과하면 재생(recovery)이 되는 특성이 있다(Herbicide handbook, 1994). 이에 반해 G-0299 균주의 경우 화본과잡초 중에서 바랭이에서만 살초력이 발현되고 있으며, 약제처리 후 완전 방제되는 처리농도에서는 일정기간 후에도 재생되지 않는 등의 살초특성을 고려하면 상기 두 유형의 제초제와도 다른 작용기전을 발휘할 가능성이 높을 것으로 사료된다. 또한, Choi et al. (1999)에 의하면 화본과 작물인 보리와 밀 간에도 디페닐 에테르계 제초제 옥시플루오르펜(oxyfluorfen)에 대한 감수성 정도의 차이가 있다고 보고하고 있어 화본과잡초 중에서 바랭이에 대해서만 제초활성을 보이고 있는 본 발명의 G-0299 균주는 프로톡스 저해제와의 작용기전 상관성을 설명하기는 곤란한 것으로 판단되었다. 따라서 본 발명에서 발굴한 제초활성을 나타내는 G-0299 균주의 보다 상세한 살초기전에 관해서는 추가 연구를 통해 구명되어야 할 것이다.

한국생명공학연구원

KCTC13358BP

20170929

<110> Korea Research Institute Of Chemical Technology <120> Streptomyces sp. G-0299 strain and use thereof <130> 2017P-09-032 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1489 <212> DNA <213> Streptomyces sp. <400> 1 acacaggctc aggacgaacg ctggcggcgt gcttaacaca tgcaagtcga acgatgaagc 60 ccttcggggt ggattagtgg cgaacgggtg agtaacacgt gggcaatctg cccttcactc 120 tgggacaagc cctggaaacg gggtctaata ccggataaca ctcctgcctg catgggcggg 180 ggttaaaagc tccggcggtg aaggatgagc ccgcggccta tcagcttgtt ggtggggtaa 240 tggcctacca aggcgacgac gggtagccgg cctgagaggg cgaccggcca cactgggact 300 gagacacggc ccagactcct acgggaggca gcagtgggga atattgcaca atgggcgaaa 360 gcctgatgca gcgacgccgc gtgagggatg acggccttcg ggttgtaaac ctctttcagc 420 agggaagaag cgaaagtgac ggtacctgca gaagaagcgc cggctaacta cgtgccagca 480 gccgcggtaa tacgtagggc gcaagcgttg tccggaatta ttgggcgtaa agagctcgta 540 ggcggcttgt cacgtcggat gtgaaagccc ggggcttaac cccgggtctg cattcgatac 600 gggctagcta gagtgtggta ggggagatcg gaattcctgg tgtagcggtg aaatgcgcag 660 atatcaggag gaacaccggt ggcgaaggcg gatctctggg ccattactga cgctgaggag 720 cgaaagcgtg gggagcgaac aggattagat accctggtag tccacgccgt aaacgttggg 780 aactaggtgt tggcgacatt ccacgtcgtc ggtgccgcag ctaacgcatt aagttccccg 840 cctggggagt acggccgcaa ggctaaaact caaaggaatt gacgggggcc cgcacaagca 900 gcggagcatg tggcttaatt cgacgcaacg cgaagaacct taccaaggct tgacatatac 960 cggaaagcat tagagatagt gccccccttg tggtcggtat acaggtggtg catggctgtc 1020 gtcagctcgt gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgcaac gagcgcaacc cttgttctgt 1080 gttgccagca tgcccttcgg ggtgatgggg actcacagga gactgccggg gtcaactcgg 1140 aggaaggtgg ggacgacgtc aagtcatcat gccccttatg tcttgggctg cacacgtgct 1200 acaatggccg gtacaatgag ctgcgatgcc gtgaggcgga gcgaatctca aaaagccggt 1260 ctcagttcgg attggggtct gcaactcgac cccatgaagt cggagttgct agtaatcgca 1320 gatcagcatt gctgcggtga atacgttccc gggccttgta cacaccgccc gtcacgtcac 1380 gaaagtcggt aacacccgaa gccggtggcc caaccccttg gggggaggga gctgtctaaa 1440 gtgggactgg cgattgggac gaagtcgtac aaaggtaacc aaagggggg 1489

Claims

기탁번호 KCTC 13358BP로 기탁된 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) G-0299 균주.
청구항 1에 있어서,
상기 균주는 16S rRNA가 서열번호 1의 염기서열로 구성된 것을 특징으로 하는 균주.
기탁번호 KCTC 13358BP로 기탁된 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) G-0299 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 제초제 조성물이되,
상기 제초제 조성물은 바랭이(Digitaria sanguinalis)에만 제초 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 제초제 조성물.
삭제
청구항 3에 있어서,
상기 균주 또는 이의 배양액은 바랭이에 광의존적 제초 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 제초제 조성물.
기탁번호 KCTC 13358BP로 기탁된 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) G-0299 균주 또는 이의 배양액을 바랭이, 바랭이의 종자 또는 이의 서식지에 처리하는 단계를 포함하는 바랭이 방제 방법.
청구항 6에 있어서,
상기 처리는 경엽처리하는 것을 특징으로 하는 바랭이 방제 방법.
청구항 6에 있어서,
상기 바랭이, 바랭이의 종자 또는 이의 서식지에 광조사하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 바랭이 방제 방법.
삭제