KR101996141B1 - Composition for diagnosing tumor using BCAR4 exon 4 or its fusion gene thereof - Google Patents

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Abstract

본 발명은 폐암 진단의 유전자 마커로 사용하기 위한 BCAR4 엑손 4(Breast cancer anti-estrogen resistance 4 exon 4) 및 이를 포함하는 융합 유전자의 용도를 제공한다. 본 발명의 BCAR4 엑손 4는 폐암, 유방암 환자의 암조직에서 정상조직에 비하여 유의적으로 발현되며, 특히 BCAR4 엑손 4와 CD63 유전자 일부가 융합된 CD63-BCAR4 융합 유전자의 서열로 발현되므로, 이를 폐암 유전자 마커로 사용할 수 있다. 또한, BCAR4 엑손 4 및 CD63 유전자 서열이 융합된 융합 유전자(CD63-BCAR4)의 발현을 조절하는 것을 통해 암세포의 증식률 및 이주능을 저하시킬 수 있으므로,본 발명의 BCAR4 엑손 4 및 이를 포함하는 융합 유전자의 발현을 억제할 수 있는 제제를 폐암 치료 또는 전이 억제용 약학적 조성물의 유효성분으로 사용할 수 있다.The present invention provides the use of BCAR4 exon 4 for use as a genetic marker for the diagnosis of lung cancer and a fusion gene comprising the same. BCAR4 exon 4 of the present invention is significantly expressed in cancer tissues of lung cancer and breast cancer patients as compared with normal tissues. Especially, BCAR4 exon 4 is expressed as a sequence of CD63-BCAR4 fusion gene in which a part of BCAR4 exon 4 and CD63 gene are fused, It can be used as a marker. In addition, since the proliferation rate and migration ability of cancer cells can be lowered by regulating the expression of the fusion gene ( CD63-BCAR4 ) fused with the BCAR4 exon 4 and CD63 gene sequences, the BCAR4 exon 4 of the present invention and the fusion gene Can be used as an active ingredient of a pharmaceutical composition for the treatment or prevention of lung cancer.

Description

BCAR4 엑손 4 또는 이를 포함하는 융합 유전자를 이용하는 종양 진단용 조성물{Composition for diagnosing tumor using BCAR4 exon 4 or its fusion gene thereof}The present invention relates to a composition for diagnosing a tumor using BCAR4 exon 4 or a fusion gene comprising the same,

본 발명은 폐암 진단의 유전자 마커로 사용하기 위한 BCAR4 엑손 4(Breast cancer anti-estrogen resistance 4 exon 4) 및 이를 포함하는 융합 유전자의 용도를 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 BCAR4 엑손 4 및 이를 포함하는 융합 유전자의 발현 억제제를 포함하는 폐암 예방, 치료 또는 전이 억제용 약학적 조성물을 제공한다.The present invention provides the use of BCAR4 exon 4 for use as a genetic marker for the diagnosis of lung cancer and a fusion gene comprising the same. In addition, the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing, treating or inhibiting metastasis of lung cancer comprising the expression inhibitor of BCAR4 exon 4 and a fusion gene comprising the same.

폐암은 암으로 인한 사망에 있어서, 가장 많은 사망률을 나타내는 조직암이다. 세계적으로 매년 1 만명 이상의 환자가 폐암으로 인해 사망하는 것으로 알려져 있다. 폐암은 진행 중에는 증상이 없는 경우가 흔하기 때문에, 증상이 나타날 때 쯤이면 이미 진행된 경우가 많다. 따라서, 폐암을 간단하게 조기 진단하기 위한 방법을 개발하기 위한 필요가 제시되고 있다. 폐암의 진단을 위해 EGFR, KRAS, ALK 등 일부 유전자의 돌연변이가 검사되고 있으나 추가로 폐암 진단의 마커로 사용하기 위한 특이 발현 유전자를 발굴하는 연구가 진행되고 있다.Lung cancer is the most common form of cancer in deaths due to cancer. More than 10,000 people worldwide are known to die of lung cancer every year. Lung cancer is often symptom-free as it progresses, so by the time the symptoms appear, it has already progressed. Therefore, there is a need to develop a method for simple and early diagnosis of lung cancer. Mutations in some genes, such as EGFR, KRAS, and ALK, have been tested for the diagnosis of lung cancer, but studies are underway to identify specific expression genes for use as markers for lung cancer diagnosis.

융합 유전자(fusion gene)는 두 개의 유전자가 한 개의 유전자로 재구성되어 전혀 새로운 기능을 수행하는 유전자이다. 융합 유전자가 형성되는 기작은 크게 3 가지로 분류되며, 서로 다른 염색체의 일부분이 위치 이동하면서 생성될 수 있고, 같은 염색체내에서 일부가 위치 이동하여 생성될 수 있으며, 또는 동일하거나 서로 다른 염색체 내에서 유전자가 각각의 전사체를 만들고 상기 각각의 전사체가 그대로 융합되어 융합 유전자를 생성할 수 있다.A fusion gene is a gene in which two genes are reconstructed as a single gene and perform entirely new functions. The mechanism by which a fusion gene is formed is classified into three types, and a part of different chromosomes can be generated while locating, and a part of the same chromosomes can be locally shifted, or they can be generated in the same or different chromosomes The gene can make each transcript and each transcript can be fused as it is to produce a fusion gene.

이러한 융합 유전자들은 암 세포를 비롯한 비정상적인 조직 세포에서 발현되는 것으로 알려져 있어, 최근 암의 진단 및 치료를 위한 표적으로 주목받고 있다. 암 세포에서 융합 유전자의 발현은 혈액암에서 최초 보고된 이래로, 융합 유전자 및 이로부터 발현되는 융합 단백질에 대한 연구가 계속되고 있다. 폐암과 같은 고형암에서는 ALK, ROS1 등 타이로신 키나아제를 암호화하는 유전자가 융합된 형태의 융합 유전자의 발현이 보고되어, 진단에 사용될 뿐 아니라 암 조직에서 융합 유전자가 발현되는 환자에서 타이로신 키나아제의 억제제를 적용하여 효과적인 임상적 치료 효과를 확인한 것으로 보고된 바 있다.These fusion genes are known to be expressed in abnormal tissue cells including cancer cells, and they have recently been attracting attention as targets for diagnosis and treatment of cancer. Since the expression of fusion genes in cancer cells has been reported for the first time in blood cancers, research continues on fusion genes and fusion proteins expressed therefrom. In solid tumors such as lung cancer, expression of a fusion gene in which a gene encoding a tyrosine kinase such as ALK or ROS1 has been reported has been reported. In addition, the inhibitor of tyrosine kinase is used in a patient in which a fusion gene is expressed in cancer tissue And it has been reported that effective clinical treatment effects have been confirmed.

따라서, 융합 유전자는 암 환자에서 낮은 빈도로 발견되나 암특이적 마커로 판단되며, 동시에 표적 치료제로서의 대상이 될 수 있어, 이에 대한 연구가 계속되고 있다.Therefore, the fusion gene is found to be a low frequency in cancer patients, but it can be regarded as a cancer-specific marker, and it can be a target treatment agent, and research on this is continuing.

이에, 본 발명자들은 폐암 진단에 사용하기 위한 융합 유전자 마커를 발굴하기 위해 노력한 결과, BCAR4 엑손 4(Breast cancer anti-estrogen resistance 4 exon 4)의 mRNA가 폐암 및 유방암 환자의 조직에서 유의적으로 발현됨을 확인하였고, 특히 BCAR4 엑손 4와 CD63 유전자 일부가 융합된 융합 유전자를 발굴하였다. 또한, 본 발명자들은 BCAR4 엑손 4 및 Cd63 유전자 서열이 융합된 융합 유전자(CD63-BCAR4)를 분리, 동정하여 과발현 세포주를 수립하였다. 정상 기관지상피세포주에 CD63-BCAR4를 과발현한 경우, 세포 증식률 및 이주능이 증가하여 종양세포의 특징을 보였다. CD63-BCAR4 과발현 세포를 이종이식한 마우스에서 종양이 형성되고 이식부위에 형성된 종양이외에도 간에서 여러 개의 종양을 형성하여 전이를 확인하였다. 이와 같은 CD63-BCAR4 과발현 세포의 종양형성 효과는 siRNA를 사용하여 CD63-BCAR4 발현을 억제하였을 때 다시 세포 증식률 및 이주능이 현저히 감소하여 CD63-BCAR4 고유의 기능인 것으로 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.Therefore, the present inventors have made efforts to identify fusion gene markers for use in the diagnosis of lung cancer. As a result, mRNA of BCAR4 exon 4 (breast cancer anti-estrogen resistance 4 exon 4) is expressed in lung cancer and breast cancer tissues , And specifically identified fusion genes in which some of BCAR4 exon 4 and CD63 gene were fused. In addition, the present inventors isolated and identified a fusion gene ( CD63-BCAR4 ) in which the BCAR4 exon 4 and Cd63 gene sequences were fused to establish an over-expression cell line. Overexpression of CD63-BCAR4 in the normal bronchial epithelial cell line increased the cell proliferation and migration potency, indicating the characteristics of tumor cells. Tumors were formed in xenograft transplanted with CD63-BCAR4 overexpressing cells and multiple tumors were formed in the liver in addition to the tumor formed at the transplantation site to confirm metastasis. The tumorigenic effect of CD63-BCAR4 overexpressing cells was confirmed to be a unique function of CD63-BCAR4 when the expression of CD63-BCAR4 was inhibited by using siRNA, and the cell proliferation rate and migration ability were remarkably decreased again, thus completing the present invention.

상술한 바와 같이, 폐암 진단을 위한 마커 유전자에 대한 연구가 계속되고 있으며, 특히 암 특이 마커 유전자로서 융합 유전자에 대한 연구가 계속되고 있다.As described above, research on marker genes for diagnosis of lung cancer is continuing, and studies on fusion genes as cancer-specific marker genes are being continued.

따라서, 본 발명의 목적은, BCAR4 유전자의 엑손4의 과발현 또는 CD63-BCAR4 융합 유전자 발현을 확인하여 폐암을 진단하기 위한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다. 또한, BCAR4 유전자의 엑손4의 과발현 또는 CD63-BCAR4 융합 유전자 발현을 확인할 수 있는 제제를 포함하는 폐암 진단용 조성물을 제공하는 것이다.Accordingly, an object of the present invention is to provide a method for providing information for diagnosing lung cancer by confirming overexpression of exon 4 of BCAR4 gene or expression of CD63-BCAR4 fusion gene. Further, it is intended to provide a composition for diagnosing lung cancer, which comprises an agent capable of confirming overexpression of exon 4 of BCAR4 gene or expression of CD63-BCAR4 fusion gene.

또한, 본 발명의 목적은, 폐암 치료 또는 전이 억제용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.It is also an object of the present invention to provide a pharmaceutical composition for the treatment or prevention of lung cancer.

상기 목적을 달성하기 위해서, BCAR4 엑손 4 및 이를 포함하는 융합 유전자 중 어느 하나의 mRNA, 또는 이로 암호화되는 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 폐암 진단용 조성물을 제공한다.In order to achieve the above object, there is provided a composition for diagnosing lung cancer, comprising an agent for measuring the expression level of mRNA of any one of BCAR4 exon 4 and a fusion gene comprising the same, or a protein encoded by the mRNA.

또한, 본 발명은 하기 i) 및 ii) 단계를 포함하는, 폐암 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다:The present invention also provides a method of providing information for lung cancer diagnosis, comprising steps i) and ii):

i) 폐암 의심 환자로부터 분리된 시료로부터, BCAR4 엑손 4 및 이를 포함하는 융합 유전자 중 어느 하나의 mRNA, 또는 이로 암호화되는 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및i) measuring the level of expression of mRNA of, or a protein encoded by, BCAR4 exon 4 and a fusion gene comprising the BCAR4 exon 4 from a sample isolated from a patient suspected of lung cancer; And

ii) 상기 단계 i)에서 측정한 결과를 정상 대조군과 비교하는 단계.ii) comparing the result measured in step i) with a normal control.

본 발명의 바람직한 일실시예에서, 상기 BCAR4 엑손 4는 서열번호 3의 염기서열로 구성되는 것일 수 있다.In a preferred embodiment of the present invention, the BCAR4 exon 4 may be composed of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3.

본 발명의 바람직한 일실시예에서, 상기 융합 유전자는 BCAR4 엑손 4의 5'말단 앞에 CD63의 엑손 2 및 엑손3이 포함된 서열이다. In one preferred embodiment of the present invention, the fusion gene is a sequence comprising exons 2 and 3 of CD63 in front of the 5 'terminus of BCAR4 exon 4.

본 발명의 바람직한 일실시예에서, 상기 융합 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 것일 수 있다. 융합유전자의 단백질 서열은 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시될 수 있다. In a preferred embodiment of the present invention, the fusion gene may consist of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1. The protein sequence of the fusion gene can be represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.

본 발명의 바람직한 일실시예에서, 상기 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제는, BCAR4 엑손 4 및 이를 포함하는 융합 유전자 중 어느 하나의 mRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머쌍 또는 프로브인 것일 수 있으며; 상기 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는, BCAR4 엑손 4 및 이를 포함하는 융합 유전자 중 어느 하나의 mRNA로 암호화는 단백질에 특이적인 항체인 것일 수 있다.In one preferred embodiment of the present invention, the agent for measuring the expression level of the mRNA may be a primer pair or a probe that specifically binds to mRNA of BCAR4 exon 4 and a fusion gene comprising the BCAR4 exon 4; The agent for measuring the expression level of the protein may be an mRNA encoding any one of BCAR4 exon 4 and a fusion gene comprising BCAR4 exon 4, and the encoding may be an antibody specific for the protein.

또한, 본 발명은 BCAR4 엑손 4 및 이를 포함하는 융합 유전자 중 어느 하나의 mRNA 발현을 억제하는 제제를 포함하는, 폐암 예방, 치료 또는 전이 억제용 약학적 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing, treating or inhibiting metastasis of lung cancer comprising an agent for inhibiting mRNA expression of any one of BCAR4 exon 4 and a fusion gene comprising the same.

본 발명의 바람직한 일실시예에서, 상기 mRNA 발현을 억제하는 제제는, CD63-BCAR4 융합유전자의 mRNA에 대한 siRNA 및 shRNA 중 어느 하나인 것일 수 있으며, 상기 siRNA는 서열번호 7의 염기서열로 구성되는 것일 수 있다.In one preferred embodiment of the present invention, the agent for inhibiting mRNA expression may be any one of siRNA and shRNA for the mRNA of the CD63-BCAR4 fusion gene, and the siRNA comprises the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7 Lt; / RTI >

따라서, 본 발명은 폐암 진단의 유전자 마커로 사용하기 위한 BCAR4 엑손 4(Breast cancer anti-estrogen resistance 4 exon 4) 및 이를 포함하는 융합 유전자의 용도를 제공한다. 본 발명의 BCAR4 엑손 4(Breast cancer anti-estrogen resistance 4 exon 4)는 폐암과 유방암에서 과발현되며, 특히 BCAR4 엑손 4와 CD63 유전자 일부가 융합된 융합 유전자를 폐암에서 발굴하여, 이를 폐암 유전자 마커로서 제공한다.Accordingly, the present invention provides the use of BCAR4 exon 4 for use as a genetic marker for lung cancer diagnosis and a fusion gene comprising the same. The present invention is based on the finding that a fusion gene in which BCAR4 exon 4 and a part of CD63 gene are fused is found in lung cancer and is expressed as a lung cancer gene marker do.

또한, BCAR4 엑손 4와 CD63 유전자 일부가 융합된 융합 유전자(CD63-BCAR4)를 과발현하는 정상 기관지상피세포주가 암세포화되어 세포 증식률 및 이주능이 증가하며, 암세포화된 Cd63-BCAR4 과발현 세포를 이종이식한 마우스에서 종양이 형성되고 간으로의 전이를 나타내었고 이와 같은 효과는 다시 CDd63-BCAR4 발현을 억제하였을 때 다시 세포 증식률 및 이주능이 정상 세포 수준으로 회복될 수 있어, 본 발명의 BCAR4 엑손 4 및 이를 포함하는 융합 유전자의 발현을 억제할 수 있는 제제를 폐암 치료 또는 전이 억제용 약학적 조성물의 유효성분으로 사용할 수 있다.In addition, a normal bronchial epithelial cell line overexpressing a fusion gene ( CD63-BCAR4 ) in which a part of BCAR4 exon 4 and CD63 gene is fused is cancer cell, resulting in an increase in cell proliferation rate and migration ability, and a cancer cell line xenografted with Cd63-BCAR4 overexpressing cells Mice exhibited tumor formation and metastasis to the liver. When such an effect was further inhibited by CDd63-BCAR4 expression, the cell proliferation rate and migratory ability could be restored to normal cell levels. Thus, BCAR4 exon 4 of the present invention and its Can be used as an active ingredient of a pharmaceutical composition for lung cancer treatment or prevention of metastasis.

도 1은 유방암 및 폐암 환자의 암조직에서 정상조직에 비하여 BCAR4 엑손 4의 과발현 수준을 확인한 결과를 나타낸다.
도 1a는 유방암 환자의 암 조직(T) 및 정상 조직(N)에서 BCAR4 엑손4 mRNA의 발현 수준을 비교한 결과이고;
도 1b는 폐암 세포주에서 BCAR4 엑손4 mRNA의 발현 수준을 비교한 결과이며;
도 1c는 폐암 환자의 암 조직(T) 및 정상 조직(N)에서 BCAR4 엑손4 mRNA의 발현 수준을 비교한 결과이다.
도 2는 BCAR4 엑손 4 과발현을 유도한 정상기관지상피세포, 폐암세포, 유방암세포의 세포 증식률과 콜로니형성 증가 양상을 확인한 결과를 나타낸다.
도 2a는 BCAR4 엑손4를 과발현한 세포에서 세포 성장의 증가를 확인한 결과이고;
도 2b는 BCAR4 엑손4를 과발현한 세포에서 콜로니 형성의 증가를 확인한 결과이다.
도 3은 BCAR4 엑손 4 및 CD63 유전자가 융합된 융합 유전자(CD63-BCAR4)의 발견된 구조 및 CD63-BCAR4 과발현 세포의 제조를 나타낸다.
도 3a는 CD63-BCAR4 융합 유전자의 서열 및 구조를 나타내는 모식도이고;
도 3b는 CD63-BCAR4 융합 유전자를 도입한 세포에서 과발현 여부를 mRNA와 단백질 수준에서 확인한 결과이다.
도 4는 CD63-BCAR4 과발현 세포의 세포 증식률 및 이주능 증가 양상을 확인한 결과를 나타낸다.
도 4a는 CD63-BCAR4 융합 유전자를 과발현한 정상기관지상피세포에서의 세포 성장 증가를 확인한 결과이고;
도 4b는 CD63-BCAR4 융합 유전자를 과발현한 정상기관지상피세포에서의 콜로니 형성 증가를 확인한 결과이며;
도 4c는 CD63-BCAR4 융합 유전자를 과발현한 정상기관지상피세포의 세포 이주능(migration) 증가 정도를 상처 회복 분석(Wound healing assay)으로 확인한 결과이고;
도 4d는 CD63-BCAR4 융합 유전자를 과발현한 정상기관지상피세포에서의 세포 이주능 증가 정도를 트랜스웰(Transwell)을 사용하여 확인한 결과이다.
도 5는 CD63-BCAR4 과발현 세포를 피하 접종한 마우스에서 종양 형성 및 간으로의 전이를 관찰한 결과를 나타낸다.
도 5a는 CD63-BCAR4 융합 유전자를 과발현한 정상기관지상피세포를 피하접종한 마우스에서 종양 형성의 증가를 확인한 결과이고;
도 5b는 CD63-BCAR4 융합 유전자를 과발현한 정상기관지상피세포를 피하접종한 마우스의 간에서 발견된 종양 조직의 형성을 확인한 결과이며;
도 5c는 CD63-BCAR4 융합 유전자를 과발현한 정상기관지상피세포를 피하접종한 마우스에서 적출한 피하 종양 및 간 종양에서 CD63-BCAR4 융합 유전자의 과발현을 확인한 결과를 나타내고;
도 5d는 CD63-BCAR4 융합 유전자를 과발현한 정상기관지상피세포를 피하접종한 마우스에서 적출한 피하 종양 및 간 종양 세포의 세포 이주능을 확인한 결과이다.
도 6은 CD63-BCAR4 과발현 세포에서 특이적 siRNA를 사용하여 CD63-BCAR4 발현을 억제하였을 때, 세포 증식률 및 이주능이 감소하는 결과를 나타낸다.
도 6a는 CD63-BCAR4 융합 유전자를 과발현한 정상기관지상피세포에 CD63-BCAR4 융합 유전자 특이적인 siRNA를 처리하였을 때, CD63-BCAR4 융합 유전자의 발현 억제 효과를 확인한 결과이고;
도 6b는 CD63-BCAR4 융합 유전자에 특이적인 siRNA로 발현 억제한 세포의 세포 이주능 감소 효과를 트랜스웰로 확인한 세포 사진이며;
도 6c는 CD63-BCAR4 융합 유전자에 특이적인 siRNA로 발현 억제한 세포의 세포 이주능 감소 효과를 정량적으로 비교한 결과이다. Figure 1 shows the results of confirming the overexpression level of BCAR4 exon 4 in cancer tissues of breast and lung cancer patients compared to normal tissues.
FIG. 1A shows the results of comparing the expression levels of BCAR4 exon 4 mRNA in cancer tissues (T) and normal tissues (N) of breast cancer patients;
1b shows the results of comparing the expression levels of BCAR4 exon 4 mRNA in lung cancer cell lines;
1c shows the results of comparing the expression levels of BCAR4 exon 4 mRNA in cancer tissues (T) and normal tissues (N) of lung cancer patients.
FIG. 2 shows the results of confirming the increase of cell proliferation and colonization of normal bronchial epithelial cells, lung cancer cells, and breast cancer cells induced by BCAR4 exon 4 overexpression.
FIG. 2A shows the results of confirming an increase in cell growth in cells overexpressing BCAR4 exon 4; FIG.
FIG. 2B shows the result of confirming an increase in colony formation in cells overexpressing BCAR4 exon 4. FIG.
Figure 3 shows the discovered structure of the fusion gene ( CD63-BCAR4 ) fused with BCAR4 exon 4 and CD63 gene and the production of CD63-BCAR4- overexpressing cells.
3A is a schematic diagram showing the sequence and structure of the CD63-BCAR4 fusion gene;
FIG. 3B shows the results of confirming overexpression at the level of mRNA and protein in cells transfected with the CD63-BCAR4 fusion gene.
FIG. 4 shows the results of confirming the cell proliferation rate and the degree of migration enhancement of CD63-BCAR4- overexpressing cells.
FIG. 4A shows the results of confirming an increase in cell growth in normal bronchial epithelial cells overexpressing the CD63-BCAR4 fusion gene;
FIG. 4B shows the result of confirming an increase in colony formation in normal bronchial epithelial cells overexpressing the CD63-BCAR4 fusion gene;
FIG. 4c shows the results of confirming the degree of cell migration enhancement of the normal bronchial epithelial cells overexpressing the CD63-BCAR4 fusion gene by a Wound healing assay;
FIG. 4D shows the results of confirming the degree of cell migration enhancement in normal bronchial epithelial cells overexpressing the CD63-BCAR4 fusion gene using Transwell.
FIG. 5 shows the results of observation of tumor formation and metastasis to liver in mice subcutaneously inoculated with CD63-BCAR4 overexpressing cells.
FIG. 5A shows the results of confirming an increase in tumor formation in mice subcutaneously inoculated with normal bronchial epithelial cells overexpressing the CD63-BCAR4 fusion gene;
FIG. 5B shows the results of confirming the formation of tumor tissues found in liver of mice subcutaneously inoculated with normal bronchial epithelial cells overexpressing the CD63-BCAR4 fusion gene;
FIG. 5c shows the overexpression of the CD63-BCAR4 fusion gene in subcutaneous tumors and liver tumors extracted from mice subcutaneously inoculated with normal bronchial epithelial cells overexpressing the CD63-BCAR4 fusion gene;
FIG. 5d shows the results of confirming cell migration ability of subcutaneous tumor and liver tumor cells extracted from mice subcutaneously inoculated with normal bronchial epithelial cells overexpressing the CD63-BCAR4 fusion gene.
Fig. 6 shows the results of decreasing cell proliferation and migration ability when CD63-BCAR4 expression was inhibited by using specific siRNA in CD63-BCAR4 overexpressing cells.
Figure 6a is a CD63-BCAR4 when in normal bronchial epithelial cells over-expressing the fusion gene was treated CD63-BCAR4 fusion gene-specific siRNA, CD63-BCAR4 results confirming the inhibitory effect of the expression of a fusion gene;
FIG. 6B is a photograph showing transwell activity of cells inhibiting expression of siRNA specific for the CD63-BCAR4 fusion gene and confirming the reduction effect of the cells;
FIG. 6C is a result of quantitatively comparing the effect of siRNA-specific inhibiting cells on the cell migration capability of the CD63-BCAR4 fusion gene.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.

상술한 바와 같이, 폐암 진단을 위한 마커 유전자에 대한 연구가 계속되고 있으며, 특히 암 특이 마커 유전자로서 융합 유전자에 대한 연구가 계속되고 있다.As described above, research on marker genes for diagnosis of lung cancer is continuing, and studies on fusion genes as cancer-specific marker genes are being continued.

이에 따라, 본 발명은 BCAR4 엑손 4 및 이를 포함하는 CD63-BCAR4 융합 유전자 중 어느 하나의 mRNA, 또는 이로 암호화되는 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 폐암 진단용 조성물을 제공한다.Accordingly, the present invention provides a composition for diagnosing lung cancer comprising an agent for measuring the expression level of mRNA of any one of BCAR4 exon 4 and a CD63-BCAR4 fusion gene comprising the same, or a protein encoded by the mRNA.

또한, 본 발명은 하기 i) 및 ii) 단계를 포함하는, 폐암 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다:The present invention also provides a method of providing information for lung cancer diagnosis, comprising steps i) and ii):

i) 폐암 의심 환자로부터 분리된 시료로부터, BCAR4 엑손 4 및 이를 포함하는 융합 유전자 중 어느 하나의 mRNA, 또는 이로 암호화되는 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및i) measuring the level of expression of mRNA of, or a protein encoded by, BCAR4 exon 4 and a fusion gene comprising the BCAR4 exon 4 from a sample isolated from a patient suspected of lung cancer; And

ii) 상기 단계 i)에서 측정한 결과를 정상 대조군과 비교하는 단계.ii) comparing the result measured in step i) with a normal control.

본 발명에 있어서, "BCAR4 엑손 4"는 BCAR4 유전자의 4 번째 엑손을 지칭하는 것으로 이해될 수 있다. 상기 BCAR4 엑손 4는 서열번호 3의 염기서열로 구성되며, 구체적으로 서열번호 5의 염기서열 중 847 번에서 1224 번째 염기서열에 해당한다.In the present invention, " BCAR4 exon 4" can be understood to refer to the fourth exon of the BCAR4 gene. The BCAR4 exon 4 consists of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 and specifically corresponds to nucleotides 847 to 1224 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5.

본 발명에 있어서, "BCAR4 엑손 4를 포함하는 융합 유전자"는 BCAR4 엑손 4의 5' 말단의 앞 부분에 파트너 유전자의 서열이 연결된 형태를 의미한다. CD63-BCAR4 융합유전자에서는 CD63 유전자의 엑손 2-3이 포함되었으나 BCAR4 엑손 4를 포함하는 융합유전자의 파트너 유전자는 CD63에 한정되지 않는다. 구체적으로, 상기 "BCAR4 엑손 4를 포함하는 융합 유전자" 로부터 발현되는 융합 단백질은 BCAR4 엑손 4으로부터 합성되는 아미노산 서열 을 그대로 유지하면서 5' 말단의 앞 부분에 파트너 유전자로부터 유래한 아미노산 서열이 연결된 형태이다. 보다 구체적으로, 상기 CD63-BCAR4 융합 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 구성되고, 이로부터 발현되는 융합 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된다. 상기 융합 유전자 서열 중에서, CD63 서열은 CD63 mRNA 서열(서열번호 6의 염기서열)의 404 번째 내지 658 번째 서열에 해당하며, BCAR4 엑손 4 서열은 서열번호 3에 해당한다.In the present invention, the "fusion gene containing the exon 4 BCAR4" means a form of the sequence of the partner gene associated with the early part of the 5 'end of exon 4 BCAR4. The CD63-BCAR4 fusion gene includes the CD63 gene exon 2-3, but the fusion gene including the BCAR4 exon 4 gene is not limited to CD63. More specifically, the fusion protein is expressed from a "BCAR4 fusion gene containing the exon 4" is BCAR4 is an amino acid sequence linked form originated in the early part of the 5 'end, while maintaining the amino acid sequence synthesized from exon 4 from the partner gene . More specifically, the CD63-BCAR4 fusion gene is composed of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, and the fusion protein expressed therefrom is composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. Among the fusion gene sequences, the CD63 sequence corresponds to the 404th to 658th sequence of the CD63 mRNA sequence (nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6), and the BCAR4 exon 4 sequence corresponds to SEQ ID NO: 3.

본 발명에 있어서, "mRNA의 발현 수준을 측정"하는 것은 폐암을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 마커 유전자의 mRNA 존재 여부 및 발현 정도를 확인하는 과정으로, mRNA의 양을 측정함으로써 알 수 있다. 구체적으로, 이를 위한 분석방법으로는 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(northern blotting), 또는 DNA 마이크로어레이 칩 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이러한 검출 방법을 통하여, 정상 대조군 개체와 폐암 의심 개체에서의 mRNA 발현 수준을 비교할 수 있고, 마커 유전자인 BCAR4 융합 유전자의 mRNA 발현 수준이 증가되는 것으로 확인되는 경우, 대상 환자가 폐암인 것으로 진단할 수 있다. 또한, "mRNA 수준을 측정하는 제제"는 프라이머 쌍 또는 프로브를 사용할 수 있으며, 본 발명의 BCAR4 엑손 4 또는 이를 포함하는 융합 유전자의 핵산 서열을 바탕으로 이들 유전자의 특정 영역을 특이적으로 증폭하는 프라이머 또는 프로브를 디자인할 수 있다. 서열번호 8은 BCAR4 엑손 4의 발현을 확인할 수 있는 프라이머 쌍의 염기서열이다. 서열번호 9는 CD63-BCAR4 융합유전자의 발현을 확인할 수 있는 프라이머 쌍의 염기서열이다. In the present invention, "measuring the expression level of mRNA" is a process of confirming the presence or absence of mRNA and the expression level of a marker gene in a biological sample in order to diagnose lung cancer and measuring the amount of mRNA. Specifically, the analysis methods include RT-PCR, competitive RT-PCR, real-time RT-PCR, RNase protection assay (RPA) Northern blotting, or DNA microarray chips, but are not limited thereto. Through this detection method, it is possible to compare mRNA expression levels in normal control subjects and suspected lung cancer patients, and if the mRNA expression level of the marker gene BCAR4 fusion gene is found to be increased, the subject can be diagnosed as lung cancer have. The "agent for measuring the mRNA level" may be a primer pair or a probe. Based on the nucleic acid sequence of the BCAR4 exon 4 of the present invention or the fusion gene comprising the BCAR4 exon 4, a primer that specifically amplifies a specific region of these genes Or a probe can be designed. SEQ ID NO: 8 is a nucleotide sequence of a primer pair that can confirm the expression of BCAR4 exon 4. SEQ ID NO: 9 is a base sequence of a primer pair that can confirm the expression of the CD63-BCAR4 fusion gene.

본 발명에서 용어, "프라이머"는 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3`hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형의 복사를 위한 시작지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성이 개시할 수 있다. 본 발명에서는 상기 본 발명 마커 폴리뉴클레오티드의 센스 및 안티센스 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 실시하여 원하는 생성물의 생성 여부를 통해 폐암 여부를 진단하거나 예후 예측이 가능하다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.The term "primer" in the present invention is a nucleic acid sequence having a short free 3 'hydroxyl group, capable of forming a base pair with a complementary template and having a starting point for copying the template ≪ / RTI > Primers can initiate DNA synthesis in the presence of reagents and four different nucleoside triphosphates for polymerization reactions (i. E., DNA polymerase or reverse transcriptase) at appropriate buffer solutions and temperatures. In the present invention, PCR amplification is performed using the sense and antisense primers of the marker polynucleotide of the present invention to diagnose whether or not lung cancer is diagnosed through prediction of prognosis. The PCR conditions, the lengths of the sense and antisense primers can be modified based on what is known in the art.

본 발명에서 용어, "프로브"란 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 표지(Labelling)되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무를 확인 할 수 있다. 프로브는 올리고 뉴클레오티드 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 본 발명에서는 본 발명의 마커 폴리뉴클레오티드와 상보적인 프로브를 이용하여 혼성화를 실시하여, 혼성화 여부를 통해 폐암의 진단 또는 예후를 예측할수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.The term "probe" in the present invention means a nucleic acid fragment such as RNA or DNA corresponding to a short period of a few nucleotides or several hundreds of nucleotides capable of specifically binding to mRNA, and is labeled, Can be confirmed. The probe can be produced in the form of an oligonucleotide probe, a single stranded DNA probe, a double stranded DNA probe, or an RNA probe. In the present invention, hybridization is carried out using a probe complementary to the marker polynucleotide of the present invention, and the diagnosis or prognosis of lung cancer can be predicted through hybridization. Selection of suitable probes and hybridization conditions can be modified based on what is known in the art.

이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미 데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.Such nucleic acid sequences may also be modified using many means known in the art. Non-limiting examples of such modifications include, but are not limited to, methylation, capping, substitution with one or more of the natural nucleotide analogs, and modifications between nucleotides, such as uncharged linkers (e.g., methylphosphonate, phosphotriester, Amidates, carbamates, etc.) or charged linkages (e.g., phosphorothioates, phosphorodithioates, etc.).

본 발명에서, "단백질의 발현 수준을 측정하는 제제"는 폐암의 진단을 위하여 생물학적 시료에서 마커 유전자에서 발현된 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 상기 유전자의 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용해 단백질의 양을 확인한다. 이를 위한 분석 방법으로는 웨스턴블롯팅(western blotting), 조직면역 염색, 면역 침전분석법(immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(complete fixation assay), FACS, 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In the present invention, "an agent for measuring the expression level of a protein" is a process for confirming the presence and expression level of a protein expressed in a marker gene in a biological sample for diagnosis of lung cancer, Confirm the amount of protein using the binding antibody. Examples of the assay method include western blotting, tissue immuno staining, immunoprecipitation assay, complete fixation assay, FACS, and protein chip. It is not.

본 발명의 폐암 진단을 위한 정보제공 방법에 있어서, 구체적으로 BCAR4 또는 이를 포함하는 융합 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 이로부터 발현되는 단백질 수준을 검출할 수 있으며, 환자로부터 분리된 생물학적 시료에서 mRNA 또는 단백질을 분리하여 공지의 공정을 통해 발현 수준을 검출할 수 있다. 여기에서, 환자로부터 분리된 생물학적 시료는 마커 유전자의 발현 수준이 차이 나는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨와 같은 시료 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 구체적으로는 조직 시료를 사용하는 것이 폐암 특이적인 진단을 위한 관점에서 바람직하다.In the method for providing information for diagnosing lung cancer according to the present invention, specifically, it is possible to detect the mRNA expression level of BCAR4 or a fusion gene comprising the same, or the level of protein expressed therefrom, and to detect mRNA or protein in a biological sample separated from the patient And the expression level can be detected through a known process. Here, the biological sample separated from the patient may include, but is not limited to, tissues, cells, whole blood, serum, plasma, saliva, sputum, cerebrospinal fluid or urine, Specifically, the use of a tissue sample is preferable from the viewpoint of lung cancer-specific diagnosis.

mRNA 수준을 측정하기 위한 분석 방법으로는 역전사효소 중합효소반응, 경쟁적 역전사효소 중합효소반응, 실시간 역전사효소 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅, DNA 마이크로어레이 칩 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다. 상기 검출방법들을 통하여, 정상 대조군 개체와 폐암 의심개체에서의 mRNA 발현양을 비교할 수 있고, 마커 유전자에서 mRNA로의 유의한 발현량의 증감여부를 판단하여 폐암 의심 개체의 실제 발병을 진단할 수 있다.Methods for measuring mRNA levels include, but are not limited to, reverse transcriptase polymerase, competitive reverse transcriptase polymerase, real-time reverse transcriptase polymerase, RNase protection assay, Northern blotting, DNA microarray chip, and the like . Through the above detection methods, it is possible to compare the amount of mRNA expression in a normal control subject and suspected lung cancer, and to determine whether a significant expression amount of a marker gene into mRNA is increased or decreased to diagnose the actual incidence of suspected lung cancer.

단백질 발현 수준의 측정은 ELISA 방법(직접적 ELISA, 간접적 ELISA 또는 샌드위치 ELISA 등), 웨스턴 블랏 또는 단백질 칩을 이용할 수 있다. 상기 단백질 칩은 마커에 대한 하나 이상의 항체가 기판 위에 정해진 위치에 배열되어 고밀도록 고정화되어있는 단백질을, 단백질칩과 혼성화시켜서 항원-항체 복합체를 형성시키고, 이를 판독하여, 단백질의 존재 또는 발현 정도를 확인할 수 있다.Measurement of the level of protein expression may be by ELISA methods (direct ELISA, indirect ELISA or sandwich ELISA, etc.), Western blot or protein chip. In the protein chip, an antigen-antibody complex is formed by hybridizing a protein, in which at least one antibody against a marker is arranged at a predetermined position on the substrate, to immobilize the protein with a protein chip, and reading the protein to detect the presence or the degree of protein expression Can be confirmed.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 유방암 조직 및 폐암 조직을 대상으로 BCAR4 엑손 4의 발현 수준을 확인한 결과, 유방암 조직 뿐 아니라 폐암 조직에서도 BCAR4 엑손 4의 과발현을 확인하였다(도 1). 이에 따라 BCAR4 엑손 4를 과발현하는 세포주를 제조하였을 때, 암세포주 뿐 아니라 정상 기관지 상피세포주에서도 BCAR4 엑손 4의 과발현에 따라 세포 증식률이 증가하는 것을 확인하였다(도 2).In a specific example of the present invention, the present inventors confirmed the expression level of BCAR4 exon 4 in breast cancer tissues and lung cancer tissues, and confirmed overexpression of BCAR4 exon 4 in lung cancer tissues as well as in breast cancer tissues (FIG. 1). As a result, when the cell line overexpressing BCAR4 exon 4 was prepared, it was confirmed that the cell proliferation rate was increased by overexpression of BCAR4 exon 4 in both normal and bronchial epithelial cell lines (FIG. 2).

또한, 본 발명자들은 BCAR4 엑손 4가 포함된 융합 유전자가 폐암 조직에서 유의적으로 발현되는지 확인한 결과, BCAR4 엑손 4의 앞에 CD63 유전자 일부가 융합된 형태의, Cd63-BCAR4 융합 유전자의 발현 수준이 유의적으로 나타나는 것을 확인하였다(도 3a). 이에, 정상 기관지상피세포주에 Cd63-BCAR4 융합 유전자를 과발현하였을 때(도 3b), 증식률 및 이주능이 증가하는 것을 확인하였다(도 4). 아울러, Cd63-BCAR4 융합 유전자 과발현 세포를 마우스에 이종이식하였을 때, 종양 조직이 형성될 뿐 아니라 주변 조직인 간으로 종양이 전이되어, 간에서도 종양이 형성되는 것을 확인하였고, 종양으로부터 분리된 세포에서 암세포의 특징을 나타낼 수 있음을 확인하였다(도 5).The present inventors also confirmed that the fusion gene containing BCAR4 exon 4 was significantly expressed in lung cancer tissues. As a result, the expression level of the Cd63-BCAR4 fusion gene in which a part of the CD63 gene was fused to BCAR4 exon 4 was significantly (Fig. 3A). Thus, when the Cd63-BCAR4 fusion gene was overexpressed in the normal bronchial epithelial cell line (FIG. 3b), it was confirmed that the proliferation rate and migration ability were increased (FIG. 4). In addition, when the Cd63-BCAR4 fusion gene overexpressing cells were xenotransplanted into the mouse, it was confirmed that the tumor was formed not only in the tumor tissue but also in the surrounding liver, liver, and in the liver, (Fig. 5).

따라서, 본 발명은 폐암 진단의 유전자 마커로 사용하기 위한 BCAR4 엑손 4(Breast cancer anti-estrogen resistance 4 exon 4) 및 이를 포함하는 융합 유전자의 용도를 제공한다. 본 발명의 BCAR4 엑손 4이 폐암 환자의 조직에서 유의적으로 발현되며, 특히 BCAR4 엑손 4와 CD63 유전자 일부가 융합된 융합 유전자의 서열로 발현되므로, 이를 폐암 유전자 마커로 사용할 수 있다. Accordingly, the present invention provides the use of BCAR4 exon 4 for use as a genetic marker for lung cancer diagnosis and a fusion gene comprising the same. The BCAR4 exon 4 of the present invention is expressed in the tissues of lung cancer patients. In particular, BCAR4 exon 4 and a part of CD63 gene are expressed as a fusion gene fusion sequence, so that it can be used as a lung cancer gene marker.

또한, 본 발명은 BCAR4 엑손 4 및 이를 포함하는 융합 유전자 중 어느 하나의 mRNA 발현을 억제하는 제제를 포함하는, 폐암 치료용 약학적 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a pharmaceutical composition for treating lung cancer, which comprises an agent for inhibiting mRNA expression of any one of BCAR4 exon 4 and a fusion gene comprising the same.

또한, 본 발명은 BCAR4 엑손 4 및 이를 포함하는 융합 유전자 중 어느 하나의 mRNA 발현을 억제하는 제제를 포함하는, 폐암 전이 억제용 약학적 조성물을 제공한다.The present invention also provides a pharmaceutical composition for inhibiting lung cancer metastasis, which comprises an agent for inhibiting mRNA expression of any one of BCAR4 exon 4 and a fusion gene comprising the same.

본 발명의 약학적 조성물에 있어서, "BCAR4 엑손 4"는 BCAR4 유전자의 4 번째 엑손을 지칭하는 것으로 이해될 수 있다. 상기 BCAR4 엑손 4는 서열번호 3의 염기서열로 구성되며, 구체적으로 서열번호 5의 염기서열 중 847 번에서 1224 번째 염기서열에 해당한다.In the pharmaceutical composition of the present invention, " BCAR4 exon 4" can be understood to refer to the fourth exon of the BCAR4 gene. The BCAR4 exon 4 consists of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 and specifically corresponds to nucleotides 847 to 1224 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5.

본 발명의 약학적 조성물에 있어서, "BCAR4 엑손 4를 포함하는 융합 유전자"는 BCAR4 엑손 4의 5' 말단의 앞 부분에 파트너 유전자의 서열이 연결된 형태를 의미한다. 구체적으로, 본 발명에서 분리, 동정한 융합 유전자는 CD63-BCAR4 융합 유전자이고, 이는 서열번호 1의 염기서열로 구성된다.In the pharmaceutical composition of the present invention, the "fusion gene containing the exon 4 BCAR4" it means a form of the sequence of the partner gene associated with the early part of the 5 'end of exon 4 BCAR4. Specifically, the fusion gene isolated and identified in the present invention is a CD63-BCAR4 fusion gene, which is composed of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.

본 발명의 약학적 조성물에서, "mRNA 발현을 억제하는 제제"는, BCAR4 엑손 4 및 이를 포함하는 융합 유전자 중 어느 하나의 mRNA에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA 또는 shRNA 중 하나일 수 있으며, 구체적으로 siRNA인 것이 바람직하다. 상기 mRNA 발현을 억제하는 제제가 siRNA일 때, siRNA의 서열은 서열번호 7의 염기서열로 구성되는 것이 바람직하다.In the pharmaceutical composition of the present invention, the "agent for inhibiting mRNA expression" may be one of antisense oligonucleotides, siRNA, or shRNA for mRNA of BCAR4 exon 4 and a fusion gene comprising the same, . When the agent for inhibiting mRNA expression is siRNA, the siRNA sequence preferably comprises the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7.

본 발명의 또다른 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 비종양 세포인 BEAS-2B 세포에서 CD63-BCAR4 융합 유전자의 발현을 유도하였을 때, 상기 융합 유전자에 의해 비종양성 세포가 암세포화 되는 것을 확인하였으므로, 이를 다시 발현 억제하는 경우에 암세포화된 특성이 유지되는지 확인한 결과, siRNA를 통해 Cd63-BCAR4 융합 유전자의 발현을 억제하였을 때 암세포화 되었던 비종양 세포의 세포 증식률 및 이주능이 정상세포 수준으로 감소하는 것을 확인하였다(도 6).In another specific example of the present invention, the present inventors have confirmed that when the expression of the CD63-BCAR4 fusion gene is induced in the BEAS-2B cell, which is a non-tumor cell, the non-neoplastic cell is cancer- When the expression of the Cd63-BCAR4 fusion gene was inhibited by siRNA, the cell proliferation and migration capacity of the tumor cells that had been transformed into cancer cells decreased to the level of the normal cells (Fig. 6).

따라서, 본 발명의 BCAR4 엑손 4 및 CD63 유전자 서열이 융합된 융합 유전자(Cd63-BCAR4)의 발현을 조절하는 것을 통해, 암세포의 증식률 및 이주능을 조절할 수 있으므로, 본 발명의 BCAR4 엑손 4 및 이를 포함하는 융합 유전자의 발현을 억제할 수 있는 제제를 폐암 치료 또는 전이 억제용 약학적 조성물의 유효성분으로 사용할 수 있다.Therefore, the proliferation rate and migration ability of cancer cells can be regulated by controlling the expression of the fusion gene ( Cd63-BCAR4 ) fused with the BCAR4 exon 4 and CD63 gene sequences of the present invention. Therefore, BCAR4 exon 4 of the present invention and its Can be used as an active ingredient of a pharmaceutical composition for lung cancer treatment or prevention of metastasis.

아울러, 본 발명은 BCAR4 엑손 4 및 이를 포함하는 융합 유전자 중 어느 하나의 mRNA 발현을 억제하는 제제를 유효성분으로 포함하는 항암 보조제를 제공한다.In addition, the present invention provides an anticancer adjuvant comprising, as an active ingredient, an agent for inhibiting mRNA expression of BCAR4 exon 4 and a fusion gene comprising the same.

본 발명의 암 치료 또는 전이 억제용 약학적 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 상기 조성물을 제형화할 경우에는 하나 이상의 완충제(예를 들어, 식염수 또는 PBS), 항산화제, 정균제, 킬레이트화제(예를 들어, EDTA 또는 글루타치온), 충진제, 증량제, 결합제, 아쥬반트(예를 들어, 알루미늄 하이드록사이드), 현탁제, 농후제 습윤제, 붕해제 또는 계면활성제, 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. The pharmaceutical composition for cancer treatment or metastasis inhibition of the present invention may be various oral or parenteral formulations. When formulating the composition, one or more buffers (e.g., saline or PBS), antioxidants, bacteriostats, chelating agents (e.g., EDTA or glutathione), fillers, extenders, binders, adjuvants Aluminum hydroxide), suspending agents, thickening agents, disintegrating agents or surfactants, diluents or excipients.

경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분(옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분, 감자 전분 등 포함), 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose), 락토오스(lactose), 덱스트로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 말티톨, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 또는 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 예컨대, 활성성분을 고체 부형제와 배합한 다음 이를 분쇄하고 적합한 보조제를 첨가한 후 과립 혼합물로 가공함으로써 정제 또는 당의정제를 수득할 수 있다. Solid formulations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules and the like, which may contain at least one excipient, such as starch (cornstarch, wheat starch, rice starch, potatoes Starch and the like), calcium carbonate, sucrose, lactose, dextrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol maltitol, cellulose, methylcellulose, sodium carboxymethylcellulose and hydroxypropylmethylcellulose - It is prepared by mixing cellulose or gelatin. For example, tablets or tablets may be obtained by combining the active ingredient with a solid excipient, then milling it, adding suitable auxiliaries, and processing the mixture into granules.

또한, 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 또는 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제 또는 보존제 등이 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있으며, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium stearate, talc, and the like may also be used. Liquid preparations for oral administration include suspensions, solutions, emulsions or syrups. In addition to water and liquid paraffin which are commonly used simple diluents, various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances or preservatives are included . In addition, crosslinked polyvinylpyrrolidone, agar, alginic acid, or sodium alginate may optionally be added as a disintegrant, and may further include an anticoagulant, a lubricant, a wetting agent, a flavoring agent, an emulsifying agent and an antiseptic agent .

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제, 동결건조제제 또는 좌제 등이 포함된다. 비수성용제 및 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다.Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, freeze-dried preparations or suppositories. Examples of non-aqueous solvents and suspensions include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, injectable esters such as ethyl oleate, and the like. As a base for suppositories, witepsol, macrogol, tween 61, cacao paper, laurin, glycerol, gelatin and the like can be used.

본 발명의 암 치료 또는 전이 억제용 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있으며, 비경구 투여시 피부외용; 복강내, 직장, 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 주사하는 주사제의 형태로 당업계에 공지된 방법에 따라 제형화할 수 있다.The pharmaceutical composition for cancer treatment or metastasis inhibition of the present invention may be administered orally or parenterally, and may be administered externally for parenteral administration; Intraperitoneally, rectally, intravenously, intramuscularly, subcutaneously, intraperitoneally, or intracerebrally injected injections, in accordance with methods known in the art.

상기 주사제의 경우에는 반드시 멸균되어야 하며 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염으로부터 보호되어야 한다. 주사제의 경우 적합한 담체의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 혼합물 및/또는 식물유를 포함하는 용매 또는 분산매질일 수 있다. 보다 바람직하게는, 적합한 담체로는 행크스 용액, 링거 용액, 트리에탄올 아민이 함유된 PBS (phosphate buffered saline) 또는 주사용 멸균수, 10% 에탄올, 40% 프로필렌 글리콜 및 5% 덱스트로즈와 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다. 상기 주사제를 미생물 오염으로부터 보호하기 위해서는 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르빈산, 티메로살 등과 같은 다양한 항균제 및 항진균제를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 주사제는 대부분의 경우 당 또는 나트륨 클로라이드와 같은 등장화제를 추가로 포함할 수 있다.In the case of such injections, they must be sterilized and protected against contamination of microorganisms such as bacteria and fungi. Examples of suitable carriers for injectables include, but are not limited to, solvents or dispersion media containing water, ethanol, polyols (e.g., glycerol, propylene glycol and liquid polyethylene glycol, etc.), mixtures thereof and / or vegetable oils . More preferably, suitable carriers include isotonic solutions such as Hanks' solution, Ringer's solution, phosphate buffered saline (PBS) containing triethanolamine, or sterile water for injection, 10% ethanol, 40% propylene glycol and 5% dextrose Etc. may be used. In order to protect the injection from microbial contamination, various antibacterial and antifungal agents such as parabens, chlorobutanol, phenol, sorbic acid, thimerosal and the like may be further included. In addition, the injections may in most cases additionally include isotonic agents, such as sugars or sodium chloride.

본 발명의 암 치료 또는 전이 억제용 약학적 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 암 치료 또는 전이 억제용 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 즉, 본 발명의 암 치료 또는 전이 억제용 약학적 조성물의 총 유효량은 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.The pharmaceutical composition for cancer treatment or metastasis inhibition of the present invention is administered in a pharmaceutically effective amount. In the present invention, "pharmaceutically effective amount" means an amount sufficient to treat a disease at a reasonable benefit / risk ratio applicable to medical treatment, and the effective dose level will depend on the type of disease, severity, , Sensitivity to the drug, time of administration, route of administration and rate of release, duration of treatment, factors including co-administered drugs, and other factors well known in the medical arts. The pharmaceutical composition for cancer treatment or metastasis inhibition of the present invention may be administered as an individual therapeutic agent or in combination with other therapeutic agents, sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents, and may be administered singly or multiply. That is, the total effective amount of the pharmaceutical composition for cancer treatment or metastasis inhibition of the present invention can be administered to a patient in a single dose, and can be divided into a fractionated treatment administered for a long time in multiple doses < / RTI > protocol). It is important to take into account all of the above factors and to administer the amount in which the maximum effect can be obtained in a minimal amount without side effects, which can be easily determined by those skilled in the art.

본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도에 따라 그 범위가 다양하다. 일일 투여량으로는, 비경구 투여 시 두류 추출물을 기준으로 하루에 체중 1 kg당 바람직하게 0.01 내지 50 mg, 더 바람직하게는 0.1 내지 30 mg의 양으로 투여되도록, 그리고 경구 투여 시는 본 발명의 두류 추출물을 기준으로 하루에 체중 1 kg당 바람직하게 0.01 내지 100 mg, 더 바람직하게는 0.01 내지 10 mg의 양으로 투여되도록 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.The dosage of the pharmaceutical composition of the present invention varies depending on the patient's body weight, age, sex, health condition, diet, administration time, administration method, excretion rate, and disease severity. The daily dose is preferably 0.01 to 50 mg, more preferably 0.1 to 30 mg per kg of body weight per day on the basis of pulpy extract in the case of parenteral administration, and when administered orally, It may be administered in one to several divided doses so as to be preferably administered in an amount of 0.01 to 100 mg, more preferably 0.01 to 10 mg per kg of body weight per day on the basis of the bean curd extract. However, the dosage may be varied depending on the route of administration, the severity of obesity, sex, weight, age, etc. Therefore, the dosage is not limited to the scope of the present invention by any means.

본 발명의 암 치료 또는 전이 억제용 약학적 조성물은 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.The pharmaceutical composition for cancer treatment or metastasis inhibition of the present invention can be used alone or in combination with methods using surgery, radiation therapy, hormone therapy, chemotherapy and biological response modifiers.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples.

이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.It is to be understood by those skilled in the art that these embodiments are merely illustrative of the present invention and that the scope of the present invention is not construed as being limited by these embodiments.

폐암 세포에서 In lung cancer cells BCAR4 BCAR4 엑손 4(Breast cancer anti-estrogen resistance 4 exon 4)의 발현 수준 확인Expression level of exon 4 (Breast cancer anti-estrogen resistance 4 exon 4)

<1-1> 폐암 세포에서 <1-1> In lung cancer cells BCAR4 BCAR4 엑손 4의 mRNA 발현 수준 확인Examination of mRNA expression level of exon 4

BCAR4는 유방암 조직에서 발현되는 것으로 공지된 바 있으며, 이에 따라 타모시펜(tamoxigen) 내성 유전자로서 역할을 하여 에스트로겐(estrogen)에 의존적인 세포의 세포 생장에 관여하는 것으로 알려져 있다. 이에, 본 발명에서는 BCAR4가 유방암 외의 조직암에서도 발현 수준이 변화할 수 있는지 확인하고자 하였다.BCAR4 has been known to be expressed in breast cancer tissues and is thus known to act as a tamoxigen resistance gene and to participate in cell growth of estrogen-dependent cells. Therefore, in the present invention, it was examined whether BCAR4 expression level could be changed in tissue cancer other than breast cancer.

먼저, 다양한 폐암 세포주(총 25종)를 표준 절차에 따라 배양하였다. 배양한 세포를 수득하여 파쇄한 다음 이로부터 mRNA를 수득한 다음, 역전사 PCR을 수행하여 각각의 세포주에 대한 cDNA를 합성하였다. 또한, 폐암 환자(총 49명)로부터 수득한 조직(총 49 시료)을 준비하고, 각각의 조직 시료로부터 mRNA를 추출한 다음, 역전사 PCR을 수행하여 각각의 시료에 대한 cDNA를 합성하였다. 합성한 cDNA를 주형으로 하고, BCAR4의 엑손 4를 표적으로 증폭하기 위한 정방향 및 역방향 프라이머를 사용하여 각각의 세포주에서의 BCAR4 mRNA의 발현 수준을 실시간 PCR(real-time PCR)으로 확인하였다. 비교 대상으로 확인하기 위해, 유방암 환자(총 23명)로부터 수득한 조직(총 23시료)에 대하여 동일 방법으로 BCAR4 엑손 4의 mRNA 발현 수준을 확인하였다.First, various lung cancer cell lines (total 25) were cultured according to standard procedures. The cultured cells were harvested, disrupted, and then mRNA was obtained. Then, reverse transcription PCR was performed to synthesize cDNA for each cell line. In addition, tissues (49 total samples) obtained from lung cancer patients (total 49) were prepared, mRNA was extracted from each tissue sample, and then reverse transcription PCR was performed to synthesize cDNA for each sample. Using the synthesized cDNA as a template, the expression level of BCAR4 mRNA in each cell line was confirmed by real-time PCR using forward and reverse primers for target amplification of exon 4 of BCAR4 . To confirm the comparison, mRNA expression levels of BCAR4 exon 4 were confirmed in the same manner for tissues obtained from breast cancer patients (total 23) (total 23 samples).

그 결과, 도 1에서 나타난 바와 같이 정상 조직(N)과 암조직(T)에서의 BCAR4 엑손 4의 발현 수준을 확인하였을 때, 유방암환자와 폐암환자의 조직에서 BCAR4 엑손 4의 발현 수준이 증가하는 것을 확인하였다. 특히, 유방암 환자의 암 조직 총 23 시료 중, 9 시료에서 BCAR4 발현 수준이 증가하여 약 30%의 암 조직에서 BCAR4의 발현 수준이 증가하는 것을 확인하였다(도 1a). 폐암에 대하여도 BCAR4 엑손 4의 발현 수준을 확인하였다. 총 25 종의 폐암 세포주 중 SNU1327, Hcc1195 및 NCI-H358 을 포함한 폐암세포주에서 BCAR4의 발현 수준이 유의적으로 증가하는 것을 확인하였다(도 1b). 이를 폐암 환자 유래의 조직에서도 비교한 결과, 총 49 명의 조직시료 중 17 개 시료에서 BCAR4 엑손 4의 발현 수준이 유의적으로 증가하는 것을 확인하였으며, 상기 17 개 시료 중에서 13 개의 시료가 EGFR 또는 KRAS 변이를 가지지 않는 환자로부터 수득된 폐암 조직인 것으로 확인하였다(도 1c). EGFR 또는 KRAS 변이를 가지지 않는 환자로부터 수득된 총 30 개의 시료로부터 확인하였을 때 13 개의 시료에서 BCAR4 발현 수준이 증가하여, 약 43% 암조직에서 정상 조직에 비해 BCAR4 엑손 4의 발현 수준이 유의적으로 증가하는 것을 확인하였다(도 1c). 이를 통해, BCAR4 엑손 4는 폐암과 유방암 조직에서 유의적으로 발현 수준이 증가할 수 있으며, 특히 EGFR 또는 KRAS 돌연변이를 가지지 않은 암세포에서 과발현 빈도가 높은 수준으로 나타나는 것을 확인하였다.As a result, when the level of expression of BCAR4 exon 4 in normal tissue (N) and cancer tissue (T) was confirmed as shown in FIG. 1, expression level of BCAR4 exon 4 was increased in breast cancer patients and lung cancer patient tissues Respectively. In particular, it was confirmed that the cancer tissues of 23 samples of breast cancer patients, and the increase in expression level BCAR4 9 samples increased the level of expression of BCAR4 in about 30% of cancer tissues (Fig. 1a). Expression levels of BCAR4 exon 4 were also confirmed in lung cancer. The expression level of BCAR4 was significantly increased in lung cancer cell lines including SNU1327, Hcc1195 and NCI-H358 among 25 types of lung cancer cell lines (Fig. 1B). As a result, it was confirmed that the expression level of BCAR4 exon 4 was significantly increased in 17 samples from 49 tissue samples. Of the 17 samples, 13 samples were EGFR or KRAS mutation (Fig. 1 (c)). The expression level of BCAR4 was increased in 13 samples from a total of 30 samples obtained from patients without EGFR or KRAS mutation, and the expression level of BCAR4 exon 4 was significantly (Fig. 1C). These results indicate that BCAR4 exon 4 may be significantly increased in lung cancer and breast cancer tissues, and that the frequency of overexpression is high in cancer cells without EGFR or KRAS mutation.

<1-2> <1-2> BCAR4BCAR4 엑손 4 과발현 암세포의 세포 증식률 변화 확인 Identification of cell proliferation rate of exon 4 overexpressed cancer cells

BCAR4 엑손 4가 폐암 세포 및 폐암, 유방암 조직에서 발현 수준이 증가하여 있는 것을 확인하였으므로, BCAR4 엑손 4를 과발현한 암세포의 증식률을 확인하였다. Since the expression level of BCAR4 exon 4 was increased in lung cancer cells, lung cancer and breast cancer tissues, the proliferation rate of cancer cells overexpressing BCAR4 exon 4 was confirmed.

구체적으로, BCAR4 엑손 4를 암호화하는 염기서열(서열번호 2)을 pHRST-IRES-GFP 렌티바이러스 플라스미드 내에 삽입하여, BCAR4 엑손 4 과발현을 위한 벡터를 제조하였다. 그런 다음, 제조한 벡터를 H293 세포에 형질도입(transduction)시켜 렌티 바이러스를 제조하고, 이를 이용하여 정상 기관지 상피세포주(non-tumorigenic bronchial epichelial cell line)인 BEAS-2B 세포주, 폐암 세포주인 NCI-H1299 세포주 또는 유방암 세포주인 MDA-MB231 세포주에 감염시켜 BCAR4 엑손 4의 과발현을 유도하였다. BCAR4 엑손 4의 과발현을 유도한 각각의 세포주를 액체 배지에 접종하고 총 60 시간 동안 배양하여, 접종 개시 시점을 기준으로 한 상대적인 세포수를 측정하여 세포 증식 정도를 확인하였다. 또한, 상기 BCAR4 엑손 4의 과발현을 유도한 각각의 세포주를 배지에 접종하고 약 2 주간 배양하여, 콜로니 형성 정도를 확인하였다(colony forming assay). 정상 대조군으로 사용하기 위해, BCAR4 엑손 4 염기서열을 포함하지 않는 pHRST-IRES-GFP 렌티바이러스 플라스미드 (empty vector) 만을 형질전환시킨 BEAS-2B 세포주, NCI-H1299 세포주 및 MDA-MB231 세포주를 제조하여 동일 방법으로 세포 증식률을 확인하였다.Specifically, a nucleotide sequence (SEQ ID NO: 2) encoding BCAR4 exon 4 was inserted into a plasmid of pHRST-IRES-GFP lentivirus to prepare a vector for overexpression of BCAR4 exon 4. Then, the prepared vector was transduced into H293 cells to prepare a lentivirus. Using this, a BEAS-2B cell line, a non-tumorigenic bronchial epichelial cell line, and a NCI-H1299 And overexpression of BCAR4 exon 4 was induced by infecting the cell line or MDA-MB231 cell line of breast cancer cell line. Each cell line that induced overexpression of BCAR4 exon 4 was inoculated into a liquid medium and cultured for a total of 60 hours. The degree of cell proliferation was determined by measuring the relative number of cells based on the time of initiation of inoculation. In addition, each cell line that induced overexpression of BCAR4 exon 4 was inoculated into the medium and cultured for about 2 weeks to confirm the degree of colony formation (colony forming assay). BEAS-2B cell line, NCI-H1299 cell line and MDA-MB231 cell line transformed with only a pHRST-IRES-GFP lentivirus plasmid (empty vector) containing no BCAR4 exon quaternary sequence were prepared for use as a normal control group Cell proliferation rate.

그 결과 도 2에서 나타난 바와 같이, BCAR4 엑손 4를 과발현하는 세포주에서 세포 성장률 및 콜로니 형성이 증가하는 것을 확인하였다(도 2a 및 도 2b). 각 세포주 중에서, 폐암세포주 뿐만 아니라 유방암 세포주인 MDA-MB231 세포에서 BCAR4 엑손 4의 과발현으로 인한 세포 증식률 및 콜로니 생성능이 높은 수준으로 증가하는 것을 확인하였다.As a result, it was confirmed that cell growth rate and colony formation were increased in the cell line overexpressing BCAR4 exon 4 as shown in Fig. 2 (Figs. 2A and 2B). Among the cell lines, it was confirmed that cell proliferation and colony production capacity due to the overexpression of BCAR4 exon 4 in the lung cancer cell line MDA-MB231 cell as well as the lung cancer cell line were increased to a high level.

폐암 세포 내 융합 유전자 발현 여부의 확인Confirmation of fusion gene expression in lung cancer cells

<2-1> 폐암 조직 내에서 <2-1> In lung cancer tissue Cd63-BCAR4Cd63-BCAR4 융합 유전자의 발현 여부 확인 Confirmation of fusion gene expression

폐암 조직 내에서 BCAR4 엑손 4의 발현 수준이 정상 조직에 비해 유의적으로 증가하는 것을 확인하였고, 폐암조직의 전사체 염기서열 분석법 (RNA-sequencing) 을 실시하여 BCAR4의 엑손4를 포함하는 융합 유전자(fusion gene)의 발현을 확인하였다. 전사체 분석 결과로부터 CD63과 BCAR4 유전자의 융합유전자 임을 확인하였고 이를 분리, 동정하여 pHRST-IRES-GFP 렌티바이러스 플라스미드 내에 삽입함으로써 렌티바이러스벡터를 완성하였다구체적으로, 먼저 융합 유전자를 구성하는 각각의 유전자를 확인하고자, 폐암 환자로부터 수득한 폐암 조직으로부터 BCAR4 암호화 서열을 얻어, BCAR4 융합 유전자의 여부를 생거 서열분석 방법(Sanger sequecing method)으로 염기서열분석하여 확인하였다.The expression level of BCAR4 exon 4 in lung cancer tissues was significantly increased compared with that of normal tissues, and RNA-sequencing of lung cancer tissues was carried out to obtain a fusion gene including exon 4 of BCAR4 fusion gene was confirmed. From the transcript analysis results, it was confirmed that the gene was a fusion gene of CD63 and BCAR4 gene. The gene was isolated and identified and inserted into pHRST-IRES-GFP lentivirus plasmid to complete the lentiviral vector. Specifically, For confirmation, BCAR4 coding sequences were obtained from lung cancer tissues obtained from lung cancer patients, and the presence or absence of the BCAR4 fusion gene was confirmed by base sequence analysis using the Sanger sequencing method.

그 결과, 도 3a에서 나타난 바와 같이 BCAR4 엑손 4 유전자(서열번호 3)의 앞에 CD63 유전자의 엑손 2 및 엑손 3 서열 일부(서열번호 4)가 융합되어 있는 것을 확인하였다(도 3a). 이에 따라, 폐암 조직 내에서 발현되는, CD63-BCAR4 융합 유전자(서열번호 1)의 염기 서열을 확보하였다(도 3a).As a result, it was confirmed that the exon 2 of the CD63 gene and a part of the exon 3 sequence (SEQ ID NO: 4) were fused before the BCAR4 exon 4 gene (SEQ ID NO: 3) (FIG. Thus, the nucleotide sequence of the CD63-BCAR4 fusion gene (SEQ ID NO: 1) expressed in lung cancer tissues was secured (Fig. 3A).

<2-2> <2-2> Cd63-BCAR4Cd63-BCAR4 융합 유전자 과발현 세포주의 제조 Production of fusion gene-overexpressing cell line

이후 실시예를 수행하기 위해, Cd63-BCAR4 융합 유전자를 과발현하는 세포주를 제조하였다.To carry out the following example, a cell line overexpressing the Cd63-BCAR4 fusion gene was prepared.

구체적으로, 상기 실시예 <2-1>에서 확보한 CD63-BCAR4 융합 유전자(서열번호 1)의 염기 서열을 pHRST-IRES-GFP 렌티바이러스 플라스미드에 삽입하여 CD63-BCAR4 융합 유전자 발현을 위한 벡터를 제작하였다. 제작한 벡터는 H293 세포에 형질도입시켜 렌티바이러스를 제조한 다음, 상기 렌티바이러스를 이용하여 정상 기관지 BEAS-2B 세포주에 감염시켜 CD63-BCAR4 융합 유전자의 과발현을 유도하였다. 음성 대조군(control)으로는 pHRST-IRES-GFP 렌티바이러스 플라스미드로부터 제조한 렌티바이러스를 감염시키지 않은 BEAS-2B 세포주를 대상으로 사용하였고, 미발현 대조군(vector)으로는 CD63-BCAR4 융합 유전자를 삽입하지 않은 pHRST-IRES-GFP 렌티바이러스 플라스미드(empty vector)를 사용한 BEAS-2B 세포주를 대상으로 사용하였다.Specifically, the nucleotide sequence of the CD63-BCAR4 fusion gene (SEQ ID NO: 1) obtained in Example <2-1> was inserted into the pHRST- IRES-GFP lentivirus plasmid to construct a vector for CD63-BCAR4 fusion gene expression Respectively. The vector thus prepared was transfected into H293 cells to prepare lentivirus, and then infected with the normal bronchial BEAS-2B cell line using the lentivirus to induce overexpression of the CD63-BCAR4 fusion gene. As a negative control (control), a BEAS-2B cell line not infected with lentivirus prepared from pHRST-IRES-GFP lentivirus plasmid was used as a control. As a non-expression control vector, a CD63-BCAR4 fusion gene was inserted BEAS-2B cell line using an empty vector, pHRST-IRES-GFP lentivirus plasmid, was used as a target.

제조한 실험군 및 대조군 세포 내에서 융합 유전자가 유의적으로 발현되는지 확인하기 위해 유세포분석을 통해 세포 내 GFP의 형광 발색 정도를 확인하였다. 또한, 각 세포주를 파쇄하여 세포의 RNA를 수득해 cDNA를 합성하고 이를 주형으로 하고, CD63-BCAR4 염기서열을 표적하는 프라이머 세트를 사용하여 PCR 증폭을 수행한 후 전기영동하여 CD63-BCAR4 융합 유전자의 발현 여부를 확인하였다. 아울러, CD63-BCAR4 융합 유전자로부터 발현된 단백질의 발현 여부는, 항-HA 항체를 1차 항체로 하여 웨스턴블럿을 수행해 단백질 발현 여부를 확인하였다.In order to confirm the expression of the fusion gene in the prepared experimental group and the control cell, fluorescence of GFP in the cells was confirmed by flow cytometry. In addition, each cell line was disrupted to obtain RNA of cells to synthesize cDNA. As a template, PCR amplification was performed using a primer set targeting the CD63-BCAR4 base sequence, followed by electrophoresis to obtain a CD63-BCAR4 fusion gene Expression. In addition, the expression of the protein expressed from the CD63-BCAR4 fusion gene was confirmed by Western blotting using the anti-HA antibody as the primary antibody.

그 결과 도 3b에서 나타난 바와 같이, 음성 대조군에서는 GFP 형광을 나타내지 않는 반면, 미발현 대조군 및 실험군에서 pHRST-IRES-GFP 포함 렌티바이러스로부터 GFP가 유의적으로 발현되는 것을 확인하였다(도 3b). 또한, CD63-BCAR4 융합 유전자 및 이로부터 발현되는 단백질의 발현 여부를 확인하였을 때, 실험군 세포에서 CD63-BCAR4 융합 유전자가 발현되어 이로부터 암호화 되는 단백질(CD63-BCAR4 융합 단백질)이 유의적으로 발현되는 것을 확인하였다(도 3b). As a result, as shown in FIG. 3B, GFP fluorescence was not observed in the negative control group, but GFP was significantly expressed from the lentivirus containing pHRST-IRES-GFP in the non-expression control group and the experimental group (FIG. In addition, when the expression of the CD63-BCAR4 fusion gene and the protein expressed therefrom is confirmed, the CD63-BCAR4 fusion gene is expressed in the test cell and the protein (CD63-BCAR4 fusion protein) encoded thereby is significantly expressed (Fig. 3B).

CD63-BCAR4CD63-BCAR4 융합 유전자 발현에 따른 세포 특징 변화 확인 Identification of changes in cell characteristics by fusion gene expression

폐암 조직에서 유의적인 발현수준을 나타내는 CD63-BCAR4 융합 유전자를 정상 기관지 상피세포주에서 발현 유도하였을 때, 정상 세포주가 암세포에서 나타내는 특징을 함께 나타낼 수 있는지 여부를 확인하고자 하였다.When the CD63-BCAR4 fusion gene, which expresses significant expression levels in lung cancer tissues, was expressed in the normal bronchial epithelial cell line, it was examined whether or not the normal cell line can exhibit the characteristics represented by cancer cells.

구체적으로, 상기 실시예 <2-2>에서 제조한 CD63-BCAR4 융합 유전자 발현 BEAS-2B 세포주를 0.3×104 세포 내지 2.0×104 세포의 농도로 96 웰 플레이트에 접종한 후, CO2 배양기에서 배양하여 증식 수준을 IncuCyte™ Live-세포 이미징 시스템(Essen Bioscience, Inc., USA)을 사용하여 관찰하였다.Specifically, the Example <2-2> and CD63-BCAR4 fusion gene prepared in the BEAS-2B Cell Line 4 10 × 0.3 to 2.0 × 10 4 cells were inoculated in a 96-well plate at a concentration of cells, CO 2 incubator And the level of proliferation was monitored using an IncuCyte ™ Live-cell imaging system (Essen Bioscience, Inc., USA).

또한, 세포 이주능(migration)을 확인하기 위해서는, 상기 배양한 세포가 웰에 포화 상태로 배양되면, 96-핀 운드 메이커(wound maker)를 사용해 플레이트 바닥을 긁어 세포에 상처(wound)를 유발하였다. 그런 다음, IncuCyte™ Live-세포 이미징 시스템을 이용하여 매 2 시간마다 세포의 이동 정도를 확인하였다.In addition, in order to confirm cell migration, when the cultured cells were cultured in a well in a saturated state, a plate was scratched by using a 96-pin wound maker to cause a wound on the cells . The IncuCyte ™ Live-cell imaging system was then used to confirm cell migration every 2 hours.

그 결과, 도 4에서 나타난 바와 같이 CD63-BCAR4 융합 유전자 과발현 세포에서 미발현 대조군(vector)에 비해 유의적으로 증가된 수준의 세포증식률 및 세포 이주능을 나타내는 것을 확인하였다. CD63-BCAR4 융합 유전자 과발현 세포는 미발현 대조군에 비해 증식 속도가 유의적으로 증가하여, 콜로니 형성 분석(Colony forming assay)을 통해 확인하였을 때 보다 많은 수의 포커스(foci)를 형성하는 것으로 확인하였다(도 4a 및 도 4b). 이주능을 확인하였을 때, CD63-BCAR4 융합 유전자 과발현 세포가 미발현 세포에 비해 유발된 상처부분을 빠르게 채울 수 있어 , 이주능이 보다 높은 수준인 것으로 확인하였다(도 4c 및 도 4d).As a result, it was confirmed that CD63-BCAR4 fusion gene-overexpressing cells showed a significantly increased level of cell proliferation and cell migration ability as compared to the non-expression control vector as shown in FIG. CD63-BCAR4 fusion gene over - expressing cells significantly increased the proliferation rate as compared to the non-expression control, and it was confirmed that a larger number of foci were formed when they were confirmed through a colony forming assay ( 4A and 4B). When the ability to migrate was confirmed, it was confirmed that CD63-BCAR4 fusion gene overexpressing cells could rapidly fill up the injured portion induced compared to the non-expressing cells, and thus the migration ability was higher (FIGS. 4C and 4D).

CD63-BCAR4CD63-BCAR4 융합 유전자 발현에 따른 종양 형성 확인 Confirmation of tumor formation by fusion gene expression

<4-1> <4-1> CD63-BCAR4CD63-BCAR4 융합 유전자 발현 유도 마우스 모델에서 종양 형성 확인 Identification of tumor formation in mouse model of fusion gene expression induction

CD63-BCAR4 융합 유전자를 발현하는 세포는 암세포와 같이 세포 증식속도 및 이주능이 증가하는 것을 확인하여 정상 세포주가 암세포화될 수 있음을 확인하였으므로, 암세포화 되는 세포로부터 종양이 형성되는지 여부를 보다 구체적으로 확인하고자 하였다. Since the cells expressing the CD63-BCAR4 fusion gene have increased cell proliferation rate and migration ability like cancer cells, it has been confirmed that the normal cell line can be cancer cell. Therefore, it is more specifically determined whether or not the tumor is formed from the cell Respectively.

구체적으로, 6 주령의 NOG 마우스를 구입하여 환경에 적응할 수 있도록 사육한 다음, 상기 실시예 <2-2>에서 제조한 CD63-BCAR4 융합 유전자 발현 BEAS-2B 세포주를 5?106 세포의 농도(in PBS)로 상기 마우스의 피하에 주입하여, 종양이 이종이식된 마우스 모델을 제조하였다. 제조한 마우스 모델은 22주간 사육하여 종양 성장 정도를 확인하였다. 미발현 대조군(vector)으로는 CD63-BCAR4 융합 유전자를 삽입하지 않은 pHRST-IRES-GFP 렌티바이러스 플라스미드(empty vector)를 사용한 BEAS-2B 세포주를 이종이식한 마우스 모델을 사용하였다. 실험군 및 대조군 마우스를 22 주간 사육하는 동안 종양의 크기를 측정하고, 사육 기간 종료 후 마우스를 희생하여 형성된 종양 조직 및 간 조직을 수득하였다. 수득한 종양 조직 및 간 조직은 형광 현미경으로 관찰하여 CD63-BCAR4 융합 단백질과 함께 발현되는 GFP 발현 여부를 확인하였다. 그런 다음, 조직 내에서 CD63-BCAR4 융합 유전자의 발현 수준이 유의적으로 나타나는지 확인하기 위해 상기 종양 조직 및 간 조직을 각각 용해(lysis)하여 RNA를 분리하였다. 분리한 RNA로부터 cDNA를 합성하여 이를 주형으로 하고, CD63-BCAR4 염기서열을 표적하는 프라이머 세트를 사용하여 RT-PCR 증폭을 수행한 후 전기영동하여 CD63-BCAR4 융합 유전자의 발현 여부를 확인하였다.Specifically, a breeding to adapt to purchase a NOG mouse of 6 weeks old environment, and then, a CD63-BCAR4 fusion gene expressing BEAS-2B cell line prepared in Example <2-2> 5? Concentration of 10 6 cells ( in PBS) to prepare a mouse xenograft model of the tumor. The prepared mouse model was cultured for 22 weeks to confirm the tumor growth. As a non-expression control vector, a mouse model xenografted with a BEAS-2B cell line using a pHRST-IRES-GFP lentivirus plasmid (empty vector) in which the CD63-BCAR4 fusion gene was not inserted was used. The size of the tumors was measured during the experimental group and the control mice for 22 weeks, and the mice were sacrificed at the end of the rearing period to obtain tumor tissues and liver tissues formed. The obtained tumor tissues and liver tissues were observed by fluorescence microscopy to confirm the expression of GFP expressed together with the CD63-BCAR4 fusion protein. Then, the tumor tissue and liver tissue were each lysed to isolate RNA to confirm expression levels of the CD63-BCAR4 fusion gene in the tissues were significant. RT-PCR amplification was carried out using a primer set targeting the CD63-BCAR4 nucleotide sequence, followed by electrophoresis to confirm the expression of the CD63-BCAR4 fusion gene.

그 결과 도 5a 내지 도 5c에서 나타난 바와 같이, CD63-BCAR4 융합 유전자 발현 정상 기관지상피세포주를 이종이식한 마우스 모델에서 이종지식 8주 이후부터 접종한 피하에 종양 조직이 성장하는 것을 확인하였다(도 5a). 종양 형성이 유도된 마우스를 희생하여 종양 조직 및 간 조직을 확인하였을 때, CD63-BCAR4 미발현 대조군 마우스 모델과 비교하여 접종부위 뿐만 아니라 간에서도 여러 개의 종양이 형성되었음을 확인하였다 (도 5b). 종양 조직과 간 조직 모두에서 GFP의 발현이 나타나는 것을 확인하여, 종양 조직 및 간 조직 모두에서 CD63-BCAR4 융합 단백질의 발현이 나타난 것으로 예상할 수 있었다(도 5b). 이와 함께, 조직을 파쇄한 파쇄물로부터 CD63-BCAR4 융합 유전자 발현을 확인하였을 때, 미발현 대조군에서는 융합 유전자가 발현되지 않는 반면, 실험군 마우스 모델에서는 융합 유전자가 발현되는 것을 확인하였다(도 5c).As a result, as shown in Figs. 5A to 5C, it was confirmed that tumor tissues were grown subcutaneously inoculated from 8 weeks after the heterologous knowledge in a mouse model xenografted with a CD63-BCAR4 fusion gene-expressing normal bronchial epithelial cell line (Fig. 5A ). When tumor tissues and liver tissues were confirmed at the expense of tumor-induced mice, it was confirmed that several tumors were formed not only in the inoculation site but also in the liver as compared with the CD63-BCAR4 non-expression control mouse model (Fig. 5B). GFP expression was observed in both tumor tissues and liver tissues, so that expression of CD63-BCAR4 fusion protein could be expected in both tumor tissue and liver tissue (FIG. 5B). In addition, when CD63-BCAR4 fusion gene expression was confirmed from the disrupted tissue, the fusion gene was not expressed in the non-expression control group, but the fusion gene was expressed in the mouse mouse of the experimental group (FIG. 5C).

<4-2> 마우스 모델에서 증식된 &Lt; 4-2 > CD63-BCAR4CD63-BCAR4 융합 유전자 발현 세포의 이주능 확인 Identification of migration ability of fusion gene-expressing cells

CD63-BCAR4 융합 유전자를 발현하는 세포를 생체 내(in vivo)에 주입하였을 때 세포가 증식하여 종양을 형성하는 것을 확인하였으며, 세포 주입 부위 외에도 주변 간 조직에서 CD63-BCAR4 융합 유전자의 발현 및 종양의 형성을 확인하였으므로, 마우스 모델에서 증식된 CD63-BCAR4 융합 유전자 발현 세포가 주변 조직으로의 전이능을 나타내는지 확인하고자 하였다. CD63-BCAR4 fusion gene was injected in vivo , the cells proliferated to form a tumor. In addition to the cell-injected site, expression of the CD63-BCAR4 fusion gene and expression of the tumor , It was confirmed that CD63-BCAR4 fusion gene-expressing cells proliferating to the surrounding tissues in the mouse model.

구체적으로, 상기 실시예 <4-1>에서 마우스 모델로부터 수득한 종양 조직 및 간 조직을 각각 gentleMACS™ 해리체(gentleMACS™ dissociator)를 사용하여 1차적으로 물리적 파쇄한 다음, 시판되는 키트를 사용하여 물리적 파쇄된 조직에서 세포외 기질을 분해하여 단일 세포 단위로 해리된 세포를 수득하였다. 상기 수득한 세포를 다시 96 웰 플레이트에 접종한 후, CO2 배양기에서 배양하여 포화 상태로 배양한 다음, 96-핀 운드 메이커(wound maker)를 사용해 플레이트 바닥을 긁어 세포에 상처(wound)를 유발하였다. 상처가 유발된 세포는 총 34시간 동안 배양하여 IncuCyte™ Live-세포 이미징 시스템(Essen Bioscience, Inc., USA)을 사용하여 매 2 시간 마다 세포의 이동 정도를 관찰하여, 세포 이동 정도를 확인하였다. 대조군으로서, CD63-BCAR4 미발현 대조군 마우스의 종양 조직으로부터 수득한 세포를 미발현 대조군(empty)으로 사용하였으며, 상기 실시예 <2-2>에서 제조한 CD63-BCAR4 융합 유전자 발현 BEAS-2B 세포를 양성 대조군(CD63-BCAR4)으로 사용하였다.Specifically, the tumor tissues and liver tissues obtained from the mouse model in the above Example <4-1> were first physically disrupted by using a gentleMACS ™ dissociator, respectively, and then, using a commercially available kit The extracellular matrix was broken down in the physically disrupted tissue to obtain dissociated cells on a single cell basis. The obtained cells were inoculated again on a 96-well plate, cultured in a CO 2 incubator, and cultured in a saturated state. Then, the bottom of the plate was scratched with a 96-pin undead maker to cause a wound on the cells Respectively. The wound-induced cells were cultured for a total of 34 hours and the degree of cell migration was observed by observing the degree of cell migration every 2 hours using IncuCyte ™ Live-cell imaging system (Essen Bioscience, Inc., USA). As a control, cells obtained from tumor tissues of CD63-BCAR4 non-expressing control mice were used as an empty expression control, and BEAS-2B cells expressing the CD63-BCAR4 fusion gene prepared in Example <2-2> Positive control (CD63-BCAR4).

그 결과, 도 5d 에서 나타난 바와 같이 미발현 대조군에서는 세포 이주능이 낮아 상처가 난 위치로 세포의 이동이 빠르게 나타나지 않는 반면, CD63-BCAR4 발현 실험군의 경우 세포 이주능이 유의적인 수준으로 나타나, 종양 전이 능력이 높은 수준인 것을 확인하였다(도 5d). 특히, 간 조직 유래의 세포는 양성 대조군보다 다소 높은 수준으로 세포 이주능을 나타내어, 상처가 유발된 위치로의 세포 이주능이 가장 빠르게 나타난 것으로 확인하여, CD63-BCAR4 발현 세포의 전이능이 뛰어남을 확인하였다.As a result, as shown in FIG. 5D, in the non-expression control group, the cell migration ability was not so fast and the cell migration did not appear rapidly. On the other hand, in the CD63-BCAR4 expression test group, the cell migration ability showed a significant level, (FIG. 5D). In particular, it was confirmed that cells derived from liver tissue exhibited cell migration ability at a somewhat higher level than that of positive control, and that the ability of cells to migrate to a wound-induced position was the fastest, and that the transfection ability of CD63-BCAR4 expressing cells was excellent .

CD63-BCAR4CD63-BCAR4 융합 유전자 발현 억제에 따른 암세포 증식 억제 및 이주능 감소 효과의 확인 Confirmation of Cancer Cell Proliferation Suppression and Reducing Ability of Migration by Inhibition of Fusion Gene Expression

비종양 세포인 BEAS-2B 세포에서 CD63-BCAR4 융합 유전자의 발현을 유도하였을 때, 상기 융합 유전자에 의해 비종양성 세포가 암세포화 되는 것을 확인하였으므로, 이를 다시 발현 억제하는 경우에 암세포화된 특성이 유지되는지 확인하고자 하였다.When the expression of the CD63-BCAR4 fusion gene was induced in the non-tumor cell BEAS-2B cells, it was confirmed that the non-cancellous cell was transformed into the cancer cell by the fusion gene. Therefore, .

구체적으로, 상기 실시예 <2-2>에서 제조한 CD63-BCAR4 융합 유전자 발현 BEAS-2B 세포주에, CD63-BCAR4 융합 유전자에 특이적인 siRNA(서열번호 7)를 형질주입하여 CD63-BCAR4 융합 유전자 발현 억제를 유도하였다. 그런 다음, 발현 억제를 유도한 세포를 파쇄하여 RNA를 수득하고, CD63-BCAR4 염기서열을 표적하는 프라이머 세트를 사용해 실시간 PCR(real-time PCR)을 수행하여 CD63-BCAR4 융합 유전자의 발현 수준을 확인하였다. 그런 다음, 상기 발현 억제를 유도한 세포에 대하여 웰 이동유도 분석(trans well assay)을 수행하여 세포 이주능을 확인하였다. 대조군으로서, 미발현 대조군(vector)으로는 CD63-BCAR4 융합 유전자를 삽입하지 않은 플라스미드를 사용한 세포주를 사용하였고, 양성 대조군(CD63-BCAR4)으로는 CD63-BCAR4 융합 유전자 발현 세포주를 사용하였다. 또한, 융합 유전자 특이적인 siRNA를 형질주입한 실험군(CD63-BCAR4+si-CD63-BCAR4)와 비교하여, 음성 대조군(CD63-BCAR4+si-control)으로서 무작위한 서열(random sequence)을 사용하여 제작한 siRNA를 형질주입한 세포주를 사용하였다. Specifically, the Example <2-2> and CD63-BCAR4 fusion gene expression in BEAS-2B cell line, CD63-specific siRNA BCAR4 the fusion gene (SEQ ID NO: 7) by injecting a transfected CD63-BCAR4 fusion gene prepared in Lt; / RTI &gt; Then, the cells inducing the expression inhibition were disrupted to obtain RNA, and real-time PCR was performed using a primer set targeting the CD63-BCAR4 base sequence to confirm the expression level of the CD63-BCAR4 fusion gene Respectively. Then, the cells that induced the expression inhibition were subjected to a trans well assay to confirm cell migration ability. As a control, a non-expressing control (vector) into a cell line with the plasmid was used without inserting a CD63-BCAR4 fusion gene, the positive control (CD63-BCAR4) was used as the CD63-expressing cell lines BCAR4 fusion gene. In addition, compared to the experimental group (CD63-BCAR4 + si-CD63-BCAR4) transfected with the fusion gene-specific siRNA, production using a random sequence as a negative control (CD63-BCAR4 + si-control) One siRNA transfected cell line was used.

그 결과, 도 6a 내지 도 6b, 6c에서 나타난 바와 같이 CD63-BCAR4 융합 유전자 발현 억제를 유도한 실험군 세포에서 특이적 siRNA에 의해 CD63-BCAR4 융합 유전자의 발현이 다시 유의적으로 감소하는 것을 확인하였다(도 6a). CD63-BCAR4 융합유전자의 발현이 억제된 실험군 세포의 세포 증식률 및 이주능을 확인하였을 때, 실험군 세포의 세포 증식률이 현저하게 감소하여 미발현 대조군 수준으로 낮은 세포 증식률을 나타내는 것을 확인하였으며, 세포 이주능 또한 미발현 대조군보다 더 낮은 수준으로 감소하여, 암세포화된 특성을 모두 나타내지 않는 것을 확인하였다(도 6b 및 도 6c).As a result, it was confirmed that the expression of the CD63-BCAR4 fusion gene was again significantly reduced by the specific siRNA in the experimental group cells that induced the inhibition of CD63-BCAR4 fusion gene expression, as shown in FIGS. 6A to 6B and 6C 6A). When the cell proliferation and migration ability of the test cell group in which the expression of the CD63-BCAR4 fusion gene was inhibited was confirmed, it was confirmed that the cell proliferation rate of the test cell group was remarkably decreased and the cell proliferation rate was low to the level of the non-expression control group. And decreased to a level lower than that of the unexpressed control group, indicating that all of the cancer cell lines did not show up (Figs. 6B and 6C).

<110> KONKUK UNIVERSITY INDUSTRIAL COOPERATION CORP <120> Composition for diagnosing tumor using BCAR4 exon 4 or its fusion gene thereof <130> 1062881 <160> 12 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 633 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atggcggtgg aaggaggaat gaaatgtgtg aagttcttgc tctacgtcct cctgctggcc 60 ttttgcgcct gtgcagtggg actgattgcc gtgggtgtcg gggcacagct tgtcctgagt 120 cagaccataa tccagggggc tacccctggc tctctgttgc cagtggtcat catcgcagtg 180 ggtgtcttcc tcttcctggt ggcttttgtg ggctgctgcg gggcctgcaa ggagaactat 240 tgtcttatga tcacgcaaaa aatcaccatg taccaaccta tccaaactta tccatggatg 300 aatctatcca gaagacggga gttccgatgc ttgtcttgct ctgaatgtct gcttgtcacc 360 tgcttagggt tatcgactgt gattctggga ctcattgttg ttctacagga cccctctgac 420 tctgtggttt tctctactgg attaacaatg atagccatag gtgctttttt tgttgtcctc 480 actggagtga cagccctgtg tacggttaca gtcgacgaga acttgcagaa aaccacgagg 540 ctaagactag gagtgatacg aaaaagcgga agtctccaag gaactacaga gccttccatg 600 actcactcaa taatcgctag cacctcgctg tag 633 <210> 2 <211> 210 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Ala Val Glu Gly Gly Met Lys Cys Val Lys Phe Leu Leu Tyr Val 1 5 10 15 Leu Leu Leu Ala Phe Cys Ala Cys Ala Val Gly Leu Ile Ala Val Gly 20 25 30 Val Gly Ala Gln Leu Val Leu Ser Gln Thr Ile Ile Gln Gly Ala Thr 35 40 45 Pro Gly Ser Leu Leu Pro Val Val Ile Ile Ala Val Gly Val Phe Leu 50 55 60 Phe Leu Val Ala Phe Val Gly Cys Cys Gly Ala Cys Lys Glu Asn Tyr 65 70 75 80 Cys Leu Met Ile Thr Gln Lys Ile Thr Met Tyr Gln Pro Ile Gln Thr 85 90 95 Tyr Pro Trp Met Asn Leu Ser Arg Arg Arg Glu Phe Arg Cys Leu Ser 100 105 110 Cys Ser Glu Cys Leu Leu Val Thr Cys Leu Gly Leu Ser Thr Val Ile 115 120 125 Leu Gly Leu Ile Val Val Leu Gln Asp Pro Ser Asp Ser Val Val Phe 130 135 140 Ser Thr Gly Leu Thr Met Ile Ala Ile Gly Ala Phe Phe Val Val Leu 145 150 155 160 Thr Gly Val Thr Ala Leu Cys Thr Val Thr Val Asp Glu Asn Leu Gln 165 170 175 Lys Thr Thr Arg Leu Arg Leu Gly Val Ile Arg Lys Ser Gly Ser Leu 180 185 190 Gln Gly Thr Thr Glu Pro Ser Met Thr His Ser Ile Ile Ala Ser Thr 195 200 205 Ser Leu 210 <210> 3 <211> 378 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 caaaaaatca ccatgtacca acctatccaa acttatccat ggatgaatct atccagaaga 60 cgggagttcc gatgcttgtc ttgctctgaa tgtctgcttg tcacctgctt agggttatcg 120 actgtgattc tgggactcat tgttgttcta caggacccct ctgactctgt ggttttctct 180 actggattaa caatgatagc cataggtgct ttttttgttg tcctcactgg agtgacagcc 240 ctgtgtacgg ttacagtcga cgagaacttg cagaaaacca cgaggctaag actaggagtg 300 atacgaaaaa gcggaagtct ccaaggaact acagagcctt ccatgactca ctcaataatc 360 gctagcacct cgctgtag 378 <210> 4 <211> 255 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 atggcggtgg aaggaggaat gaaatgtgtg aagttcttgc tctacgtcct cctgctggcc 60 ttttgcgcct gtgcagtggg actgattgcc gtgggtgtcg gggcacagct tgtcctgagt 120 cagaccataa tccagggggc tacccctggc tctctgttgc cagtggtcat catcgcagtg 180 ggtgtcttcc tcttcctggt ggcttttgtg ggctgctgcg gggcctgcaa ggagaactat 240 tgtcttatga tcacg 255 <210> 5 <211> 1314 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 agttagtgct gggaaacagt gctaagaagg atacagtggc tagaagtcgt cctgtcgtcc 60 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agttccgatg cttgtcttgc tctgaatgtc tgcttgtcac ctgcttaggg 960 ttatcgactg tgattctggg actcattgtt gttctacagg acccctctga ctctgtggtt 1020 ttctctactg gattaacaat gatagccata ggtgcttttt ttgttgtcct cactggagtg 1080 acagccctgt gtacggttac agtcgacgag aacttgcaga aaaccacgag gctaagacta 1140 ggagtgatac gaaaaagcgg aagtctccaa ggaactacag agccttccat gactcactca 1200 ataatcgcta gcacctcgct gtagttgtac attgaaccct ggcatcttcg tctttggaac 1260 taagtctcct gagcattgtt tttaaataga aataaaatct ggcttttaaa aaaa 1314 <210> 6 <211> 1238 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 agactaggat ccctggaaaa tggagaagct gtgctaatag aggggggcca gaaatcccca 60 ctctagaatg ctgtagaatg ttgggagaca cccaggatgt gagccaggga ctttctggaa 120 gtgtttgttc tggccccacc cgaccccagg cagtccccag ctgtctgcac agtcggatgg 180 ggagggggct tgcacagagt tggagccaga ggagagagct ggctcatccc ctacggtagg 240 atggggaaac ctcacagacc acattgtcac ccggcctcag ctctccgccc cggcgctcag 300 agggtaactc tcacccacct cgtccgcttc tctgaaccag agtgacccag gctgcgctcc 360 gccccgctct cctaccccga gttggcacgg aggcccggca gccatggcgg tggaaggagg 420 aatgaaatgt gtgaagttct tgctctacgt cctcctgctg gccttttgcg cctgtgcagt 480 gggactgatt gccgtgggtg tcggggcaca gcttgtcctg agtcagacca taatccaggg 540 ggctacccct ggctctctgt tgccagtggt catcatcgca gtgggtgtct tcctcttcct 600 ggtggctttt gtgggctgct gcggggcctg caaggagaac tattgtctta tgatcacgtt 660 tgccatcttt ctgtctctta tcatgttggt ggaggtggcc gcagccattg ctggctatgt 720 gtttagagat aaggtgatgt cagagtttaa taacaacttc cggcagcaga tggagaatta 780 cccgaaaaac aaccacactg cttcgatcct ggacaggatg caggcagatt ttaagtgctg 840 tggggctgct aactacacag attgggagaa aatcccttcc atgtcgaaga accgagtccc 900 cgactcctgc tgcattaatg ttactgtggg ctgtgggatt aatttcaacg agaaggcgat 960 ccataaggag ggctgtgtgg agaagattgg gggctggctg aggaaaaatg tgctggtggt 1020 agctgcagca gcccttggaa ttgcttttgt cgaggttttg ggaattgtct ttgcctgctg 1080 cctcgtgaag agtatcagaa gtggctacga ggtgatgtag gggtctggtc tcctcagcct 1140 cctcatctgg gggagtggaa tagtatcctc caggtttttc aattaaacgg attatttttt 1200 cagaccgaaa agagatggtc tgagtttgtc ttagagtg 1238 <210> 7 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD63-BCAR4 siRNA Sequence_Forward <400> 7 ucuuaugauc acgcaaaaaa ucacc 25 <210> 8 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD63-BCAR4 siRNA Sequence_Reverse <400> 8 ggugauuuuu ugcgugauca uaaga 25 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BCAR (Exon4) Primer Sequence_Forward <400> 9 tcaccatgta ccaacctatc ca 22 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BCAR (Exon4) Primer Sequence_Reverse <400> 10 gcgaggtgct agcgattatt 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD63-BCAR4 Junction(for conforming fusion gene) promer_forward <400> 11 accataatcc agggggctac 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD63-BCAR4 Junction(for conforming fusion gene) promer_reverse <400> 12 tcagagcaag acaagcatcg 20 <110> KONKUK UNIVERSITY INDUSTRIAL COOPERATION CORP <120> Composition for diagnosing tumor using BCAR4 exon 4 or its fusion          again <130> 1062881 <160> 12 <170> Kopatentin 2.0 <210> 1 <211> 633 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atggcggtgg aaggaggaat gaaatgtgtg aagttcttgc tctacgtcct cctgctggcc 60 ttttgcgcct gtgcagtggg actgattgcc gtgggtgtcg gggcacagct tgtcctgagt 120 cagaccataa tccagggggc tacccctggc tctctgttgc cagtggtcat catcgcagtg 180 ggtgtcttcc tcttcctggt ggcttttgtg ggctgctgcg gggcctgcaa ggagaactat 240 tgtcttatga tcacgcaaaa aatcaccatg taccaaccta tccaaactta tccatggatg 300 aatctatcca gaagacggga gttccgatgc ttgtcttgct ctgaatgtct gcttgtcacc 360 tgcttagggt tatcgactgt gattctggga ctcattgttg ttctacagga cccctctgac 420 tctgtggttt tctctactgg attaacaatg atagccatag gtgctttttt tgttgtcctc 480 actggagtga cagccctgtg tacggttaca gtcgacgaga acttgcagaa aaccacgagg 540 ctaagactag gagtgatacg aaaaagcgga agtctccaag gaactacaga gccttccatg 600 actcactcaa taatcgctag cacctcgctg tag 633 <210> 2 <211> 210 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Ala Val Glu Gly Gly Met Lys Cys Val Lys Phe Leu Leu Tyr Val   1 5 10 15 Leu Leu Leu Ala Phe Cys Ala Cys Ala Val Gly Leu Ile Ala Val Gly              20 25 30 Val Gly Ala Gln Leu Val Leu Ser Gln Thr Ile Ile Gln Gly Ala Thr          35 40 45 Pro Gly Ser Leu Leu Pro Val Val Ile Ile Ala Val Gly Val Phe Leu      50 55 60 Phe Leu Val Ala Phe Val Gly Cys Cys Gly Ala Cys Lys Glu Asn Tyr  65 70 75 80 Cys Leu Met Ile Thr Gln Lys Ile Thr Met Tyr Gln Pro Ile Gln Thr                  85 90 95 Tyr Pro Trp Met Asn Leu Ser Arg Arg Arg Glu Phe Arg Cys Leu Ser             100 105 110 Cys Ser Glu Cys Leu Leu Val Thr Cys Leu Gly Leu Ser Thr Val Ile         115 120 125 Leu Gly Leu Ile Val Val Leu Gln Asp Pro Ser Asp Ser Val Val Phe     130 135 140 Ser Thr Gly Leu Thr Met Ile Ala Ile Gly Ala Phe Val Val Leu 145 150 155 160 Thr Gly Val Thr Ala Leu Cys Thr Val Thr Val Asp Glu Asn Leu Gln                 165 170 175 Lys Thr Thr Arg Leu Arg Leu Gly Val Ile Arg Lys Ser Gly Ser Leu             180 185 190 Gln Gly Thr Thr Glu Pro Ser Met Thr His Ser Ile Ile Ala Ser Thr         195 200 205 Ser Leu     210 <210> 3 <211> 378 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 caaaaaatca ccatgtacca acctatccaa acttatccat ggatgaatct atccagaaga 60 cgggagttcc gatgcttgtc ttgctctgaa tgtctgcttg tcacctgctt agggttatcg 120 actgtgattc tgggactcat tgttgttcta caggacccct ctgactctgt ggttttctct 180 actggattaa caatgatagc cataggtgct ttttttgttg tcctcactgg agtgacagcc 240 ctgtgtacgg ttacagtcga cgagaacttg cagaaaacca cgaggctaag actaggagtg 300 atacgaaaaa gcggaagtct ccaaggaact acagagcctt ccatgactca ctcaataatc 360 gctagcacct cgctgtag 378 <210> 4 <211> 255 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 atggcggtgg aaggaggaat gaaatgtgtg aagttcttgc tctacgtcct cctgctggcc 60 ttttgcgcct gtgcagtggg actgattgcc gtgggtgtcg gggcacagct tgtcctgagt 120 cagaccataa tccagggggc tacccctggc tctctgttgc cagtggtcat catcgcagtg 180 ggtgtcttcc tcttcctggt ggcttttgtg ggctgctgcg gggcctgcaa ggagaactat 240 tgtcttatga tcacg 255 <210> 5 <211> 1314 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 agttagtgct gggaaacagt gctaagaagg atacagtggc tagaagtcgt cctgtcgtcc 60 tgcctcacag taacatcgtt accgaattct cagcaggtga accaaatgaa atggtcaact 120 gaaagccaac cagggtaaaa cagatctttt atttcttgtt gttgttatta ttattttttt 180 ttatgtgggg acattcaagt gaactgctat atgcatttgc ccccagtctc tccttgtgag 240 aagtgaattt cttcaacgtt tatagaactg aggtattaca ttattggatg aattaagaaa 300 acaatctaac ctgatgtgtg aaaatttctg cttgtgagaa tccgtgttat ttcaattatc 360 caatcaagag cctaattcgt ataaaagaaa cacagcagct tgttgctcat ctttttatct 420 aaggacggtt tgtcttgaca gagggtgtct ggctgttttg gggaaactat tcctgacctt 480 attttgacta aaaagttgcc tgctgtacca gggcctgtga tgtgttgata aaatgccaca 540 caaccatttc tcagtgaaaa gcccaaccgg gacttgagtt atgttggtgg ctatggagtt 600 ctgcaatcca caattgatgt tctctaataa ccagtgacct tgagtgaact gtccccaagg 660 caagagcaac cacagctgcg gggagcgttt ggcaatcact atccccaccc aagcttctcc 720 cttgggtctt gtcctgtcac tctggctgga atacaatggc gtaatcatag ctcactgcgg 780 cctccatctc ctgggttcaa gtgattctcc tgcttcagct tcccaagtat ctgggactac 840 aggcatcaaa aaatcaccat gtaccaacct atccaaactt atccatggat gaatctatcc 900 agaagacggg agttccgatg cttgtcttgc tctgaatgtc tgcttgtcac ctgcttaggg 960 ttatcgactg tgattctggg actcattgtt gttctacagg acccctctga ctctgtggtt 1020 ttctctactg gattaacaat gatagccata ggtgcttttt ttgttgtcct cactggagtg 1080 acagccctgt gtacggttac agtcgacgag aacttgcaga aaaccacgag gctaagacta 1140 ggagtgatac gaaaaagcgg aagtctccaa ggaactacag agccttccat gactcactca 1200 ataatcgcta gcacctcgct gtagttgtac attgaaccct ggcatcttcg tctttggaac 1260 taagtctcct gagcattgtt tttaaataga aataaaatct ggcttttaaa aaaa 1314 <210> 6 <211> 1238 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 agactaggat ccctggaaaa tggagaagct gtgctaatag aggggggcca gaaatcccca 60 ctctagaatg ctgtagaatg ttgggagaca cccaggatgt gagccaggga ctttctggaa 120 gtgtttgttc tggccccacc cgaccccagg cagtccccag ctgtctgcac agtcggatgg 180 ggagggggct tgcacagagt tggagccaga ggagagagct ggctcatccc ctacggtagg 240 atggggaaac ctcacagacc acattgtcac ccggcctcag ctctccgccc cggcgctcag 300 agggtaactc tcacccacct cgtccgcttc tctgaaccag agtgacccag gctgcgctcc 360 gccccgctct cctaccccga gttggcacgg aggcccggca gccatggcgg tggaaggagg 420 aatgaaatgt gtgaagttct tgctctacgt cctcctgctg gccttttgcg cctgtgcagt 480 gggactgatt gccgtgggtg tcggggcaca gcttgtcctg agtcagacca taatccaggg 540 ggctacccct ggctctctgt tgccagtggt catcatcgca gtgggtgtct tcctcttcct 600 ggtggctttt gtgggctgct gcggggcctg caaggagaac tattgtctta tgatcacgtt 660 tgccatcttt ctgtctctta tcatgttggt ggaggtggcc gcagccattg ctggctatgt 720 gtttagagat aaggtgatgt cagagtttaa taacaacttc cggcagcaga tggagaatta 780 cccgaaaaac aaccacactg cttcgatcct ggacaggatg caggcagatt ttaagtgctg 840 tggggctgct aactacacag attgggagaa aatcccttcc atgtcgaaga accgagtccc 900 cgactcctgc tgcattaatg ttactgtggg ctgtgggatt aatttcaacg agaaggcgat 960 ccataaggag ggctgtgtgg agaagattgg gggctggctg aggaaaaatg tgctggtggt 1020 agctgcagca gcccttggaa ttgcttttgt cgaggttttg ggaattgtct ttgcctgctg 1080 cctcgtgaag agtatcagaa gtggctacga ggtgatgtag gggtctggtc tcctcagcct 1140 cctcatctgg gggagtggaa tagtatcctc caggtttttc aattaaacgg attatttttt 1200 cagaccgaaa agagatggtc tgagtttgtc ttagagtg 1238 <210> 7 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD63-BCAR4 siRNA Sequence_Forward <400> 7 ucuuaugauc acgcaaaaaa ucacc 25 <210> 8 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD63-BCAR4 siRNA Sequence_Reverse <400> 8 ggugauuuuu ugcgugauca uaaga 25 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BCAR (Exon 4) Primer Sequence_Forward <400> 9 tcaccatgta ccaacctatc ca 22 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> &Lt; 223 > BCAR (Exon4) Primer Sequence_Reverse <400> 10 gcgaggtgct agcgattatt 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD63-BCAR4 junction (for conforming fusion gene) promer_forward <400> 11 accataatcc agggggctac 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD63-BCAR4 junction (for conforming fusion gene) promer_reverse <400> 12 tcagagcaag acaagcatcg 20

Claims (13)

BCAR4 엑손 4 및 CD63-BCAR4 융합 유전자 중 어느 하나의 mRNA, 또는 이로 암호화되는 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 폐암 진단용 조성물.
A BCAR4 exon 4 and a CD63-BCAR4 fusion gene, or an expression level of a protein encoded by the mRNA.
제 1항에 있어서, 상기 BCAR4 엑손 4는 서열번호 3의 염기서열로 구성되는 것을 특징으로 하는, 폐암 진단용 조성물.
2. The composition for diagnosing lung cancer according to claim 1, wherein the BCAR4 exon 4 comprises the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3.
제 1 항에 있어서, 상기 융합 유전자는 BCAR4 엑손 4의 5' 말단 앞 부분에 파트너 유전자인 CD63의 서열이 연결된 형태로 융합된 유전자인 것을 특징으로 하는, 폐암 진단용 조성물.
The fusion gene according to claim 1, wherein the fusion gene comprises the nucleotide sequence of CD63 Wherein the gene is a gene fused in a linked sequence.
제 1항에 있어서, 상기 융합 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 것을 특징으로 하는, 폐암 진단용 조성물.
2. The composition for diagnosing lung cancer according to claim 1, wherein the fusion gene comprises the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
제 1항에 있어서, 상기 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제는, BCAR4 엑손 4 및 CD63-BCAR4 융합 유전자 중 어느 하나의 mRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머쌍 또는 프로브인 것을 특징으로 하는, 폐암 진단용 조성물.
2. The composition for diagnosing lung cancer according to claim 1, wherein the agent for measuring the expression level of the mRNA is a primer pair or a probe that specifically binds to mRNA of any one of BCAR4 exon 4 and CD63-BCAR4 fusion gene .
제 1항에 있어서, 상기 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는, BCAR4 엑손 4 및 CD63-BCAR4 융합 유전자 중 어느 하나의 mRNA로 암호화는 단백질에 특이적인 항체인 것을 특징으로 하는, 폐암 진단용 조성물.
2. The composition for diagnosing lung cancer according to claim 1, wherein the agent for measuring the expression level of the protein is an mRNA of any one of BCAR4 exon 4 and CD63-BCAR4 fusion gene, wherein the coding is an antibody specific for the protein.
i) 폐암 의심 환자로부터 분리된 시료로부터, BCAR4 엑손 4 및 CD63-BCAR4 융합 유전자 중 어느 하나의 mRNA, 또는 이로 암호화되는 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
ii) 상기 단계 i)에서 측정한 결과를 정상 대조군과 비교하는 단계를 포함하는, 폐암 진단을 위한 정보 제공 방법.
i) measuring the level of expression of mRNA of, or a protein encoded by, a BCAR4 exon 4 and a CD63-BCAR4 fusion gene from a sample isolated from a patient suspected of lung cancer; And
ii) comparing the result measured in step i) with a normal control.
CD63-BCAR4 융합 유전자의 mRNA 발현을 억제하는 siRNA를 포함하는, 폐암 예방, 치료 또는 전이 억제용 약학적 조성물.
A pharmaceutical composition for preventing, treating or inhibiting metastasis of lung cancer comprising an siRNA that inhibits mRNA expression of a CD63-BCAR4 fusion gene.
삭제delete 제 8 항에 있어서, 상기 융합 유전자는, BCAR4 엑손 4의 5' 말단 앞 부분에 파트너 유전자인 CD63의 서열이 연결된 형태로 융합된 유전자인 것을 특징으로 하는, 폐암 예방, 치료 또는 전이 억제용 약학적 조성물.
9. The method according to claim 8, wherein the fusion gene is a gene fused in a form in which a sequence of CD63, a partner gene, is fused to the 5 'end of BCAR4 exon 4, Composition.
제 8항에 있어서, 상기 융합 유전자는, 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 것을 특징으로 하는, 폐암 예방, 치료 또는 전이 억제용 약학적 조성물.
9. The pharmaceutical composition according to claim 8, wherein the fusion gene comprises the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
삭제delete 제 8항에 있어서, 상기 siRNA는 서열번호 7의 염기서열로 구성되는 것을 특징으로 하는, 폐암 예방, 치료 또는 전이 억제용 약학적 조성물.
9. The pharmaceutical composition according to claim 8, wherein the siRNA comprises the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7.
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