KR101995189B1 - Biomarker for non-invasive in vitro diagnosis of a Hepatocellular carcinoma and biokit for diagnosis thereof comprising the same - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 비침습적 체외진단을 위한 간암 진단용 바이오마커 및 이를 포함하는 키트에 관한 것으로, 구체적으로 엑소좀 유래 신규 단백 마커인 Cofilin-1 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는 간암 진단용 바이오마커 조성물, 이를 포함하는 간암 진단용 키트, 및 간암 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 바이오마커 조성물 및 키트는 소량의 혈액만으로도 우수한 민감도와 특이도를 나타내어, 간암 진단에 있어 정확성, 간편성, 및 경제성 측면에서 매우 우수하다.The present invention relates to a biomarker for liver cancer diagnosis for noninvasive in vitro diagnosis and a kit comprising the biomarker for non-invasive in vitro diagnosis, and more particularly to a biomarker composition for diagnosing liver cancer comprising Cofilin-1 protein or a gene coding for the novel protein marker derived from exosome, And a method for providing information necessary for diagnosis of liver cancer. The biomarker composition and kit according to the present invention exhibit excellent sensitivity and specificity even with only a small amount of blood, and are excellent in terms of accuracy, simplicity, and economy in diagnosis of liver cancer.
간세포암(hepatocellular carcinoma; HCC)은 조직검사 및 전형적인 간 조영 CT 또는 MRI 소견으로 진단 할 수 있다. 만성간염, 간경변 환자들과 같은 간암 고위험군은 간암 조기진단을 위한 선별검사(surveillance test)로 초음파 검사 및 혈청 알파태아단백(alpha-fetoprotein; AFP)를 정기적으로 시행하도록 권고 되고 있다. Hepatocellular carcinoma (HCC) can be diagnosed by biopsy and typical CT or MRI findings. High-risk patients with liver cancer such as chronic hepatitis and cirrhosis are recommended to perform ultrasonography and serum alpha-fetoprotein (AFP) regularly as a surveillance test for early diagnosis of liver cancer.
현재 혈청 AFP는 간세포암의 혈액 바이오마커 또는 종양표지자로 가장 널리 사용되고 있다. 그러나 간세포암 환자의 약 40 내지 60 %에서만 혈청 알파태아단백이 상승되어 있어 진단 정확도에 문제가 있어 기존 간암 진단 가이드라인에 AFP가 포함되어 있었으나, 최근 개정된 2018 간세포암종 진료 가이드라인에서는 간암 진단 알고리즘에 AFP가 빠진 상태이다. 이와 같이 현재 간암 환자에서 진단 및 예후 예측을 위한 신뢰성 있는 바이오마커가 없는 상태로 조기 진단 및 예후, 치료 반응 예측을 위한 차세대 혈청 간암 바이오마커 발굴이 절실한 상황이다. 또한 조직 검사의 경우 대부분의 간암 환자가 간경변을 동반하고 있어 출혈 위험도가 다른 암종에 비해 매우 높고, 간암 조직 검사는 간암을 초음파로 타겟하여 조직 검사용 바늘을 피부를 통해 병변으로 삽입하여 조직 검사가 진행되는데, 종양의 위치가 접근이 어렵고 크기가 작은 경우 조직 검사의 타게팅 오류가 발생할 가능성이 높다. 따라서 간암 진단 및 스크리닝을 위한 신뢰성 있는 혈청 바이오마커 개발이 절실한 상황이다. 본 연구는 간세포암 바이오마커, 종양표지자를 개발을 위한 연구이며, 간세포암 바이오마커 또는 종양표지자는 혈액검사를 통하여 간암의 진단 및 예후 예측에 도움을 줄 수 있는 인자를 말한다. Currently, serum AFP is most widely used as a blood biomarker or tumor marker for HCC. However, AFP has been included in the guideline for diagnosis of hepatocellular carcinoma because of the elevation of serum alpha-fetoprotein in only about 40% to 60% of patients with hepatocellular carcinoma. However, recently revised 2018 guidelines for hepatocellular carcinoma AFP is missing. Thus, there is a need to find a next generation serum hepatoma biomarker for early diagnosis and prediction of prognosis and treatment response without a reliable biomarker for diagnosis and prognosis prediction in patients with hepatocellular carcinoma. In the case of histologic examination, most of the patients with liver cancer are accompanied by liver cirrhosis, and the risk of bleeding is very high compared to other carcinomas. Liver cancer examination is targeted to the liver cancer by ultrasonography. The tumor location is difficult to access and the size is small, there is a high possibility of errors in targeting of the biopsy. Therefore, it is urgent to develop a reliable serum biomarker for diagnosis and screening of liver cancer. This study was designed to develop hepatocarcinoma biomarkers and tumor markers, and hepatocarcinoma biomarkers or tumor markers are factors that can help diagnosis and prognosis of liver cancer through blood test.
한편, 종양 유래‘엑소좀(Exosome)’은 암세포에서 만들어져 혈청내로 분비되는 매우 작은 50 내지 100 nm 막구조 물질로서 내부에 여러 가지 단백질 및 유전정보를 포함하고 있는 것으로 알려졌다. On the other hand, the tumor-derived 'Exosome' is a very small 50-100 nm membrane structure substance that is produced in cancer cells and secreted into the serum, and it is known that it contains various proteins and genetic information therein.
암 세포가 혈액으로 분비하는 엑소좀(Exosome)을 검출하여, 암세포 분비 엑소좀 내부 물질을 분석함으로서, 조직 검사 없이 혈액 만으로 암세포 유전체 및 단백체를 확인하는 것을 액체 생검이라고 한다. 최근 액체 생검에 대한 연구가 활발히 진행되고 있는데, 출혈 및 여러 합병증의 위험이 있는 조직 검사를 대체하여 간단한 혈액 체취 만으로 암세포가 분비하는 단백질 및 유전 정보를 얻을수 있어, 향후 진단 바이오마커 발굴을 위한 유용한 방법으로 액체 생검 활용 가능성이 매우 높을 것으로 예측되고 있다. A liquid biopsy is an examination of the exosome secreted by the cancer cell into the blood and analyzing the internal substance of the cancer cell secretory exosome to identify the cancer cell genome and the proteome by only blood without histological examination. Recently, studies on liquid biopsy have been actively carried out. As a result, it is possible to obtain protein and genetic information secreted by cancer cells by using simple blood body odor instead of biopsy, which is a risk of hemorrhage and various complications. The possibility of using liquid biopsies is expected to be very high.
기존 간암 단백체 분석 연구는 간암 조직에서 과발현 되는 단백질 관련 연구가 대부분이다. 비간암 조직에 비해 간암 조직에서 과발현되는 단백질은 천여가지에 달하는 것으로 알려져 있지만, 이중에서 엑소좀을 통해 혈액으로 배출되어 혈액 바이오마커로 활용할 수 있는 단백질에 대한 연구는 간암 분야에서 전무한 상황이다. 이처럼 엑소좀의 활용 가능성과 간암 진단 혈청 바이오마커 발굴의 필요성을 고려하여, 본 연구진은 간암이 혈액으로 분비하는 엑소좀을 검출, 엑소좀 내부 단백체 분석을 통해 간암 엑소좀 특이적으로 과발현 되는 단백질을 발굴하고, 이를 환자 혈액에서 검증하여 우수한 진단 정확도를 보이는 비침습적 간암 바이오마커를 개발하고자 하였다. Most of the studies on protein expression in liver cancer are over-expressed in liver cancer tissue. Although it is known that the protein overexpressed in liver cancer tissues is more than a thousand, compared to non-liver cancer tissues, studies on proteins that can be used as blood biomarkers through exosomes have not been studied in the liver cancer field. Considering the possibility of using exosomes and the necessity of digesting serum biomarkers for diagnosis of hepatocellular carcinoma, we investigated the exosomes secreted from blood of liver cancer, And to develop a noninvasive liver cancer biomarker with excellent diagnostic accuracy.
본 발명의 발명자들은 혈액으로 간편하게 간암인지 여부를 확인할 수 있으며, 진단 예민도도 우수한 비침습적 체외진단을 위한 간암 진단용 바이오마커를 개발하고자 노력하였다. 이에 본 발명자들은 단백체학 (proteoimics) 분석을 통해 간암 세포주에서 유래된 엑소좀에서 특이적으로 과발현되는 Cofilin-1을 동정하였고, 이의 가능성을 대단위 코호트의 NGS data 결과에서 확인하고, 실제 임상 현장에서 수집한 간암 환자 혈청에서 엑소좀을 분리, RNA를 추출하여 정상군에 비해 간암 환자 혈청 엑소좀에서 유의하게 증가된 Cofilin-1의 mRNA의 수준을 확인하였고, 최종적으로 아주대병원 및 가톨릭대 서울성모병원 환자군 혈청 샘플을 ELISA 기법을 통해 간암 특이적이 마커의 효용성을 확인함으로써, 단순한 혈액 감사만으로 간암 환자를 쉽게 선별 및 진단할 수 있다는 것을 알게 되어 본 발명을 완성하였다.The inventors of the present invention have made efforts to develop a biomarker for liver cancer diagnosis for noninvasive in vitro diagnosis, which can confirm whether or not liver cancer is easily caused by blood, and has excellent diagnostic sensitivity. Therefore, the present inventors have identified Cofilin-1, which is specifically overexpressed in exosomes derived from hepatocarcinoma cells, through proteoimic analysis and confirmed the possibility of this in the NGS data of the large cohort, The exosomes were isolated from serum of patients with liver cancer, RNA was extracted, and the level of mRNA of Cofilin-1 was significantly increased in the serum exocose of liver cancer patients compared with the normal group. Finally, serum levels of Cofilin- By confirming the efficacy of the liver cancer-specific marker through the ELISA technique of the sample, it was found that the patient can easily select and diagnose the liver cancer patient with a simple blood test.
따라서 본 발명의 목적은 Cofilin-1 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는 비침습적 체외진단을 위한 간암 진단용 바이오마커 조성물, 이를 포함하는 간암 진단용 키트, 및 간암 진단에 필요한 정보를 제공하는 것이다.Accordingly, an object of the present invention is to provide a biomarker composition for non-invasive in vitro diagnosis comprising a Cofilin-1 protein or a gene encoding the Cofilin-1 protein, a kit for the diagnosis of liver cancer containing the same, and information necessary for diagnosis of liver cancer.
따라서 상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 침습적 체외진단을 위한 간암 진단용 바이오마커 조성물로서, 상기 바이오마커 조성물은 엑소좀 유래 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하되, 상기 엑소좀 유래 단백질은 Cofilin-1인 간암 진단용 바이오마커 조성물을 제공한다.In order to accomplish the above object, the present invention provides a biomarker composition for liver cancer diagnosis for invasive in vitro diagnosis, wherein the biomarker composition comprises a protein derived from exosome or a gene coding therefor, wherein the exosome-derived protein is Cofilin-1 A biomarker composition for human liver cancer diagnosis is provided.
또한, 본 발명은 비침습적 생물학적 시료로부터 엑소좀 유래 단백질인 Cofilin-1 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 검출할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는 간암 진단용 키트를 제공한다.The present invention also provides a kit for the diagnosis of liver cancer, which contains, as an active ingredient, a preparation capable of detecting Cofilin-1 protein or a gene encoding the exosome-derived protein from a non-invasive biological sample.
또한, 본 발명은 (a) 간암 환자의 개체로부터 분리된 비침습적 생물학적 시료에서 엑소좀 유래 단백질인 Cofilin-1 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계의 시료 내 Cofilin-1 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 정상 대조군의 발현 수준과 비교하여 정상 대조군의 발현 수준보다 높은 경우에 간암 환자로 진단하는 단계를 포함하는 간암 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다. (A) measuring the expression level of the exosome-derived protein Cofilin-1 protein or a gene encoding the same, in a non-invasive biological sample isolated from an individual of a liver cancer patient; And (b) comparing the expression level of the Cofilin-1 protein or the gene encoding the Cofilin-1 protein in the sample of step (a) with the expression level of the normal control group and diagnosing the patient as a liver cancer patient when the expression level is higher than that of the normal control group And to provide information necessary for diagnosis of liver cancer.
본 발명에 따른 바이오마커 조성물 및 키트는 비침습적 체외진단이 가능한 것으로, 단순한 혈액 검사만으로도 간암의 환자를 쉽게 선별 및 진단할 수 있다.The biomarker composition and kit according to the present invention are capable of noninvasive in vitro diagnosis, and patients with liver cancer can be easily selected and diagnosed by a simple blood test.
아울러, 소량의 혈액만으로도 높은 진단적 정확도를 갖기에 경제적 측면에서도 유리하여, 향후 간암 진단용 혈청 바이오마커로 유용하게 이용될 수 있다.In addition, even with a small amount of blood, it has high diagnostic accuracy and is economically advantageous. Therefore, it can be usefully used as a serum biomarker for diagnosis of liver cancer in the future.
도 1은 실시예 1-1에서 간암 세포주 및 정상 간세포주로부터 엑소좀 분리 과정을 나타낸 그림이다.
도 2는 실시예 1-1에서 분리한 엑소좀의 형태학적 모습을 확인할 수 있는 투과전자현미경(TEM) 측정 사진이다. 간암 세포주 Hep3B, 간암 세포주 Huh-7, 정상 간세포주 THLE-2에서 엑소좀이 분리된 것으로 확인할 수 있다.
도 3은 실시예 1-1에서 분리한 엑소좀을 검증하기 위해 웨스턴 블롯(Western blot)을 수행한 결과로, 기존 알려진 엑소좀 마커인 LAMP-1, CD63, TSG101, HSC70 단백질의 발현 여부를 확인할 수 있다. 간암 세포주 Hep3B, 간암 세포주 Huh-7, 정상 간세포주 THLE-2에서 엑소좀이 잘 분리된 것으로 확인할 수 있다.
도 4는 간암 세포주 Hep3B, 간암 세포주 Huh-7, 정상 간세포주 THLE-2로 부터 간암 특이적 엑소좀 단백 마커를 동정하기 위한 분석 흐름도이다.
도 5는 엑소좀 단백 마커 동정을 위해 간암 세포주 Hep3B, 간암 세포주 Huh-7, 간세포주 THLE-2에 대하여 벤다이어그램 분석법(Venn diagramic analysis) 및 비감시 클러스터링(unsupervised clustering) 분석법을 이용하여 간암 세포주에서 특이적으로 증가한 단백질 스팟(protein spot)을 분류한 벤다이어그램이다.
도 6은 대단위 간암 코호트 데이터를 통해 후보 단백질 Cofilin-1의 mRNA 발현 수준을 확인한 결과이다. 간암 코호트 테이터로서 TCGA RNA-seq data, ICGC RNA-seq data, 및 GSE77314 RNA-seq data을 분석한 것으로, 실제 환자 조직에서도 Cofilin-1이 높은 fold-changes 수치 값을 보였다.
도 7은 TTCGA 데이터 세트에 대한 산점도 그래프이다. Cofilin-1이 종양 조직에서 유의하게 증가됨을 확인할 수 있다.
도 8은 간암 환자의 엑소좀 내 CFL-1의 mRNA 발현 수준을 실시간 qPCR(Real-time qPCR) 분석한 결과이다. 정상인 혈청과 간암 환자 혈청의 엑소좀으로부터 CFL-1의 mRNA 발현을 확인한 결과 정상인에 비해 간암 환자에서 Cofilin-1의 mRNA 발현이 증가됨을 확인할 수 있다.
도 9는 아주대학교 병원에서 얻은 혈청 샘플에 대해 Cofilin-1 단백질 발현 수준을 측정하기 위해 ELISA 수행한 결과이다. 아주대병원 환자군 샘플에서 ELISA 수행한 결과, 정상군에서 Cofilin-1의 농도는 평균 8.2 ng/ml로 측정되었고 간암환자의 경우 평균 33.56 ng/ml로 측정되었다.
도 10은 가톨릭대학교 서울성모병원에서 얻은 혈청 샘플에 대해 Cofilin-1 단백질 발현 수준을 측정하기 위해 ELISA 수행한 결과이다. 가톨릭대 서울성모병원 환자군 샘플에서 ELISA 수행한 결과, 정상군에서 Cofilin-1의 농도는 평균 7.724 ng/ml로 측정되었고 간암환자의 경우 평균 37.63 ng/ml로 측정되었다.
도 11은 아주대학교 병원 환자군 샘플의 ELISA 결과로부터 ROC 곡선 분석을 수행한 결과이다. 아주대병원 환자군 샘플의 분석 결과, AUC = 0.946으로 측정되었고 95 % 신뢰구간은 0.833 내지 0.992로 평가되었다.
도 12는 가톨릭대학교 서울성모병원 환자군 샘플의 ELISA 결과로부터 ROC 곡선 분석을 수행한 결과이다. 서울성모병원 환자군 샘플의 분석 결과, AUC = 0.925로 측정되었고 95 % 신뢰구간은 0.804 내지 0.982로 평가되었다.
도 13은 아주대학교 병원 환자군 샘플 및 가톨릭대학교 서울성모병원 환자군 샘플을 합하여 ELISA 수행한 결과로부터 ROC 곡선 분석을 수행한 결과이다. 두 기관의 환자 시료를 모두 통합하여 분석하였을 때, AUC = 0.936으로 측정되었고 95 % 신뢰구간은 0.863 내지 0.977로 평가되었다.
도 14는 간암 환자의 혈중 내 Cofilin-1 단백질의 농도를 나타낸 그래프이다. 간암 환자의 혈중 Cofilin-1의 농도는 8.64 ng/mL 측정되었고, 이 경우 민감도는 0.8636(0.7329 내지 0.936), 특이도는 0.9545(0.8487 내지 0.9919)로 측정되었다.FIG. 1 is a view showing the process of separating exosome from liver cancer cell line and normal hepatocyte line in Example 1-1. FIG.
FIG. 2 is a transmission electron microscope (TEM) photograph showing the morphological appearance of the exosome isolated in Example 1-1. FIG. It can be confirmed that exosomes were isolated from liver cancer cell line Hep3B, liver cancer cell line Huh-7 and normal hepatocyte cell line THLE-2.
FIG. 3 shows the results of Western blotting to confirm exosomes isolated in Example 1-1, confirming the expression of known exo-somatic markers LAMP-1, CD63, TSG101 and HSC70 proteins . It can be confirmed that exosomes were well isolated in liver cancer cell line Hep3B, liver cancer cell line Huh-7 and normal hepatocyte cell line THLE-2.
FIG. 4 is a flow chart for identifying liver cancer-specific exo-somatic protein markers from liver cancer cell line Hep3B, liver cancer cell line Huh-7 and normal hepatocyte cell line THLE-2.
FIG. 5 is a graph showing the results of immunohistochemical analysis of hepatocellular carcinoma cell line Hep3B, hepatocellular cell line Huh-7 and hepatocyte THLE-2 for the identification of exosomal protein markers using Venn diagrammatic analysis and unsupervised clustering It is a venn diagram that classifies protein spots that are specifically increased.
FIG. 6 shows the results of confirming the mRNA expression level of the candidate protein Cofilin-1 through the large liver cancer cohort data. Analysis of TCGA RNA-seq data, ICGC RNA-seq data, and GSE77314 RNA-seq data as liver cancer cohort data showed that Cofilin-1 showed high fold-change values in actual patient tissues.
Figure 7 is a scatter plot for the TTCGA data set. Cofilin-1 is significantly increased in tumor tissues.
FIG. 8 shows real-time qPCR (real-time qPCR) analysis of mRNA expression levels of CFL-1 in exosomes in patients with liver cancer. The expression of CFL-1 mRNA from exosomes of normal serum and liver cancer patients was found to be higher than that of normal controls, indicating an increase in mRNA expression of Cofilin-1 in liver cancer patients.
FIG. 9 shows the result of ELISA performed to measure the level of Cofilin-1 protein expression in a serum sample obtained from Ajou University Hospital. The concentration of Cofilin-1 was measured as 8.2 ng / ml in the normal group and 33.56 ng / ml in the liver cancer patients as measured by ELISA in the Ajou University Hospital patient sample.
FIG. 10 shows the results of ELISA performed to measure the level of Cofilin-1 protein expression in serum samples obtained from St. Mary's Hospital of the Catholic University of Korea. The concentration of Cofilin-1 was measured as 7.724 ng / ml in the normal group and 37.63 ng / ml in the liver cancer patients as a result of ELISA in the Catholic University Hospital in Seoul.
FIG. 11 shows the result of ROC curve analysis from the ELISA results of the sample of the patient group of Ajou University Hospital. An analysis of the Ajou University Hospital sample showed AUC = 0.946 and the 95% confidence interval was 0.833 to 0.992.
FIG. 12 shows the result of ROC curve analysis from the ELISA results of the patient group of the Catholic University of Seoul, St. Mary's Hospital. AUC = 0.925 and the 95% confidence interval was estimated as 0.804 to 0.982.
FIG. 13 shows the result of ROC curve analysis from the results of ELISA of the patient sample of Ajou University Hospital and the sample of the patient group of Catholic University Seoul St. Mary's Hospital. AUC = 0.936 and 95% confidence interval were estimated to be 0.863 to 0.977 when both patient samples were analyzed.
14 is a graph showing the concentration of Cofilin-1 protein in blood of a patient with liver cancer. The concentration of Cofilin-1 in the liver of patients with liver cancer was measured to be 8.64 ng / mL, with a sensitivity of 0.8636 (0.7329 to 0.936) and a specificity of 0.9545 (0.8487 to 0.9919).
본 발명자들은 엑소좀 유래 Cofilin-1 단백질이 비침습적 체외진단을 위한 간암 진단용 바이오마커 유용하게 사용될 수 있다는 것을 밝혀냄으로써 본 발명을 완성하였다.The inventors of the present invention have found that Cofilin-1 protein derived from exosome can be used for biomarker for liver cancer diagnosis for noninvasive in vitro diagnosis, and thus completed the present invention.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
본 발명은 비침습적 체외진단을 위한 간암 진단용 바이오마커 조성물로서, 상기 바이오마커 조성물은 엑소좀 유래 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하되, 상기 엑소좀 유래 단백질은 Cofilin-1인 간암 진단용 바이오마커 조성물을 제공한다.The present invention relates to a biomarker composition for the diagnosis of liver cancer for non-invasive in vitro diagnosis, wherein the biomarker composition comprises exosome-derived protein or a gene coding therefor, wherein the exosome-derived protein is a Cofilin- to provide.
본 발명에서“Cofilin-1”은 CFL1로 알려져 있으며, Protein GI accession no. 1025735596일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.In the present invention, " Cofilin-1 " is known as CFL1, and Protein GI accession no. 1025735596, but is not limited thereto.
상기 Cofilin-1 단백질은 엑소좀 유래일 수 있다. 엑소좀(Exosome)이란 30 내지 100 nm의 크기를 갖는 작은 세포막성 수포로서 다양한 세포에서 분비되며 혈액, 혈청, 소변 또는 타액 등과 같은 체액에서 발견된다.The Cofilin-1 protein may be derived from exosomes. Exosome is a small cell membrane vesicle with a size of 30-100 nm and is secreted from various cells and found in body fluids such as blood, serum, urine or saliva.
본 발명의 "진단"은 특정 질병 또는 질환에 대한 한 개체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 개체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 개체의 예후(prognosis)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 개체의 상태를 모니터링하는 것)을 포함한다."Diagnosis" of the present invention includes determining the susceptibility of an individual to a particular disease or disorder, determining whether an individual currently has a particular disease or disorder, determining whether a particular disease or disorder affects an individual Determining the prognosis of the subject, or therametrics (e.g., monitoring the condition of an individual to provide information about the therapeutic efficacy).
또한, 본 발명은 비침습적 생물학적 시료로부터 엑소좀 유래 단백질인 Cofilin-1 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 검출할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는 간암 진단용 키트를 제공한다.The present invention also provides a kit for the diagnosis of liver cancer, which contains, as an active ingredient, a preparation capable of detecting Cofilin-1 protein or a gene encoding the exosome-derived protein from a non-invasive biological sample.
상기 제제는 Cofilin-1 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브; 또는 Cofilin-1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 펩타이드, 앱타머 또는 화합물일 수 있다. The agent may be a primer or a probe that specifically binds Cofilin-1 gene; Or an antibody, peptide, aptamer or compound that specifically binds Cofilin-1 protein.
본 발명에서“비침습적 생물학적 시료”는 혈액, 혈청, 소변 또는 타액일 수 있고, 바람직하게는 혈액 또는 혈청일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In the present invention, a " non-invasive biological sample " may be blood, serum, urine or saliva, preferably blood or serum, but is not limited thereto.
본 발명에서“프라이머”는 짧은 자유 수산화기를 가지는 핵산서열로서 상보적인 템플레이트와 염기쌍을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능하는 짧은 핵산서열을 말한다. 본 발명의 프라이머는 예를 들면, 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법과 같은 당 분야에 공지된 방법을 이용하여 화학적으로 합성할 수 있다.As used herein, the term " primer " refers to a nucleic acid sequence having a short free hydroxyl group, which can form a base pair with a complementary template and serves as a starting point for template strand copying. The primers of the present invention can be chemically synthesized using methods known in the art such as, for example, the phosphoramidite solid support method.
본 발명에서“프로브”는 mRNA와 특이적으로 결합할 수 있는 수개 내지 수백 개의 염기로 이루어진 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링되어 있어 특정 mRNA의 존재유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오타이드 프로브, 단쇄 DNA 프로브, 이중쇄 DNA 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있고 비오틴, FITC, 로다민, DIG 등으로 표지되거나 방사선 동위 원소 등으로 표지될 수 있다.In the present invention, the term " probe " means a nucleic acid fragment such as RNA or DNA consisting of several to several hundred bases capable of specifically binding to mRNA and is labeled to confirm the presence or absence of a specific mRNA. The probe can be produced in the form of an oligonucleotide probe, a short-chain DNA probe, a double-stranded DNA probe, an RNA probe, etc., and can be labeled with biotin, FITC, rhodamine, DIG or the like or labeled with radioisotope.
본 발명에서“항체”는 당해 기술분야에 공지된 용어로서 항원성 부위에 대하여 지시되는 특이적인 면역 글로불린을 의미한다. 본 발명에서의 항체는 본 발명의 Cofilin-1에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 당해 기술분야의 통상적인 방법에 따라 항체를 제조할 수 있다. 상기 항체의 형태는 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체를 포함하며, 모든 면역글로불린 항체가 포함된다. 상기 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2 개의 전체 길이의 중쇄를 갖는 완전한 형태를 의미한다. 또한, 상기 항체는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함된다.As used herein, the term " antibody " means a specific immunoglobulin as indicated in the art and directed against an antigenic site. The antibody in the present invention refers to an antibody that specifically binds to Cofilin-1 of the present invention, and the antibody can be produced according to a conventional method in the art. The forms of the antibodies include polyclonal or monoclonal antibodies, including all immunoglobulin antibodies. The antibody refers to a complete form having two full-length light chains and two full-length heavy chains. The antibody also includes a special antibody such as a humanized antibody.
본 발명에서 "펩타이드"는 표적 물질에 대한 결합력 높은 장점이 있으며, 열/화학 처리시에도 변성이 일어나지 않는다. 또한 분자 크기가 작기 때문에 다른 단백질에 붙여서 융합 단백질로의 이용이 가능하다. 구체적으로, 고분자 단백질 체인에 붙여서 이용이 가능하므로 진단 키트 및 약물전달 물질로 이용될 수 있다.In the present invention, "peptide" has a high binding strength to a target substance and does not cause denaturation even during thermal / chemical treatment. Also, because of its small size, it can be used as a fusion protein by attaching it to other proteins. In particular, it can be used as a diagnostic kit and a drug delivery material because it can be attached to a polymer protein chain.
본 발명에서 "앱타머(aptamer)"는, 그 자체로 안정된 삼차 구조를 가지면서 표적 분자에 높은 친화성과 특이성으로 결합할 수 있는 특징을 가진 특별한 종류의 단일가닥 핵산(DNA, RNA 또는 변형핵산)으로 구성된 폴리뉴클레오티드의 일종을 의미한다. 상술한 바와 같이, 앱타머는 항체와 동일하게 항원성 물질에 특이적으로 결합할 수 있으면서도, 단백질보다 안정성이 높고, 구조가 간단하며, 합성이 용이한 폴리뉴클레오티드로 구성되어 있으므로, 항체를 대체하여 사용될 수 있다.The term " aptamer " in the present invention refers to a specific type of single-stranded nucleic acid (DNA, RNA or modified nucleic acid) having a stable tertiary structure per se and capable of binding with high affinity and specificity to a target molecule. ≪ / RTI > As described above, since the aptamer is composed of a polynucleotide which is capable of specifically binding to an antigenic substance like the antibody and is more stable than the protein, has a simple structure, and is easy to synthesize, .
본 발명에서“키트”는 마커 성분에 특이적으로 결합하는 항체, 기질과의 반응에 의해서 발색하는 표지체가 접합된 2차 항체 접합체(conjugate), 상기 표지체와 발색 반응할 발색 기질 용액, 세척액 및 효소반응 정지용액 등을 포함할 수 있으며, 사용되는 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.In the present invention, the term " kit " includes an antibody specifically binding to a marker component, a secondary antibody conjugate conjugated with a marker that develops upon reaction with the substrate, a coloring substrate solution to be colored with the label, Enzyme reaction termination solutions, and the like, and can be made from a number of separate packaging or compartments, including the reagent components used.
본 발명에서 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 일 예로서 RT-PCR 키트의 경우, 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), Taq-중합효소 및 역전사효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-물(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.In the present invention, the kit may be a kit including essential elements necessary for performing RT-PCR, but the present invention is not limited thereto. As an example, in the case of an RT-PCR kit, in addition to each primer pair specific for the marker gene, a test tube or other appropriate container, reaction buffer, deoxynucleotides (dNTPs), Taq polymerase and reverse transcriptase, DNase, RNase inhibitor , DEPC-water (DEPC-water), sterilized water, and the like.
본 발명의 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 간암의 진단용 유전자를 검출하기 위한 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA가 프로브로 부착되어 있는 기판을 포함하고 기판은 정량 대조군 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA를 포함할 수 있다.The kit of the present invention may be a kit for detecting a diagnostic gene of liver cancer containing essential elements necessary for carrying out a DNA chip. The DNA chip kit may include a substrate to which a cDNA corresponding to a gene or a fragment thereof is attached as a probe, and the substrate may include a cDNA corresponding to a quantitative control gene or a fragment thereof.
또한, 본 발명은 (a) 간암 환자의 개체로부터 분리된 비침습적 생물학적 시료에서 엑소좀 유래 단백질인 Cofilin-1 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계의 시료 내 Cofilin-1 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 정상 대조군의 발현 수준과 비교하여 정상 대조군의 발현 수준보다 높은 경우에 간암 환자로 진단하는 단계를 포함하는 간암 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다. (A) measuring the expression level of the exosome-derived protein Cofilin-1 protein or a gene encoding the same, in a non-invasive biological sample isolated from an individual of a liver cancer patient; And (b) comparing the expression level of the Cofilin-1 protein or the gene encoding the Cofilin-1 protein in the sample of step (a) with the expression level of the normal control group and diagnosing the patient as a liver cancer patient when the expression level is higher than that of the normal control group And to provide information necessary for diagnosis of liver cancer.
상기 (a) 단계에서의 비침습적 생물학적 시료는 혈액, 혈청, 소변 또는 타액일 수 있으나, 바람직하게는 혈액 또는 혈청이다.The noninvasive biological sample in step (a) may be blood, serum, urine or saliva, but preferably blood or serum.
상기 (a) 단계에서의 Cofilin-1 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준은 종래에 개발된 다양한 정량적 또는 정성적 면역분석 프로토콜에 따라 실시될 수 있다. 일 예로서, 효소면역분석법(ELISA), 방사능면역분석법(radioimmnoassay, RIA), 샌드위치 측정법(sandwich assay), 웨스턴 블롯팅, 면역침강법, 면역조직화학염색법(immnohistochemical staining), 유체 세포측정법(flow cytometry), 형광활성화 세포분류법(FACS), 효소기질발색법 및 항원-항체 응집법을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.The expression level of the Cofilin-1 protein or the gene encoding the Cofilin-1 protein in the step (a) may be carried out according to various quantitative or qualitative immunoassay protocols conventionally developed. Examples of such methods include enzyme immunoassay (ELISA), radioimmunoassay (RIA), sandwich assay, Western blotting, immunoprecipitation, immunohistochemical staining, flow cytometry ), Fluorescence activated cell sorting (FACS), enzyme substrate staining and antigen-antibody aggregation methods.
상기 (b) 단계는 상기 (a) 단계의 시료 내 Cofilin-1의 발현 수준을 정상 대조군의 발현 수준과 비교하여 정상 대조군의 발현 수준보다 높은 경우 간암으로 진단할 수 있는 것으로, Cofilin-1 발현 수준은 Cofilin-1 단백질의 mRNA 발현 수준 또는 Cofilin-1 단백질 발현 수준을 의미할 수 있다.In step (b), the expression level of Cofilin-1 in the sample of step (a) is compared with the expression level of the normal control. When the expression level of Cofilin-1 is higher than that of the normal control, May refer to mRNA expression level or Cofilin-1 protein expression level of Cofilin-1 protein.
상기 mRNA 발현 수준은 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(Competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), 정량적 중합효소반응(quantitative RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블롯팅(Northern blotting), 또는 DNA 칩 방식으로 실시될 수 있으나, 반드시 이에 한정하지 않는다.The level of mRNA expression can be determined by RT-PCR, competitive RT-PCR, real-time RT-PCR, quantitative RT-PCR, RNase protection assay (RPA; RNase protection assay, northern blotting, or DNA chip method, but the present invention is not limited thereto.
상기 Cofilin-1 단백질 발현 수준은 웨스턴블랏, ELISA, 방사선면역분석, 면역확산법, 면역 전기영동, 조직 면역염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, 형광활성화 세포분류법(FACS), 질량분광분석, 또는 단백질 마이크로어레이 방식으로 실시될 수 있으나, 반드시 이에 한정하지 않는다. The level of expression of Cofilin-1 protein can be determined by Western blotting, ELISA, radioimmunoassay, immunodiffusion, immunoelectrophoresis, tissue immuno staining, immunoprecipitation assays, complement fixation assays, fluorescence activated cell sorting (FACS), mass spectrometry, Microarray method, but is not limited thereto.
또한, 본 발명은 (a) 정상 간세포주 및 간암 간세포주로부터 엑소좀을 각각 분리하고 엑소좀 내 단백질을 크로마토그래피-질량 분석법을 이용하여 단백질을 분석하는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 분석한 단백질 중 간암 세포주에서 특이적으로 증가한 단백질을 동정하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계에서 동정한 단백질이 간암 특이적 단백질인지 여부를 확인하는 단계를 거쳐, 본 발명에 따른 엑소좀 유래 단백질 Cofilin-1을 선별할 수 있으나, 반드시 이에 한정하지 않는다.The present invention also relates to a method for detecting a protein, comprising the steps of: (a) separating exosomes from normal hepatocellular carcinoma cells and hepatocellular carcinoma cells, and analyzing proteins in the exosome by chromatography-mass spectrometry; (b) identifying a protein specifically elevated in a liver cancer cell line among the proteins analyzed in the step (a); And (c) confirming whether the protein identified in the step (b) is a liver cancer-specific protein, to select the exosome-derived protein Cofilin-1 according to the present invention.
상기 (a) 단계에서 정상 간세포주는 THLE-2이고, 간암 간세포주는 Huh-7 또는 Hep3b일 수 있으나, 반드시 이에 한정하지 않는다. In step (a), the normal hepatocyte may be THLE-2, and the hepatocellular hepatocyte may be Huh-7 or Hep3b, but the present invention is not limited thereto.
상기 (b) 단계에서 동정한 단백질은 Cofilin-1로서, 위에 언급한 바와 같이 Protein GI accession no. 1025735596일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.The protein identified in step (b) is Cofilin-1, and as mentioned above, Protein GI accession no. 1025735596, but is not limited thereto.
상기 (c) 단계에서 간암 특이적 단백질인지 여부는 간암 질병 데이터 베이스를 통계 분석하여 이용하되, 상기 통계 분석 결과 중 종양군과 비종양군의 엑소좀 단백질에 대한 폴드 체인지(fold changes) 값을 기초로 하여 판단할 수 있다. 상기 폴드 체인지(fold changes) 값이 클수록 비종양군과 종양군에서 차이가 나는 단백질로 간주될 수 있다.In step (c), whether liver cancer-specific protein is used is determined by statistical analysis of the liver cancer disease database, and the fold change values of the exosome protein in the tumor group and the non- As shown in FIG. The larger fold change values can be considered as proteins that differ in the non-tumor and tumor groups.
본 발명에서 간암 질병 데이터 베이스는 “빅데이터”의 형태를 지닌 공개된 인간 유전자 발현 데이터로서, 구체적으로 GEO, TCGA, ICGC, ArrayExpress 및 Pan-cancerinitiative 등이 있다. 바람직하게는, 본 발명에서는 대단위 간암 코호트(Cohort; 동일집단) 데이터로, TCGA(The Cancer Genome Atlas) RNA-seq data, ICGC(International Cancer Genome Consortium) RNA-seq data, 또는 access number GSE77314 RNA-seq data일 수 있다. In the present invention, the liver cancer disease database is disclosed as human gene expression data in the form of " Big Data ", specifically GEO, TCGA, ICGC, ArrayExpress and Pan-cancerinitiative. Preferably, in the present invention, the large-scale hepatoma cohort (cohort) data includes the Cancer Genome Atlas (TCGA) data, the International Cancer Genome Consortium (ICGC) RNA-seq data, or the access number GSE77314 RNA-seq data.
상기 (c) 단계 이후, (c) 단계에서 확인한 간암 특이적 단백질 마커가 간암 환자의 혈청에서 검출되는지를 재차 확인하는 (d) 단계를 추가적으로 더 포함할 수 있다.The method may further include the step (d) of checking whether the liver cancer-specific protein marker identified in step (c) is detected in the serum of the liver cancer patient after the step (c).
상기 (d) 단계에서 간암 특이적 단백질 마커가 간암 환자의 혈청에서 검출되는지 여부는 Cofilin-1 단백질 발현 수준 또는 Cofilin-1 단백질의 mRNA 발현 수준을 측정할 수 있다.Whether the liver cancer-specific protein marker is detected in the serum of the liver cancer patient in the step (d) can be determined by measuring the Cofilin-1 protein expression level or the Cofilin-1 protein mRNA expression level.
구체적으로, 상기 Cofilin-1 단백질 발현 수준은 웨스턴블랏, ELISA, 방사선면역분석, 면역확산법, 면역 전기영동, 조직 면역염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, 형광활성화 세포분류법(FACS), 질량분광분석, 또는 단백질 마이크로어레이 방식으로 실시될 수 있으나, 반드시 이에 한정하지 않는다. Specifically, the level of Cofilin-1 protein expression can be measured by Western blotting, ELISA, radioimmunoassay, immunodiffusion, immunoelectrophoresis, tissue immunostaining, immunoprecipitation assay, complement fixation assay, fluorescence activated cell sorting (FACS) , Or a protein microarray method, but the present invention is not limited thereto.
또한, 상기 mRNA 발현 수준은 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(Competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), 정량적 중합효소반응(quantitative RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블롯팅(Northern blotting), 또는 DNA 칩으로 실시될 수 있으나, 반드시 이에 한정하지 않는다. In addition, the mRNA expression level can be measured by RT-PCR, competitive RT-PCR, real-time RT-PCR, quantitative RT-PCR, RNase protection assay (RPA), northern blotting, or DNA chip.
또한, 본 발명에서는 ROC 곡선을 통해 상기 Cofilin-1 바이오마커를 검증할 수 있으나, 반드시 이에 한정하지 않는다. In the present invention, the Cofilin-1 biomarker can be verified through the ROC curve, but the present invention is not limited thereto.
상기 언급한 바와 같이, 본 발명에 따른 Cofilin-1 단백질을 포함하는 간암 진단용 혈청 바이오마커는 소량의 혈액만으로도 높은 진단적 정확도를 갖기에 경제적 측면에서도 유리하여 향후 간암 진단용 바이오마커로 유용하게 이용될 수 있다.As mentioned above, the serum biomarker for diagnosing liver cancer containing the Cofilin-1 protein according to the present invention is economically advantageous because it has a high diagnostic accuracy even with a small amount of blood, and thus can be usefully used as a biomarker for diagnosis of liver cancer have.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. It is to be understood by those skilled in the art that these embodiments are only for describing the present invention in more detail and that the scope of the present invention is not limited by these embodiments in accordance with the gist of the present invention .
이하 CFL1은 본 발명에서의 Cofilin-1이다.Hereinafter, CFL1 is Cofilin-1 in the present invention.
실시예 1. 엑소좀의 분리 및 검증Example 1 Isolation and Validation of Exosomes
1-1. 엑소좀 분리1-1. Isolation of exosome
간암 세포주 Hep3B, 간암 세포주 Huh-7, 정상 간세포주 THLE-2에 대한 각각의 배양액을 준비하고, 각각의 배양액을 원심분리기에 넣고 300×g에서 10 분간 원심분리하여 세포 데브리스(cell debris)를 제거한 다음, 다시 3000×g에서 20 분간 원심분리하여 세포자멸체(apoptotic body)를 제거하였다. 다음으로 100,000×g에서 70 분간 초원심분리하여 엑소좀 분획(exosome fraction)을 분리하고, 0.2 ㎛ 중공(pore)을 갖는 필터를 이용하여 초미세여과(ultrafiltration)를 통해 D-PBS 배지에 부유시킨 엑소좀을 250 ㎕로 농축시켰다(도 1).Each culture medium for liver cancer cell line Hep3B, hepatocellular cell line Huh-7 and normal hepatocyte cell line THLE-2 was prepared, and each culture liquid was put into a centrifuge and centrifuged at 300 xg for 10 minutes to remove cell debris After removal, the cells were centrifuged at 3000 × g for 20 minutes to remove the apoptotic body. Next, the exosome fraction was separated by ultracentrifugation at 100,000 × g for 70 minutes, and the exosome fraction was suspended in D-PBS medium through ultrafiltration using a filter having a pore size of 0.2 μm The exosomes were concentrated to 250 [mu] l (Fig. 1).
1-2. 엑소좀 정제: Opti-prep gradient 원심분리1-2. Exosome purification: Opti-prep gradient centrifugation
실시예 1-1에서 획득한 엑소좀을 더욱 정제하기 위해, 수크로스 구배(sucrose gradient)를 시행하였다. 구체적으로, 설탕 버퍼와 60 % opti-prep gradient 배지(Sigma-Aldrich)를 희석하여 40 %, 20 %, 10 %, 5 %의 수크로스를 포함하는 용액을 각각 준비하였다. 각 농도별 수크로스 용액을 초고속 원심 분리용 튜브에 차례대로 놓고(layering), 실시예 1-1에서 획득한 엑소좀 로딩(loading)하고 초고속 원심분리기(㎕tracentrifuge L-90k, Beckman)에서 100,000 g에서 12 시간 동안 20℃로 초고속 원심분리하였다. 초고속 원심분리한 후, 40 %와 20 % 수크로스 용액 부분에 위치한 엑소좀을 수득하였다. In order to further purify the exosomes obtained in Example 1-1, a sucrose gradient was performed. Specifically, a solution containing 40%, 20%, 10%, 5% sucrose was prepared by diluting a sugar buffer and a 60% opti-prep gradient medium (Sigma-Aldrich). The sucrose solution for each concentration was layered on the ultrahigh-speed centrifuge tube in order to load the exosomes obtained in Example 1-1 and centrifuged at 100,000 g in an ultrafast centrifuge (L-90k, Beckman) Lt; RTI ID = 0.0 > 20 C < / RTI > for 12 hours. After ultra-high-speed centrifugation, exosomes located in the 40% and 20% sucrose solution portions were obtained.
1-3. 엑소좀 분리 검증1-3. Isolation of exosome
1-3-1. 투과전자현미경 측정1-3-1. Transmission electron microscope measurement
간암 세포주 Hep3B, 간암 세포주 Huh-7, 정상 간세포주 THLE-2에 대한 각각의 세포 배양액에서 엑소좀이 잘 분리되었는지 확인하기 위해, 투과전자현미경(Transmission electron micrographs, TEM)을 측정하였다. 그리고, 그 결과를 도 2에 나타내었다. Transmission electron micrographs (TEM) were measured to confirm that the exosomes were well separated in each cell culture medium for hepatoma cell line Hep3B, hepatoma cell line Huh-7 and normal hepatocyte THLE-2. The results are shown in Fig.
도 2를 통해, 간암 세포주 Hep3B, 간암 세포주 Huh-7, 정상 간세포주 THLE-2에서 모두 엑소좀이 잘 분리된 것을 육안으로 확인할 수 있었다.FIG. 2 shows that the exosomes were well isolated from hepatocellular carcinoma cell line Hep3B, hepatoma cell line Huh-7 and normal hepatocyte cell line THLE-2.
1-3-2. 웨스턴 블롯1-3-2. Western blot
일반적인 엑소좀 마커인 LAMP-1, CD63, TSG101, HSC70가 잘 발현되었는지 웨스턴 블롯(Western blot)을 통해 확인하였다. 구체적으로, 웨스턴 블롯은 3개 세포주의 세포 용해물(cell lysate)과 엑소좀을 각각 추출하여 정량한 후 SDS 젤에 전기영동으로 분리하였다. 전기영동이 완료된 젤의 단백질은 Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane으로 옮겨진 후 Anti-LAMP-1 antibody(abcam ab24170) 1:1000으로, Anti-CD63 antibody (ab134045) 1:1000 으로, Anti β-actin antibody(sigma A5441) 1:2500, Anti-TSG101 antibody (abcam ab30871) 1:1000, Anti-HSC70 antibody (abcam 2788) 1:1000으로 1차 항체를 붙인 후 각 해당 단백질의 발현을 확인하였다. 그리고 그 결과를 도 3에 나타내었다.The expression of LAMP-1, CD63, TSG101 and HSC70, which are common exosomal markers, was confirmed by Western blotting. Specifically, western blot was obtained by extracting cell lysate and exosomes from three cell lines and quantitating them, followed by electrophoresis on SDS gels. The proteins of the gels were transferred to polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane, and the anti-LAMP-1 antibody (abcam ab24170) 1: 1000 and anti-CD63 antibody (ab134045) (anti-TSC101 antibody 1: 1000) and anti-HSC70 antibody (abcam 2788) 1: 1000, and then the expression of each protein was confirmed. The results are shown in Fig.
도 3을 통해, 3개의 간암 세포주 Hep3B, 간암 세포주 Huh-7, 정상 간세포주 THLE-2에서 모두 엑소좀이 잘 분리된 것으로 확인할 수 있었다.3, it was confirmed that exosomes were well isolated from three hepatocellular carcinoma cell lines Hep3B, hepatocellular carcinoma cell line Huh-7 and normal hepatocyte cell line THLE-2.
실시예 2 : 간암 특이적 엑소좀 단백질 마커 발굴을 위한 분석 Example 2: Analysis for the detection of liver cancer-specific exosome protein markers
2-1. 프로테오믹스 분석을 통한 엑소좀 단백질 마커 선별2-1. Screening of exosomal protein markers by proteomic analysis
정상 간세포주에 비해 간암 세포주에서 특이적으로 발현되는 단백질 리스트 동정하기 위해, 도 4의 분석 흐름도에 따라 분석을 진행하였다.The analysis was performed according to the analysis flow chart of FIG. 4 in order to identify the protein list specifically expressed in the liver cancer cell line compared to the normal hepatocyte lineage.
먼저 정상 간세포주 THLE-2, 간암 세포주 Huh-7, 간암 세포주 Hep3b 각각의 엑소좀을 질량분석기를 이용하여 분석하였다. 구체적으로, 상기 실시예 1-2에서 분리한 엑소좀에 Internal standard tryptophan-d5 를 첨가한 200 ㎕ 의 메탈올과 혼합하여 잘 저어준 다음, -20℃에서 1 시간 동안 배양하고 이를 4℃에서 15 분간 16,000×g 으로 원심분리하였다. 상층액의 190 ㎕를 수집(collection)한 후 용해액은 제거하였다. 용해액이 제거된 마른 추출물을 15 ㎕ 메탈올로 다시 녹이고 크로마토그래피 분리와 질량분석법(mass spectrometry)을 이용하여 표면 단백질 검출하였다.First, the exosomes of normal hepatocyte THLE-2, hepatoma Huh-7 and liver cancer cell Hep3b were analyzed using a mass spectrometer. Specifically, the exosomes isolated in Example 1-2 were mixed with 200 μl of metalol to which internal standard tryptophan-d5 had been added. The resulting mixture was incubated at -20 ° C. for 1 hour, And centrifuged at 16,000 x g for a minute. 190 [mu] l of the supernatant was collected and the lysate was removed. The dried extract, from which the lysate was removed, was redissolved in 15 μl of methanol and the surface protein was detected by chromatographic separation and mass spectrometry.
다음으로, 정상 간세포주 THLE-2에 비하여 간암 세포주 Hep3B, 간암 세포주 Huh-7에 특이적인 엑소좀 단백질 후보를 선정하기 위해, 각각의 세포주에서 발현된 단백질 스팟(protein spot) 중에서 벤다이어그램 분석법(Venn diagramic analysis)을 이용하여 3개 셀 라인(cell line)에서 발현되는 259 개의 스팟을 선별하였다(도 5). Next, among the protein spots expressed in the respective cell lines, in order to select the exosome protein candidates specific for the liver cancer cell line Hep3B and the hepatoma cell line Huh-7 as compared to the normal hepatocyte cell line THLE-2, Venn diagram analysis and 259 spots expressed in three cell lines were selected using a diagrammatic analysis (Fig. 5).
다음으로 이들의 발현이 간암 특이적인지 여부를 확인하기 위해, 비감시 클러스터링(unsupervised clustering) 분석법을 이용하여 확인하였다. Next, we used unsupervised clustering method to confirm whether these expressions were liver cancer specific.
그 결과, 간세포주인 THLE-2에 비하여 간암 세포주 Hep3B에서 특이적으로 증가되는 94 개의 스팟과 감소되는 23 개의 스팟을 찾을 수 있었으며, Huh-7 세포주에서는 특이적으로 증가되는 53 개의 스팟과 감소되는 58 개의 스팟으로 구분될 수 있었다. As a result, 94 spots and 23 spots specifically increased in hepatocellular carcinoma cell line Hep3B and 23 spots decreased, respectively, compared with hepatocyte host THLE-2. In the Huh-7 cell line, 53 spots specifically increased and 58 It could be divided into four spots.
엑소좀 단백 마커를 찾기 위하여, 특이적으로 발현 변화되는 스팟 중에서 54 개의 스팟을 동정하였다. 그리고 54 개의 스팟에 대해 가장 최신 명명법을 적용하기 위해 DAVID 프로그램을 이용하여 ID conversion 분석을 시행하여 각각의 단백질에 대한 유전자명을 새로이 명명하였다. To identify exosomal protein markers, 54 spots were identified in spots that were specifically expressed. In order to apply the most recent nomenclature to 54 spots, ID conversion analysis was performed using the DAVID program and the gene names for each protein were newly named.
그 결과, 간암 세포주에서 CFL1 단백질이 정상 세포주에 비해서 가장 높은 비율로 증가되어 발현되는 것을 확인할 수 있었다. As a result, it was confirmed that the expression of CFL1 protein in hepatocellular carcinoma cell line was increased at the highest rate as compared with that of normal cell line.
2-2. 대단위 간암 코호트(cohort)를 이용한 CFL1 바이오마커 확인2-2. Identification of CFL1 biomarkers using a coarse liver cohort
TCGA 간암 데이터 등을 이용하여 CFL1 단백질이 실제 환자 조직에서 발현이 높게 나타나는 것을 본다면, 상기 실시예 2-1에서 선정한 CFL1이 간암 진단을 위한 바이오마커로서 이용될 수 있다는 것이 검증된 것으로 판단할 수 있다고 사료되어, TCGA RNA-seq 데이터를 포함한 3개 대규모 환자군의 시퀀싱 데이터를 활용하여 CFL1의 mRNA 발현을 검증하고자 하였다. It can be judged that the CFL1 protein selected in Example 2-1 can be used as a biomarker for the diagnosis of liver cancer if it is observed that the CFL1 protein is highly expressed in the actual patient tissue using TCGA liver cancer data or the like And to examine the mRNA expression of CFL1 using sequencing data from three large-scale patient populations including TCGA RNA-seq data.
구체적으로, TCGA(The Cancer Genome Atlas) RNA-seq data를 수집하였으며, 상기 TCGA 데이터는 총 50 개의 비종양(non-tumor) 샘플과 371 개의 종양(tumor) 샘플로 분석하였다. ICGC RNA-seq data의 경우 비종양 202 개, 종양 243 개를 분석하였다. 또한 GSE77314 RNA-seq data의 경우 50 명의 간암 환자에서 종양 조직과 주변 정상 조직에 대한 시퀀싱 데이터로, raw data를 public DB에서 다운로드 받아 맵핑(mapping)부터 발현(expression)까지 구현한 다음 분석에 사용하였다. 각각의 비종양군에 비해 종양군에서 변화된 발현량을 폴드 체인지(fold-changes)로 나타내었으며, 그 결과를 도 6에 나타내었다. Specifically, the Cancer Genome Atlas (TCGA) RNA-seq data was collected, and the TCGA data was analyzed as a total of 50 non-tumor samples and 371 tumor samples. For ICGC RNA-seq data, 202 non-tumors and 243 tumors were analyzed. In addition, in the case of GSE77314 RNA-seq data, raw data was downloaded from the public DB as mapping data from tumor tissues and surrounding normal tissues in 50 patients with liver cancer, and mapping to expression was used for analysis . The amount of expression expressed in the tumor group was represented by fold-changes compared to the respective non-tumor group, and the results are shown in FIG.
도 6의 결과, TCGA, ICGC, 및 GSE77314 RNA-seq data의 대단위 간암 코호트를 통한 실제 환자 조직에서도 CFL1 mRNA 발현이 높다는 것을 확인할 수 있었으며, 이는 CFL1가 간암 진단을 위한 후보 엑소좀 단백 마커로 이용될 수 있음을 시사한다.As a result of FIG. 6, it was confirmed that CFL1 mRNA expression was also high in actual patient tissues through a large liver cancer cohort of TCGA, ICGC, and GSE77314 RNA-seq data, indicating that CFL1 is used as a candidate exosome protein marker for the diagnosis of liver cancer .
2-3. TTCGA(The Cancer Genomic A) 데이터에 이용한 산점도 평가2-3. Evaluation of scatter plot used for TTCGA (The Cancer Genomic A) data
차세대염기서열분석법(NGS, next-generation sequencing)의 분석 결과인 TCGA 데이터세트(dataset)를 이용하여 산점도(scatter plot) 평가를 하였다. 산점도 평가를 통해, 비종양군과 종양군에 대한 발현을 재검증하고, 병기(tumor stage)에 따라 발현의 증감도 확인할 수 있다. 그 결과를 도 7에 나타내었다. A scatter plot was evaluated using a TCGA data set (dataset) as a result of analysis of next-generation sequencing (NGS). Assessment of acidity indicates that expression in non-tumor and tumor groups can be re-verified and increased or decreased in expression depending on the tumor stage. The results are shown in Fig.
도 7의 결과, CFL1은 비종양 조직에 비해서 종양 조직에서 발현이 통계적으로 유의하게 증가되는 것을 확인하였고, 병기(tumor stage)가 증가함에 따라 유의하게 증가되는 경향을 보이는 것으로 관찰되었다.As a result of FIG. 7, CFL1 showed a statistically significant increase in expression in tumor tissues as compared with that of non-tumor tissues, and it was observed that the CFL1 was significantly increased as the tumor stage increased.
실시예 3. 간암 진단을 위한 혈중 단백질 마커로서의 CFL1 검증Example 3. CFL1 assay as a serum protein marker for the diagnosis of liver cancer
3-1. 간암 환자 및 정상인의 혈청 수집3-1. Serum collection of liver cancer patients and normal persons
아주대학교병원 및 가톨릭대학교 서울성모병원에서 IRB 심사를 통과한 인체자원은행에서 공급받은 정상인 총 44 명과 간암 환자 총 44 명의 혈청을 분양 받아 아래의 실험을 진행하였다. A total of 44 healthy persons and 44 liver cancer patients from the Human Resources Bank passed the IRB screening test at the Aju University Hospital and the Catholic University of Seoul.
비간암(정상인)의 경우 간 질병이 없는 정상군을 대상으로 진행하였으며, 간암(간암 환자)의 경우 아주대학교병원에서 얻은 샘플은 mUICC 기준 IVa/Ivb에 해당하는 환자를 선별하였고, 가톨릭대학교 서울성모병원에서 얻은 샘플은 BCLC를 기준으로 stage C 이상을 선별하여 진행하였다. In the case of liver cancer (liver cancer patient), the samples obtained at Ajou University Hospital were selected for patients with the criteria of mUICC standard IVa / Ivb, and the Catholic University of Seoul Samples obtained from hospitals were screened for stage C or higher based on BCLC.
3-2. 혈청에서 엑소좀 RNA 분리3-2. Isolation of exosome RNA from serum
실시예 3-1에서 준비한 정상인 및 간암 환자 각각의 혈청 300 ㎕을 사용하고 Exosome RNA isolation kit(SeraMir™ Exosome RNA Amplification, Cat #RA806A-1)를 이용하여 제조사의 방법대로 엑소좀 RNA를 추출하였다.Exosomal RNA was extracted by using the Exosome RNA isolation kit (SeraMir ™ Exosome RNA Amplification, Cat # RA806A-1) using 300 μl of each of the normal and liver cancer patients prepared in Example 3-1.
구체적으로, 혈청 300 ㎕에 ExoQuick™ 용액 72 ㎕를 넣고 볼텍싱 해준 후, 4℃에 하루 정도 보관하였다. 다음으로, 환자 혈청 300 ㎕에 ExoQuick™ 용액을 넣어둔 샘플을 13,000 rpm, 4℃, 2 분 동안 원심분리하였다. 생성된 펠렛만 남기고 상층액은 모두 제거 후 1× PBS(Hyclone™) 100 ㎕로 펠렛을 녹인 후 용해용 버퍼(Lysis buffer) 300 ㎕ 와 100 % EtOH 용액 200 ㎕를 첨가 후 볼텍싱을 10 초간 진행하였다.Specifically, 72 μl of ExoQuick ™ solution was added to 300 μl of serum, vortexed, and stored at 4 ° C for about one day. Next, the sample in which the ExoQuick ™ solution was placed in 300 μl of patient serum was centrifuged at 13,000 rpm and 4 ° C for 2 minutes. After removing the supernatant, the pellet was dissolved in 100 μl of 1 × PBS (Hyclone ™). 300 μl of a lysis buffer and 200 μl of a 100% EtOH solution were added, followed by vortexing for 10 seconds Respectively.
상기 샘플 전량 600 ㎕를 스핀 컬럼(Spin Column)과 컬렉션 튜브(Collection Tube)를 이용하여 컬럼(Column)에 옮겨 준 후 13,000 rpm, 4℃, 1 분간 원심분리 진행하여, 컬렉션 튜브에 내려온 용액을 제거 후 워싱 버퍼(Washing Buffer) 400 ㎕를 넣어 주고, 13,000 rpm, 4℃, 1 분간 원심분리 및 컬렉션 튜브에 내려온 용액을 제거 후 반복 작업 후 13,000 rpm, 4℃, 2 분간 원심분리 진행 후 최종 건조시켰다. 여기에 용출 완충액(Elution buffer) 30 ㎕를 첨가하여 2,000 rpm, 4℃, 2 분간 원심분리하고 다시 13,000 rpm, 4℃, 1 분간 최종 원심분리하였다. 수득한 용액을 분광광도계인 NanoDrop ND 1000 분광광도계(NanoDrop Technologies Inc., 미국)를 이용하여 측정하였다.The total volume of the sample was transferred to a column using a spin column and a collection tube and then centrifuged at 13,000 rpm at 4 ° C for 1 minute to remove the solution from the collection tube 400 μl of Washing Buffer was added thereto, followed by centrifugation at 13,000 rpm, 4 ° C. for 1 minute, and removal of the solution from the collection tube. After the repeated operation, the mixture was centrifuged at 13,000 rpm at 4 ° C. for 2 minutes and finally dried . Then, 30 μl of elution buffer was added thereto, followed by centrifugation at 2,000 rpm at 4 ° C for 2 minutes, followed by final centrifugation at 13,000 rpm and 4 ° C for 1 minute. The resulting solution was measured using a spectrophotometer, NanoDrop ND 1000 spectrophotometer (NanoDrop Technologies Inc., USA).
3-3. 실시간 qPCR(Real-time qPCR) 분석을 통한 CFL-1의 mRNA 발현 수준 측정3-3. Measurement of mRNA expression level of CFL-1 by real-time qPCR (Real-time qPCR) analysis
혈청 내 CFL1의 mRNA의 수준을 확인하기 위해, 실시예 3-2에서 분리한 RNA를 miScript RT Ⅱ kit(Cat #218161)를 이용하여 cDNA 합성을 진행하였다. 프라이머는 BLAST 소프트웨어 확인 후 [표 1]과 같이 제작하여 제조사의 방법대로 실시간 qPCR(Real-time qPCR) 분석을 수행하였다.In order to confirm the level of mRNA of CFL1 in serum, the cDNA isolated in Example 3-2 was subjected to cDNA synthesis using miScript RT II kit (Cat # 218161). After confirming the BLAST software, the primer was prepared as shown in [Table 1] and real-time qPCR analysis was performed according to the manufacturer's method.
구체적으로, 상기 실시예 3-2에서 분리한 RNA를 12 ㎕에 맞추고, miScript RT Ⅱ Buffer를 8 ㎕(5× miScript Hiflex buffer는 4 ㎕, 10× miScript Nucleics Mix는 2 ㎕, miScript Reverse TranScriptase Mix는 2 ㎕)를 더하여 총 20 ㎕로 cDNA 합성을 진행하고 합성된 cDNA는 1/20 희석하여 사용하였다.Specifically, 8 μl of miScript RT II buffer (4 μl for 5 × miScript Hiflex buffer, 2 μl for 10 × miScript Nucleics Mix, 2 μl for miScript Reverse TranScriptase Mix) was mixed with 12 μl of the RNA isolated in Example 3-2. 2 μl) was added to synthesize cDNA with a total of 20 μl, and the synthesized cDNA was diluted 1/20.
여기서, qRT-PCR은 CFX Connect™ Optics Module(Bio-rad, Richmond, CA)를 이용하였으며, 최종 반응 산물은 cDNA 4 ㎕, CFL1 primer, qPCR MasterMix(2X)(Gendepot, Cat #Q5602) 5 ㎕ 사용하여 총 10 ㎕로 실험을 진행하였고, 결과는 Bio-rad CFX Maestro software를 이용하여 분석하였다. 그리고 그 결과를 도 8에 나타내었다. The final reaction products were 4 μl of cDNA, 5 μl of CFL1 primer, qPCR MasterMix (2X) (Gendepot, Cat # Q5602) using the CFX Connect ™ Optics Module (BioRad, Richmond, CA) The results were analyzed using Bio-rad CFX Maestro software. The results are shown in Fig.
도 8의 결과, 정상인에 비해 간암 환자에서 Cofilin-1의 mRNA 발현이 증가됨을 확인할 수 있다. As shown in Fig. 8, the expression of Cofilin-1 mRNA was increased in liver cancer patients compared to normal persons.
또한, 간암에서 현재까지 밝혀지지 않은 새로운 신규 엑소좀 단백 마커를 선별하기 위해서 엑소좀 마커 데이터 베이스인 EXOCARTA (http://www.exocarta.org/)에서 기존 마커와 비교 분석을 시행하였다. In addition, we conducted a comparative analysis with existing markers in EXOCARTA (http://www.exocarta.org/), a database of exosomal markers, to screen for new, unexplained new exosomal protein markers in liver cancer.
그 결과, CFL1이 EXOCARTA DB에도 등록되어 있지 않은 새로운 마커라는 것을 확인할 수 있었다. 본 발명에서 CFL1이 간암 진단을 위한 단백질 마커임을 최초로 발견했다는 점에서 의미가 더욱 크다.As a result, it was confirmed that CFL1 is a new marker not registered in EXOCARTA DB. In the present invention, CFL1 is the first to discover that it is a protein marker for the diagnosis of liver cancer.
3-4. ELISA를 통한 CFL-1 단백질 발현 수준 측정3-4. Measurement of CFL-1 protein expression level by ELISA
아주대학교 병원에서 얻은 샘플과 서울성모병원에서 얻은 샘플에 대해 ELISA Kit(mybiosource, Catalog No: MBS2505977 Human CFL1(Cofilin 1, Non-Muscle))를 이용하여 제조사의 방법대로 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)를 수행하였고, 그 결과를 도 9 및 도 10에 나타내었다. (Enzyme-linked immunosorbent assay) using the ELISA kit (mybiosource, Catalog No: MBS2505977 Human CFL1 (
이때 ELISA는 다음과 같은 방법으로 수행되었다. 먼저 CFL1 recombinant protein 1 vial에 샘플 희석완충 용액(sample dilution buffer) 1ml(10ng/mL) 첨가한 후 10 내지 20 초간 볼텍싱하여 표준 대조군(Standard control)을 준비하였다. 또한, 환자의 혈청 샘플을 샘플 희석완충 용액로 1:8로 용해시켜 준비하였다. 다음으로, 플레이트의 각 웰에 표준 대조군과 준비된 샘플 각 100 ㎕씩 넣고 37℃에서 90 분간 인큐베이션 시켰다. 인큐베이션 중 비오틴화된 항체 용액(Biotinylated Detection Ab working solution)을 제조하였다. 플레이트에 들어 있는 샘플을 제거하고, 제조해 둔 비오틴화된 항체 용액 100 ㎕를 각 웰에 넣어준 후, 37℃에서 1 시간 동안 인큐베이션 시켰다. 농축된 HRP 컨쥬게이션 용액(Concentrated HRP Conjugate working solution) 제조하여 인큐베이션 후 비오틴화된 항체 용액을 제거하고 각 웰에 300 ㎕ 워싱 용액으로 세척 진행 후 각 웰에 농축된 HRP 컨쥬게이션 용액을 100 ㎕씩 넣고 37℃에서 30 분 동안 인큐베이션 진행하였다. 인큐베이션 후 농축된 HRP 컨쥬게이션 용액을 제거하고 각 웰에 300 ㎕ 워싱 용액을 넣어 세척 진행하였다. 각 웰에 기질 용액(Substrate Reagent)을 90 ㎕씩 넣은 후 37℃에서 10 분 동안 인큐베이션 하였다. 기질 시약(Substrate Reagent)이 들어있는 각 웰에 정지 용액(stop solution)을 50 ㎕씩 첨가하여 ELISA 판독기(Micro-plate reader)를 이용해 450 nm에서 흡광도(optical density; OD)값을 측정하였다. The ELISA was performed in the following manner. First, 1 ml (10 ng / ml) of sample dilution buffer was added to 1 vial of CFL1 recombinant protein, and then a standard control was prepared by vortexing for 10 to 20 seconds. In addition, patient serum samples were prepared by dissolving 1: 8 with sample dilution buffer. Next, 100 占 퐇 of each of the standard control group and the prepared sample was added to each well of the plate and incubated at 37 占 폚 for 90 minutes. A biotinylated Detection Ab working solution was prepared during incubation. The sample contained in the plate was removed, and 100 μl of the biotinylated antibody solution thus prepared was added to each well, followed by incubation at 37 ° C for 1 hour. Concentrated HRP Conjugate working solution was prepared. After incubation, the biotinylated antibody solution was removed. Each well was washed with 300 μl washing solution, 100 μl of concentrated HRP conjugation solution was added to each well, Incubation was carried out at 37 DEG C for 30 minutes. After the incubation, the concentrated HRP conjugation solution was removed, and 300 μl wash solution was added to each well to perform washing. Substrate solution (Substrate Reagent) was added to each well in an amount of 90 μl, followed by incubation at 37 ° C for 10 minutes. 50 μl of stop solution was added to each well containing Substrate Reagent and the optical density (OD) value was measured at 450 nm using an ELISA reader (Micro-plate reader).
도 9의 결과, 아주대병원 환자군 샘플에서 ELISA 수행 시, 정상군에서의 CFL1의 농도는 평균 8.2 ng/ml로 측정되었고, 간암 환자의 경우 평균 33.56 ng/ml로 측정되었으며, 아주대 간암환자의 CFL1의 혈청 농도는 정상군에 비하여 약 4.09 배 정도 높은 것으로 확인되었다. As a result of FIG. 9, the concentration of CFL1 in the normal group was measured as 8.2 ng / ml in the normal group and 33.56 ng / ml in the hepatoma group when the ELISA was performed in the sample group of Ajou University Hospital. Serum concentration was about 4.09 times higher than normal group.
도 10의 결과, 가톨릭대 서울성모병원 환자군 샘플에서 ELISA 진행 시, 정상군에서의 CFL1의 농도는 평균 7.724 ng/ml로 측정되었고, 간암 환자의 경우 평균 37.63 ng/ml로 측정되었으며, 가톨릭대 간암 환자의 CFL1의 혈청 농도는 정상군에 비하여 약 4.875 배 정도 높은 것으로 확인되었다.As a result, the concentration of CFL1 in the normal group was measured as 7.724 ng / ml in the normal group and 37.63 ng / ml in the hepatocarcinoma group when the ELISA was performed in the sample of the Catholic University Seoul St. Mary's Hospital patients. Serum concentration of CFL1 was about 4.875 times higher than that of normal group.
따라서 간암 환자의 혈청에는 CFL1 단백질이 정상자의 혈청에 비해 약 4 배 이상 많은 것으로, 이는 CFL1이 간암 진단을 위한 혈중 단백질 마커로서 사용될 수 있음을 의미한다.Therefore, CFL1 protein in serum of liver cancer patients is about 4 times more than normal serum, meaning CFL1 can be used as a blood protein marker for the diagnosis of liver cancer.
실시예 4. 통계 분석Example 4. Statistical analysis
4-1. CFL1의 혈중 단백 농도의 ROC Curve 분석4-1. ROC curve analysis of serum protein concentration of CFL1
상기 실시예 3-4의 CFL1에 대한 ELISA 수치를 바탕으로 ROC(receiver operating characteristic) 곡선 분석을 수행하였다. 그 결과를 도 10 내지 도 12에 나타내었다. 도 11은 아주대병원 환자군 샘플에서의 CFL1에 대한 ELISA 수치로 ROC Curve 분석 결과이며, 도 12는 서울성모병원 환자군 샘플에서의 CFL1에 대한 ELISA 수치로 ROC Curve 분석 결과이고, 도 13은 두 기관의 환자 샘플을 통합하여 ROC Curve 분석 결과이다. Based on the ELISA values for CFL1 of Example 3-4, receiver operating characteristic (ROC) curve analysis was performed. The results are shown in Figs. 10 to 12. Fig. FIG. 11 shows the results of ROC curve analysis of CFL1 in the sample of Ajou University Hospital, FIG. 12 shows the results of ROC curve analysis of CFL1 in a sample of patients in Seoul St. Mary's Hospital, FIG. The results of the ROC Curve analysis are summarized in the sample.
여기서, x 축은 특이도, y 축은 민감도로 표현된 것으로, 진단의 정확도는 ROC curve 아래의 면적(area under the ROC curve; AUC)에 의해 측정되며, 면적이 1이라면 완벽한 진단 검사임을 의미한다.The accuracy of the diagnosis is measured by the area under the ROC curve (AUC). If the area is 1, it means that it is a perfect diagnostic test.
도 11의 결과를 보면, 아주대병원 환자군 샘플의 분석 결과, AUC = 0.946으로 측정되었고 95 % 신뢰구간은 0.833 내지 0.992로 평가되었다.The results of Fig. 11 show that AUC = 0.946 and the 95% confidence interval were 0.833 to 0.992, respectively.
도 12의 결과를 보면, 서울성모병원 환자군 샘플의 분석 결과, AUC = 0.925로 측정되었고 95 % 신뢰구간은 0.804 내지 0.982로 평가되었다. As shown in FIG. 12, AUC = 0.925, and the 95% confidence interval was 0.804 to 0.982.
도 13의 결과를 보면, 두 기관의 환자 시료를 모두 통합하여 분석하였을 때, AUC = 0.936으로 측정되었고 95 % 신뢰구간은 0.863 내지 0.977로 평가되었다. The results of FIG. 13 show that when both patient samples were analyzed in a combined manner, AUC was measured as 0.936 and the 95% confidence interval was evaluated as 0.863 to 0.977.
따라서 본 발명에 따른 CFL1은 간암 진단을 위한 바이오마커로서 간암 발병 여부를 높은 정확도로 진단할 수 있음을 알 수 있다.Therefore, it can be seen that CFL1 according to the present invention can diagnose high risk of liver cancer as a biomarker for diagnosis of liver cancer with high accuracy.
4-2. 혈중 CFL1의 농도 척도 4-2. Concentration of plasma CFL1
간암 환자의 혈중 CFL1의 농도를 구하기 위하여 아주대병원 환자군 샘플과 서울성모병원 환자군 샘플을 모두 통합하여 분석에 적용하였다.To obtain the concentration of CFL1 in patients with liver cancer, both samples from Ajou University Hospital and patients from Seoul St. Mary 's Hospital were combined and analyzed.
구체적으로, Microsoft Office Excel 프로그램을 사용하여 혈청의 상대적인 농도를 계산한 후, MedCalc 분석 프로그램을 이용하여 절단값(cut-off value)을 구하였다. 그 결과를 도 14에 나타내었다. 이때 절단값(cut-off value) 이상으로 증가된 시료들의 경우 양성(Positive)으로 절단값(cut-off value) 미만으로 감소된 시료들의 경우 음성(Negative)로 구분하여 분석하였다. 그리고 Fisher's exact test 시행 결과, P<0.0001의 유의성을 나타내고 Relative Risk는 17.5 (95% CI:5.272 내지 63.52)로 나타났으며 오즈비(Odds ratio)의 경우 133 (24.64 내지 599.9)로 나타내었다.Specifically, the relative concentration of serum was calculated using a Microsoft Office Excel program, and a cut-off value was determined using a MedCalc analysis program. The results are shown in Fig. In the case of the samples which were increased more than the cut-off value, the samples which were positive and less than the cut-off value were classified as negative. The relative risk was 17.5 (95% CI: 5.272 to 63.52) in the Fisher's exact test and 133 (24.64 to 599.9) in the odds ratio.
도 14의 결과, 혈중 CFL1의 농도는 8.64 ng/mL로 측정되었고, 이 경우 민감도는 0.8636(0.7329 내지 0.936), 특이도는 0.9545(0.8487 내지 0.9919)로 측정되었는 바, 간암 환자의 경우 혈중에 CFL1가 정상자와 대비하여 약 20 배 이상 높은 것으로, CFL1가 혈중 바이오 단백질 마커로 이용될 수 있음을 재차 확인할 수 있었다.As a result, the concentration of CFL1 in the blood was measured to be 8.64 ng / mL. In this case, the sensitivity was 0.8636 (0.7329 to 0.936) and the specificity was 0.9545 (0.8487 to 0.9919) Was about 20 times higher than that of the normal subjects, confirming that CFL1 could be used as a bio-protein marker in blood.
본 발명은 간암 세포가 혈액으로 분비하는 엑소좀으로부터 간암 특이적으로 과다 발현되는 단백질을 발굴하였고 이를 실제 환자 코호트에서 검증한 것으로, 본 발명에 따른 엑소좀 유래 Cofilin-1 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는 바이오마커 조성물 및 키트는 비침습적 체외진단이 가능하고 종래의 간암 진단바이오마커가 갖지 못하는 높은 진단적 정확도를 구현하였다는 점에서 우수한 발명인 것이다.In the present invention, a protein that is over-expressed in liver cancer-specific expression from exosomes secreted from hepatocarcinoma cells into blood is obtained. The exfoliated Cofilin-1 protein of the present invention or a gene encoding the exosome- The inventive biomarker compositions and kits are excellent inventions in that noninvasive in vitro diagnostics are possible and high diagnostic accuracy that traditional biomarkers of liver cancer do not have is realized.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.While the present invention has been particularly shown and described with reference to exemplary embodiments thereof, it is to be understood that the same is by way of illustration and example only and is not to be construed as limiting the scope of the present invention. It is therefore intended that the scope of the invention be defined by the claims appended hereto and their equivalents.
<110> AJOU UNIVERSITY INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION
<120> Biomarker for non-invasive in vitro diagnosis of a Hepatocellular
carcinoma and biokit for diagnosis thereof comprising the smae
<130> ADP-2019-0038
<160> 2
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CFL1-Forward primer
<400> 1
gcaacaagga ggatctgg 18
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CFL1-Reverse primer
<400> 2
ctgtcagctt cttcttgatg 20
<110> AJOU UNIVERSITY INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION
<120> Biomarker for non-invasive in vitro diagnosis of a Hepatocellular
carcinoma and biokit for diagnosis of the smae
<130> ADP-2019-0038
<160> 2
<170> Kopatentin 1.71
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CFL1-Forward primer
<400> 1
gcaacaagga ggatctgg 18
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CFL1-Reverse primer
<400> 2
Claims (6)
상기 바이오마커 조성물은 엑소좀 유래 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하되,
상기 엑소좀 유래 단백질은 Cofilin-1인 간암 진단용 바이오마커 조성물.
A biomarker composition for the diagnosis of liver cancer for noninvasive in vitro diagnosis from blood or serum biological samples,
Wherein the biomarker composition comprises a protein derived from exosome or a gene coding therefor,
The exosome-derived protein is Cofilin-1 biomarker composition for the diagnosis of liver cancer.
A kit for the diagnosis of liver cancer, which comprises, as an active ingredient, a preparation capable of detecting Cofilin-1 protein or a gene encoding the exosome-derived protein from a non-invasive biological sample of blood or serum.
상기 제제는 Cofilin-1 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브; 또는 Cofilin-1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 펩타이드, 앱타머 또는 화합물 중 어느 하나인 간암 진단용 키트.
3. The method of claim 2,
The agent may be a primer or a probe that specifically binds Cofilin-1 gene; Or a Cofilin-1 protein that specifically binds to Cofilin-1 or Cofilin-1.
상기 키트는 엑소좀 유래 단백질인 Cofilin-1 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하여 정상 대조군에 비해 발현이 증가되었을 경우 간암인 것으로 결정하는 것을 지시하는 설명서를 포함하는 간암 진단용 키트.
3. The method of claim 2,
Wherein the kit comprises instructions for determining the expression level of Cofilin-1, a protein derived from exosome, or a gene encoding the same, and determining that the expression level of Cofilin-1 is higher than that of a normal control.
(b) 상기 (a) 단계의 시료 내 Cofilin-1 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 정상 대조군의 발현 수준과 비교하여 정상 대조군의 발현 수준보다 높은 경우에 간암 환자로 진단하는 단계;
를 포함하는 간암 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.(a) measuring the expression level of the exosome-derived protein Cofilin-1 protein or a gene encoding the exosome-derived protein in a non-invasive biological sample of blood or serum isolated from an individual of a liver cancer patient; And
(b) comparing the expression level of the Cofilin-1 protein or the gene encoding the Cofilin-1 protein in the sample of step (a) with the expression level of the normal control, and diagnosing the patient as a liver cancer patient if the expression level is higher than that of the normal control;
Wherein the method comprises the steps < RTI ID = 0.0 > of: < / RTI >
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| CN114113611A (en) * | 2021-12-13 | 2022-03-01 | 郑州大学 | Biomarker for liver cancer diagnosis and detection kit |
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| KR20180029936A (en) | 2016-09-13 | 2018-03-21 | 사회복지법인 삼성생명공익재단 | Novel Biomarkers For Diagnosing Liver Cancer and Uses Thereof |
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