KR101988735B1 - 류실-tRNA 합성효소의 UNE-L 도메인을 유효성분으로 함유하는 근육증강용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 류실-tRNA 합성효소의 UNE-L 도메인을 유효성분으로 함유하는 근육증강용 조성물에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명에 따른 LRS의 UNE-L 도메인은 Vps34와 상호작용하여 이를 조절하는 부위로서, 상기 도메인은 단백질 합성에 관여하는 mTORC1을 활성화시키며, 근육세포의 분화 및 근섬유의 재생을 증가시키므로, 근육 증강 용도로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

류실-tRNA 합성효소의 UNE-L 도메인을 유효성분으로 함유하는 근육증강용 조성물{COMPOSITIONS FOR MUSCLE ENHANCEMENT COMPRISING UNE-L DOMAIN OF LEUCYL-tRNA SYNTHETASE AS AN ACTIVE INGREDIENT}
본 발명은 류실-tRNA 합성효소의 UNE-L 도메인을 유효성분으로 함유하는 근육증강용 조성물에 관한 것이다.
근육은 인체에서 가장 구성량이 많은 조직으로서 적정한 양의 근육은 인체의 기능적 능력을 유지하고 대사성 질환을 예방하는데 필요하다. 근육의 크기는 근육 내에서 일어나는 동화작용이나 이화작용을 유도하는 세포 내 신호전달 과정에 의해 조절된다. 근육단백질의 분해보다 합성을 유도하는 신호전달 반응이 많이 일어날 경우 근육단백질의 합성이 증가하여 결과적으로 근섬유수가 증가하거나 근육의 크기가 증가하는 근비대가 발생하게 된다. 근육세포의 분화와 근육형성은 myoD, myf5, 미오게닌(myogenin) 또는 mrf4와 같은 다양한 근육조절 인자에 의해 조절된다. 그 중, myoD는 근육분화에 특이적인 유전자의 발현을 개시하고, 중간엽줄기세포가 근원세포로 분화하는 것을 유도한다. MyoD에 의해 조절되는 미오게닌은 근원세포의 결합에 가장 중요한 요소로, 근관세포의 형성에 관여한다. 이 같은 과정을 통해 형성된 근섬유는 다발을 이루어 최종적으로 근육을 형성한다.
반면, 근육단백질의 합성보다 분해를 유도하는 신호전달 반응이 많이 일어날 경우 근위축과 같은 근육 소모 질환이 발생하게 된다. 만성 질환에 따른 근육소모는 운동성 조기 손실을 유발하고 질환과 관련된 사망의 위험성을 증가시킨다. 근육의 미사용으로 인한 근육 소모는 노년층에서 특히 심각한 문제로 영구적 무력함 및 조기 사망뿐만 아니라 골절률을 증가시킬 수 있다. 65-70세 중 약 24%는 노화에 의한 근위축을 경험하고 있으며, 약 20%는 근 기능이 상실된 것으로 알려져 있다. 신체가 노화됨에 따라, 단백질을 합성하는 동화작용에 관여하는 성장 호르몬, 성 호르몬, 유사 인슐린 성장인자 등의 호르몬 분비가 감소되어 근육의 단백질 합성이 저하되고 순환 염증성 사이토카인인 종양괴사인자-알파(TNF-α)의 수치가 증가하게 된다. TNF-α는 손상된 근섬유와 융합하거나 분화를 억제하며, 근육 내 단백질을 분해하는 작용인 이화작용을 촉진하여 결국 골격근 조직의 손실을 일으킨다.
류신은 근육형성에 가장 중요한 역할을 하는 3개의 분지쇄 아미노산(Branched-Chain Amino Acid) 중 하나로, 단백질 합성의 기질일 뿐만 아니라 단백질 대사를 조절하는 신호를 보내는 영양소이다. 류신을 쥐에 경구투여하면 골격근 단백질을 합성하는 비율이 증가되는(Crozier SJ et al., J Nutr. 135:376-382, 2005) 반면, 류신을 제거하면 단백질 합성이 저해된다(Stipanuk MH, Nutr Rev. 65:122-129, 2007). 류신에서 유도된 단백질 합성은 포유류 라파마이신 표적(mTOR; mammalian target of rapamycin), 랩터(raptor), GβL 및 Rheb으로 구성된 포유류 라파마이신 표적 복합체 1(mTORC1; mammalian target of rapamycin complex 1)의 영향을 받는다. mTORC1은 세포 외 통합 및 미토겐(mitogen), 세포에너지상태, 산소수준 및 아미노산 이용 가능성 등의 세포 내 통합에 의해 세포 성장을 조절한다. mTORC1이 활성화되면 번역 개시 단계에서 단백질 합성을 조절하는 리보솜 S6 키나아제 1(S6K1) 및 진핵세포 개시인자 4E 결합 단백질 1(4EBP1; 4E-binding protein 1)이 인산화된다.
mTOR는 세린/트레오닌 단백질 키나아제로서, 성장인자, 영양 또는 스트레스 등과 같은 자극에 의한 세포 성장, 세포 증식, 세포 운동성, 세포 생존, 자가포식(autophagy), 단백질 합성 및 전사를 조절한다. mTOR의 기전은 비만 및 당뇨병을 포함한 대사질환, 신경퇴행성 질환, 심혈관 질환 등과 같은 노화관련 질환뿐만 아니라, 수명조절에도 관련이 있다.
류실-tRNA 합성효소(LRS)는 단백질 합성 및 생존에 필수적이며 아미노산을 활성화시켜 tRNA와 연결시켜주는 효소인 아미노아실-tRNA 합성효소(ARS)의 클래스 Ⅰ 효소이다. 고등진핵세포에서 LRS는 9개의 서로 다른 tRNA 합성효소들과 3개의 비효소적 구성요소로 이루어진 ARS 복합체의 구성요소로 존재한다. LRS는 근육형성에 가장 중요한 역할을 하는 류신을 감지하여 단백질이 합성되고 근육이 형성되도록 하며, LRS와 이의 산물인 Ap4A는 유전자 발현 조절에 의한 면역반응에서 신호전달 조절자로서 작용한다. LRS가 정상적으로 작동하지 않는 경우 암, 당뇨, 노화 등의 질병을 유발한다.
포스포리파아제 D(PLD)는 포스파티딜콜린(PC)의 가수분해를 촉매하여 mTOR의 FKBP12-라파마이신 결합 도메인에 결합하는 포스파티딕산(PA)을 생성한다. PLD1 및 PA는 미토겐에 의한 mTORC1의 활성을 매개하는 것 뿐만 아니라, PLD1은 아미노산에 의해 유도된 Vps34(vacuolar protein sorting 34)를 통해 mTORC1 활성을 중재한다. Vps34는 포유류에서 유일한 클래스 Ⅲ의 PI-3-키나아제로, 아미노산 자극시 포스파티딜 이노시톨로부터 포스파티딜이노시톨-3-인산(PI(3)P)을 생성하고, PLD1을 활성화시킨다.
이에, 본 발명자들은 근육 증강제를 개발하던 중, LRS(Leucyl-tRNA Synthetase)가 아미노산 센서로서 Vps34와 직접적으로 상호작용하여 Vps34를 활성화시키며, Vps34-PLD1은 mTORC1의 LRS 활성을 매개하는데 필요하고, LRS의 UNE-L 도메인이 mTORC1 활성화에 중요한 Vps34 및 PLD1의 활성에 필수적임을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 류실-tRNA 합성효소의 UNE-L 도메인 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 근육증강용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 류실-tRNA 합성효소의 UNE-L 도메인 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 근육 질환 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 류실-tRNA 합성효소의 UNE-L 도메인 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 함유하는 근육증강용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 류실-tRNA 합성효소의 UNE-L 도메인 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 함유하는 근육 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
아울러, 본 발명은 근육 질환의 예방 또는 치료용 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 LRS의 UNE-L 도메인은 Vps34와 상호작용하여 이를 조절하는 부위로서, 상기 도메인은 단백질 합성에 관여하는 mTORC1을 활성화시키며, 근육세포의 분화 및 근섬유의 재생을 증가시키므로, 근육 증강 용도로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 LRS에 의한 Vps34 및 pS6K1의 활성 조절을 확인한 도이다.
도 2는 IRS 및 EPRS에 의한 Vps34의 활성 조절을 확인한 도이다.
도 3은 LRS가 Vps34를 경유하여 mTOR의 활성화를 유도하는지 확인한 도이다.
도 4는 LRS에서 Vps34의 결합위치를 확인한 도이다.
도 5는 LRS에서 Vps34의 활성위치를 확인한 도이다.
도 6은 비자기포식 복합체에서 LRS와 Vps34의 상호작용을 확인한 도이다.
도 7은 류신 자극의 유무에 따른 LRS의 Vps34 활성 조절 정도를 확인한 도이다.
도 8은 LRS에 의한 PLD1의 활성 조절을 확인한 도이다.
도 9는 IRS 및 EPRS에 의한 PLD의 활성 조절을 확인한 도이다.
도 10은 LRS에 의한 PLD1 및 mTOR의 리소좀으로의 이동을 확인한 도이다.
도 11은 LRS에 의한 mTORC1 활성 조절에 PLD1의 관여 여부를 확인한 도이다.
도 12는 Vps34-PLD 경로에서 LRS의 류신 결합의 역할을 확인한 도이다.
도 13은 LRS의 UNE-L 도메인에 의한 PLD1의 활성과 S6K1의 활성 증가를 확인한 도이다.
도 14는 LRS의 UNE-L 도메인에 의한 미오게닌 발현 증가를 확인한 도이다.
도 15는 LRS의 UNE-L 도메인에 의한 마우스 근육 세포의 분화 지수, 융합 지수 및 근관세포 크기의 증가를 확인한 도이다.
도 16은 LRS의 UNE-L 도메인에 의한 마우스의 전경골근에서 근섬유 재생의 증가를 확인한 도이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 류실-tRNA 합성효소의 UNE-L 도메인 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 함유하는 근육증강용 조성물을 제공한다.
상기 류실-tRNA 합성효소의 UNE-L 도메인은 통상의 기술분야에 알려진 어떠한 서열로 구성되는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 UNE-L 도메인은 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드일 수 있다.
상기 폴리펩티드는 UNE-L 도메인의 아미노산 서열뿐만 아니라, 상기 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 이의 단편을 포함한다. 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드는 본 발명의 폴리펩티드와 80％ 이상, 구체적으로는 90％ 이상, 더욱 구체적으로는 95％ 이상의 상동성을 가질 수 있다. 상기 폴리펩티드는 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위 내에서, 아미노산 잔기의 결실, 삽입, 치환 또는 이들의 조합에 의해서 상이한 서열을 가지는 아미노산의 변이체 또는 단편일 수 있다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 또는 펩티드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다. 경우에 따라서는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation) 등으로 수식(modification)될 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드는 통상의 기술분야에 알려진 어떠한 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 UNE-L 도메인을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드는 UNE-L 도메인의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열뿐만 아니라, 상기 폴리뉴클레오티드와 실질적으로 동일한 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 이의 단편을 포함한다. 실질적으로 동일한 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 폴리뉴클레오티드와 80％ 이상, 구체적으로는 90％ 이상, 더욱 구체적으로는 95％ 이상의 상동성을 가질 수 있다. 상술한 바와 같이, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 이와 동등한 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 한, 하나 이상의 염기서열이 치환, 결실 또는 삽입된 변이체를 포함할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 LRS가 Vps34의 활성화의 상위 조절자이고(도 1 참조), 상기 Vps34의 활성화가 IRS 및 EPRS에 의해 조절되지 않으며(도 2 참조), 아미노산 자극에 의한 LRS를 경유한 mTOR의 활성화에 Vps34가 필요하고(도 3 참조), Vps34에 대한 LRS의 결합부위가 LRS의 361-720 아미노산 내에 존재하고(도 4 참조), 특히 LRS의 C 말단의 UNE-L 도메인이 Vps34의 활성에 중요함을 확인하였다(도 5 참조).
또한, 비자기포식 Vps34 복합체만이 mTOR 아미노산 신호에 관여하며, LRS는 비자기포식 복합체에서 Vps34와 특이적으로 결합하고(도 6 참조), LRS가 Vps34의 활성을 직접적으로 조절하며, 여기에는 류신이 중요한 역할을 함을 확인하였으며(도 7 참조), LRS는 PLD1의 상위 조절자로(도 8 참조), LRS-PLD 경로의 하위에 mTORC1이 있고(도 11 참조), LRS의 녹다운은 아미노산에 의해 유도된 PLD1 및 mTOR가 리소좀으로 이동하는 것을 억제하는(도 10 참조) 반면, IRS 및 EPRS는 PLD의 조절자가 아님을 확인하였다(도 9 참조).
또한, LRS의 류신 결합은 Vps34-PLD1 경로의 활성에 필요하며, LRS가 아미노산 센서로서의 역할을 함을 확인하였으며(도 12 참조), LRS의 UNE-L 도메인의 아미노산 단편만의 발현으로도 야생형 LRS와 유사한 정도로 PLD1 및 S6K1을 활성화시킴을 통해, LRS의 C-말단의 UNE-L 도메인은 PLD1과 S6K1의 활성을 조절하는 주요한 부위임을 확인하였다(도 13 참조).
아울러, UNE-L 도메인은 마우스 근육 세포 C2C12 세포 분화의 마커인 미오게닌(myogenin)의 발현 증가(도 14 참조), 마우스 근육 세포의 분화 지수, 융합 지수, 근관세포 크기가 모두 증가(도 15 참조), BaCl2로 근육 손상시킨 마우스의 전경골근에서 근섬유의 증가(도 16 참조)를 확인하였다.
또한, 본 발명은 류실-tRNA 합성효소의 UNE-L 도메인 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 함유하는 근육 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 UNE-L 도메인은 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 UNE-L 도메인은 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 상기 근육 질환은 근육의 감소로 유발되는 질환, 구체적으로, 긴장감퇴증, 근위축증, 근이영양증, 근육 퇴화증, 근무력증 또는 근육감소증일 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 LRS가 아미노산 센서로서 Vps34와 직접적으로 상호작용하여 Vps34를 활성화시키며, Vps34-PLD1은 mTORC1의 LRS 활성을 매개하는데 필요하고, LRS의 UNE-L 도메인이 mTORC1 활성화에 중요한 Vps34, PLD1 및 S6K1의 활성에 필수적임을 확인하였다(도 1 내지 도 13 참조).
상기 약학적 조성물은 약학적 조성물 전체 중량에 대하여 유효성분인 본 발명에 따른 류실-tRNA 합성효소의 UNE-L 도메인을 10 내지 95 중량%로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 상기 유효성분 외에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 추가로 함유할 수 있다.
본 발명의 조성물은 또한 생물학적 제제에 통상적으로 사용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 둘 이상의 이들의 조합을 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 조성물을 생체 내에 전달하는데 적합한 것이면 특별히 제한되지 않으며, 예로서, Merck Index, 13th ed., Merck & Co. Inc. 에 기재된 화합물, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 또는 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합한 것일 수 있다. 이때, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다.
상기 조성물을 제제화할 경우, 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조된다.
본 발명의 조성물은 경구제제 또는 비경구제제로 제형화 될 수 있다. 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 트로키제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 하나 이상의 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스, 락토오스 및 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 첨가될 수 있다. 한편, 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 또는 시럽제 등이 해당되는데, 여기에는 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등과 같은 부형제가 포함될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제 등의 주사제가 포함될 수 있다.
비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 또는 비경구 투여될 수 있으며, 비경구 투여는 피부 외용 또는 복강내 주사, 직장내 주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사 또는 흉부내 주사 주입방식중 선택될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여된다. 이는 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물 등에 따라 달라질 수 있다. 본 발명의 조성물은 단독 또는 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있다. 병용 투여시, 투여는 순차적 또는 동시일 수 있다.
그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명에 따른 약학적 조성물에 포함되는 유효성분의 양은 0.001 ~ 10,000 mg/㎏, 구체적으로는 0.1 g ~ 5 g/kg 일 수 있다. 상기 투여는 하루에 1회일 수 있고, 수회로 나뉠 수도 있다.
아울러, 본 발명은 1) Vps34 단백질을 발현하는 세포에 류실-tRNA 합성효소 C 말단의 UNE-L 도메인 및 피검시료를 처리하는 단계; 2) 상기 단계 1)의 세포를 배양하는 단계; 및 3) 상기 단계 2)의 배양액에서 PLD1 또는 S6K1의 활성을 측정하여 UNE-L 도메인을 처리하지 않은 대조군에 비해 활성을 증가시키는 피검시료를 선별하는 단계를 포함하는, 근육 질환의 예방 또는 치료용 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
상기 UNE-L 도메인은 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 UNE-L 도메인은 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 상기 근육 질환은 근육의 감소로 유발되는 질환, 구체적으로, 긴장감퇴증, 근위축증, 근이영양증, 근육 퇴화증, 근무력증 또는 근육감소증일 수 있다.
상기 피검시료는 펩타이드, 단백질, 항체, 비펩타이드성 물질, 합성 물질, 화학물질, 핵산, 천연물, 천연화합물, 반합성물질, 발효 생산물, 세포 추출액, 식물 추출액, 동물 조직 추출액 및 혈장으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 또는 하나 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.
LRS와 Vps34 단백질의 상호작용 확인
아미노산 자극에 의한 LRS와 Vps34 단백질의 상호작용을 하기와 같은 방법으로 확인하였다.
<1-1> LRS에 의한 Vps34 및 mTORC1의 활성 조절
LRS가 Vps34 활성화의 조절자인지 확인하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
구체적으로, LRS의 shRNA(shLRS) 또는 대조군으로 무작위(scrambled) 서열의 shRNA(control)를 발현하는 렌티바이러스를 HEK293 세포에 형질도입(transduction)하였다. 이를 10% 소태아혈청(FBS)이 포함된 DMEM 배지를 이용하여 37℃, 5% CO2 조건에서 3일 동안 배양하였다. LRS의 shRNA는 shLRS-1(TRCN0000290440) 및 shLRS-2(TRCN0000290511)를 사용하였고, 무작위 서열의 shRNA는 이전에 기술된 것을 사용하였다(Yoon, et al., J Cell Biol., 2011 195(3);435-447). 렌티바이러스 패키징과 형질도입은 논문에 기술된 방법에 따라 수행하였다(Sun, et al., Proc Natl Acad Sci USA., 2008, 105(24);8286-8291). Vps15와 Vps34의 동시발현은 Vps34의 안정성 및 활성에 필수적이므로 상기 세포에 2개의 시스트론을 가진(bicistronic) Myc-Vps34/V5-Vps15 플라스미드(Yan, et al., Biochem J., 2009, 417(3);747-755)를 트랜스펙션하고, FBS가 없는 조건에서 밤새 배양하였다. 다음날 세포를 류신 또는 아미노산이 없는 DMEM 배지에서 2시간 동안 배양한 후 30분 동안 0.8 mM의 류신 또는 DMEM 배지와 같은 농도의 아미노산으로 세포를 자극하였다. 상기 세포의 용해물을 통상적으로 수행되는 방법에 따라 웨스턴 블랏으로 분석하였다. 웨스턴 블랏의 결과로 얻어진 밴드의 강도는 소프트웨어 Image J를 사용하여 X선 필름 이미지의 밀도를 계측하여 정량하였다.
시험관 내 Vps34 지질 키나아제 어세이를 수행하기 위해 Vps34 면역복합체를 1% NP-40이 포함된 PBS로 3회, 500 mM LiCl을 함유한 100 mM Tris(pH 7.4)가 포함된 PBS로 3회 및 TNE 완충액(10 mM Tris(pH 7.4), 100 mM NaCl 및 1mM EDTA)으로 2회 세척한 후, 2 mg/㎖의 PI, 10 μCi 32P-γ-ATP(PerkinElmer)을 TNE 완충액에 두었다. 20 ㎕의 8 N HCl을 첨가하여 반응을 종결시키고, 지질을 160 ㎕의 CHCl3:MeOH(1:1)로 추출하였다. CHCl3:MeOH:NH4OH:물(60:47:2:11.3)을 용매로 사용하여 박층크로마토그래피 판(EMD Chemicals Inc.)상에서 32P-PI(3)P를 분리한 후, 방사능 사진으로 Vps34의 활성을 측정하였다. Vps34의 활성은 웨스턴 블랏의 정량화에 의해 결정된 면역 침전물에서 Vps34의 양으로 표준화하여 정량하였다. 세포내 PI(3)P의 양을 측정하기 위해 제조사의 방법에 따라 ELISA-포맷 어세이(Echelon Biosciences)를 수행하여 PI(3)P 표준의 비선형 적합도로부터 PI(3)P의 양을 정량하였다. 모든 정량 데이터는 적어도 독립적으로 3번 실험한 값의 평균±표준편차로 나타내었으며, 스튜던트 t-분포를 통해 통계적 유의성을 분석하였다(*p≤0.05. **p≤0.01).
그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, LRS의 녹다운(knock down)은 류신(도 1A) 또는 전체 아미노산(도 1B)에 의해 유도된 S6K1 단백질의 인산화(pS6K1의 발현량) 및 Vps34의 활성을 감소시켰으며, 세포 내 PI(3)P 레벨은 Vps34 활성과 유사한 경향을 나타내었다(도 1C). S6K1의 인산화 (pS6K1)는 mTORC1의 활성을 나타내는 표지자로 사용되었다. 이로부터, LRS가 Vps34와 mTOR의 상위 조절자임을 알 수 있었다.
<1-2> IRS 및 EPRS에 의한 Vps34의 활성 조절 확인
이소류실-tRNA 합성효소(IRS) 및 글루타밀프롤릴-tRNA 합성효소(EPRS)에 의해 Vps34의 활성이 조절되는지 하기와 같은 방법으로 확인하였다.
구체적으로, siEPRS 또는 siIRS를 HEK293 세포에 트랜스펙션(transfection)시킨 것을 제외하고는 실시예 <1-1>과 같은 방법으로 아미노산으로 세포를 자극하여 웨스턴 블랏 및 시험관 내 Vps34 지질 키나아제 어세이를 수행하였다. siEPRS 및 siIRS는 이전에 기술된 것을 사용하였다(Han, et al., Cell., 2012, 149(2);410-424 및 Han, et al., J Biol Chem., 2006, 281(50);38663-38667). 모든 정량 데이터는 적어도 독립적으로 3번 실험한 값의 평균±표준편차로 나타내었으며, 스튜던트 t-분포를 통해 통계적 유의성을 분석하였다(*p≤0.05. **p≤0.01).
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, IRS 및 EPRS의 녹다운은 류신에 의해 유도된 Vps34의 활성에 영향을 미치지 않았다(도 2). 이로부터, IRS 및 EPRS에 의해 Vps34의 활성이 조절되는 것이 아님을 알 수 있었다.
<1-3> LRS가 Vps34를 경유하여 mTOR의 활성화를 유도하는지 확인
LRS가 Vps34를 통하여 mTORC1을 활성화시키는지 하기와 같은 방법으로 확인하였다.
구체적으로, Vps34에 대한 shRNA(shVps34)를 발현하는 렌티바이러스를 HEK293 세포에 형질도입한 후, Myc-LRS 및 Myc-S6K1을 공형질주입시킨 것을 제외하고는 실시예 <1-1>과 같은 방법으로 아미노산으로 세포를 자극하여 웨스턴 블랏을 수행하였다. Vps34의 shRNA는 이전에 기술된 것을 사용하였다(Yoon, et al., J Cell Biol., 2011 195(3);435-447).
또한, Vps34에 특이적인 억제제인 SAR405(APExBIO, US)를 HEK293 세포에 처리한 후 아미노산에 의한 mTORC1의 활성화를 S6K1의 인산화를 통해 확인하였다. 먼저, 0.1, 0.3, 1, 3 또는 10 μM의 SAR405를 HEK293세포에 처리하여 S6K1의 인산화가 완전히 억제되는 농도인 3 μM을 SAR405의 처리농도로 결정하였다. 이후, 3 μM의 SAR405를 HEK293 세포에 처리하고, Myc-LRS 및 Myc-S6K1을 공형질주입시킨 것을 제외하고는 실시예 <1-1>과 같은 방법으로 아미노산으로 세포를 자극하여 웨스턴 블랏을 수행하였다. 이때, SAR405를 처리하지 않은 세포를 대조군으로 하였다. 모든 정량 데이터는 적어도 독립적으로 3번 실험한 값의 평균±표준편차로 나타내었으며, 스튜던트 t-분포를 통해 통계적 유의성을 분석하였다(*p≤0.05. **p≤0.01).
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, LRS가 과발현되면 S6K1의 인산화가 증가되었는데 이러한 LRS의 효과는 Vps34의 녹다운에 의해 사라졌다(도 3A). 또한, SAR405는 전체 아미노산에 의해 유도된 S6K1의 인산화(도 3B) 및 LRS의 과발현에 의해 증가한 S6K1의 인산화를 감소시켰다(도 3C). 이로부터, 아미노산 자극에 의한 Vps34가 LRS에 의한 S6K1의 인산화(mTORC1의 활성화)에 필요함을 알 수 있었다.
LRS에서 Vps34의 결합위치 및 활성위치 확인
LRS에서 Vps34의 결합위치 및 활성위치를 하기와 같은 방법으로 확인하였다.
<2-1> LRS에서 Vps34의 결합위치 확인
LRS와 Vps34의 물리적인 상호작용 및 상기 상호작용이 아미노산의 자극 유무에 영향을 받는지 확인하기 위해 Vps34 및 LRS를 하기와 같은 방법으로 면역침전하였다.
구체적으로, 실시예 <1-1>과 같은 방법으로 아미노산으로 자극한 MEF 세포를 아주 차가운 PBS로 세척하였다. 이때, 아미노산으로 자극하지 않은 MEF 세포를 대조군으로 하였다. 세포를 순한 용해 완충액(MLB: 10 mM Tris(pH 7.5), 2 mM EDTA, 100 mM NaCl, 1% NP-40, 50 mM NaF, 1 mM Na3VO4 및 프로테아제 억제제 칵테일(Sigma))에 용해시켰다. 한편, LRS의 면역침전을 위해서는 세포를 MIPT 완충액에 용해시켰다. 이후, 용해액을 13,000 ×g에서 10분 동안 미세원심분리하여 상등액을 모으고 4℃에서 상기 상등액에 항체를 첨가하여 면역침전시킨 후 단백질 G-아가로오스 또는 M2-비드(Sigma)와 함께 반응시켰다. 상기 비드를 용해 완충액으로 3 내지 5회 세척한 후 통상적인 방법에 따라 웨스턴 블랏을 수행하였다. Vps34에 대한 면역침전은 단백질 G-아가로오스 비드로, Flag-LRS에 대한 면역 침전은 M2-비드로 수행하였다.
또한, Vps34의 결합위치를 확인하고, LRS와 Vps34의 상호작용이 F50A/Y52A 돌연변이에 의해 영향을 받는지 확인하기 위해 HEK293 세포에 Myc-Vps34 및 Flag-LRS WT, F50A/Y52A, LRS의 1-720 아미노산 단편, LRS의 1-976 아미노산 단편, LRS의 721-1176 아미노산 단편, LRS의 1-360 아미노산 단편 또는 LRS의 361-720 아미노산 단편을 실시예 <1-1>과 같은 방법으로 트랜스팩션시켰다. 각 아미노산 단편의 플라스미드는 cDNA를 PCR로 증폭하고 pCDNA8-Flag 벡터에 서브 클로닝한 것을 제외하고는 논문에 기술된 방법에 따라 제조하였다(Han, et al., Cell., 2012, 149(2);410-424). 실시예 <2-1>과 같은 방법으로 항-Flag 면역침전을 한 후, 통상적인 방법에 따라 웨스턴 블랏을 수행하였다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, LRS는 Vps34와 함께 면역침전되었고, LRS 면역침전물에는 EPRS, IRS 및 Vps34가 포함되어 있었으나, Vps34 면역침전물에는 LRS만 포함되어 있었다(도 4A). 또한, Vps34에 대한 LRS의 최소결합부위는 LRS의 361-720 아미노산 내에 존재하였다(도 4B). LRS와 Vps34 사이의 상호작용은 아미노산의 자극 유무(도 4C) 또는 F50A/Y52A 돌연변이(도 4D)에 의해 영향을 받지 않았다. 이로부터, Vps34에 대한 LRS의 결합부위가 LRS의 361-720 아미노산 내에 존재함을 알 수 있었다.
<2-2> LRS에서 Vps34의 활성위치 확인
LRS와 Vps34의 상호작용에서 Vps34의 활성위치를 하기와 같은 방법으로 확인하였다.
구체적으로, LRS N-말단의 역할을 확인하기 위해 HEK293 세포에 2개의 시스트론을 가진(bicistronic) Myc-Vps34/V5-Vps15, HA-PLD1 또는 HA-S6K1과 LRS, LRS의 1-720 아미노산 단편 또는 LRS의 1-976 아미노산 단편을 트랜스팩션시킨 것을 제외하고는 실시예 <1-1>과 같은 방법으로 아미노산으로 세포를 자극하여 시험관 내 Vps34 지질 키나아제 어세이를 수행하였고, 세포의 용해물로는 웨스턴 블랏을 수행하였다. 이때, 아미노산으로 자극하지 않은 세포를 대조군으로 하였다.
또한, 세포내 PLD 어세이는 12-웰 플레이트에 있는 HEK 293 세포에 HA-PLD1 또는 LRS, LRS의 1-720 아미노산 단편 또는 LRS의 1-976 아미노산 단편을 트랜스팩션 시킨 후, 웰 당 5 μCi 3H-올레산(총 부피 500 ㎕)을 첨가하여 FBS가 없는 조건에서 밤새 배양하고, 실시예 <1-1>과 같은 방법으로 아미노산으로 세포를 자극하였다. 이때, 아미노산으로 자극하지 않은 세포를 대조군으로 하였다. 이어서 아미노산으로 세포를 자극하는 30분 동안 0.3% 1-부탄올을 처리한 후, 세포를 용해시키고 지질을 추출하여 박층크로마토그래피로 분석하였다(Sun, et al., Proc Natl Acad Sci USA., 2008, 105(24);8286-8291). PLD1이 트랜스팩션된 세포의 PLD 활성에서 빈 벡터가 트랜스팩션된 세포의 PLD 활성을 뺀 후, PLD1의 활성을 정량하였다.
또한, LRS의 UNE-L 도메인의 역할을 확인하기 위해 HEK293 세포에 Myc-Vps34 또는 Myc-Vps34와 정상적인 LRS 또는 UNE-L 도메인이 결실된 LRS를 트랜스팩션시킨 것을 제외하고는 실시예 <1-1>과 같은 방법으로 아미노산으로 세포를 자극하여 시험관 내 Vps34 지질 키나아제 어세이를 수행하였고, 세포의 용해물로는 웨스턴 블랏을 수행하였다. 이때, 아미노산으로 자극하지 않은 세포를 대조군으로 하였다. 모든 정량 데이터는 적어도 독립적으로 3번 실험한 값의 평균±표준편차로 나타내었으며, 스튜던트 t-분포를 통해 통계적 유의성을 분석하였다(*p≤0.05. **p≤0.01).
그 결과 도 5에 나타낸 바와 같이, LRS의 N-말단의 1-976 아미노산을 함유하는 LRS 단편은 Vps34에 결합할 수 있는 부위를 가지고 있지만 Vps34, PLD1 및 S6K1을 활성화시키지 못했다. 또한, UNE-L 도메인이 결실된 LRS는 아미노산에 의한 Vps34 및 S6K1의 활성을 감소시켰다(도 5). 이로부터 LRS와 Vps34의 결합만으로는 LRS가 정상적으로 기능을 수행하는데 충분하지 않으며 LRS의 C-말단의 UNE-L 도메인은 Vps34의 활성에 중요함을 알 수 있었다.
비자기포식 복합체에서 LRS와 Vps34의 상호작용 확인
Vps34는 아미노산 신호 전달에서 중요한 자기포식 조절자로, 아미노산 결핍 이후에, Atg14L을 포함하는 Vps34 복합체는 자기포식에 관여하는 반면, Atg14L이 결여된 Vps34 복합체는 자기포식에 관여하지 않는다고 알려져 있다(Yuan, et al., Autophagy., 2013, 9(12);1983-1995). 자기포식 Vps34 복합체와 비자기포식 Vps34 복합체 중 어떤 Vps34 복합체가 LRS와의 결합에 관여하는지 확인하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
구체적으로, 먼저 아미노산 신호에 의한 mTOR 경로의 활성에 어떤 Vps34 복합체가 관여하는지 확인하기 위하여 10% FBS가 포함된 DMEM 배지를 이용하여 37℃, 5% CO2 조건에서 MEF 세포를 배양하였다. 이후, FBS가 없는 조건에서 밤새 배양하고 다음날 세포를 아미노산이 없는 DMEM 배지에서 2시간 동안 배양한 후, 30분 동안 DMEM 배지와 같은 농도의 아미노산으로 세포를 자극하였다. 이때, 아미노산으로 자극하지 않은 세포를 대조군으로 하였다. 상기 세포 배양액에 항-Atg14L 항체를 첨가하여 면역침전시켜 세포 용해물의 Atg14L을 사전 제거한 후, 항-Atg14L 또는 항-Vps34 항체를 첨가하여 실시예 <2-1>과 같은 방법으로 면역침전시켰다. 이후, 실시예 <1-1>과 같은 방법으로 시험관 내 Vps34 지질 키나아제 어세이를 수행하였다.
또한, 어떤 Vps34 복합체가 LRS에 결합하는지 확인하기 위하여 세포 배양액에 Vps34, 베클린1 또는 Atg14L 항체를 첨가하여 실시예 <2-1>과 같은 방법으로 면역침전시킨 후, 웨스턴 블랏으로 분석하였다.
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, Atg14L이 없는 조건에서 Vps34는 아미노산 자극에 의해 활성화되었다(도 6A 왼쪽). 그러나 Atg14L이 있는 조건에서 Vps34는 아미노산 자극에 의해 저해되었다(도 6A 오른쪽). 또한, Atg14L이 없는 조건에서 Vps34 또는 베클린1 항체를 이용한 면역침전에 의해 분리된 비자기포식 Vps34 복합체에 LRS가 존재함을 확인하였다(도 6B). 그러나 Atg14L이 있는 조건에서 면역침전에 의해 분리된 자기포식 Vps34 복합체에는 LRS가 존재하지 않았다(도 6B). 이로부터 비자기포식 Vps34 복합체만이 mTOR 아미노산 신호에 관여하며, LRS는 비자기포식 복합체에서 Vps34와 특이적으로 결합한다는 것을 알 수 있었다.
류신 자극의 유무에 따른 LRS의 Vps34 활성 조절 정도 확인
류신 자극의 유무에 따른 LRS의 Vps34 활성 조절에 대해 확인하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
구체적으로, MEF 세포를 FBS가 없는 조건에서 밤새 배양하고 다음날 세포를 류신이 없는 DMEM 배지에서 2시간 동안 배양하였다. 이후, 항-Atg14L 항체를 첨가하여 면역침전시켜 세포 용해물의 Atg14L을 사전 제거한 후, 항-Vps34 항체를 첨가하여 Vps34를 면역침전시켰다. 30℃에서 20분 동안 류신이 있거나 없는 조건하에서 VPS34 면역 복합체를 2 mg/㎖의 PI, 10 μCi 32P-γ-ATP(PerkinElmer) 및 3.75 μg의 GST 단백질과 함께 TNE 완충액에 두었다. 상기 GST 단백질을 대장균 균주인 BL21에서 발현시키고 제조사의 프로토콜에 따라 글루타티온 세파로스 4B(GE Healthcare)를 이용해 정제하여 사용하였다. 이후, 실시예 <1-1>과 같은 방법으로 Vps34 지질 키나아제 어세이를 수행하였다. 모든 정량 데이터는 적어도 독립적으로 3번 실험한 값의 평균±표준편차로 나타내었으며, 스튜던트 t-분포를 통해 통계적 유의성을 분석하였다(*p≤0.05. **p≤0.01).
그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 정제된 GST-LRS 단백질을 Vps34 면역 복합체에 첨가시 GST 대조군에 비해 Vps34 활성이 약 3배 증가하였고, 류신 자극에 의해 활성이 더 증가하였다. LRS 돌연변이(F50A/Y52A)는 Vps34를 거의 활성화시키지 않았으며, 류신 자극 유무에 따른 활성의 차이도 거의 없었다(도 7). 이로부터 LRS가 Vps34 활성을 직접적으로 조절하며, 류신에 의한 LRS의 조절이 Vps34의 활성에 중요함을 알 수 있었다.
LRS와 PLD1의 상호작용 확인
<5-1> LRS에 의한 PLD1의 활성 조절 확인
LRS가 PLD1의 활성 조절자인지 확인하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
구체적으로, shLRS 렌티바이러스 또는 대조군으로 무작위 서열의 shRNA(control)를 발현하는 렌티바이러스를 HEK293 세포에 형질도입시킨 것을 제외하고는 실시예 <1-1>과 동일한 방법으로 류신 또는 아미노산으로 세포를 자극하고, 실시예 <2-2>와 동일한 방법으로 세포내 PLD 어세이를 수행하였다.
그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, LRS의 녹다운은 전체 아미노산(도 8A) 또는 류신(도 8B)에 의해 유도된 PLD1의 활성을 억제하였다. 이로부터, LRS가 PLD1의 상위 조절자임을 알 수 있었다.
<5-2> IRS 및 EPRS에 의한 PLD의 활성 조절 확인
이소류실-tRNA 합성효소(IRS) 및 글루타밀프롤릴-tRNA 합성효소(EPRS)에 의해 PLD의 활성이 조절되는지 하기와 같은 방법으로 확인하였다.
구체적으로, siEPRS 또는 siIRS를 HEK293 세포에 트랜스펙션시킨 것을 제외하고는 실시예 <1-1>과 같은 방법으로 류신으로 세포를 자극하고, 실시예 <2-2>와 동일한 방법으로 세포내 PLD 어세이를 수행하였다.
그 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, IRS 및 EPRS의 녹다운은 류신에 의해 유도된 PLD의 활성에 영향을 미치지 않았다(도 9). 이로부터, IRS 및 EPRS는 PLD의 조절자가 아님을 알 수 있었다.
<5-3> LRS에 의한 PLD1 및 mTOR의 리소좀으로의 이동 확인
아미노산 신호에 따라 PLD1 및 mTOR가 리소좀으로 이동하는데 LRS가 관여하는지 하기와 같은 방법으로 확인하였다.
구체적으로, 면역형광이미지를 관찰하기 위해 폴리-L-리신으로 코팅된 유리 커버슬립에서 배양된 HEK293 세포에 shLRS 렌티바이러스를 형질도입시킨 다음 HA-PLD1(Fang, et al., Curr Biol., 2003, 13(23);2037-2044)을 트랜스팩션시킨 후, 실시예 <1-1>과 같은 방법으로 아미노산으로 세포를 자극하였다. 이때, HA-PLD1을 트랜스팩션시키지 않은 세포를 대조군으로 하였다. 이후, 3.7% 파라포름 알데하이드로 세포를 고정시키고, 0.1% 트리톤 X-100으로 투과성을 증가시켰다. 3% BSA가 들어있는 PBS에 항-mTOR(Cell signaling technology), 항-HA(Covance) 또는 항-LAMP1/2(Abcam) 1차 항체를 넣고 4℃에서 세포와 밤새 반응시킨 후, 3% BSA가 들어있는 PBS에 Alexa-항-마우스 594 또는 Alexa-항-토끼 488 항체를 넣고 실온에서 30분 동안 세포와 반응시켰다. 반응이 끝나면 60×NA 1.4 렌즈를 이용하여 personal deconvolution microscope system(DeltaVision, Applied Precision)을 사용해 형광이미지를 분석하였다. 디콘볼루션(deconvolution)은 향상된 비율 반복적 제약 알고리즘(agard et al., 1989)을 사용했다. 다른 필터세트 사이의 XY 및 Z 광학 변위는 Tetraspeck fluorescent microsphere standard(Invitrogen)를 사용하여 결정하였다. 공동위치(colocalization)의 정량분석을 위해 LSM T-PMT 카메라(Carl Zeiss, LSM 700)가 장착된 Laser Scanning 공초점 현미경 700(LSM 700, Carl Zeiss)을 사용하여 형광이미지를 얻었다. 오버랩 계수는 ZEN2009 소프트웨어를 사용하여 측정하였다. 각 샘플의 공동위치는 10개 이상의 세포에 대한 오버랩 계수의 평균으로 결정하였다. 모든 정량 데이터는 적어도 독립적으로 3번 실험한 값의 평균±표준편차로 나타내었으며, 스튜던트 t-분포를 통해 통계적 유의성을 분석하였다(*p≤0.05. **p≤0.01).
그 결과, 도 10에 나타낸 바와 같이, LRS의 녹다운은 아미노산에 의해 유도된 PLD1이 리소좀으로 전달되는 것을 억제했으며(도 10A), mTOR가 리소좀으로 이동하는 것 또한 억제했다(도 10B).
<5-4> LRS에 의한 mTORC1 활성 조절에 PLD1의 관여 여부 확인
LRS에 의한 mTORC1 활성 조절에 PLD1가 관여하는지 하기와 같은 방법으로 확인하였다.
구체적으로, shLRS, shRagD 렌티바이러스 또는 대조군으로 무작위 서열의 shRNA(control)를 발현하는 렌티바이러스를 HEK293 세포에 형질도입시킨 후, PLD1의 산물인 100 μM의 포스파티드산(PA)이 있거나 없는 조건에서 실시예 <1-1>과 같은 방법으로 아미노산으로 세포를 자극하였다. 상기 세포의 용해물을 통상적으로 수행되는 방법에 따라 웨스턴 블랏으로 분석하였다.
그 결과, 도 11에 나타낸 바와 같이, LRS가 녹다운되었을때 인산화된 S6K1 양이 감소하였고 이는 외인성 PA에 의해 다시 증가되었다(도 11). 또한, LRS와 RagD가 모두 녹다운되었을 때 외인성 PA에 의해 인산화된 S6K1의 양이 부분적으로 증가되었다. 이로부터 아미노산 자극 신호 전달에 있어서 LRS에 의한 RagD를 경유하는 조절기작과 함께 LRS에 의한 PLD1의 조절이 필요하며, PLD1은 LRS-RagD 경로와 상관없이 LRS에 의한 조절에 의해 mTORC1의 활성을 조절하고 있음을 알 수 있었다.
Vps34 -PLD 경로에서 LRS의 류신 결합의 역할 확인
LRS의 류신 결합이 Vps34-PLD1 신호전달조절에 관여하는지 확인하기 위해 하기와 같은 실험을 수행하였다.
구체적으로, 먼저 두 가지의 LRS 돌연변이인 류신 결합이 결핍된 돌연변이(F50A/Y52A) 및 tRNA 충전이 결핍된(charging-deficient) 돌연변이(K716A/K719A)를 제작하였다(Han, et al., Cell., 2012, 149(2);410-424). HEK293 세포에 LRS, LRS-F50A/Y52A 또는 LRS-K716A/K719A를 트랜스팩션시킨 것을 제외하고는 실시예 <1-1>과 같은 방법으로 웨스턴 블랏 및 PI(3)P 어세이를 수행하였다. 또한, PLD1 활성을 측정하기 위해 HEK293 세포에 HA-PLD1과 LRS, LRS-F50A/Y52A 또는 LRS-K716A/K719A를 트랜스팩션시킨 것을 제외하고는 실시예 <2-2>와 같은 방법으로 PLD 어세이를 수행하였다. 모든 정량 데이터는 적어도 독립적으로 3번 실험한 값의 평균±표준편차로 나타내었으며, 스튜던트 t-분포를 통해 통계적 유의성을 분석하였다(*p≤0.05. **p≤0.01).
그 결과, 도 12에 나타낸 바와 같이, 아미노산의 자극에 의해 LRS 및 LRS-K716A/K719A는 S6K1의 활성이 증가하였다(도 12A). 또한, LRS 및 K716A/K719A는 PI(3)P 레벨과 PLD1의 활성을 증가시키는 반면 F50A/Y52A는 상기 효과를 나타내지 않았다(도 12B 및 12C). 이로부터 LRS의 류신 결합이 Vps34-PLD1 경로의 활성에 필요하며, LRS가 아미노산 센서로서의 역할을 함을 알 수 있었다.
LRS의 UNE -L 도메인에 의한 PLD1의 활성과 S6K1의 활성 증가 확인
LRS의 UNE-L 도메인에 의한 mTOR의 활성증가 효과를 하기와 같은 방법으로 확인하였다.
구체적으로, LRS의 UNE-L 도메인의 역할을 확인하기 위해 HEK293 세포에 LRS의 UNE-L 도메인의 아미노산 단편과 야생형 LRS(WT LRS) 각각을 myc-S6K1과 함께 트랜스팩션시킨 것을 제외하고는 실시예 <1-1>과 같은 방법으로 아미노산으로 세포를 자극하여 세포의 용해물로 웨스턴 블랏을 수행하였다. 이때, LRS의 UNE-L 도메인의 효과를 확인하기 위해 야생형 LRS를 양성 대조군으로 사용하였고 아미노산으로 자극하지 않은 세포를 대조군으로 하였다.
또한, 세포내 PLD 어세이는 12-웰 플레이트에 있는 HEK 293 세포에 HA-PLD1과 함께 야생형 LRS 또는 LRS의 UNE-L 도메인의 아미노산 단편을 트랜스팩션시킨 후 웰 당 5 μCi 3H-올레산(총 부피 500 ㎕)을 FBS가 없는 배지에 첨가하여 하루 동안 반응시켰다. 이후, 실시예 <1-1>과 같은 방법으로 아미노산으로 세포를 자극하였다. 이때, LRS의 UNE-L 도메인의 효과를 확인하기 위해 야생형 LRS를 양성대조군으로 사용하였고 아미노산으로 자극하지 않은 세포를 대조군으로 하였다. 이어서 아미노산으로 세포를 자극하는 30분 동안 0.3% 1-부탄올을 처리한 후, 세포를 용해시키고 지질을 추출하여 박층크로마토그래피로 분석하였다(Sun, et al., Proc Natl Acad Sci USA., 2008, 105(24);8286-8291). PLD1이 트랜스팩션된 세포의 PLD 활성에서 빈 벡터가 트랜스팩션된 세포의 PLD 활성을 뺀 후, PLD1의 활성을 정량하였다.
그 결과, 도 13에 나타낸 바와 같이, LRS의 UNE-L 도메인의 아미노산 단편만의 발현으로도 야생형 LRS와 유사한 정도로 PLD1(도 13A) 및 S6K1을 활성화시켰다(도 13B). 이로부터, LRS의 C-말단의 UNE-L 도메인은 PLD1과 S6K1의 활성을 조절하는 주요한 부위임을 알 수 있었다.
LRS의 UNE -L 도메인에 의한 근육 증강 효과 확인
<8-1> 마우스 근육세포인 C2C12 세포의 분화 촉진 및 S6K1의 활성 증가 확인
LRS의 UNE-L 도메인에 의한 마우스 근육세포인 C2C12 세포의 분화 증가 효과를 하기와 같은 방법으로 확인하였다.
구체적으로, LRS의 UNE-L 도메인의 역할을 확인하기 위해 통상적인 방법을 통해 나노파티클(nanoparticle; NP)에 LRS의 UNE-L 도메인의 아미노산 단편을 결합시켜 NP-UNE-L을 제작하였다. UNE-L을 포함하지 않은 NP를 대조군(control)으로 사용하여 실험을 진행하였다.
마우스 근육세포인 C2C12 세포를 10% FBS가 포함된 4.5 g/l 글루코오스가 포함된 DMEM에서 37℃, 7.5% CO2하에서 유지하였다. 근육세포의 분화를 유도하기 위해 0.2% 젤라틴으로 도포한 플레이트에 100% confluent하게 키운 후에 2% horse serum이 포함된 분화 유도 배양액으로 교체함에 따라 C2C12 세포에서 근육세포의 분화를 유도하였으며 3일 동안 매일 배양액을 교체하였다. 3일 동안의 분화 기간 동안 분화배양액 처리군, NP-UNE-L와 함께 분화배양액 처리군, NP와 함께 분화배양액 처리군을 비교하였다.
C2C12 세포의 분화 후 상기 세포의 용해물을 통상적으로 수행되는 방법에 따라 웨스턴 블랏으로 분석하였다. 또한 C2C12 세포의 분화 정도를 비교하기 위해 C2C12 세포는 고정하고 근육세포의 분화 표지 인자인 MHC과 세포핵 표지 인자인 4',6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)로 면역염색(immunostaining)을 실시하였다 (Yoon et al. 2013 Molecularbiology of the cell, 24(23) 3754-3763). 염색된 세포는 Leica DMI 4000B 형광 현미경으로 관찰하였으며 RETIGA EXi camera를 이용하여 형광 이미지를 촬영하였다. 분화 지수(differentiation index)는 MHC에 염색된 근관세포(myotube)안의 핵의 비율(percentage)을 계산하였고 융합 지수(fusion index)는 MHC로 염색된 2개 이상의 핵을 가진 근관세포 안의 핵의 비율을 계산하였다. 근관세포의 크기는 MHC에 염색되는 근관세포 안의 핵의 수로 계산하였다.
그 결과, 도 14에 나타낸 바와 같이 NP-UNE-L에 의해 C2C12 세포의 분화과정 동안 S6K1의 T389의 인산화, 즉 mTORC1의 활성이 현저하게 증가하는 것을 확인하였다. 동시에 분화의 마커(marker)인 미오게닌(myogenin)의 발현이 UNE-L 도메인 처리군에서 증가하였다.
또한, 도 15에서 나타낸 바와 같이 C2C12 세포의 분화 지수, 융합 지수, 근관세포 크기가 모두 증가한 것을 확인, UNE-L가 근육세포에서 분화를 촉진함을 알 수 있었다. 이는 UNE-L 도메인에 의한 mTOR의 활성 증가가 근육세포의 분화를 촉진함을 나타내고 있다.
<8-2> BaCl 2 에 의한 근육 손상시 근육재생 증가 확인
근육의 손상시, LRS의 UNE-L 도메인이 근육 재생 증가에 미치는 효과를 하기와 같은 방법으로 확인하였다.
구체적으로, 10주령의 BL6 마우스의 전경골근(tibialis anterior; TA) 근육에 BaCl2(saline에 1.2% wt/vol으로 준비: 50 μl)을 주입한 후 근육의 손상을 유도하였다(Sun et al., 2011, J. Cell Biol. 192, 69-81). NP-UNE-L은 왼쪽에 NP는 오른쪽에 각각 BaCl2와 함께 주입하였다. 7일 후에 마우스를 안락사한 후 전경골근 근육을 분리하여 액체 질소에서 차갑게 준비한 2-메틸부탄(2-methylbutane)에 넣고 TBS 조직 냉동 배지(tissue freezing medium)에 포배(embed) 하였다. 10 μm 두께로 cryostat (Microm HM550; Thermo Fisher Scientific)을 이용하여 -20℃에서 cryosection을 하여 코팅되지 않은 슬라이드에 올리고 hematoxylin and eosin (H&E)으로 염색하였다. 염색된 슬라이드는 현미경(DMI 4000B; Leica)의 10× dry objective 렌즈를 통해 관찰하였다. 염색된 이미지는 24bit 이미지로 카메라(RETIGA EXi; QImaging)로 촬영하였으며 image J로 regenarating myofiber cross section area(CSA)를 측정하였다. CSA는 핵이 정중앙에 위치하는 재생 근섬유(myofiber)의 특징을 보이는 근섬유만을 측정하였다.
그 결과, 도 16에 나타난 것과 같이 근육 재생시 생성되는 근섬유의 CSA가 UNE-L를 처리한 전경골근(TA)에서 증가하는 것을 확인, UNE-L 도메인이 근육 재생을 증가시키는 효과를 보이는 것을 확인하였다. 이는 UNE-L 도메인이 근육 재생을 촉진하는 근육증강제로의 개발 가능성을 강하게 증명하고 있다.
<110> Gachon University of Industry-Academic cooperation Foundation <120> COMPOSITIONS FOR MUSCLE ENHANCEMENT COMPRISING UNE-L DOMAIN OF LEUCYL-tRNA SYNTHETASE AS AN ACTIVE INGREDIENT <130> 2017P-08-048 <150> KR 10-2017-0057777 <151> 2017-05-09 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Pro Gly Val Ser Val Ser Leu Val Asn Pro Gln Pro Ser Asn Gly His 1 5 10 15 Phe Ser Thr Lys Ile Glu Ile Arg Gln Gly Asp Asn Cys Asp Ser Ile 20 25 30 Ile Arg Arg Leu Met Lys Met Asn Arg Gly Ile Lys Asp Leu Ser Lys 35 40 45 Val Lys Leu Met Arg Phe Asp Asp Pro Leu Leu Gly Pro Arg Arg Val 50 55 60 Pro Val Leu Gly Lys Glu Tyr Thr Glu Lys Thr Pro Ile Ser Glu His 65 70 75 80 Ala Val Phe Asn Val Asp Leu Met Ser Lys Lys Ile His Leu Thr Glu 85 90 95 Asn Gly Ile Arg Val Asp Ile Gly Asp Thr Ile Ile Tyr Leu Val His 100 105 110 <210> 2 <211> 339 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 cctggtgtgt ccgtttctct ggtgaatccc cagccatcca atggccactt ctcaaccaaa 60 attgaaatca ggcaaggaga taactgtgat tccataatca ggcgtttaat gaaaatgaat 120 cgaggaatta aagacctttc caaagtgaaa ctgatgagat ttgatgatcc actgttgggg 180 cctcgacgag ttcctgtcct gggaaaggag tacaccgaga agacccccat ttctgagcat 240 gctgttttca atgtggacct catgagcaag aaaattcatc tgactgagaa tgggataagg 300 gtggatattg gcgatacaat aatctatctg gttcattaa 339

Claims (7)

  1. 류실-tRNA 합성효소(Leucyl-tRNA Synthetase; LRS)의 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 UNE-L 도메인 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 함유하는 근육증강용 조성물.
  2. 삭제
  3. 제 1항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 서열번호 2의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드인, 근육증강용 조성물.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 UNE-L 도메인은 Vps34(vacuolar protein sorting 34)를 활성화하는 것인, 근육증강용 조성물.
  5. 류실-tRNA 합성효소의 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 UNE-L 도메인 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 함유하는 근육 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 근육 질환이 긴장감퇴증, 근위축증, 근이영양증, 근육 퇴화증, 근무력증 또는 근육감소증인, 근육 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  7. 1) Vps34(vacuolar protein sorting 34) 단백질을 발현하는 세포에 류실-tRNA 합성효소 C 말단의 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 UNE-L 도메인 및 피검시료를 처리하는 단계;
    2) 상기 단계 1)의 세포를 배양하는 단계; 및
    3) 상기 단계 2)의 배양액에서 포스포리파아제 D1(PLD1) 또는 S6 키나아제 1(S6K1)의 활성을 측정하여 UNE-L 도메인을 처리하지 않은 대조군에 비해 활성을 증가시키는 피검시료를 선별하는 단계;
    를 포함하는, 근육 질환의 예방 또는 치료용 후보물질의 스크리닝 방법.
KR1020170126082A 2017-05-09 2017-09-28 류실-tRNA 합성효소의 UNE-L 도메인을 유효성분으로 함유하는 근육증강용 조성물 KR101988735B1 (ko)

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