KR101985577B1 - Use of CRY1 for treatment and screening target of therapeutic agents of diabetes mellitus - Google Patents
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Abstract
본원은 CRY1의 당뇨병 치료제로서의 용도를 개시한다. 아울러 본원은 SREBP1c-CRY1-FOXO1 포도당 생합성 조절 경로를 기반으로 하는 새로운 분자기전을 이용한 혈당조절제 또는 당뇨병 치료제 스크리닝 방법을 개시한다. 본원에 따른 치료제는 지방생합성을 증가시키지 않으면서 동시에 포도당 생합성을 억제시킬 수 있다. The present application discloses the use of CRY1 as a therapeutic agent for diabetes. In addition, the present disclosure discloses a method for screening a glycemic control agent or a diabetes therapeutic agent using a novel molecular mechanism based on the SREBP1c-CRY1-FOXO1 glucose biosynthesis regulatory pathway. The therapeutic agent according to the present invention can simultaneously inhibit glucose biosynthesis without increasing fat biosynthesis.
Description
본원은 당뇨병 치료 및 치료 약물 개발과 관련된 기술이다.The present application is a technique related to diabetes treatment and therapeutic drug development.
당뇨병은 인슐린의 분비량이 부족하거나 정상적인 기능이 이루어지지 않는 등의 대사질환의 일종으로, 혈중 포도당의 농도가 높아지는 고혈당을 특징으로 하며, 고혈당으로 인하여 여러 증상 및 징후를 일으키고 소변에서 포도당을 배출하게 된다. 당뇨병은 제1형과 제2형으로 구분되는데, 제1형 당뇨병은 인슐린을 전혀 생산하지 못하는 것이 원인이 되어 발생하며, 인슐린이 상대적으로 부족한 제2형 당뇨병은 인슐린 저항성(insulin resistance; 혈당을 낮추는 인슐린 기능이 떨어져 세포가 포도당을 효과적으로 연소하지 못하는 것)을 특징으로 한다. 제2형 당뇨는 식생활의 서구화에 따른 고열량, 고지방, 고단백의 식단, 운동 부족, 스트레스 등 환경적인 요인이 크게 작용하는 것으로 보이지만, 이 외에 특정 유전자의 결함, 췌장 수술, 감염, 약제 등에 의해서도 생길 수 있다. Diabetes is a type of metabolic disease such as insufficient insulin secretion or normal function. It is characterized by high blood glucose, which increases the concentration of glucose in the blood, and causes various symptoms and signs and releases glucose from urine. . Diabetes is divided into
인슐린은 섭취시에 분비되는 주요 동화작용 호르몬으로, 체내 에너지 대사를 관장한다. 인슐린은 간에서 포도당 생합성을 억제하고 지방생합성을 증가시켜 잉여에너지는 저장하게 한다. 인슐린저항성으로 대표되는 당뇨병에서는 흥미로운 현상이 발생하는데, 인슐린 신호전달경로가 기능을 하지 못해 포도당 생합성의 억제가 사라져 간에서 지속적으로 포도당을 만들어 혈액으로 내보내고 있으나, 동시에 인슐린이 과도하게 기능을 해 지방생합성이 증가되어 혈중 지질 농도가 높아지고 지방간이 발생하는 선택적 인슐린 저항성이 나타나게 된다.Insulin is a major anabolic hormone secreted at the time of ingestion, and is responsible for energy metabolism in the body. Insulin inhibits glucose biosynthesis and increases fat biosynthesis in the liver, thereby storing surplus energy. In diabetes mellitus, which is represented by insulin resistance, an interesting phenomenon occurs. The insulin signaling pathway does not function and the inhibition of glucose biosynthesis disappears, and glucose is continuously produced in the liver and released into the blood. This increases the concentration of lipids in the blood and results in selective insulin resistance resulting from fatty liver.
당뇨병 환자의 90% 이상이 제2형 당뇨 환자이다. 현행 제2형 당뇨병의 경우 약물치료법을 살펴보면, 메트포르민(metformin)과 티아졸리딘디온(thiazolidinedione, TZD)계열의 약물이 상당한 유용성을 보이고 있으나, 인슐린 저항성 발생 등 당뇨병의 근본적 원인 치료에는 이르지 못하고 있으며, 여러 부작용 또한 보고되고 있어 인슐린 저항성을 근본적으로 해결할 수 있는 보다 효능이 우수하고 안전한 약물의 개발이 필요하다.More than 90% of diabetics have
CRY1(Cryptochrome Circadian Clock 1)은 블루라이트에 민감한 플라보단백질(flavoprotein)의 일종으로, 동식물의 생체시계 리듬에 관여한다. Cryptochrome Circadian Clock 1 (CRY1) is a blue light-sensitive flavoprotein that is involved in the biological clock rhythm of plants and animals.
대한민국 공개특허번호 제2013-0027059호는 방광암 검출용 소변표지에 관한 것으로, 방광암 표지자로서의 CRY1이 개시되어 있다.Republic of Korea Patent No. 2013-0027059 relates to a urine label for detecting bladder cancer, CRY1 as a bladder cancer marker is disclosed.
대한민국 공개특허번호 제2015-0106492호는 FPR2를 활성화하는 물질을 포함하는 인슐린 저항성 관련 질환 치료용 조성물에 관한 것으로, 인슐린 신호전달에 중요한 Akt의 인산화를 유지하고, PKC-theta의 인산화를 억제하여 인슐린 저항성을 개선하는 것이 개시되어 있다.Korean Patent Laid-Open No. 2015-0106492 relates to a composition for treating insulin resistance-related diseases comprising a substance that activates FPR2, which maintains phosphorylation of Akt, which is important for insulin signaling, and inhibits phosphorylation of PKC-theta. It is disclosed to improve the resistance.
본원은 새로운 분자 기전에 근거한 제2형 당뇨병의 치료제, 및 치료제 스크리닝 방법을 제공하고자 한다.The present application seeks to provide a therapeutic agent for
한 양태에서 본원은 CRY1 유전자, 또는 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 포함하는 제 1 형 또는 제 2 당뇨병을 포함하는 당뇨병 치료용 약학적 조성물을 제공한다. In one aspect, the present application provides a pharmaceutical composition for treating diabetes, including
특히 일 구현예에서 본원에 따른 조성물이 사용될 수 있는 당뇨병은 제 2 형 당뇨병이다. In one embodiment in particular the diabetes in which the composition according to the invention can be used is
다른 구현예에서 본원에 따른 조성물이 사용될 수 있는 제 2 형 당뇨병 환자는 선택적 인슐린 저항성이 수반되는 것으로 선택적 인슐린 저항성은 지방대사는 여전히 증가되는데, 포도당 생합성은 억제되지 않는 현상을 말하며, 본 이론으로 한정하는 것은 아니지만, SREBP1c가 증가되어 있는 반면 CRY1은 감소로 인한 것이다. In another embodiment, a
또 다른 양태에서 본원은 또한 CRY1 유전자, 또는 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 포함하는 제 1 형 또는 제 2 당뇨병을 포함하는 혈당조절용, 특히 혈당강하제, 특히 포도당 생합성 억제를 통한 혈당강하용 조성물을 제공한다. In another aspect, the present invention also provides a composition for controlling blood glucose, particularly a hypoglycemic agent, in particular a hypoglycemic agent through inhibiting glucose biosynthesis, including the CRY1 gene, or
또 다른 양태에서 본원은 또한 SREBP1c-CRY1-FOXO1 신호전달 경로를 표적으로 하는 포도당 생합성 억제제 스크리닝 방법을 제공한다. In another aspect, the present disclosure also provides a method for screening glucose biosynthesis inhibitors that targets the SREBP1c-CRY1-FOXO1 signaling pathway.
일 구현예에서 상기 방법은 CRY1의 발현 또는 활성이 감소 또는 결여된 세포 또는 동물모델을 제공하는 제 1 단계; 상기 세포를 CRY1의 발현 또는 활성을 증가시킬 것으로 기대되는 시험물질로 처리하는 제 2 단계; 상기 시험물질로 처리된 세포에서 FOXO1 단백질 농도를 측정하는 제 3 단계; 및; 상기 측정결과 상기 FOXO1 단백질 양이 상기 시험물질과 접촉되지 않은 대조군에서 FOXO1 단백질 양과 비교하여 감소한 경우 이를 제 2 형 당뇨병 치료제 후보물질로 선별하는 제 4 단계를 포함한다. In one embodiment the method comprises the steps of providing a cell or animal model with reduced or lacking CRY1 expression or activity; A second step of treating said cells with a test substance that is expected to increase the expression or activity of CRY1; A third step of measuring FOXO1 protein concentration in cells treated with the test substance; And; And a fourth step of selecting the FOXO1 protein as a candidate for
다른 구현예에서는 제 3 단계 대신에 또는 이에 부가하여 상기 FOXO1에 의해 발현이 촉진되는 포도당 생합성에 관여하는 효소인 PEPCK 및/또는 G6Pase의 발현을 측정하는 단계를 포함하며, 그리고 이 경우 상기 제 4 단계에서 상기 후보물질은 상기 시험물질과 접촉된 세포에서 상기 시험물질과 접촉되지 않은 대조군 세포와 비교하여 상기 PEPCK 또는 G6Pase의 발현이 감소한 것이다. Another embodiment includes measuring the expression of PEPCK and / or G6Pase, an enzyme involved in glucose biosynthesis that is promoted by FOXO1 in lieu of or in addition to a third step, in which case the fourth step In the candidate material is a decrease in the expression of the PEPCK or G6Pase in the cells in contact with the test material compared to the control cells not in contact with the test material.
본원에 따른 방법에서 상기 CRY1의 발현이 감소된 세포 또는 동물은 CRY1의 감소에 부가하여 상위 단계의 단백질인 SREBP1c의 발현은 증가된 것일 수 있다. In the method according to the present invention, cells or animals in which the expression of CRY1 is decreased may be increased in the expression of SREBP1c, which is a higher-level protein in addition to the reduction of CRY1.
상기 본원에 따른 스크리닝 방법으로 선별된 화합물은 포도당 생합성을 억제할 수 있어, 혈당조절, 혈당 강하, 당뇨병 치료에 유용하게 사용될 수 있다. The compounds selected by the screening method according to the present application can inhibit glucose biosynthesis, and thus can be usefully used for glycemic control, hypoglycemia, and diabetes treatment.
또 다른 양태에서 본원은 CRY1 유전자, 또는 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질, 또는 상기 유전자를 포함하는 인비트로에서 간세포 또는 동물에서 SREBP1c-CRY1-FOXO1 신호전달 경로 조절용 키트를 제공한다. In another aspect, the present application provides a kit for regulating the CRY1 gene, or a protein encoded by the gene, or an SREBP1c-CRY1-FOXO1 signaling pathway in hepatocytes or animals in vitro containing the gene.
CRY1 유전자, 또는 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질, 또는 상기 유전자를 포함하는 인비트로에서 간세포 또는 동물에서 포도당생합성 억제용 키트를 제공한다. Provided are a kit for inhibiting glucose biosynthesis in hepatocytes or animals in a CRY1 gene, a protein encoded by the gene, or in vitro comprising the gene.
또한 다른 양태에서 본원은 인비트로에서 간세포 또는 동물에 CRY1 유전자, 또는 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 처리하는 단계를 포함하는, SREBP1c-CRY1-FOXO1 경로 조절 방법 또는 상기 경로 조절을 통한 포도당 생합성 억제방법을 제공하며, 상기 방법에서, 특히 상기 간세포 및 동물은 SREBP1c 발현은 증가되고 CRY1 단백질의 발현 또는 활성은 감소된 것이다. In another aspect, the present invention provides a method of regulating the SREBP1c-CRY1-FOXO1 pathway or a method of inhibiting glucose biosynthesis by regulating the pathway, the method comprising treating the CRY1 gene, or a protein encoded by the gene, in hepatocytes or animals in vitro. In the above method, in particular, the hepatocytes and animals have increased SREBP1c expression and reduced expression or activity of CRY1 protein.
본원에서는 SREBP1c가 SREBP1c-CRY1-FOXO1 경로를 통해 포도당 생합성을 억제하고, 또한 당뇨병 동물모델에서 CRY1의 과발현에 의해 포도당 생합성을 억제할 수 있음을 발견하였다. 따라서 CRY1은 지방생합성을 증가시키지 않으면서 동시에 포도당 생합성을 억제시킬 수 있는 새로운 당뇨병 치료제로서 그리고 치료제 개발의 표적으로서 유용하게 사용될 수 있다. It has been found herein that SREBP1c can inhibit glucose biosynthesis via the SREBP1c-CRY1-FOXO1 pathway and also inhibit glucose biosynthesis by overexpression of CRY1 in diabetic animal models. Therefore, CRY1 may be usefully used as a new anti-diabetic agent that can inhibit glucose biosynthesis at the same time without increasing fat biosynthesis and as a target of therapeutic development.
도 1은 본원의 일 구현예에 따른 CRY1이 섭취(feeding) 및 인슐린에의 노출에 의해 자극받는다는 것을 나타낸 것이다. (a,b) C57BL/6 마우스를 24시간 동안 금식시키고 그 후 12시간 동안 재섭취시켰다. 섭취시킨 마우스 및 재섭취시킨 마우스 둘 다 ZT 3 희생시켰다. TBP mRNA 레벨에 정규화시킨 qRT-PCT 및 웨스턴 블랏을 이용하여 간에서의 CRY1 mRNA(a) 및 CRY1 단백질(b)을 각각 측정하였다. pSREBP1, precursor SREBP1; nSREBP1, nuclear SREBP1. 데이터는 평균±s.d.로 나타내었다. 각 그룹당 N = 3. *P<0.05, **P<0.01 (Student’s t-test). (C) 12시간 인슐린 노출 후 qRT-PCR을 이용하여 CRY1 유전자 발현을 측정하였다. qRT-PCR 정규화를 하기 위하여 TBP mRNA 레벨을 사용하였다. 데이터는 평균±s.d.로 나타내었다. 각 그룹당 N = 3. *P<0.05, **P<0.001 (Student’s t-test).
도 2는 본원의 일 실시예에 따른 CRY1 유전자 발현이 SREBP1c에 의해 직접적으로 활성화된다는 것을 나타낸 것이다. (a,b) Ad-MOCK 또는 Ad-SREBP1c으로 마우스 1차 간세포를 아데노바이러스로 감염시켰다. CRY1 mRNA (a) 및 CRY1 단백질 (b) 레벨은 각각 TBP mRNA 레벨에 정규화시킨 qRT-PCT 및 웨스턴 블랏을 사용하여 측정하였다. 각 그룹당 N = 3. *P<0.05, **P<0.01 (Student’s t-test). (C) HEK293T 세포에서 SREBP1c 또는 MOCK를 인코딩하는 발현 플라스미드로 동시-트랜스펙션한 후 WT CRY1 프로모터 및 3XSRE 돌연변이 프로모터의 루시퍼라아제 활성을 측정하였다. 루시퍼라아제 활성은 β-gal 활성으로 정규화시켰다. TSS, Transcription Start Site; SRE, Sterol Regulatory Elements. 데이터는 평균±s.d.로 나타내었다. 각 그룹당 N = 5. **P<0.01 (Student’s t-test). (d) H4IIE 세포에서 SREBP1c가 점유한 CRY1 프로모터를 나타내는 ChIP 분석법을 나타낸 것이다. (e) 마우스 1차 간세포를 SREBP1c-/- 및 SREBP1c+/+ 마우스에서 분리하였다. 인슐린(10 nM) 존재시의 SREBP1c 및 CRY1 단백질 레벨을 웨스턴 블랏으로 측정하였다. (f) SREBP1c-/- 및 SREBP1c+/+ 마우스를 24시간 동안 금식시킨 후 12시간 동안 재섭취시켰다. 섭취시킨 마우스 및 재섭취시킨 마우스 둘 다 ZT 3 희생시켰다. SREBP1c 및 CRY1 mRNA 레벨을 qRT-PCR로 측정하여 TBP mRNA 레벨로 정규화시켰다. 데이터는 평균±s.d.로 나타내었다. 각 그룹당 N = 3-4. *P<0.05, **P<0.01 (Student’s t-test).
도 3은 본원의 일 실시예에 따른 SREBP1c-CRY1 시그널링 경로가 간 포도당 생성을 조절한다는 것을 나타낸 것이다. (a) 마우스 1차 간세포를 Ad-MOCK 또는 Ad-SREBP1c로 감염시켰다. 포도당 옥시다아제(GO)를 사용하여 상대적 포도당 생산을 측정하였다. 데이터는 평균±s.d.로 나타내었다. 각 그룹당 N = 3. **P<0.05 (Student’s t-test). (b) Ad-G6Pase-luc 및 Ad-MOCK 또는 Ad-SREBP1c 중 하나로 C57BL/6 마우스를 감염시켰다. 광학 인 비보 이미지 및 광자 밀도로 G6Pase 프로모터 활성을 측정하였다. (c,d) Ad-MOCK 또는 Ad-SREBP1c로 C57BL/6 마우스를 감염시켜 PTT(pyruvate tolerance test)를 수행하였다(c). 모든 마우스를 ZT3 희생시켜 ZT3에서 PTT를 수행하였다. 결과를 AUC로 전환시켰다(d). 데이터는 평균±s.d.로 나타내었다. 각 그룹당 N = 5. *P<0.05, **P<0.01 (Student’s t-test). (e,f) SREBP1-/- 및 SREBP1c+/+ 마우스에서 PTT(e)를 수행하였다. 모든 마우스를 ZT3 희생시켜 ZT3에서 PTT를 수행하였다. 결과를 AUC로 전환시켰다(f). 데이터는 평균±s.d.로 나타내었다. 각 그룹당 N = 5. *P<0.05, **P<0.01 (Student’s t-test). (g) H4IIE 세포를 siCON 또는 siCRY1로 감염시켰다. qRT-PCR로 상대적 mRNA 레벨을 측정하여 싸이클로필린(cyclophilin) mRNA 레벨로 정규화시켰다. 데이터는 평균±s.d.로 나타내었다. 각 그룹당 N = 3. *P<0.05, **P<0.001 (Student’s t-test). (h) Ad-MOCK 또는 Ad-CRY1로 마우스 초기 간세포를 감염시켰다. qRT-PCR로 상대적 mRNA 레벨을 측정하여 TBP mRNA 레벨로 정규화시켰다. 데이터는 평균±s.d.로 나타내었다. 각 그룹당 N = 3. *P<0.05 (Student’s t-test). (i,j) CRY1+/+ 및 CRY1-/- 마우스(i)에서 PTT를 수행하였다. 모든 마우스를 ZT10 희생시켜 ZT3에서 PTT를 수행하였다. 결과를 AUC로 전환시켰다(j). 데이터는 평균±s.d.로 나타내었다. 각 그룹당 N = 7. *P<0.05, **P<0.01 (Student’s t-test). (k) CRY1+/+ 및 CRY1-/- 마우스에서 분리한 마우스 1차 간세포를 Ad-MOCK 또는 Ad-SREBP1c로 감염시켰다. 상대적 포도당 생산을 GO(glucose oxidase) 키트를 사용하여 측정하였다. 데이터는 평균±s.d.로 나타내었다. 각 그룹당 N = 8. ***P<0.001 versus Ad-MOCK, ###P<0.001 versus CRY1+/+(Student’s t-test). (l,m) Ad-MOCK를 주입한 SREBP1c+/+ 마우스 및 Ad-MOCK 또는 Ad-CRY1를 주입한 SREBP1c-/- 마우스에서의 PTT(l). 결과를 AUC로 전환시켰다(m). 모든 마우스를 ZT10 희생시켜 ZT3에서 PTT를 수행하였다. 결과를 AUC로 전환시켰다(j). 데이터는 평균±s.d.로 나타내었다. 각 그룹당 N = 7-10. **P<0.01, ***P<0.001 versus SREBP1c+/+, Ad-MOCK, #P<0.05, ###P<0.001 versus SREBP1c-/-, Ad-MOCK (Student’s t-test).
도 4는 CRY1이 FOXO1 단백질 레벨을 조절한다는 것을 나타낸 것이다. (a,b) 마우스 1차 간세포를 Ad-MOCK 또는 Ad-CRY1로 아데노바이러스 감염시켰다. FOXO1의 발현 프로파일을 웨스턴 블랏을 사용한 단백질 레벨(a) 및 qRT-PCR을 사용한 mRNA 레벨로 분석하였다. 데이터는 평균±s.d.로 나타내었다. 각 그룹당 N = 4. *P<0.05 (Student’s t-test). (c,d) H4IIE 세포를 siCON 또는 siCRY1로 감염시켰다. 내인성 FOXO1의 면역세포화학 분석. DAPI, 4’, 6-diamidino-2-phenylindole. 스케일 바, 10 ㎛. 내인성 FOXO1 및 CRY1 단백질 레벨을 웨스턴 블랏을 사용하여 분석하였다(d). (e,f) CRY1+/+ 및 CRY1-/- 마우스의 간에서의 FOXO1 단백질의 발현 패턴을 웨스턴 블랏 및 qRT-PCT(f)로 분석하였다. 상대적 mRNA 레벨을 qRT-PCR을 사용하여 측정하여 TBP mRNA 레벨로 노말라이즈하였다. 데이터는 평균±s.d.로 나타내었다. 각 그룹당 N = 4. *P<0.05 (Student’s t-test). (g) SREBP1c+/+ 및 SREBP1c-/- 마우스 간에서의 CRY1 및 FOXO1 단백질 발현을 웨스턴 블랏으로 분석하였다. (h) siCRY1 및/또는 siFOXO1로 H4IIE 세포를 공동-트랜스펙션시켰다. qRT-PCR을 사용하여 상대적 mRNA 레벨을 측정하여 싸이클로필린 mRNA 레벨로 노말라이즈하였다. 데이터는 평균±s.d.로 나타내었다. 각 그룹당 N = 3. #P<0.05, ##P<0.01 versus siCRY1, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 versus siCON (Student’s t-test).
도 5는 장기간 인슐린 치료가 CRY1 발현을 자극하고 간 포도당 신생과정을 저해한다는 것을 나타낸 것이다. (a,b) 마우스 일차 간세포에 서로 다른 기간동안 10 nM 인슐린을 처리하였다. 단백질 레벨(a)을 웨스턴 블랏으로 측정하였다. mRNA 레벨(b)을 qRT-PCR로 분석하였다. 데이터는 평균±s.d.로 나타내었다. 각 그룹당 N = 3. *P<0.05, ***P<0.001 versus siCON (Student’s t-test). (c-e) CRY1+/+ 및 CRY1-/- 마우스에서 분리한 마우스 일차 간세포에 서로 다른 기간동안 10nm 인슐린을 처리하였다. 단백질 레벨(c)을 웨스턴 블랏으로 분석하였고, 상대적 mRNA 레벨(d)을 qRT-PCR로 측정하여 TBP mRNA 레벨로 정규화하였다. 데이터는 평균±s.d.로 나타내었다. 각 그룹당 N = 3. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 versus CRY1+/+ 대조군(Student’s t-test). 상대적 포도당 생산(e)을 GO(glucose oxidase) 키트를 사용하여 측정하였다. 데이터는 평균±s.d.로 나타내었다. 각 그룹당 N = 5. *P<0.05, **P<0.01 versus CRY1+/+ 대조군(Student’s t-test). (f) 마우스 일차 간세포를 Ad-MOCK 및 Ad-CRY1로 감염시킨 후, 인슐린(10 nM) 또는 인슐린(10 nM) 및 AKTVIII (5 ㎛)로 12시간 동안 처리하였다. 단백질 레벨을 웨스턴 블랏으로 측정하였다. (g-i) C57BL/6 마우스를 Ad-MOCK 또는 Ad-CRY1으로 감염시켜 AKT 저해제 MK2206 존재 또는 부존재하에 PTT를 수행하였다. PTT 수행전에 MK2206 (30mg kg-1)를 경구로 10분간 투여하였다. 모든 마우스를 ZT10 희생시켜 ZT3에서 PTT를 수행하였다. 결과를 AUC로 전환시켰다(h). 데이터는 평균±s.d.로 나타내었다. 각 그룹당 N = 5-7. ##P<0.01, ###P<0.001 versus Ad-MOCK + 비히클 대조군, *P<0.05, **P<0.01, versus Ad-MOCK + MK2206 대조군(Student’s t-test).
도 6은 CRY1이 유비퀴틴-매개 FOXO1 분해를 촉진시킨다는 것을 나타낸 것이다. (a) 마우스 일차 간세포를 Ad-MOCK 또는 Ad-CRY1로 아데노바이러스 감염시켰다. 상기 세포에 20㎛ MG132 또는 비히클을 4시간 동안 처리하였다. 총 세포 용해물을 지시된 항체를 사용하여 웨스턴 블랏으로 분석하였다. (b) HEK293T 세포를 GFP-CRY1 및/또는 FOXO1-MYC 발현 벡터로 트랜스펙션시켰다. 지시된 항체 존재하에서 항-MYC 항체와의 공동-면역침강 및 웨스턴 블랏을 수행하였다. IP, immunoprecipitation. (c) FOXO1-MYC, GFP-CRY1, 및 Ubiquitin-HA를 인코딩하는 플라스미드로 COS-1 세포를 공동-트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션 후, 상기 세포에 MG132(20㎛)를 6시간 동안 처리한 후 상기 세포 용해물을 항-MYC 항체와 같이 면역침강하고나서 지시된 항체존재하에 웨스턴 블랏을 수행하였다. (d) 마우스 일차 간세포를 Ad-MOCK 또는 Ad-CRY1로 감염시켰다. 감염 후, 상기 세포를 MG132(20㎛)로 4시간 동안 처리하였다. 핵 및 세포질 분획을 분리하여 지시된 항체 존재하에 웨스턴 블랏을 수행하였다. (e) COS-1 세포를 nFOXO1-MYC, GFP-CRY1, 및 Ubiquitin-HA를 인코딩하는 플라스미드와 같이 공동-트랜스팩션시켰다. 트랜스펙션 후, 상기 세포를 MG132(20㎛)로 6시간 동안 챌린지시켰다. 상기 세포 용해물을 항-MYC 항체 존재하에 면역침강시켰다. IP, immunoprecipitation.
도 7은 CRY1이 MDM2-매개 FOXO1 유비퀴틴화에 포함된다는 것을 나타낸 것이다. (a) 마우스 일차 간세포를 Ad-MOCK 또는 Ad-CRY1 및/또는 siCON 또는 siMDM2로 감염시켰다. 총 세포 용해물을 지시된 항체 존재하에 웨스턴 블랏으로 분석하였다. (b) HEK293T 세포를 FLAG-MDM2, nFOXO1-MYC, 및 GFP-CRY1 발현 벡터로 트랜스펙션시켰다. 총 세포 용해물을 항-MYC 항체 존재하에 공동-면역침강한 후 지시된 항체 존재하에 웨스턴 블랏을 수행하였다. IP, immunoprecipitation. (c) nFOXO1-MYC, FLAG-MDM2, FLAG-CRY1,및 Ubiquitin-HA 인코딩 플라스미드로 COS-1 세포를 공동-트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션후, 상기 세포를 MG132(20㎛)로 6시간 동안 챌린지시켰다. 세포 용해물을 항-MYC 항체로 면역침강시켰다. IP, immunoprecipitation. (d) nFOXO1-MYC, FLAG-MDM2, Ubiquitin-HA, 및 siCRY1 인코딩 플라스미드로 COS-1 세포를 공동-트랜스펙션시켰다. 상기 세포를 MG132(20㎛)로 6시간 동안 챌린지시켰다. 세포 용해물을 항-MYC 항체로 면역침강시켰다. IP, immunoprecipitation.
도 8은 당뇨 마우스 모델에서 CRY1이 당신생과정을 완화시킨다는 것을 나타낸 것이다. (a-c) 8-주령 수컷 마우스에게 STZ (150mg kg- 1)를 주입한 후 1주 후에 ZT 3일때 희생시켰다. ZT 3에 임의(ad libitum)로 혈당 레벨(a)을 측정하였다. 모든 마우스를 ZT 3일때 희생시킨 후, 간 단백질 레벨(b)을 웨스턴 블랏으로 분석하였다. mRNA 레벨(c)을 qRT-PCR 분석으로 측정하여 TBP mRNA 레벨로 정규화하였다. 데이터는 평균±s.d.로 나타내었다. 각 그룹당 N = 3. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 (Student’s t-test). (d-f) STZ-주입 마우스를 MOCK 또는 CRY1 인코딩 아데노바이러스로 감염시켰다(adenoviral dose of 2109 viral particles per mouse). 혈당 레벨(d)을 ZT3에 임의로 측정하였다. 모든 마우스를 ZT 3에 희생시킨 후, mRNA 레벨(e)을 qRT-PCR 분석으로 측정하여 TBP mRNA 레벨로 노말라이즈하였다. 간 단백질 레벨(f)을 웨스턴 블랏으로 분석하였다. 데이터는 평균±s.d.로 나타내었다. 각 그룹당 N = 4. *P<0.05, **P<0.01, (Student’s t-test). (g,h) 10-주령 수컷 db/+ 및 db/db 마우스를 임의로 ZT3일때 희생시켰다. 다양한 간 유전자의 상대적 mRNA 레벨(g)을 qRT-PCR 분석으로 측정하여 TBP mRNA 레벨로 노말라이즈하였다. 데이터는 평균±s.d.로 나타내었다. 각 그룹당 N = 4. *P<0.05 (Student’s t-test). 단백질 레벨(h)을 웨스턴 블랏으로 측정하였다. (i-l) 10-주령 수컷 db/db 마우스를 MOCK 또는 CRY1 인코딩 아데노바이러스로 꼬리 정맥을 통해 감염시켜(adenoviral dose of 21010 viral particles per mouse) PTT(i)를 수행하였다. 모든 마우스를 ZT 10 희생시켜 ZT 3에 PTT 수행하였다. 결과를 AUC로 전환시켰다. 혈당 레벨(j)을 ZT 3에 임의로 측정하였다. 모든 마우스를 ZT 3에 희생시킨 후, 간 단백질 레벨(k)을 웨스턴 블랏으로 분석하였다. mRNA 레벨(l)은 qRT-PCR로 분석한 후 TBP mRNA 레벨로 노말라이즈하였다. 데이터는 평균±s.d.로 나타내었다. 각 그룹당 N = 5. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 (Student’s t-test).
도 9는 SREBP1c-CRY1 축이 FOXO1 분해를 촉진시킴으로써 간 포도당 신생과정을 억제시킨다는 것을 나타낸 것이다. 장기간 인슐린 작용을 한 후, SREBP1c-CRY1 축은 핵내 FOXO1 분해를 통해 간 포도당 신생과정을 억제시킨다. 동화작용 상태동안, 증가된 CRY1이 MDM2-매개 FOXO1 분해를 촉진시키고 그럼으로써 인슐린이 지속적으로 간 포도당 생성을 억제한다. 1 shows that CRY1 is stimulated by feeding and exposure to insulin according to one embodiment of the present disclosure. (a, b) C57BL / 6 mice were fasted for 24 hours and then reingested for 12 hours. Both ingested mice and re-ingested mice were ZT 3 sacrificed. CRY1 mRNA (a) and CRY1 protein (b) in the liver were measured using qRT-PCT and Western blot normalized to TBP mRNA levels, respectively. pSREBP1, precursor SREBP1; nSREBP1, nuclear SREBP1. Data are shown as mean ± sd. N = 3. * P <0.05, ** P <0.01 (Student's t-test) for each group. (C) CRY1 gene expression was measured using qRT-PCR after 12 h insulin exposure. TBP mRNA levels were used for qRT-PCR normalization. Data are shown as mean ± sd. N = 3. * P <0.05, ** P <0.001 (Student's t-test) for each group.
2 shows that CRY1 gene expression according to an embodiment of the present application is directly activated by SREBP1c. (a, b) Mouse primary hepatocytes were infected with adenovirus with Ad-MOCK or Ad-SREBP1c. CRY1 mRNA (a) and CRY1 protein (b) levels were measured using qRT-PCT and Western blot normalized to TBP mRNA levels, respectively. N = 3. * P <0.05, ** P <0.01 (Student's t-test) for each group. (C) Luciferase activity of the WT CRY1 promoter and the 3XSRE mutant promoter was measured after co-transfection with an expression plasmid encoding SREBP1c or MOCK in HEK293T cells. Luciferase activity was normalized to β-gal activity. TSS, Transcription Start Site; SRE, Sterol Regulatory Elements. Data are shown as mean ± sd. N = 5. ** P <0.01 (Student's t-test) for each group. (d) ChIP assay showing CRY1 promoter occupied by SREBP1c in H4IIE cells. (e) Mouse primary hepatocytes were isolated from SREBP1c − / − and SREBP1c + / + mice. SREBP1c and CRY1 protein levels in the presence of insulin (10 nM) were measured by Western blot. (f) SREBP1c − / − and SREBP1c + / + mice were fasted for 24 hours and then reingested for 12 hours. Both ingested mice and re-ingested mice were
3 shows that the SREBP1c-CRY1 signaling pathway regulates hepatic glucose production according to an embodiment of the present disclosure. (a) Mouse primary hepatocytes were infected with Ad-MOCK or Ad-SREBP1c. Glucose oxidase (GO) was used to measure relative glucose production. Data are shown as mean ± sd. N = 3. ** P <0.05 (Student's t-test) for each group. (b) C57BL / 6 mice were infected with Ad-G6Pase-luc and either Ad-MOCK or Ad-SREBP1c. G6Pase promoter activity was measured by optical in vivo image and photon density. (c, d) C57BL / 6 mice were infected with Ad-MOCK or Ad-SREBP1c to perform a pyruvate tolerance test (PTT) (c). All mice were subjected to PTT on ZT3 at the expense of ZT3. The results were converted to AUC (d). Data are shown as mean ± sd. N = 5. * P <0.05, ** P <0.01 (Student's t-test) for each group. (e, f) PTT (e) was performed in SREBP1 − / − and SREBP1c + / + mice. All mice were subjected to PTT on ZT3 at the expense of ZT3. The results were converted to AUC (f). Data are shown as mean ± sd. N = 5. * P <0.05, ** P <0.01 (Student's t-test) for each group. (g) H4IIE cells were infected with siCON or siCRY1. Relative mRNA levels were measured by qRT-PCR and normalized to cyclophilin mRNA levels. Data are shown as mean ± sd. N = 3. * P <0.05, ** P <0.001 (Student's t-test) for each group. (h) Mouse early hepatocytes were infected with Ad-MOCK or Ad-CRY1. Relative mRNA levels were measured by qRT-PCR and normalized to TBP mRNA levels. Data are shown as mean ± sd. N = 3. * P <0.05 for each group (Student's t-test). (i, j) PTT was performed on CRY1 + / + and CRY1 − / − mice (i). All mice were subjected to PTT on ZT3 at the expense of ZT10. The results were converted to AUC (j). Data are shown as mean ± sd. N = 7. * P <0.05, ** P <0.01 (Student's t-test) for each group. (k) Mouse primary hepatocytes isolated from CRY1 + / + and CRY1 − / − mice were infected with Ad-MOCK or Ad-SREBP1c. Relative glucose production was measured using a GO (glucose oxidase) kit. Data are shown as mean ± sd. N = 8. *** P <0.001 versus Ad-MOCK, ### P <0.001 versus CRY1 + / + (Student's t-test) for each group. (l, m) PTT (l) in SREBP1c + / + mice injected with Ad-MOCK and SREBP1c − / − mice injected with Ad-MOCK or Ad-CRY1. Results were converted to AUC (m). All mice were subjected to PTT on ZT3 at the expense of ZT10. The results were converted to AUC (j). Data are shown as mean ± sd. N = 7-10 per group. ** P <0.01, *** P <0.001 versus SREBP1c + / + , Ad-MOCK, # P <0.05, ### P <0.001 versus SREBP1c -/- , Ad-MOCK (Student's t-test).
4 shows that CRY1 regulates FOXO1 protein levels. (a, b) Mouse primary hepatocytes were infected with adenovirus with Ad-MOCK or Ad-CRY1. The expression profile of FOXO1 was analyzed by protein level (a) using Western blot and mRNA level using qRT-PCR. Data are shown as mean ± sd. N = 4. * P <0.05 for each group (Student's t-test). (c, d) H4IIE cells were infected with siCON or siCRY1. Immunocytochemical Analysis of Endogenous FOXO1. DAPI, 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole. Scale bar, 10 μm. Endogenous FOXO1 and CRY1 protein levels were analyzed using Western blot (d). (e, f) Expression patterns of FOXO1 protein in livers of CRY1 + / + and CRY1 − / − mice were analyzed by Western blot and qRT-PCT (f). Relative mRNA levels were measured using qRT-PCR to normalize to TBP mRNA levels. Data are shown as mean ± sd. N = 4. * P <0.05 for each group (Student's t-test). (g) CRY1 and FOXO1 protein expression in SREBP1c + / + and SREBP1c − / − mouse livers was analyzed by Western blot. (h) H4IIE cells were co-transfected with siCRY1 and / or siFOXO1. The relative mRNA levels were measured using qRT-PCR to normalize to cyclophilin mRNA levels. Data are shown as mean ± sd. N = 3. # P <0.05, ## P <0.01 versus siCRY1, * P <0.05, ** P <0.01, *** P <0.001 versus siCON (Student's t-test).
5 shows that long-term insulin treatment stimulates CRY1 expression and inhibits hepatic glucose angiogenesis. (a, b) Mouse primary hepatocytes were treated with 10 nM insulin for different time periods. Protein level (a) was measured by Western blot. mRNA level (b) was analyzed by qRT-PCR. Data are shown as mean ± sd. N = 3. * P <0.05 for each group, *** P <0.001 versus siCON (Student's t-test). (ce) Mouse primary hepatocytes isolated from CRY1 + / + and CRY1 − / − mice were treated with 10 nm insulin for different periods of time. Protein levels (c) were analyzed by Western blot and relative mRNA levels (d) were measured by qRT-PCR and normalized to TBP mRNA levels. Data are shown as mean ± sd. N = 3. * P <0.05, ** P <0.01, *** P <0.001 versus CRY1 + / + control (Student's t-test) for each group. Relative glucose production (e) was measured using a GO (glucose oxidase) kit. Data are shown as mean ± sd. N = 5. * P <0.05 for each group, ** P <0.01 versus CRY1 + / + control (Student's t-test). (f) Mouse primary hepatocytes were infected with Ad-MOCK and Ad-CRY1 and then treated with insulin (10 nM) or insulin (10 nM) and AKTVIII (5 μm) for 12 hours. Protein levels were measured by Western blot. (gi) C57BL / 6 mice were infected with Ad-MOCK or Ad-CRY1 to perform PTT with or without the AKT inhibitor MK2206. MK2206 (30 mg kg −1 ) was orally administered for 10 minutes prior to PTT. All mice were subjected to PTT on ZT3 at the expense of ZT10. The results were converted to AUC (h). Data are shown as mean ± sd. N = 5-7 for each group. ## P <0.01, ### P <0.001 versus Ad-MOCK + vehicle control, * P <0.05, ** P <0.01, versus Ad-MOCK + MK2206 control (Student's t-test).
FIG. 6 shows that CRY1 promotes ubiquitin-mediated FOXO1 degradation. (A) Mouse primary hepatocytes were infected with adenovirus with Ad-MOCK or Ad-CRY1. The cells were treated with 20 μm MG132 or vehicle for 4 hours. Total cell lysates were analyzed by Western blot using the indicated antibodies. (b) HEK293T cells were transfected with GFP-CRY1 and / or FOXO1-MYC expression vectors. Co-immunoprecipitation and western blot with anti-MYC antibodies were performed in the presence of the indicated antibodies. IP, immunoprecipitation. (c) COS-1 cells were co-transfected with plasmids encoding FOXO1-MYC, GFP-CRY1, and Ubiquitin-HA. After transfection, the cells were treated with MG132 (20 μm) for 6 hours and the cell lysates were immunoprecipitated with anti-MYC antibody and then subjected to western blot in the presence of the indicated antibody. (d) Mouse primary hepatocytes were infected with Ad-MOCK or Ad-CRY1. After infection, the cells were treated with MG132 (20 μm) for 4 hours. Nuclear and cytoplasmic fractions were separated and western blots were performed in the presence of the indicated antibody. (e) COS-1 cells were co-transfected with plasmids encoding nFOXO1-MYC, GFP-CRY1, and Ubiquitin-HA. After transfection, the cells were challenged with MG132 (20 μm) for 6 hours. The cell lysates were immunoprecipitated in the presence of anti-MYC antibody. IP, immunoprecipitation.
Figure 7 shows that CRY1 is involved in MDM2-mediated FOXO1 ubiquitination. (a) Mouse primary hepatocytes were infected with Ad-MOCK or Ad-CRY1 and / or siCON or siMDM2. Total cell lysates were analyzed by Western blot in the presence of the indicated antibody. (b) HEK293T cells were transfected with FLAG-MDM2, nFOXO1-MYC, and GFP-CRY1 expression vectors. Total cell lysates were co-immunoprecipitated in the presence of anti-MYC antibody followed by Western blot in the presence of the indicated antibody. IP, immunoprecipitation. (c) COS-1 cells were co-transfected with nFOXO1-MYC, FLAG-MDM2, FLAG-CRY1, and Ubiquitin-HA encoding plasmids. After transfection, the cells were challenged with MG132 (20 μm) for 6 hours. Cell lysates were immunoprecipitated with anti-MYC antibodies. IP, immunoprecipitation. (d) COS-1 cells were co-transfected with nFOXO1-MYC, FLAG-MDM2, Ubiquitin-HA, and siCRY1 encoding plasmids. The cells were challenged with MG132 (20 μm) for 6 hours. Cell lysates were immunoprecipitated with anti-MYC antibodies. IP, immunoprecipitation.
8 shows that CRY1 alleviates your life cycle in a diabetic mouse model. (ac) to 8-week-old male mice STZ - when
Figure 9 shows that the SREBP1c-CRY1 axis inhibits hepatic glucose angiogenesis by promoting FOXO1 degradation. After prolonged insulin action, the SREBP1c-CRY1 axis inhibits hepatic glucose angiogenesis through nuclear FOXO1 degradation. During the assimilation state, increased CRY1 promotes MDM2-mediated FOXO1 degradation and thereby insulin continuously inhibits hepatic glucose production.
본원은 인슐린에 의해 활성화되어 지방생합성 촉진 및 포도당 생합성 억제에 관여하는 전사인자인 SREBP1c가 CRY1 유전자 발현을 조절하고, CRY1이 FOXO1 단백질 레벨을 조절함으로써 포도당생합성을 억제한다는 SREBP1c-CRY1-FOXO1 경로를 규명하고, 당뇨 마우스 모델에서 과발현된 CRY1이 과혈당증을 완화시키므로 CRY1을 이용하면 지방생합성을 증가시키지 않으면서도 동시에 포도당생합성을 억제시킬 수 있다는 발견에 근거한 것이다.Herein we identified the SREBP1c-CRY1-FOXO1 pathway, in which SREBP1c, a transcription factor activated by insulin and involved in promoting fat biosynthesis and inhibiting glucose biosynthesis, regulates CRY1 gene expression and CRY1 inhibits glucose biosynthesis by regulating FOXO1 protein levels. In addition, since CRY1 overexpressed in the diabetic mouse model alleviates hyperglycemia, the use of CRY1 can simultaneously suppress glucose biosynthesis without increasing fat biosynthesis.
이에 한 양태에서 본원은 CRY1(Cryptochrome Circadian Clock 1) 유전자 또는 그 단백질 또는 이와 기능적으로 동등한 변이체, 또는 그 발현을 활성화 시키는 물질을 포함하는 제 1 형 또는 제 2 형 당뇨병 치료용 조성물에 관한 것이다.In one embodiment, the present application relates to a composition for treating
본원에 따른 조성물에 포함되는 CRY1(Cryptochrome Circadian Clock 1)은 식물에서는 블루라이트에 민감한 플라보단백질(flavoprotein)의 일종이지만, 동물에서는 크게 역할이 알려져 있지 않고, 단지 생체시계 리듬에 관여함이 알려져 있다. 본원에 따른 조성물에 포함되는 CRY1의 유전자 또는 단백질 서열은 본원에 따른 효과를 달성하는 한 다양한 형태 및 유래의 것이 사용될 수 있다. 일 구현예에서는 포유류, 특히 인간 유래의 CRY1 또는 이와 기능적으로 동등한 변이체가 사용되며, 그 유전자 및 단백질 서열은 공지되어 있다 (Gene ID: 12952, NCBI Reference Sequence: NP_031797.1).Cryptochrome Circadian Clock 1 (CRY1) included in the composition according to the present invention is a kind of flavoprotein that is sensitive to blue light in plants, but it is known that its role is not largely known in animals, and is only involved in biological clock rhythm. . The gene or protein sequence of CRY1 included in the composition according to the present invention can be used in various forms and derived so long as the effect according to the present invention is achieved. In one embodiment CRY1 derived from mammals, in particular humans, or a functionally equivalent variant thereof, is used and its gene and protein sequences are known (Gene ID: 12952, NCBI Reference Sequence: NP — 031797.1).
본원에 따른 유전자는 게놈 DNA, cDNA 및 화학합성 DNA를 포함한다. 게놈 DNA 및 cDNA는 당업계의 공지된 방법에 따라 제조할 수 있다. 게놈 DNA는 예를 들어, 해당 유전자를 가지는 세포로부터 게놈 DNA를 추출하고 게놈 라이브러리(벡터는 예를 들면 플라스미드, 파지, 코스미드, BAC, PAC 등이 이용될 수 있다)를 제작하고 상기 라이브러리를 본 발명의 단백질을 암호화하는 DNA를 기초로 제작한 프로브를 이용하여 콜로니 또는 플라그 혼성화를 수행하거나, 본 발명의 단백질을 암호화하는 DNA에 특이적인 프라이머를 작성하고, 이를 이용한 PCR(Polymerase Chain Reaction)을 행함으로써 제조할 수도 있다. cDNA는 예를 들어, CRY1 유전자를 가지는 세포에서 추출한 mRNA를 기초로 cDNA를 합성하고, 상기 합성된 cDNA를 λZAP 등의 벡터로 삽입하여 cDNA 라이브러리를 제작하고, 상기 cDNA 라이브러리를 전개하여, 상기와 동일하게 콜로니 또는 플라그 혼성화를 수행하거나 또는 PCR을 수행하여 제조할 수 있다.Genes according to the present invention include genomic DNA, cDNA and chemical synthetic DNA. Genomic DNA and cDNA can be prepared according to methods known in the art. Genomic DNA, for example, extracts genomic DNA from cells having the gene of interest and constructs a genomic library (vectors may be used, for example, plasmids, phages, cosmids, BACs, PACs, etc.) and viewed the library. Colony or plaque hybridization is performed using a probe prepared on the basis of the DNA encoding the protein of the present invention, or primers specific for the DNA encoding the protein of the present invention are prepared and PCR (Polymerase Chain Reaction) using the same is performed. It can also manufacture by doing. For example, cDNA synthesizes a cDNA based on mRNA extracted from a cell having a CRY1 gene, inserts the synthesized cDNA into a vector such as λZAP, prepares a cDNA library, and expands the cDNA library. Can be prepared by colony or plaque hybridization or by PCR.
본원에서 용어 “기능적으로 동등한 변이체”란 특정 종 유래의 야생형 단백질 또는 이의 유전자 서열과 비교하여 변이가 있지만 본원에서 규명한 효능을 갖는 것을 말한다. 따라서, 예를 들면 본원발명의 CRY1 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자는 사람 유래의 서열로서, 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 암호화하는 돌연변이체(mutants), 유도체(derivatives), 대립유전자(alleles), 변형체(variants) 및 동질체 (homologues)를 포함한다. 나아가, 예를 들어, 염기서열의 변이가 단백질 중의 아미노산의 변이를 수반하지 않는 경우(축중변이)도 있고, 이러한 축중변이체(degeneracy mutants)도 본 발명의 유전자에 포함된다.As used herein, the term "functionally equivalent variant" refers to a variant compared to a wild type protein or gene sequence thereof derived from a particular species, but having the efficacy identified herein. Thus, for example, the CRY1 protein of the present invention or a gene encoding the same may be a mutants encoding a protein derived from a human sequence consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, added and / or inserted, Derivatives, alleles, variants and homologues. Furthermore, for example, variations in nucleotide sequences may not be accompanied by variations in amino acids in proteins (degeneracy variants), and such degeneracy mutants are also included in the gene of the present invention.
CRY1 단백질 및 이와 기능적으로 동등한 단백질을 암호화하는 유전자는 당업계의 공지된 방법, 예를 들면 PCR 방법(Saiki et al., Science, 230: 1350-1354, 1985; Saiki et al., Science, 239: 487-491, 1988)을 이용하여 제조될 수 있다. 예를 들면, 당업자라면 공지된 CRY1 유전자의 염기서열로부터 이에 특이적으로 혼성화할 수 있는 프라이머를 고안하여 CRY1 유전자와 높은 상동성을 가지는 다양한 포유류 유래의 유전자를 분리할 수 있을 것이다. Genes encoding the CRY1 protein and proteins functionally equivalent thereto are known in the art, for example PCR methods (Saiki et al., Science, 230: 1350-1354, 1985; Saiki et al., Science, 239: 487-491, 1988). For example, those skilled in the art will be able to isolate primers from a variety of mammals having high homology with the CRY1 gene by designing primers capable of specific hybridization thereof from known base sequences of the CRY1 gene.
상기와 같이 분리된 유전자는 아미노산 수준에 있어서, 인간 유래 CRY1 단백질의 아미노산 서열과 높은 상동성을 가진다. 높은 상동성이란 아미노산 서열 전체에서, 적어도 50% 이상, 더 바람직하게는 70% 이상, 더 바람직하게는 90%이상(예를 들어, 95% 이상)의 서열의 동일성을 가리킨다. 아미노산 서열이나 염기서열의 상동성은 BLAST(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873-5877, 1993)에 기초하여 개발된 BLASTN 이나 BLASTX라 불리는 프로그램(Altschul et al, J. Mol. Biol., 215, 403-410, 1990)을 사용하여 분석될수 있으며 구체적인 방법은 다음의 웹사이트에 공지되어 있다(http://www,ncbi.nlm.nih.gov.).The gene isolated as described above has high homology with the amino acid sequence of the human-derived CRY1 protein at the amino acid level. High homology refers to the identity of at least 50%, more preferably at least 70%, more preferably at least 90% (eg, at least 95%) sequences throughout an amino acid sequence. The homology of amino acid sequences or nucleotide sequences is based on BLAST (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873-5877, 1993), a program called BLASTN or BLASTX (Altschul et al, J. Mol. Biol. , 215, 403-410, 1990) and specific methods are known on the following website (http: //www,ncbi.nlm.nih.gov.).
본원에 따른 조성물에 포함되는 CRY1 단백질 또는 유전자는 전장 또는 잘린 형태의 것이 모두 포함된다. 또한 동일한 숙주, 예를 들면 인간에서 유래된 것이라도 특정 개인, 지역, 환경 등에 따라 서열변이가 있을 수 있으며, 이러한 것은 물론 일부 서열이 변형(결실, 치환, 부가)되었으나, 기능적으로 동등한 변이체가 모두 본 발명에 사용될 수 있다. 한 구현예에서는 인간 유래의 것으로 이에 관하여는 앞서 언급한 바와 같다.The CRY1 protein or gene included in the composition according to the present invention includes all of full length or truncated forms. In addition, there may be sequence variations according to a specific individual, region, environment, etc., even if they are derived from the same host, for example, humans, and of course, some sequences have been modified (deleted, substituted, added), but all functionally equivalent variants are present. It can be used in the present invention. In one embodiment it is of human origin and is as previously mentioned.
본원에 따른 조성물이 CRY1 유전자 또는 이와 동등한 변이체를 포함하는 경우, 상기 단백질을 코딩하는 유전자는 재조합 DNA 기술 등 공지된 방법에 따라, 표적세포 예를 들면 포유류 유래의 당뇨 비만세포에서 CRY1 유전자를 발현할 수 있는 한 이로 제한되는 것은 아니나, 예를 들면, 선형 DNA, 플라스미드 벡터 또는 그 외 DNA 전달용 벡터로 도입되어 사용될 수 있다. 이러한 벡터는 바람직하게는 비바이러스성이며, 진핵세포에서 CRY1 유전자를 발현할 수 있는 한, 특별히 제한되는 것은 아니며, 본원 실시예에 기재된 것을 참고할 수 있다. When the composition according to the present invention comprises the CRY1 gene or a variant thereof, the gene encoding the protein may express the CRY1 gene in target cells, for example, diabetic mast cells derived from mammals, according to known methods such as recombinant DNA technology. As long as it is possible, it may be used, for example, as a linear DNA, a plasmid vector or other DNA delivery vector. Such vectors are preferably non-viral and are not particularly limited as long as they can express the CRY1 gene in eukaryotic cells, and reference may be made to those described in the Examples herein.
또한 본 발명의 CRY1 유전자는 유전자치료 시스템 등에 사용되는 발현벡터 예를 들면 바이러스벡터에 도입되어 공지된 방법에 따라 전달체로서 바이러스입자에 포함되어 사용될 수 있다. 상기의 바이러스 벡터는 본 발명의 단백질을 목적하는 세포 또는 조직내로 도입할 수 있는 것이면 제한되지 않으며 바람직하게는 아데노바이러스 벡터이며, 상기 바이러스성 벡터는 진핵세포에서 이에 포함된 유전자를 발현할 수 있는 한, 특별히 제한되는 것은 아니다. In addition, the CRY1 gene of the present invention may be introduced into an expression vector used in a gene therapy system or the like, for example, a viral vector, and then included in a viral particle as a carrier according to a known method. The viral vector is not limited as long as the protein of the present invention can be introduced into a desired cell or tissue, and is preferably an adenovirus vector, and the viral vector is capable of expressing a gene contained therein in a eukaryotic cell. It is not particularly limited.
본원에 따른 조성물이 단백질 또는 이와 기능적으로 동등한 변이체를 포함하는 경우, 예를 들면 상기 벡터를 공지된 방법에 따라 세포배양 시스템에서 적절한 세포에 트렌스펙션하여 발현시킨 후 단백질을 정제하여 사용할 수 있다. 이러한 본 발명의 단백질은 예를 들면 정제된 단백질, 수용성 단백질, 또는 표적 세포로의 전달 또는 투여를 위해 담체에 결합된 형태의 단백질 또는 아미노산 잔기와 융합된 형태의 것을 포함하는 것이다.When the composition according to the present invention comprises a protein or a functionally equivalent variant thereof, for example, the vector may be purified and used after transfection into an appropriate cell in a cell culture system according to a known method. Such proteins of the invention include, for example, purified proteins, water soluble proteins, or those in fusion with protein or amino acid residues in a form bound to a carrier for delivery or administration to a target cell.
본원에 따른 조성물이 사용되는 당뇨병은 혈중 포도당 농도가 높은 증상으로, 제 1 형 및 제 2 형 당뇨병을 포함한다. 제 1 형 당뇨병은 인슐린을 분비하는 췌장 베타 세포의 문제가 발생하여 혈중에 인슐린 분비가 되지 않는 질환이고, 제 2 형 당뇨병은 췌장 베타세포에서는 인슐린이 분비되나, 간, 지방세포 및 근육에서 인슐린 수용체 하위 신호가 문제가 발생하여 인슐린이 있음에도 인슐린 신호가 전달되지 않는 질환이나, 이와 같은 상황에서는 결국 췌장 베타세포에 과부하가 걸려 베타 세포도 망가져서 인슐린도 분비되지 않는 상황이 발생할 수 있다. 즉 제 2 형 당뇨병은 췌장에서 인슐린 분비기능은 일부 남아있지만 여러 가지 원인에 의해 상대적으로 인슐린 저항성이 커지면서 인슐린의 작용이 원활하지 않아 고혈당과 상대적인 인슐린 분비 장애가 생기는 것이 특징이다. 본원에서는 제 1 형 및 제 2 형의 대표적 당뇨병 모델 마우스를 이용하여 실험한 결과 인슐린 분비의 문제 뿐 아니라 인슐린 신호전달 경로의 문제 모두에서 CRY1의 과발현을 통해 포도당 생합성을 억제할 수 있는 현상을 관찰하였기에 본원은 제 1 형 당뇨병 뿐 아니라 제 2 형 당뇨병 혈당 조절제, 혈당 강하제로 사용될 수 있다. Diabetes in which the composition according to the present invention is used is a symptom of high blood glucose concentration, and includes
본원에 따른 조성물은 특히 지방생합성을 증가시키지 않으면서 포도당생합성을 억제시킴으로써 인슐린 저항성이 나타나는 제 2 형 당뇨병에 사용될 수 있다. 구체적으로 인슐린에 의해 발현이 증가되는 SREBP1c가 CRY1 유전자 발현을 조절하고, CRY1은 FOXO1 단백질 레벨을 조절함으로써 포도당생합성을 억제한다.The composition according to the invention can be used especially for
일 구현예에서 본원에 따른 조성물이 사용되는 제 2 형 당뇨병은 특히 고인슐린 혈증, 특히 본원에서 규명된 SREBP1c가 증가되어 있는 반면 CRY1은 감소로 인한 당뇨병, 일종의 선택적 인슐린 저항성에 사용될 수 있다. In one embodiment,
선택적 인슐린 저항성은 과도한 인슐린으로 인해 지방생합성이 증가되어 혈중 지질 농도가 높아지고 지방간이 발생하지만, 고혈당이 발생하는 증상이다. 본원의 이전에는 그 이유가 규명되지 않았고, 본원에 따른 CRY1 단백질 또는 유전자는 이러한 선택적저항성 인슐린 증상의 고혈당을 완화시킬 수 있다. Selective insulin resistance is a condition in which hyperlipidemia occurs due to excessive insulin, resulting in increased blood lipid levels and fatty liver, but high blood sugar. The reason for this has not been identified previously, and the CRY1 protein or gene according to the present invention may alleviate the hyperglycemia of such selective resistance insulin symptoms.
본원에서 사용된 용어 "치료" 란 당뇨병으로 인한 불규칙한 혈당을 조절하는, 특히 고혈당을 완화시키거나 또는 정상범위의 혈당으로 돌려놓거나 유지시키는 것을 의미한다. As used herein, the term "treatment" refers to controlling irregular blood sugar caused by diabetes, in particular to alleviate high blood sugar or to return or maintain blood sugar in the normal range.
이런 측면에서 본원은 또한 CRY1 유전자, 또는 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 포함하는 당뇨병 환자의 혈당조절용 약학 조성물에 관한 것이다. In this respect, the present application also relates to a pharmaceutical composition for glycemic control of a diabetic patient comprising the CRY1 gene, or a protein encoded by the gene.
혈당조절은 고혈당을 정상범위의 혈당으로 낮추거나 유지하는 것을 의미하는 것이다. Glucose control refers to lowering or maintaining hyperglycemia in the normal range of blood glucose.
본원의 조성물은 CRY1 이외에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 또는 유효성분의 용해성 및/또는 흡수성을 유지/증가시키는 화합물을 추가로 함유할 수 있다. 또한 본원의 약학 조성물은 신장암의 치료 또는 예방을 위하여 단독으로, 또는 수술, 약물치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.The composition of the present application may further contain at least one active ingredient exhibiting the same or similar function in addition to CRY1, or a compound for maintaining / increasing the solubility and / or absorption of the active ingredient. In addition, the pharmaceutical composition of the present invention may be used alone or in combination with methods using surgery, drug treatment and biological response modifiers for the treatment or prevention of kidney cancer.
본원의 조성물은 상기 언급한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 씨딩 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있으며, 표적 기관에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 기관 특이적 항체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합시켜 사용할 수 있다. 더 나아가 당해 기술분야의 적정한 방법으로 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제형화 할 수 있다.The composition of the present invention may be prepared by including at least one pharmaceutically acceptable carrier in addition to the above-mentioned active ingredient. Pharmaceutically acceptable carriers may be used in combination with saline, sterile water, Ringer's solution, buffered saline, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol, seeding, and one or more of these components, as necessary. Other conventional additives such as buffers and bacteriostatic agents can be added. In addition, diluents, dispersants, surfactants, binders, and lubricants may be additionally added to formulate into injectable formulations, pills, capsules, granules, or tablets such as aqueous solutions, suspensions, emulsions, and the like, and may act specifically on target organs. Target organ specific antibodies or other ligands may be used in combination with the carriers so as to be used. Furthermore, it may be suitably formulated according to each disease or component using an appropriate method in the art or using the method disclosed in Remington's Pharmaceutical Science (Recent Edition, Mack Publishing Company, Easton PA). Can be.
본원의 조성물의 투여방법은 특별히 이에 제한되는 것은 아니며, 공지된 투여방법을 적용할 수 있으며, 목적하는 방법에 따라 비경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)하거나 경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여의 경우 피부에 붙이는 패치형, 코/호흡기를 통해 투여할 수 있으며, 신속한 치료효과를 얻기 위해서는 정맥내 주사에 의한 투여가 바람직하다. 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여 시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 매우 다양할 수 있다. CRY1 유전자 또는 폴리펩타이드를 포함한 단백질 제제의 경우 비경구 투여가 선호될 수 있으나 다른 경로 및 수단을 배제하는 것은 아니다. 전형적인 약물의 경우 투약단위체는, 예를 들어 약 0.01mg 내지 100mg를 포함하나 상기 범위의 이하 및 이상의 범위를 배제하는 것은 아니다. 일일 투여량은 약 1μg 내지 10g 일 수 있으며, 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다.The method of administration of the composition of the present application is not particularly limited thereto, and known administration methods may be applied, and parenteral administration (for example, intravenous, subcutaneous, intraperitoneal, or topical) or oral, depending on the desired method. In the case of parenteral administration, it can be administered through a patch-type, nasal / respirator attached to the skin, and administration by intravenous injection is preferable to obtain a rapid therapeutic effect. The dosage may vary widely depending on the weight, age, sex, health condition, diet, time of administration, method of administration, rate of excretion and severity of the patient. Parenteral administration may be preferred for protein preparations comprising the CRY1 gene or polypeptide, but does not exclude other routes and means. For typical drugs, dosage units include, for example, about 0.01 mg to 100 mg but do not exclude the below and above ranges. The daily dose may be about 1 μg to 10 g, and may be administered once to several times a day.
본원에서는 마우스 일차 간세포에서 SREBP1c 과발현에 의해 포도당 생성이 감소되며, 상기 SREBP1c이 CRY1의 발현을 통해 포도당 생성을 조절하며, 상기 CRY1은 FOXO1과 FOXO1을 분해시킬 수 있는 MDM2라는 단백질의 결합을 강화시켜 FOXO1의 분해를 촉진시킨다는, SREBP1c-CRY1-FOXO1 신호전달 경로를 발견하였다. FOXO1은 포도당 생합성의 주요 효소인 PEPCK(Phosphoenolpyruvate carboxykinase) 및 G6Pase(Glucose-6-phosphatase)의 발현 조절을 억제하는데, CRY1에 의해 FOXO1 단백질 레벨이 저하되면 PEPCK 및 G6Pase의 발현도 저하되어 포도당 생합성이 저해된다. Herein, glucose production is reduced by SREBP1c overexpression in mouse primary hepatocytes, SREBP1c regulates glucose production through the expression of CRY1, and CRY1 enhances the binding of a protein called MDM2, which can degrade FOXO1 and FOXO1, thereby enhancing FOXO1. The SREBP1c-CRY1-FOXO1 signaling pathway was found to promote the degradation of. FOXO1 inhibits the regulation of the expression of Phosphoenolpyruvate carboxykinase (PEPCK) and G6Pase (Glucose-6-phosphatase), which are major enzymes of glucose biosynthesis. do.
따라서 다른 양태에서 본원은 SREBP1c(Sterol Regulatory Element Binding Transcription Factor 1c)-CRY1-FOXO1 신호전달 경로를 표적으로 하는 제2형 당뇨병 예방 또는 치료제 스크리닝 방법에 관한 것이다. Thus, in another aspect, the present disclosure is directed to a method for screening a prophylactic or therapeutic agent for
일 구현예에서 상기 방법은 CRY1의 발현 또는 활성이 감소된 간 세포 또는 동물을 제공하는 제 1 단계; 상기 세포를 CRY1의 발현 또는 활성을 증가시킬 것으로 기대되는 시험물질로 처리하는 제 2 단계; 상기 시험물질로 처리된 세포에서 FOXO1 단백질 농도를 측정하는 제 3 단계; 및; 상기 측정결과 상기 FOXO1 단백질 양이 상기 시험물질과 접촉되지 않은 대조군에서 FOXO1 단백질 양과 비교하여 감소한 경우 이를 포도당 생합성 억제제, 또는 당뇨병 치료제 후보물질을 선별하는 제 4 단계를 포함한다. In one embodiment the method comprises a first step of providing a liver cell or animal having reduced expression or activity of CRY1; A second step of treating said cells with a test substance that is expected to increase the expression or activity of CRY1; A third step of measuring FOXO1 protein concentration in cells treated with the test substance; And; And a fourth step of selecting a glucose biosynthesis inhibitor or a candidate for treating diabetes when the FOXO1 protein amount is reduced compared to the FOXO1 protein amount in a control group not in contact with the test substance.
본원에 따른 방법이 적용되는 세포 또는 동물은 당뇨병의 특징 또는 증상을 나타내는 것이 사용될 수 있으며, 특히 SREBP1c 및/또는 CRY1이 발현 또는 활성이 감소된 세포 및/또는 동물이 사용된다. The cells or animals to which the method according to the present invention is applied may be used to exhibit the characteristics or symptoms of diabetes, in particular cells and / or animals in which SREBP1c and / or CRY1 is reduced in expression or activity.
SREBP1c 및/또는 CRY1 발현은 유전자 및 단백질 수준에서의 발현으로, 발현이 감소된 세포는 정상 세포 특히 정상 간세포와 비교하여 감소된 것으로 당업자면 본원의 개시사항 및 당업계의 수준을 근거로 감소된 수준을 판단할 수 있다. SREBP1c 및/또는 CRY1 의 활성은 단백질은 발현되나, 돌연변이 등의 이유로 인해, 목적하는 활성을 나타내지 못하거나 감소한 것을 의미하며, 당업자면 본원의 개시사항 및 당업계의 수준을 근거로 감소된 수준을 판단할 수 있다. SREBP1c and / or CRY1 expression is expression at the gene and protein levels, with reduced expression of cells compared to normal cells, especially normal hepatocytes, which levels are reduced by those skilled in the art based on the disclosure herein and the level of the art. Can be judged. Activity of SREBP1c and / or CRY1 means that the protein is expressed, but due to a mutation or the like, it does not exhibit or decrease the desired activity, and those skilled in the art can determine a reduced level based on the disclosure herein and the level of the art. can do.
본원에 따른 방법에 사용되는 동물모델은 제 1 형 또는 제 2 형 당뇨병 모델 마우스가 사용될 수 있으며, 이러한 모델은 당업계에 공지된 것으로 예를 들면 스트렙토조토신 유도된 1형 당뇨병 마우스 또는 자연발생 2형 당뇨병 모델인 db/db 마우스 (C57BLKsJ-db/db 마우스)을 포함한다. The animal model used in the method according to the present invention may be a
본원에 따른 방법에 사용되는 세포로는 상술한 조건을 갖는 포도당 합성이 가능한 세포로 이러한 세포는 상술한 동물모델로부터 유래된 세포 특히 포도당을 합성할 수 있는 세포, 특히 일차 간세포, 또는 세포주 예를 들면 H4IIE, HepG2를 포함하나 이로 제한되는 것은 아니다. Cells used in the method according to the present invention is a cell capable of synthesizing glucose having the above-mentioned conditions, such cells are cells derived from the animal model described above, in particular cells capable of synthesizing glucose, in particular primary hepatocytes, or cell lines Including but not limited to H4IIE, HepG2.
본원에 따른 다른 구현예에서, 본원에 따른 방법에 사용될 수 있는 세포 또는 동물은 CRY1의 윗단계인 SREBP1c의 발현은 증가되었으나 CRY1의 발현 또는 활성이 감소된 동물 또는 세포가 사용될 수 있다. In another embodiment according to the present application, a cell or animal that can be used in the method according to the present application may be an animal or cell in which the expression of SREBP1c, which is an upper level of CRY1, is increased but the expression or activity of CRY1 is decreased.
본원에 따른 방법에서 분자 표적은 CRY1으로서, 이의 발현 또는 활성을 증가시키는 물질은 당뇨병 치료제 또는 포도당 생합성 억제 스크리닝의 시험물질로 사용될 수 있다. CRY1의 발현을 증가시키는 물질은 유전자 및/또는 단백질 수준에서의 증가를 의미하는 것이다. In the method according to the present invention, the molecular target is CRY1, and a substance which increases its expression or activity may be used as a test substance for diabetic therapeutic agents or glucose biosynthesis inhibition screening. A substance that increases the expression of CRY1 means an increase in gene and / or protein levels.
본원의 방법에 사용되는 시험물질은 상술한 표적 유전자 또는 단백질의 발현 및/또는 활성을 조절할 것으로 기대되는 물질로, 예를 들면 약물의 스크리닝 목적을 위해서는 화합물은 저분자량의 치료효과를 갖는 것이 사용될 수 있다. 예를 들면 중량이 400 Da, 600 Da 또는 800 Da과 같은 약 1000 Da 내외의 화합물이 사용될 수 있다. 목적에 따라 이러한 화합물은 화합물 라이브러리의 일부를 구성할 수 있으며, 라이브러리를 구성하는 화합물의 숫자도 수십개부터 수백만개까지 다양하다. 이러한 화합물 라이브러리는 펩타이드, 펩토이드 및 기타 환형 또는 선형의 올리고머성 화합물, 및 주형을 기본으로 하는 저분자 화합물, 예컨대 벤조디아제핀, 하이단토인, 바이아릴, 카보사이클 및 폴리사이클 화합물 (예컨대 나프탈렌, 페노티아진, 아크리딘, 스테로이드 등), 카보하이드레이트 및 아미노산 유도체, 디하이드로피리딘, 벤즈하이드릴 및 헤테로사이클 (예컨대 트리아진, 인돌, 티아졸리딘 등)을 포함하는 것일 수 있으나, 이는 단지 예시적인 것으로 이로 한정되는 것은 아니다. The test substance used in the method of the present invention is a substance which is expected to modulate the expression and / or activity of the target gene or protein described above. For example, for the purpose of screening a drug, the compound may have a low molecular weight therapeutic effect. have. For example, compounds of about 1000 Da in weight such as 400 Da, 600 Da or 800 Da can be used. Depending on the purpose, such compounds may form part of a compound library, and the number of compounds constituting the library may vary from tens to millions. Such compound libraries include peptides, peptoids and other cyclic or linear oligomeric compounds, and small molecule compounds based on templates such as benzodiazepines, hydantoin, biaryls, carbocycles and polycycle compounds (such as naphthalene, phenoty) Azine, acridine, steroids, and the like), carbohydrate and amino acid derivatives, dihydropyridine, benzhydryl and heterocycles (such as triazine, indole, thiazolidine, etc.), but these are merely illustrative. It is not limited to this.
본원에 따른 방법은 시험물질 처리 후 시험물질이 목적하는 효과를 나타내는지는 FOXO1 단백질의 발현량 변화로 측정될 수 있다. The method according to the present application can be measured by the change in the expression level of the FOXO1 protein after the test material treatment to show the desired effect.
FOXO1(Forkhead box protein O1)은 본원에서 규명한 SREBP1c-CRY1-FOXO1 경로의 단백질로 인슐린 신호전달과정에서 혈당조절과 관련된 전사인자이며, 인간의 핵산 및 단백질 서열은 각각 NM_002015 및 NP_002006.2로 공지되어 있다. 본원에서는 CRY1이 MDM2를 통해 FOXO1의 분해를 촉진하여 결국 포도당합성을 억제하는 것을 발견하여, SREBP1c-CRY1-FOXO1 기전에 기반한 제2형 당뇨병 치료제는 결국 FOXO1의 단백질 농도를 낮추게 되는 것이다. Forkhead box protein O1 (FOXO1) is a protein of the SREBP1c-CRY1-FOXO1 pathway identified herein and is a transcription factor related to glycemic control in insulin signaling, and human nucleic acid and protein sequences are known as NM_002015 and NP_002006.2, respectively. have. Here we find that CRY1 promotes the degradation of FOXO1 through MDM2 and eventually inhibits glucose synthesis, resulting in a
다른 구현예에서는 상기 제 3 단계에 부가하여, 또는 제 3 단계의 FOXO1 대신에, FOXO1에 의해 발현이 촉진되는 포도당 생합성에 관여하는 효소인 PEPCK 또는 G6Pase의 발현의 측정하여 시험물질의 선별이 가능하다. 이 경우 본원 방법 제 4 단계에서 후보물질은 상기 시험물질과 접촉된 세포에서 상기 시험물질과 접촉되지 않은 대조군 세포와 비교하여 상기 PEPCK 또는 G6Pase의 발현이 감소한 것이다. In another embodiment, a test substance can be selected by measuring the expression of PEPCK or G6Pase, an enzyme involved in glucose biosynthesis in which expression is promoted by FOXO1 in addition to the third step or instead of the FOXO1 of the third step. . In this case, the candidate material in the fourth step of the present method is a decrease in the expression of the PEPCK or G6Pase in the cells in contact with the test material compared to the control cells not in contact with the test material.
PEPCK (Phosphoenolpyruvate carboxykinase)의 핵산 및 단백질 서열을 각각 (Gene ID: 18534, NP_035174.1)로 공지되어 있고, G6Pase (Glucose 6-phosphatase)의 핵산 및 단백질 서열을 각각 (Gene ID: 14377, NP_032087.2)로 공지되어 있다. The nucleic acid and protein sequences of Phosphoenolpyruvate carboxykinase (PEPCK) are known as (Gene ID: 18534, NP_035174.1) and the nucleic acid and protein sequences of G6Pase (Glucose 6-phosphatase), respectively (Gene ID: 14377, NP_032087.2). Is known.
본원에서 FOXO1 단백질 양 또는 PEPCK 또는 G6Pase의 발현 양 측정은 정량 및/또는 정성 분석을 포함하는 것으로, 존재, 부존재의 검출 및 발현량 검출을 포함하는 것으로 이러한 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 당업자라면 본원의 실시를 위해 적절한 방법을 선택할 수 있을 것이다.Determination of the amount of FOXO1 protein or expression of PEPCK or G6Pase herein includes quantitative and / or qualitative analysis, including the detection of presence, absence, and detection of expression levels, which methods are known in the art, and Appropriate methods may be selected for the practice herein.
본원의 일 구현예에 따르면 검출시약은 항체를 포함하며, 본원의 FOXO1 단백질 양 또는 PEPCK 또는 G6Pase의 발현 양 측정은 이에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체를 이용하여 실시된다.According to an embodiment of the present disclosure, the detection reagent comprises an antibody, and the measurement of the amount of FOXO1 protein or expression of PEPCK or G6Pase herein is performed using a monoclonal antibody that specifically binds thereto.
본원에 이용될 수 있는 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체이며, 바람직하게는 모노클로날 항체이다. 항체는 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법들, 예를 들어, 융합 방법(Kohler and Milstein, European Journal of Immunology, 6:511-519(1976)), 재조합 DNA 방법(미국 특허 제4,816,56호) 또는 파아지 항체 라이브러리 방법(Clackson et al, Nature, 352:624-628(1991) 및 Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597(1991))에 의해 제조될 수 있다. 항체 제조에 대한 일반적인 과정은 Harlow, E. and Lane, D., Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York, 1999; Zola, H., Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1984; 및 Coligan, CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY, 1991에 상세하게 기재되어 있으며, 상기 문헌들은 본 명세서에 참조로 삽입된다. 예를 들어, 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 제조는 불멸 세포주를 항체-생산 림프구와 융합시켜 이루어지며, 이 과정에 필요한 기술은 당업자에게 잘 알려져 있으며 용이하게 실시할 수 있다. 폴리클로날 항체는 단백질 항원을 적합한 동물에게 주사하고, 이 동물로부터 항혈청을 수집한 다음, 공지의 친화성(affinity) 기술을 이용하여 항혈청으로부터 항체를 분리하여 얻을 수 있다.Antibodies that can be used herein are polyclonal or monoclonal antibodies, preferably monoclonal antibodies. Antibodies may be commonly used in the art, such as fusion methods (Kohler and Milstein, European Journal of Immunology, 6: 511-519 (1976)), recombinant DNA methods (US Pat. No. 4,816,56) Or phage antibody library methods (Clackson et al, Nature, 352: 624-628 (1991) and Marks et al, J. Mol. Biol., 222: 58, 1-597 (1991)). General procedures for antibody preparation are described in Harlow, E. and Lane, D., Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York, 1999; Zola, H., Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1984; And Coligan, CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley / Greene, NY, 1991, which are incorporated herein by reference. For example, the preparation of hybridoma cells producing monoclonal antibodies is accomplished by fusing immortal cell lines with antibody-producing lymphocytes, and the techniques required for this process are well known to those skilled in the art and can be readily implemented. Polyclonal antibodies can be obtained by injecting a protein antigen into a suitable animal, collecting antisera from the animal, and then isolating the antibody from the antisera using known affinity techniques.
이러한 면역분석은 종래에 개발된 다양한 정량적 또는 정성적 면역분석 프로토콜에 따라 실시될 수 있다. 상기 면역분석 포맷은 방사능면역분석, 방사능면역침전, 면역침전, 면역조직화학염색, ELISA(enzyme-linked immunosorbant assay), 캡처-ELISA, 억제 또는 경쟁 분석, 샌드위치 분석, 유세포 분석(flow cytometry), 면역형광염색 및 면역친화성 정제를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 면역분석 또는 면역염색의 방법은 Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; Gaastra, W., Enzymelinked immunosorbent assay(ELISA), in Methods in Molecular Biology, Vol. 1, Walker, J.M. ed., Humana Press, NJ, 1984 등에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다. 상술한 면역분석 과정에 의한 최종적인 시그널의 세기를 분석하여 즉, 정상 시료와의 시그널 대조를 수행함으로써, 질환 발생 여부를 진단할 수 있다.Such immunoassays can be performed according to various quantitative or qualitative immunoassay protocols developed in the prior art. The immunoassay format may include radioimmunoassay, radioimmunoprecipitation, immunoprecipitation, immunohistochemical staining, enzyme-linked immunosorbant assay (ELISA), capture-ELISA, inhibition or competition assay, sandwich assay, flow cytometry, immunity. Including but not limited to fluorescent staining and immunoaffinity purification. The immunoassay or method of immunostaining is described in Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; Gaastra, W., Enzymelinked immunosorbent assay (ELISA), in Methods in Molecular Biology, Vol. 1, Walker, J.M. ed., Humana Press, NJ, 1984, etc., which is incorporated herein by reference. By analyzing the final signal intensity by the above-described immunoassay process, that is, by performing a signal contrast with a normal sample, it is possible to diagnose whether the disease occurs.
단백질의 양, 존재여부 발현패턴의 분석을 위한 방법은 공지된 것으로 예를 들면 웨스턴 블롯, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선 면역분석(Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테를로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역 전기영동, 조직 면역 염색, 면역 침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS, 단백질 칩(protein chip) 등을 들 수 있다. 단백질 또는 핵산 수준검출을 위한 시약은 공지된 것으로서, 예를 들면 전자는 항원-항체반응, 상기 마커에 특이적으로 결합하는 기질, 핵산 또는 펩타이드 앱타머, 상기 마커와 특이적으로 상호작용하는 수용체 또는 리간드 또는 보조인자와의 반응을 통해 검출될 수 있거나, 또는 질량분광분석기를 이용할 수 있다. 상기 본원의 마커와 특이적으로 상호작용 또는 결합하는 시약 또는 물질은 칩 방식 또는 나노입자(nanoparticle)과 함께 사용될 수 있다.Methods for the analysis of the amount and presence of the protein expression patterns are known, for example Western blot, ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), radioimmunoassay, radioimmunodiffusion, oukterroni Ouchterlony) immune diffusion, rocket immunoelectrophoresis, tissue immunostaining, immunoprecipitation assay, complement fixation assay, FACS, protein chip, and the like. Reagents for detecting protein or nucleic acid levels are known, for example, the former may be an antigen-antibody reaction, a substrate that specifically binds to the marker, a nucleic acid or peptide aptamer, a receptor that specifically interacts with the marker or It can be detected through reaction with a ligand or cofactor, or a mass spectrometer can be used. Reagents or materials that specifically interact with or bind to the markers of the present disclosure may be used with chip or nanoparticles.
본원의 다른 구현예에 따르면 발현 양 분석은 가능한 경우 mRNA 수준에서 실시될 수 있다. mRNA 검출은 통상 노던블랏이나 역전사 PCR(중합효소연쇄반응)을 통해 수행된다. 후자의 경우 검체의 RNA를 특히 mRNA를 분리한 후, 이로부터 cDNA를 합성한 후, 특정 프라이머, 또는 프라이머 및 프로브의 조합을 사용하여, 검체 중의 특정 유전자를 검출하는 것으로, 특정 유전자의 존재/부존재 또는 발현량을 결정할 수 있는 방법이다. 이러한 방법은 예를 들면 (Han, H.; Bearss, D. J.; Browne, L. W.; Calaluce, R.; Nagle, R. B.; Von Hoff, D. D., Identification of differentially expressed genes in pancreatic cancer cells using cDNA microarray. Cancer Res 2002, 62, (10), 2890-6)에 기재되어 있다.According to another embodiment of the present disclosure, expression amount analysis can be performed at the mRNA level if possible. mRNA detection is usually carried out by Northern blot or reverse transcription PCR (polymerase chain reaction). In the latter case, the RNA of a sample is specifically isolated from mRNA, and then cDNA is synthesized therefrom, and then a specific gene or a combination of primers and probes is used to detect a specific gene in the sample. Or it is a method which can determine the expression amount. Such methods are described, for example, in (Han, H .; Bearss, DJ; Browne, LW; Calaluce, R .; Nagle, RB; Von Hoff, DD, Identification of differentially expressed genes in pancreatic cancer cells using cDNA microarray. Cancer Res 2002 , 62, (10), 2890-6).
후보물질은 상기 시험물질과 접촉된 세포와 상기 시험물질과 접촉되지 않은 대조군 세포에서 상기 FOXO1의 단백질 양을 비교하여, 상기 시험물질과 접촉된 세포에서 상기 FOXO1의 단백질 양이 상기 대조군의 FOXO1의 단백질 양과 비교하여 감소한 경우 이를 제2형 당뇨병 치료제 후보물질로 선별할 수 있다. Candidates compared the amount of FOXO1 protein in the cells in contact with the test material and the control cell not in contact with the test material, the amount of FOXO1 protein in the cell in contact with the test material is the protein of FOXO1 of the control If reduced compared to the amount it can be selected as a candidate for
본 방법에서 사용되는 세포의 종류 및 시험물질의 양 및 종류 등은 사용하는 구체적인 실험방법 및 시험물질의 종류에 따라 달라지며, 당업자라면 적절한 양을 선택할 수 있을 것이다. 실험결과 시험물질과 접촉되지 않은 대조군과 비교하여 시험물질의 존재 하에서 상기 단백질 발현 또는 활성의 감소를 가져오는 물질을 후보 물질로 선별한다. 대조군과 비교 약 99% 이상 감소, 약 95% 이상 감소, 약 90% 이상 감소, 약 85% 이상 감소, 약 80% 이상 감소, 약 75% 이상 감소, 약 70% 이상 감소, 약 65% 이상 감소, 약 60% 이상 감소, 약 55% 이상 감소, 약 50% 이상 감소, 약 45% 이상 감소, 약 40% 이상 감소, 약 30% 이상 감소, 약 20% 이상 감소, 약 10% 이상 감소를 의미하나, 이를 벗어나는 범위를 제외하는 것은 아니다.The type of cell used in the present method and the amount and type of test substance vary depending on the specific test method used and the type of test substance, and those skilled in the art will be able to select an appropriate amount. As a result of the experiment, as a candidate, a substance which results in a decrease in the expression or activity of the protein in the presence of the test substance is selected as compared with the control group which is not in contact with the test substance. Compared with the control group, about 99% reduction, about 95% reduction, about 90% reduction, about 85% reduction, about 80% reduction, about 75% reduction, about 70% reduction, about 65% reduction , About 60% reduction, about 55% reduction, about 50% reduction, about 45% reduction, about 40% reduction, about 30% reduction, about 20% reduction, about 10% reduction However, it does not exclude the range beyond this.
다른 양태에서 본원은 CRY1 유전자, 또는 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질, 또는 상기 유전자를 포함하는 인비트로 세포 또는 동물에서 SREBP1c-CRY1-FOXO1 신호전달 경로 조절용 키트 또는 방법에 관한 것이다. In another aspect, the present disclosure relates to a CRY1 gene, or a protein encoded by the gene, or a kit or method for regulating the SREBP1c-CRY1-FOXO1 signaling pathway in an in vitro cell or animal comprising the gene.
또 다른 양태에서 본원은 CRY1 유전자, 또는 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질, 또는 상기 유전자를 포함하는 인비트로 세포 또는 동물에서 포도당생합성 조절용 키트 또는 방법에 관한 것이다. In another aspect the invention relates to a kit or method for the control of glucose biosynthesis in a CRY1 gene, or a protein encoded by said gene, or in vitro cells or animals comprising said gene.
상기 키트 및 방법에 사용되는 물질 및 이를 이용한 조절 기전에 대한 설명은 앞서 언급한 바를 참조할 수 있다. 본원에 따른 방법 및 키트는 당뇨병의 혈당조절제, 혈당강하제, 기존의 약물 테스트, 신약 개발, 연구툴로서 유용하게 사용될 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니다. For a description of the materials used in the kits and methods and the regulatory mechanism using the same, reference may be made to the foregoing. Methods and kits according to the present application can be usefully used as, but not limited to, blood glucose control agents, hypoglycemic agents, existing drug tests, drug development, research tools of diabetes.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해서 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, examples are provided to help understand the present invention. However, the following examples are provided only to more easily understand the present invention, and the present invention is not limited to the following examples.
실시예Example
동물실험Animal experiment
C57BL/6 수컷 마우스를 SAMTACO 에서 구입하였다. db/+와 db/db 마우스를 중앙실험동물에서 구입하였다. SREBP1c 결핍 마우스는 University of texas Southwestern Medical Center의 J. Horton 박사에게서 받았다. 모든 동물은 12시간 light, 12시간 dark로 이뤄진 병원균이 없는 동물실에서 유지하였다. 마우스의 조직은 -80도에 보관한 뒤 분석하였다. 모든 마우스 실험은 SNU IACUC와 Institutional Animal Care and Use Committee at the University of North Carolina 의 허락을 받고 수행되었다. C57BL / 6 male mice were purchased from SAMTACO. db / + and db / db mice were purchased from central laboratory animals. SREBP1c deficient mice were received from Dr. J. Horton of the University of texas Southwestern Medical Center. All animals were maintained in a pathogen-free animal room consisting of 12 hours light and 12 hours dark. Tissues of mice were stored at -80 degrees and analyzed. All mouse experiments were performed with permission from SNU IACUC and the Institutional Animal Care and Use Committee at the University of North Carolina.
시약 및 플라스미드Reagents and Plasmids
MG132는 Calbiochem (San Diego, CA, USA)에서 구입하였다. MK2206는 Selleckchem (S1078)에서 구입하였다. AKTVIII는 Santa Cruz Biotechnology (sc-202048)에서 구입하였다. 사용된 하기 항체 및 구입처는 다음과 같다 : MYC (Cell Signalling, 2276, 1:1,000 dilution), HA (Cell Signalling, 3724, 1:1,000 dilution), FOXO1 (Cell Signalling, 2880, 1:1,000 dilution), phosphor-FOXO1-Ser256 (Cell Signalling, 9461, 1:1,000 dilution), AKT (Cell Signalling, 9272, 1:1,000 dilution), 및 phosphor-AKT-Ser473 (Cell Signalling, 9271, 1:1,000 dilution), FLAG (Sigma-Aldrich, F3165, 1:1,000 dilution), ACTIN (Sigma-Aldrich, A5316, 1:2,000 dilution), G6Pase (Santa Cruz Biotechnology, sc-33839, 1:500 dilution), POLII (Santa Cruz Biotechnology, sc-899, 1:1,000 dilution), GFP (Santa Cruz Biotechnology, sc-9996, 1:1,000 dilution), GAPDH (LabFrontier, Co., LF-PA0018, 1:1,000 dilution), SREBP1 (BD Bioscience, 557036, 1:1,000 dilution), MDM2(Abcam, ab16895, 1:1,000 dilution) 및 CRY1 (lab made antibody from Dr Aziz Sancar31, 1:200 dilution). GFP-CRY1는 pEGFP-N1 벡터로 클론되었고 FLAG-MDM2는 pCMV-3 FLAG로 클론되었다. 마우스 CRY1 프로모터는 pGL3-basic 벡터로 클론되었다.MG132 was purchased from Calbiochem (San Diego, CA, USA). MK2206 was purchased from Selleckchem (S1078). AKTVIII was purchased from Santa Cruz Biotechnology (sc-202048). The following antibodies and where used were purchased: MYC (Cell Signaling, 2276, 1: 1,000 dilution), HA (Cell Signaling, 3724, 1: 1,000 dilution), FOXO1 (Cell Signaling, 2880, 1: 1,000 dilution), phosphor-FOXO1-Ser256 (Cell Signaling, 9461, 1: 1,000 dilution), AKT (Cell Signaling, 9272, 1: 1,000 dilution), and phosphor-AKT-Ser473 (Cell Signaling, 9271, 1: 1,000 dilution), FLAG ( Sigma-Aldrich, F3165, 1: 1,000 dilution), ACTIN (Sigma-Aldrich, A5316, 1: 2,000 dilution), G6Pase (Santa Cruz Biotechnology, sc-33839, 1: 500 dilution), POLII (Santa Cruz Biotechnology, sc- 899, 1: 1,000 dilution), GFP (Santa Cruz Biotechnology, sc-9996, 1: 1,000 dilution), GAPDH (LabFrontier, Co., LF-PA0018, 1: 1,000 dilution), SREBP1 (BD Bioscience, 557036, 1: 1,000 dilution), MDM2 (Abcam, ab16895, 1: 1,000 dilution) and CRY1 (lab made antibody from Dr Aziz Sancar31, 1: 200 dilution). GFP-CRY1 was cloned into pEGFP-N1 vector and FLAG-MDM2 was cloned into pCMV-3 FLAG. Mouse CRY1 promoter was cloned into pGL3-basic vector.
In In vivovivo imaging system imaging system
10주령 된 C57BL/6 수컷 마우스에 GFP, SREBP1c가 들어있는 adenovirus를 G6Pase luciferase가 나오는 adenovirus와 함께 감염시켰다. 5일 이후 마우스의 복강에 100mg/kg의 firefly D-luciferin을 찌른 뒤 5분후 마취시키고, IVIS100 기계를 이용하여 이미지를 확보하였다. Ten-week-old C57BL / 6 male mice were infected with adenovirus containing GFP and SREBP1c along with adenovirus containing G6Pase luciferase. After 5 days, 100 mg / kg of firefly D-luciferin was stabbed in the abdominal cavity of the mouse and anesthetized after 5 minutes, and images were obtained using an IVIS100 machine.
피루브산염Pyruvate 저항성 실험 Resistance test
피루브산염 저항성 실험을 위해 마우스를 16시간 굶긴 뒤 복강에 피루브산염을 2g/kg 의 농도로 주입하였다. 혈당은 꼬리의 혈관을 통해서 각 시간마다 Free-Style blood glucose metre를 이용하여 측정하였다. Mice were starved for 16 hours for pyruvate resistance experiments and then injected into the abdominal cavity with pyruvate at a concentration of 2 g / kg. Blood glucose was measured using a free-style blood glucose meter each hour through the blood vessels of the tail.
세포-기초의 Cell-based 유비퀴틴화Ubiquitination 분석법 Method
COS-1 세포에 FOXO1 WT-MYC, nFOXO1(ADA)-MYC, GFP-CRY1 (또는 FLAG-CRY1), FLAG-MDM2, 그리고 Ubiquitin-HA를 넣어준 뒤 MG132를 20uM의 농도로 4시간 처리하였다. 이후 세포를 TGN Buffer를 이용해서 깬 뒤 myc 안티바디를 이용해 침전시켰다. TGN buffer로 침전물을 3번 씻은 뒤 SDS-PAGE를 이용하여 단백질을 분리시켰다. 이후 western blotting을 할 때에 HA 항체를 이용하였다. FOXO1 WT-MYC, nFOXO1 (ADA) -MYC, GFP-CRY1 (or FLAG-CRY1), FLAG-MDM2, and Ubiquitin-HA were added to COS-1 cells, and MG132 was treated at a concentration of 20 uM for 4 hours. Cells were then crushed using TGN Buffer and then precipitated using myc antibody. After washing the precipitate three times with TGN buffer, the protein was separated using SDS-PAGE. Since the Western blotting was used HA antibody.
ChIPChIP assay assay
4% formaldehyde를 이용하여 H4IIE cell의 핵에 있는 chromatin과 protein을 고정시켰다. 고정시킨 이후에 세포를 분해하고, sonication을 이용하여 DNA를 잘게 분쇄하였다. 이후 SREBP1c 안티바디와 대조군 IgG 안티바디를 이용하여 2시간 동안 침전시켰다. 침전 된 DNA 조각들은 PCR 방법을 이용하여 증폭시켰다. ChIP 분석 프라이머 서열은 하기와 같다 : sense, 50-GTCCGAGCCAGCGTAGTAAA-30 , antisense, 50-GGATAGCGCGGGCTAGAG-30 ; negative control primer sense, 50-CCAGCCACTTTGCTGAAGTT-30 and antisense, 50-CTAGACAAGGCTGCCCACTC-30.4% formaldehyde was used to fix chromatin and protein in the nucleus of H4IIE cells. After fixation, cells were digested and DNA was crushed using sonication. Thereafter, it was precipitated for 2 hours using SREBP1c antibody and control IgG antibody. Precipitated DNA fragments were amplified using the PCR method. ChIP assay primer sequences are as follows: sense, 50-GTCCGAGCCAGCGTAGTAAA-30, antisense, 50-GGATAGCGCGGGCTAGAG-30; negative control primer sense, 50-CCAGCCACTTTGCTGAAGTT-30 and antisense, 50-CTAGACAAGGCTGCCCACTC-30.
아데노바이러스Adenovirus 제조 Produce
SREBP1c와 CRY1의 cDNA 를 adTrack-CMV 셔틀 벡터에 클로닝을 한 뒤 ad-easy adenoviral 벡터 시스템에 재조합 시켰다. 완성된 벡터는 HEK293A 세포에 발현 시킨뒤 만들어지는 adenovirus를 응축시켰다. In vivo 실험을 하기 위해서는 5 x 109 p.f.u(plaqueformationunit)의 Adenovirus를 이용하였다. The cDNAs of SREBP1c and CRY1 were cloned into an adTrack-CMV shuttle vector and recombined into an ad-easy adenoviral vector system. The completed vector was expressed in HEK293A cells to condense the adenovirus produced. For in vivo experiments, 5 x 10 9 pfu (plaqueformation unit) Adenovirus was used.
마우스 일차 간세포 배양Mouse primary hepatocyte culture
마우스의 일차 간세포는 10주령 된 C57BL/6 male mice에서 분리하였다. 마우스를 마취시킨 이후 간의 혈관을 이용하여 collagenase를 주입하였다. 이를 통해 간조직이 간세포로 분리되었다. 6시간이 지나면 분리된 간세포는 dish에 붙었다. 이후에 adenovirus나 siRNA을 이용한 실험을 진행하였다. Adenovirus는 4시간 동안 10 PFU의 농도로 처리한 뒤 미디어를 갈아주었다. Primary hepatocytes were isolated from 10-week-old C57BL / 6 male mice. After anesthetizing mice, collagenase was injected using blood vessels of the liver. This separated liver tissue into hepatocytes. After 6 hours, the isolated hepatocytes were attached to the dish. After that, the experiment was carried out using adenovirus or siRNA. Adenovirus was treated at a concentration of 10 PFU for 4 hours and then the media was changed.
세포 분해 및 침전Cell breakdown and precipitation
세포를 차가운 PBS를 이용해 씻은 다음 TGN Buffer (50mM Tris-HCl, pH 7.5, 150mM NaCl, 1% Tween-20 and 0.3% NP-40) 또는 SDS lysis buffer (200mM Tris-HCl, pH 6.8, 10% glycerol and 4% SDS)에 0.1% proteases inhibitor를 넣어 준 buffer로 세포를 분해하였다. 분해된 세포의 부산물은 12,000r.p.m. 4℃에서 15분 동안 원심분리 한 뒤 1~1.5mg의 단백질을 면역침전에 사용하였다. 면역침전은 1차 안티바디를 이용하여 2시간 동안 4℃에서 배양한 뒤 50% slurry of protein A sepharose를 첨가한 뒤 1시간 더 배양하였다. 이후 세번의 워시 과정을 거친 뒤 SDS-PAGE를 이용하여 Western blot을 진행하였다. Wash cells with cold PBS then TGN Buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 1% Tween-20 and 0.3% NP-40) or SDS lysis buffer (200 mM Tris-HCl, pH 6.8, 10% glycerol and 4% SDS) were digested with buffer containing 0.1% proteases inhibitor. The by-product of lysed cells was 12,000 r.p.m. After centrifugation for 15 minutes at 4
일시적 형질 도입 및 Transient transduction and luciferaseluciferase assay assay
HEK293T 세포에 다양한 DNA를 일시적 형질 도입방법으로 넣었다. 이 때 사용되는 방법은 calcium-phosphate 방법이다. 36시간 동안 배양한 이후에 lysis buffer(25mM Tris-phosphate pH 7.8, 10% glycerol, 2mM EDTA, 2mM DTT and 1% Triton X-100) 를 이용하여 세포를 깬 뒤 luciferase 활성 및 beta-galatosidase 활성을 측정하였다(Promega, Madison, WI, USA). Various DNAs were inserted into HEK293T cells by transient transfection. The method used at this time is calcium-phosphate method. After incubation for 36 hours, luciferase activity and beta-galatosidase activity were measured after cell breakdown using lysis buffer (25 mM Tris-phosphate pH 7.8, 10% glycerol, 2 mM EDTA, 2 mM DTT and 1% Triton X-100). (Promega, Madison, Wis., USA).
RNA 준비와 정량적 실시간 RNA Preparation and Quantitative Real Time PCRPCR
전체 RNA를 iso-RNA 용해 시약으로 추출하였으며, RevertAid M-MuLV 역전사 효소로 cDNA를 합성하였다. 상대적인 mRNA 양은 CFX96TM 리얼 타임 시스템을 이용하여 측정하였으며, TBP 또는 cyclophilin mRNA 양으로 보정한 뒤 계산하였다. Total RNA was extracted with iso-RNA lysis reagent and cDNA was synthesized with RevertAid M-MuLV reverse transcriptase. Relative mRNA levels were measured using the CFX96TM real time system and calculated after correction with TBP or cyclophilin mRNA amounts.
siRNAsiRNA 일시적 형질 도입 Transient transduction
CRY1, FOXO1, MDM2의 siRNA Duplex를 Bioneer, Inc. (Daejeon, South Korea)에서 구입하였다. 일차간세포에는 Lipofectamine RNAi MAX를 이용하여 일시적 형질 도입을 하였다.SiRNA Duplex of CRY1, FOXO1, MDM2 Bioneer, Inc. It was purchased from (Daejeon, South Korea). Primary cells were transiently transduced using Lipofectamine RNAi MAX.
포도당 생합성 ASSAYGlucose Biosynthesis ASSAY
일차간세포에서 포도당 생합성을 Glucose oxidase assay kit을 사용하였다 (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA). 세포를 Krebs-Ringer buffer (115mM NaCl, 5.9mM KCl, 1.2mM MgCl2, 1.2mM NaH2PO4, 2.5mM CaCl2, 25mM NaHCO3, 10mM lactate and 2mM pyruvate, pH 7.4)에 37℃ and 5% CO2의 조건에서 6시간 동안 배양한 뒤 측정하였다. Glucose biosynthesis in primary hepatocytes was used with a Glucose oxidase assay kit (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA). Cells were treated with Krebs-Ringer buffer (115 mM NaCl, 5.9 mM KCl, 1.2 mM MgCl 2 , 1.2 mM NaH 2 PO 4 , 2.5 mM CaCl 2 , 25 mM NaHCO 3 , 10 mM lactate and 2 mM pyruvate, pH 7.4) at 37 ° C. and 5%. It was measured after incubating for 6 hours under conditions of CO 2 .
통계분석Statistical analysis
샘플의 크기는 서행실험에 근거해서 통계적인 의미성을 가지는 수준에서 선택하였다. 통계분석은 Student’s t-test를 이용하였고, mean±s.d.로 표기하였다. 각각의 실험은 3번 이상 독립적으로 수행하였다. P<0.05의 의미는 통계적으로 의미가 있다. 기술적인 실패가 발생한 샘플은 최종 분석에서 제외하였다. 각각의 실험들은 임의적으로 수행되지 않았다. 또한 실험자들은 실험샘플의 정체를 알고 수행하였다. The size of the sample was selected at the level having statistical significance based on the slow experiment. Statistical analysis was performed using Student's t-test and expressed as mean ± s.d. Each experiment was performed three or more times independently. The significance of P <0.05 is statistically significant. Samples with technical failures were excluded from the final analysis. Each experiment was not performed randomly. In addition, the experimenter knows the identity of the test sample and performed it.
실시예Example 1. 섭취 및 인슐린에 의한 1. By ingestion and insulin CRY1의Of CRY1 상향조절 Up-regulation
간에서, 말초 생체시계(peripheral circadian clock) 유전자는 다양한 영양 및 호르몬 변화에 의해 조절된다. 생체시계 유전자가 에너지 항상성과 밀접하게 연관되어 있다면, 생체시계 유전자가 섭취-의존성 간 지질 및 당 대사에 영향을 미칠 수 있다고 본 발명자는 생각하였다. 대부분 생체시계 유전자의 발현이 시간 의존적 방식으로 변동하므로, 섭취 및/또는 재섭취 실험의 종점을 ZT3으로 고정하였다. 재 섭취시에, SREBP1c, FASN 및 ACC를 포함하는 지질생성 유전자의 발현이 간에서 상향조절되었다. 종래 연구와 일치하게도, PEPCK 및 G6Pase와 같은 당 신생과정의 유전자의 발현은 식사 후 상태에서는 하향조절되었다 (도 1의 a). 흥미롭게도, 간 CRY1 mRNA의 레벨이 재섭취된 마우스에서 증가하였다(도 1a도 1의 a). 또한, ZT 3일 때 CRY1 단백질의 발현이 재섭취된 마우스 간에서 현저히 증가하였다(도 1의 b). CRY1이 생체시계 핵심 유전자의 하나이므로, 본 발명자는 각각 CRY1 발현의 피크 및 트로프(trough) 타임인 ZT 22 및 ZT 10일 때 CRY1 유전자 발현을 조사하였다. 재섭취시에, CRY1, BMAL1, CLOCK, PER1, PER2 및 Reverbs를 포함하는 많은 생체시간 유전자의 발현이 ZT22일 때 상당히 변화하였지만, ZT 10일때는 대부분 그렇지 않았다. CRY1 발현의 기저 레벨이 ZT 22 및 ZT 10일때 서로 다르게 조절되었던 반면, 재섭취는 ZT 22일때 CRY1 mRNA 및 단백질 레벨이 ZT 10일때와 비교하여 증가하였다. 이러한 결과는, CRY1 발현이 특정 ZT 시점에서 영양적 자극에 의해 조절된다는 것을 의미한다. 이러한 발견으로 인해 본 발명자는 인슐린이 간 CRY1 유전자 발현을 증가시킬 수 있는지를 시험하였다. 일차 간세포에서, CRY1 mRNA 레벨은 SREBP1c mRNA와 유사하게 인슐린에 의해 증가하였다(도 1의 c). 종합하여 보면, 이러한 데이터는 간 CRY1 발현이 섭취 및 인슐린에 의해 상향조절되는 것을 나타낸다. In the liver, the peripheral circadian clock genes are regulated by various nutritional and hormonal changes. If the biological clock gene is closely associated with energy homeostasis, the inventors thought that the biological clock gene could affect uptake-dependent liver lipid and sugar metabolism. Since the expression of most biological clock genes fluctuates in a time-dependent manner, the end point of intake and / or reintake experiments was fixed at ZT3. Upon re-ingestion, the expression of lipogenetic genes, including SREBP1c, FASN and ACC, was upregulated in the liver. Consistent with previous studies, expression of glycogenetic genes such as PEPCK and G6Pase was downregulated in post-meal conditions (FIG. 1 a). Interestingly, the level of hepatic CRY1 mRNA was increased in reingested mice (FIG. 1A and FIG. 1A). In addition, the expression of CRY1 protein was significantly increased in the re-ingested mouse liver at ZT 3 (FIG. 1B). Since CRY1 is one of the biological clock core genes, we examined CRY1 gene expression at
CRY1이 당코르티코이드 수용체 시그널링 및 글루카곤 시그널링 경로를 방해함으로써 간에서 당의 신생과정을 억제하는 것처럼 보인다고 보고되어 있다. CRY1는, 당 신생과정의 조절에 참여하는 당코르티코이드 수용체 및 글루카곤 수용체의 α-서브유닛과 상호작용한다. 그럼에도 불구하고, 인슐린에 노출된 후 영양이 풍부한 상태동안의 CRY1의 특이적 역할은 분명하게 설명되어 있지 않았다. CRY1가 글루카곤 시그널링 및/또는 당코르티코이드 수용체 의존성 경로를 저해함으로써 당신생과정을 억제할 수 있는지를 시험하기 위하여, 글루카곤 또는 당코르티코이드 자극에 대한 상태를 흉내내기 위하여 CRY1-과발현 일차 간세포를 포르스콜린(forskolin), db-cAMP 또는 덱사메타손으로 처리하였다. 일차 간세포에서, CRY1는 포르스콜린(forskolin), db-cAMP 또는 덱사메타손의 존재시에 당신생과정 유전자를 부분적으로 억제하는데, 이는 글루카곤 및 당코르티코이드 시그널링 경로에 추가하여, 간 포도당 생산을 억제하는, CRY1에 의해 조절되는 또다른 시그널링 캐스캐이드가 존재할 수 있다는 것을 의미한다. 따라서 CRY1는 다양한 호르몬에 반응하여 간 당 신생과정을 조절하는 다양한 조절 경로에 포함된 것으로 보인다. It has been reported that CRY1 appears to inhibit the angiogenesis of sugars in the liver by interfering with glycocorticoid receptor signaling and glucagon signaling pathways. CRY1 interacts with the α-subunits of glycocorticoid receptors and glucagon receptors that participate in the regulation of sugar angiogenesis. Nevertheless, the specific role of CRY1 during the nutritional state after exposure to insulin is not clearly explained. To test whether CRY1 can inhibit your life cycle by inhibiting glucagon signaling and / or glycocorticoid receptor-dependent pathways, CRY1-overexpressing primary hepatocytes may be used to simulate the condition for glucagon or glycocorticoid stimulation. forskolin), db-cAMP or dexamethasone. In primary hepatocytes, CRY1 partially inhibits your life cycle gene in the presence of forskolin, db-cAMP or dexamethasone, which in addition to the glucagon and glycocorticoid signaling pathways, inhibits hepatic glucose production. It means that there may be another signaling cascade regulated by CRY1. Thus, CRY1 appears to be involved in a variety of regulatory pathways that regulate hepatic glucose angiogenesis in response to various hormones.
실시예Example 2. 2. SREBP1c에On SREBP1c 의한 by CRY1CRY1 유전자 발현 조절 Gene expression regulation
이어 인슐린-의존성 CRY1 유전자 발현을 조절하는 단백질을 조사하기 위하여, 원숭이, 소, 양, 인간, 랫트 및 마우스를 포함하는 다양한 종에서 CRY1 프로모터를 분석하였다. 프록시말 CRY1 프로모터에 E-BOX (CANNTG) 뿐만 아니라 몇몇 SRE(sterol regulatory element)가 있는데, 이는 또한 핵심 생체시계 단백질인 BMAL1 및 CLOCK에 대한 타겟 모티프이다. SRE 및 E-BOX 모티프 둘다 이중 DNA 결합 특이성을 가지는 SREBP1c의 잘 알려진 결합 타겟이다. SREBP1c가 CRY1 유전자 발현을 조절할 수 있는지를 알아보기 위하여, SREBP1c를 마우스 일차 간세포에 과발현시켰다. 도 2의 a, b에 나타난 바와 같이, 간 CRY1 mRNA 및 CRY1 단백질 레벨은 SREBP1c 과발현에 의해 증가하였는데(도 2의 a, b), 이는 SREBP1c가 식사 후 상태에서 간 CRY1 유전자 발현을 상향조절하는 주요 전사인자일 수 있다는 것을 암시한다. 다음으로, CRY1 프로모터 활성에 대한 SREBP1c의 이소성 발현의 효과를 조사하였다. 야생형 CRY1 프로모터 유래 루시퍼라아제의 발현을 HEK293T 세포에서 돌연변이 SRE 모티프(3XSRE)가 있는 프로모터로부터의 발현과 비교하였다. 본원에서는 3XSRE 서열 손실과 함께 프로모터 활성이 실질적으로 손실되지만 E-BOX 모티프 서열은 그렇지 않다는 것을 발견하였다(도 2의 c). 또한, CRY1 프로모터에 결합하는 SREBP1c를 ChIP 분석법으로 확인하였다(도 2의 d). 그 결과 간 SREBP1c는 G6Pase 및 PEPCK 발현을 감소시켰다(도 2a).The CRY1 promoter was then analyzed in various species, including monkeys, cattle, sheep, humans, rats, and mice, to examine proteins that regulate insulin-dependent CRY1 gene expression. In addition to E-BOX (CANNTG) in the proximal CRY1 promoter, there are several sterol regulatory elements (SREs), which are also target motifs for the key biological clock proteins BMAL1 and CLOCK. Both SRE and E-BOX motifs are well known binding targets of SREBP1c with double DNA binding specificity. To determine if SREBP1c can regulate CRY1 gene expression, SREBP1c was overexpressed in mouse primary hepatocytes. As shown in Figures a and b, hepatic CRY1 mRNA and CRY1 protein levels were increased by SREBP1c overexpression (a, b in Figure 2), which is the major factor in which SREBP1c upregulates hepatic CRY1 gene expression in post-meal state. Imply that it can be a transcription factor. Next, the effect of ectopic expression of SREBP1c on CRY1 promoter activity was investigated. Expression of wild-type CRY1 promoter-derived luciferase was compared with expression from a promoter with a mutant SRE motif (3XSRE) in HEK293T cells. It was found herein that promoter activity is substantially lost with 3XSRE sequence loss while the E-BOX motif sequence is not (FIG. 2C). In addition, SREBP1c binding to the CRY1 promoter was confirmed by ChIP analysis (d in Fig. 2). As a result, liver SREBP1c reduced G6Pase and PEPCK expression (FIG. 2A).
SREBP1c가 인슐린이 있을 때 CRY1 유전자 발현을 촉진시키는지를 조사하기 위하여, SREBP1c+/+ 및 SREBP1c-/- 마우스에서 분리한 일차 간세포 를 인슐린으로 챌린지하였다. SREBP1c+/+ 일차 간세포에서의 CRY1 단백질 레벨이 인슐린에 의해 현저히 높아진 반면 SREBP1c-/- 일차 간세포의 CRY1 단백질 레벨은 인슐린에 의해 더 낮은 정도로 증가하였다(도 2의 e). 또한 SREBP1c+/+ 마우스와는 반대로, SREBP1c-/- 마우스에서는 재섭취를 하더라도 간 CRY1 유전자 발현을 증가시키지 못하였다(도 2의f). 이러한 데이터는 SREBP1c이 식사 후 상태에서 간 CRY1 유전자 발현을 상향조절시키는 주요 인자라는 것을 의미한다. To investigate whether SREBP1c promotes CRY1 gene expression in the presence of insulin, primary hepatocytes isolated from SREBP1c + / + and SREBP1c − / − mice were challenged with insulin. CRY1 protein levels in SREBP1c + / + primary hepatocytes were markedly elevated by insulin, whereas CRY1 protein levels in SREBP1c − / − primary hepatocytes were increased to a lower extent by insulin (FIG. 2 e). Also SREBP1c + / + mice, as opposed to, SREBP1c - / - did not increase the cross-CRY1 gene expression, even if the re-uptake in the mouse (f of Fig. 2). These data indicate that SREBP1c is a major factor that upregulates liver CRY1 gene expression in the post-meal state.
실시예Example 3. 3. SREBP1cSREBP1c -- CRY1CRY1 경로에 의한 간의 당 신생과정 저해 규명 Inhibition of hepatic glycemic process by pathway
마우스 일차 간세포에서 SREBP1c 과발현은 포도당 생성을 감소시키는 것으로 나타났다(도 3의 a). 또한 광학 인 비보 이미지 분석에서, 간 SREBP1c 과발현은 인 비보 G6Pase 유전자의 프로모터 활성을 현저하게 억제하였다(도 3b). 따라서, G6Pase 및 PEPCK 유전자의 발현은 SREBP1c 과발현 마우스의 간에서 억제되었다. 이러한 발견으로 인해 인비보 혈당 레벨에 대한 SREBP1c의 효과에 대해 연구하게 되었다. PTT 시험에서 피루브산염 주입 후 SREBP1c의 아데노바이러스 과발현은 혈당 레벨을 상당히 감소시켰다(도 3의 c, d). 또한 SREBP1c-/- 마우스에서 SREBP1c+/+ 마우스보다 혈당이 더 높게 나타났다(도 3e,f). 이에 이러한 결과는, 간 SREBP1c가 당신생과정 유전자 발현을 강력하게 조절함으로써 당신생과정을 억제할 수 있다는 것을 의미한다. SREBP1c overexpression in mouse primary hepatocytes was shown to reduce glucose production (FIG. 3 a). Also in optical in vivo image analysis, liver SREBP1c overexpression significantly inhibited the promoter activity of the in vivo G6Pase gene (FIG. 3B). Thus, expression of the G6Pase and PEPCK genes was inhibited in the liver of SREBP1c overexpressing mice. This finding led to the study of the effect of SREBP1c on in vivo blood glucose levels. Adenovirus overexpression of SREBP1c after pyruvate injection in the PTT test significantly reduced blood glucose levels (FIG. 3 c, d). In addition, the blood glucose was higher in SREBP1c − / − mice than in SREBP1c + / + mice (FIG. 3e, f). These results indicate that liver SREBP1c can inhibit your life process by strongly regulating your life cycle gene expression.
이어 SRENBP1c의 신규타겟 유전자인 CRY1이 간 당 신생과정 유전자 발현을 조절하는지 조사하기 위하여, 랫트 간세포암 H4IIE 세포에서 siRNA(small interfering RNA)를 통해 CRY1 발현을 억제시켰다. CRY1이 하향조절되면, 간 당신생과정에 중요한 유전자인 G6Pase 및 PEPCK 유전자 발현이 증가하였다(도 3g). 반대로, 간 CRY1 과발현은 마우스 일차 간세포에서 G6Pase 및 PEPCK 유전자 발현을 감소시켰다(도 3h). 이러한 관찰을 확인하기 위하여, CRY1+/+ 및 CRY1-/- 마우스에서 피루브산-유도의 혈당 레벨을 측정하였다. 도 3i,j에 나타난 바와 같이, CRY1+/+ 마우스보다 CRY1-/- 마우스에서 혈당 레벨이 더 높게 나타났다. CRY1가 SREBP1c에 의한 간 당 신생과정을 저해하는 주요 매개자인지를 알아보기 위하여, CRY1+/+ 및 CRY1-/- 마우스 유래의 일차 간세포에서 포도당 생산 분석법을 수행하였다. 도 3k에 나타나 있는 바와 같이, SREBP1c 과발현에 의하여 CRY1+/+ 일차 간세포에서 포도당 생성이 약화된 반면 SREBP1c는 CRY1-/- 일차 간세포에서 포도당 생성을 억제하지 못하였다. SREBP1c-CRY 시그널링 경로가 실제 인비보 간 당 생성과정을 억제하는지를 알아보기 위하여, SREBP1-/- 마우스의 간에서 CRY1을 아데노바이러스성으로 과발현시켰다. PTT에서 SREBP1c+/+ 마우스보다 SREBP1c-/- 마우스에서 혈당 레벨이 더 높게 나타난 반면, CRY1 과발현된 SREBP1c-/- 마우스에서는 혈당 레벨이 감소되었다(도 3의 l,m). 이러한 데이터는 SREBP1c-CRY1 시그널링 경로가 인 비보에서 간 당 신생과정을 저해할 수 있다는 것을 의미한다. In order to investigate whether CRY1, a new target gene of SRENBP1c, regulates the expression of hepatic glycemic neoplasms, CRY1 expression was inhibited through siRNA (small interfering RNA) in HCCIIE cells. When CRY1 was down-regulated, the expression of G6Pase and PEPCK genes, which are important genes for liver life, increased (FIG. 3G). In contrast, hepatic CRY1 overexpression reduced G6Pase and PEPCK gene expression in mouse primary hepatocytes (FIG. 3H). To confirm this observation, blood glucose levels of pyruvate-induced blood levels were measured in CRY1 + / + and CRY1 − / − mice. As shown in FIG. 3 i, j, blood glucose levels were higher in CRY1 − / − mice than in CRY1 + / + mice. To determine whether CRY1 is a major mediator of hepatic glucose angiogenesis by SREBP1c, glucose production assays were performed in primary hepatocytes from CRY1 + / + and CRY1 − / − mice. As shown in FIG. 3K, SREBP1c overexpression attenuated glucose production in CRY1 + / + primary hepatocytes while SREBP1c did not inhibit glucose production in CRY1 − / − primary hepatocytes. To determine if the SREBP1c-CRY signaling pathway inhibits the actual in vivo hepatic glucose production process, CRY1 was overexpressed adenovirus in the liver of SREBP1 − / − mice. In PTT, blood glucose levels were higher in SREBP1c − / − mice than in SREBP1c + / + mice, whereas blood glucose levels were decreased in CRY1 overexpressed SREBP1c − / − mice (l, m in FIG. 3). These data indicate that the SREBP1c-CRY1 signaling pathway can inhibit hepatic glycemic angiogenesis in vivo.
실시예Example 4. 4. CRY1에On CRY1 의한 by FOXO1FOXO1 단백질 레벨 조절 규명 Protein Level Regulation
인슐린-유도 CRY1이 간 당신생과정을 억제하는 기저 매카니즘을 규명하기 위하여, 인슐린 시그널링 및 당 신생과정에 대한 FOXO1의 조절 효과가 잘 확립되어 있으므로 본 발명자는 FOXO1에 초점을 두었다. 마우스 일차 간세포에서 FOXO1 단백질의 레벨은 CRY1 과발현에 의해 감소된 반면(도 4의 a) FOXO1 mRNA 레벨은 변경되지 않았다(도 4b). 이러한 데이터는, FOXO1 mRNA와는 독립적으로, CRY1가 상기 단백질 레벨을 조절할 수 있다는 것을 의미한다. 또한, FOXO1 단백질 레벨은 CRY1가 억제된 간세포에서 증가하였다(도 4의 c,d). 이러한 인 비트로 데이터와 일치하게도, FOXO1 단백질 레벨은 CRY1+/+ 마우스 간에서보다 CRY1-/- 마우스 간에서 더 높은 반면, FOXO1 mRNA 레벨은 CRY1+/+ 및 CRY1-/- 마우스 사이에 다른 점이 없었다(도 4의 e, f). SREBP1c+/+ 마우스와 비교하여, FOXO1 단백질 및 G6Pase 및 PEPCK mRNA의 레벨이 SREBP1c-/- 마우스의 간에서는 증가된 반면 CRY1 단백질의 레벨은 감소되었다(도 4의 g). CRY1이 FOXO1을 통해 간 당 신생과정을 저해하는지를 입증하기 위하여 당 신생과정 유전자 발현에 대한 CRY1 및/또는 FOXO1 억제 효과를 조사하였다. FOXO1 유전자가 siRNA에 의해 하향조절될때 CRY1 억제에 의한 G6Pase 및 PEPCK 유전자의 발현 증가가 없어졌는데, 이는 FOXO1이 포도당신생과정을 조절하는 CRY1의 다운스트림 인자일 수 있다는 것을 암시하는 것이다. 이러한 인비보 및 인비트로 데이터는 CRY1이 FOXO1을 통해 간 포도당 신생과정을 억제 또는 완화시킬 수 있다는 것을 의미한다.In order to elucidate the underlying mechanism by which insulin-induced CRY1 inhibits hepatic life processes, the present inventors focused on FOXO1 because the regulatory effects of FOXO1 on insulin signaling and glucose angiogenesis are well established. The level of FOXO1 protein in mouse primary hepatocytes was reduced by CRY1 overexpression (FIG. 4 a) while FOXO1 mRNA levels were not altered (FIG. 4B). These data mean that CRY1 can regulate the protein level, independent of FOXO1 mRNA. In addition, FOXO1 protein levels were increased in hepatocytes with CRY1 inhibition (FIG. 4 c, d). Consistent with these in vitro data, FOXO1 protein levels were higher in CRY1 − / − mouse livers than in CRY1 + / + mouse livers, while FOXO1 mRNA levels were not different between CRY1 + / + and CRY1 − / − mice. (E, f in Figure 4). Compared to SREBP1c + / + mice, the levels of FOXO1 protein and G6Pase and PEPCK mRNAs were increased in the liver of SREBP1c − / − mice while the levels of CRY1 protein were decreased (FIG. 4 g). In order to demonstrate that CRY1 inhibits hepatic glycemic angiogenesis via FOXOl, the effect of CRYl and / or FOXOl inhibition on glycogenic gene expression was investigated. When the FOXO1 gene is downregulated by siRNA, there is no increase in expression of G6Pase and PEPCK genes by CRY1 inhibition, suggesting that FOXO1 may be a downstream factor of CRY1 that regulates uveogenesis. These in vivo and in vitro data mean that CRY1 can inhibit or mitigate hepatic glucose angiogenesis via FOXO1.
실시예Example 5. 인슐린-활성화된 5. Insulin-activated CRY1에On CRY1 의한 by FOXO1FOXO1 단백질 감소 확인 Confirm protein reduction
FOXO1-매개 당 신생과정의 활성화는 인슐린에 의해 저해된다. AKT는 인슐린-활성화된 시그널링의 주요 다운스트림 분자로서, 그 후 14-3-3 단백질과의 연관을 통해 핵에서 세포질로 이동(translocation)한다 (Zhao, X. et al. Multiple elements regulate nuclear/cytoplasmic shuttling of FOXO1: characterization of phosphorylation- and 14-3-3-dependent and -independent mechanisms. Biochem. J. 378, 839849 (2004)). 일차 간세포에서, FOXO1 인산화는 인슐린에 의해 재빨리 증가한다. 그러나, 인슐린 작용 후기 단계에서 FOXO1 인산화의 감소에도 불구하고 간 당신생과정 프로그래밍은 지속적으로 그리고 효율적으로 억제된다. 흥미롭게도 간 CRY1 발현은 인슐린 작용의 상대적 후기 기간 동안 증가하였다(도 5a). Activation of angiogenesis per FOXO1-mediated is inhibited by insulin. AKT is a major downstream molecule of insulin-activated signaling, which then translocations from the nucleus to the cytoplasm through association with 14-3-3 proteins (Zhao, X. et al. Multiple elements regulate nuclear / cytoplasmic shuttling of FOXO1: characterization of phosphorylation- and 14-3-3-dependent and -independent mechanisms.Biochem. J. 378, 839849 (2004)). In primary hepatocytes, FOXO1 phosphorylation is rapidly increased by insulin. However, despite a decrease in FOXO1 phosphorylation at later stages of insulin action, liver life cycle programming is continuously and efficiently inhibited. Interestingly, hepatic CRY1 expression increased during the relative late period of insulin action (FIG. 5A).
상기와 같은 AKT에 의한 핵에서 세포질로의 FOXO1의 이동(translocation)은 인슐린이 간 포도당 생성을 급성으로 저해하는 잘 알려진 기전이다. 인슐린이 CRY1을 상향조절하고 순차적으로 FOXO1 단백질을 하향조절하므로(도 1c 및 4a), 인슐린-처리된 일차 간세포에서 FOXO1 및 CRY1 단백질의 발현 프로파일을 조사하여 이들 사건을 시간 순서대로 연구하였다. 도 5의 a에 나타난 바와 같이, 비교적 짧은 기간(0-4h)동안 인슐린으로 처리된 세포에서 AKT 및 FOXO1의 인산화가 확실히 유도되었다. 종래 결과와 일치하게도, 단기간 인슐린 처리에 의해 FOXO1 단백질의 레벨이 감소되었으며, 이는 세포기질에서 FOXO1 유비퀴틴화 및 분해에 의해 매개되었다. 또한, AKT 및 FOXO1의 인산화 레벨은 장기간(8-12h) 인슐린 유도에 의하여 점차적으로 그리고 실질적으로 감소하였다. 장기긴 인슐린 처리(8-12h) 이후 보다는 단기간(0-4h) 인슐린에의 노출 후에, AKT에 의한 핵에서 세포질로의 FOXO1 이동이 일어나는 것으로 나타났다. 흥미로운 것은, 장기간(8-12h)동안 인슐린으로 처리된 간세포에서는, CRY1 단백질의 레벨이 현저하게 증가한 반면, 총 FOXO1 단백질의 레벨은 계속하여 감소하였는데, 이는 CRY1 단백질의 양은 FOXO1 단백질의 총 양과 역으로 연관되어 있다는 것을 나타낸다. 따라서, 장기간(8-12h) 또는 단기간(0-4h) 인슐린 처리 후에 PEPCK 및 G6Pase 유전자의 발현이 하향조절되었다(도 5b). 이러한 데이터는, FOXO1 단백질의 지속적 감소가 장기간 인슐린 작용동안 간 포도당신생과정의 억제에 관여할 수 있다는 것을 의미한다. The translocation of FOXO1 from the nucleus to the cytoplasm by AKT is a well known mechanism by which insulin acutely inhibits liver glucose production. As insulin upregulates CRY1 and sequentially downregulates FOXO1 protein (FIGS. 1C and 4A), these events were studied in chronological order by examining the expression profiles of FOXO1 and CRY1 proteins in insulin-treated primary hepatocytes. As shown in Figure 5a, phosphorylation of AKT and FOXO1 was certainly induced in cells treated with insulin for a relatively short period of time (0-4 h). Consistent with conventional results, short-term insulin treatment reduced the levels of FOXO1 protein, which was mediated by FOXO1 ubiquitination and degradation in cell substrates. In addition, phosphorylation levels of AKT and FOXO1 gradually and substantially decreased by long term (8-12 h) insulin induction. After short-term (0-4h) exposure to insulin, rather than after long-term insulin treatment (8-12h), FOXO1 migration from the nucleus to the cytoplasm was shown to occur. Interestingly, in hepatocytes treated with insulin for an extended period of time (8-12 h), the level of CRY1 protein increased significantly, while the level of total FOXO1 protein continued to decrease, which was inversely proportional to the total amount of FOXO1 protein. Indicates that it is related. Thus, expression of PEPCK and G6Pase genes was downregulated after prolonged (8-12h) or short (0-4h) insulin treatment (FIG. 5B). These data indicate that the continuous reduction of FOXO1 protein may be involved in the inhibition of hepatic uveogenesis during prolonged insulin action.
다음으로, CRY1이 실지로 인슐린-처리된 간세포에서 FOXO1 단백질을 조절하는지를 조사하였다. 이점을 다루기 위하여, CRY1+/+ 및 CRY1-/- 일차 간세포를 시험하였다. 도 5의 c에 나타난 바와 같이, 인슐린-처리된 CRY1+/+ 일차 간세포에서 FOXO1 단백질의 레벨이 감소한 반면, 인슐린-처리된 CRY1-/- 일차 간세포에서 FOXO1 단백질의 레벨은 지속적으로 억제되지는 않았다. 인슐린 작용 후기에는, CRY1-/- 일차 간세포에서 PEPCK 및 G6Pase mRNA의 레벨 감소가 조금 그러나 실질적으로 증가하였다(도 5의 d). 또한, 장기간(8-12h) 인슐린-처리된 CRY1-/- 일차 간세포에서, 인슐린이 포도당 생성을 억제하지 못하였다(도 5e). 종합하여 보면, 이러한 데이터는 장기간 인슐린 작용할 동안(8-12h) FOXO1 단백질이 감소되어 있고 간 당신생과정 유전자의 발현을 CRY1이 억제할 수 있다는 것을 의미한다. Next, it was examined whether CRY1 actually regulates FOXO1 protein in insulin-treated hepatocytes. To address this, CRY1 + / + and CRY1 − / − primary hepatocytes were tested. As shown in FIG. 5C, the level of FOXO1 protein was decreased in insulin-treated CRY1 + / + primary hepatocytes, while the level of FOXO1 protein was not continuously inhibited in insulin-treated CRY1 − / − primary hepatocytes. . Later on insulin action, the level of PEPCK and G6Pase mRNA was slightly but substantially increased in CRY1 − / − primary hepatocytes (FIG. 5 d). In addition, in long-term (8-12h) insulin-treated CRY1 − / − primary hepatocytes, insulin did not inhibit glucose production (FIG. 5E). Taken together, these data indicate that during long-term insulin action (8-12 h), the FOXO1 protein is reduced and CRY1 can inhibit the expression of liver GI genes.
증가된 CRY1이 단기간 인슐린 작용(0-4h)이 없을 때에도 간 당신생과정을 억제할 수 있는지 알아보기 위하여, AKT 저해제를 이용하여 시험하였다. 일차 간세포에서, 인슐린이 AKT 및 FOXO1 둘 다의 인산화 레벨을 증가시켰지만, 반면 AKT 저해제인 AKTVIII와 같이 공동-처리하면 기대한 바와 같이 인산화가 저해되었다(도 5f). 그러나, CRY1-과발현된 간세포에서, 인슐린 처리 세포 및/또는 AKT 저해제 처리 세포에서 총 FOXO1 레벨이 감소되었는데, 이는 CRY1이 FOXO1 인산화와는 상관없이 독립적으로 FOXO1 단백질을 하향조절할 수 있다는 것을 의미한다(도 5의 f). 인 비보에서 이러한 발견을 확인하기 위하여, 또다른 AKT 저해제인 MK2206으로 마우스에서 시험하였다. 도 5의 g,h에 나타난 바와 같이, MK2206을 투여하면 피루브산 챌린지에 대한 혈당 레벨이 상당히 증가하였다. 그러나, 마우스에서 MK2206이 존재하더라도 아데노바이러스성 CRY1 과발현에 의해 혈당 레벨이 상당히 약화되었다. FOXO1 단백질의 레벨이 MK2206에 의해 상당히 증가된 반면 CRY1 증가에 의해 인 비보에서 FOXO1 단백질 발현은 억제되었다(도 5i). 이를 종합하여 보면, 이러한 데이터는 분명히 CRY1-1의존적 FOXO1 감소가 AKT 활성화와 상관없이 간 당신생과정을 억제하는데 기여한다는 것을 분명히 보여주는 것이다. To determine if increased CRY1 could inhibit liver life processes even in the absence of short-term insulin action (0-4 h), an AKT inhibitor was tested. In primary hepatocytes, insulin increased phosphorylation levels of both AKT and FOXO1, while co-treatment with AKT inhibitor AKTVIII inhibited phosphorylation as expected (FIG. 5F). However, in CRY1-overexpressed hepatocytes, total FOXO1 levels were reduced in insulin treated cells and / or AKT inhibitor treated cells, which means that CRY1 can downregulate FOXO1 protein independently of FOXO1 phosphorylation (FIG. 5, f). To confirm this finding in vivo, mice were tested with another AKT inhibitor, MK2206. As shown in g, h of FIG. 5, administration of MK2206 significantly increased blood glucose levels for pyruvate challenge. However, even in the presence of MK2206 in mice, blood glucose levels were significantly attenuated by adenovirus CRY1 overexpression. The level of FOXO1 protein was significantly increased by MK2206 while FOXO1 protein expression was inhibited in vivo by CRY1 increase (FIG. 5I). Taken together, these data clearly show that CRY1-1 dependent FOXO1 reduction contributes to the suppression of liver life processes independent of AKT activation.
종합하여 보면, 본원의 인비보 및 인비보 데이터는, CRY1-의존성 FOXO1 분해가 장기간 인슐린 작용동안 간 당신생과정을 약화시키는 주요한 매카니즘의 하나 일수 있다는 것을 의미한다. 따라서, 이러한 관찰결과는 초기 인슐린 반응에서는 AKT-매개 FOXO1 인산화로 인해 급성 포도당 합성 반응이 일어난 반면, SREBP1c-매개 CRY1 조절은 동화작용 전반에 걸쳐 간에서, 필요하지 않은 (futile) 당의 신생과정을 억제하게 하는 보다 지속적인 반응에 관여하는 것을 나타낸다(도 9).Taken together, the in vivo and in vivo data herein indicate that CRY1-dependent FOXO1 degradation may be one of the major mechanisms that weaken the liver life cycle during prolonged insulin action. Thus, these findings indicate that in the early insulin response, AKT-mediated FOXO1 phosphorylation resulted in acute glucose synthesis, whereas SREBP1c-mediated CRY1 regulation inhibited the angiogenesis of futile sugars in the liver throughout anabolic activity. Involved in a more sustained response to FIG. 9 (FIG. 9).
실시예Example 6. 6. CRY1에On CRY1 의한 by FOXO1의Of FOXO1 프로테아좀Proteasome 분해 자극 규명 Decomposition Stimulation
CRY1 과발현이 FOXO1 단백질 레벨을 감소시키지만 FOXO1 mRNA 레벨은 감소시키지 않으므로, FOXO1 하향조절이 프로테아좀 분해를 통해 이루어질 수도 있는지를 조사하였다. 도 6의 a에 나타난 바와 같이, CRY1 과발현에 의한 FOXO1 단백질 감소가 MG132에 의해 완화될 수 있는데, 이는 CRY1에 의한 FOXO1 단백질의 조절이, 최소 일 부분은, 프로테아좀 분해에 의해 좌우된다는 것을 의미한다. FOXOa 및 CRY1 단백질 사이의 물리적 상호작용을 시험해 보았을 때, 공동-면역침전 분석법에서 CRY1이 FOXO1 단백질과 상호작용할 수 있다는 것이 나타났다(도 6의 b). 그 후, CRY1이 유비퀴틴-프로테아좀 경로를 통해 FOXO1 분해를 유도할 수 있는지를 조사하였다. 도 6c에 나타난 바와 같이, CRY1 과발현은 FOXO1 폴리-유비퀴틴화를 극적으로 촉진시켰는데, 이는 CRY1이 아마도 단백질-단백질 상호작용을 통해 FOXO1 분해를 강화시킬 수 있다는 것을 의미한다.Since CRY1 overexpression reduced FOXO1 protein levels but not FOXO1 mRNA levels, it was investigated whether FOXO1 downregulation could be via proteasome degradation. As shown in FIG. 6A, FOXO1 protein reduction by CRY1 overexpression can be alleviated by MG132, which means that the regulation of FOXO1 protein by CRY1 depends, at least in part, on proteasome degradation. do. Examination of the physical interactions between FOXOa and CRY1 protein revealed that CRY1 can interact with FOXO1 protein in co-immunoprecipitation assays (FIG. 6 b). Then, it was examined whether CRY1 can induce FOXO1 degradation via the ubiquitin-proteasome pathway. As shown in FIG. 6C, CRY1 overexpression dramatically promoted FOXO1 poly-ubiquitination, which means that CRY1 can possibly enhance FOXO1 degradation via protein-protein interactions.
CRY1에 의해 유도된 FOXO1 분해시의 세포내(subcellular) 위치를 탐구하기 위하여, 핵 및 세포기질 FOXO1 단백질의 레벨을 조사하였다. 도 6의 d에 나타난 바와 같이, CRY1 과발현에 의하여 FOXO1 단백질의 핵 분획은 감소한 반면 MG132와 배양으로 이러한 감소는 방지되었다. 동시에, 세포기질 FOXO1의 레벨은, MG132의 존재와 상관없이, CRY1 과발현에 의해 변경되지 않았다. 이러한 결과와 일치하게도 FOXO1 돌연변이 단백질의 핵 형태의 폴리유비퀴틴화(nFOXO1-MYC)는 CRY1에 의하여 상당히 증가되었다(도 6의 e). 따라서, 이는 폴리-유비퀴틴화를 통한 FOXO1 단백질의 분해가 핵에서 CRY1에 의해 자극받는다는 것을 나타낸다. To explore the subcellular location of FOXO1 degradation induced by CRY1, the levels of nuclear and cytoplasmic FOXO1 proteins were examined. As shown in d of FIG. 6, the nuclear fraction of the FOXO1 protein was reduced by CRY1 overexpression, while this reduction was prevented by incubation with MG132. At the same time, the level of cell substrate FOXO1 was not altered by CRY1 overexpression, regardless of the presence of MG132. Consistent with these results, polyubiquitination (nFOXO1-MYC) in the nuclear form of the FOXO1 mutant protein was significantly increased by CRY1 (FIG. 6E). Thus, this indicates that degradation of the FOXO1 protein via poly-ubiquitination is stimulated by CRY1 in the nucleus.
실시예Example 7. 7. CRY1의Of CRY1 MDM2MDM2 -매개 -medium FOXO1FOXO1 분해 관여 규명 Identification of decomposition involvement
FOXO1 단백질의 여러 유비퀴틴 E3 리가아제 중에서, MDM2 유비퀴틴 E3 리가아제가 CRY1-매개 FOXO1 분해에 관여하는 것으로 나타났다. 도 7의 a에 나타난 바와 같이, CRY1-과발현 세포에서 MDM2 억제에 의해 FOXO1 단백질의 레벨이 현저하게 회복되었는데, 이는 MDM2가 CRY1-의존성 FOXO1 감소에 참여할 수 있다는 것을 암시한다. MDM2-매개 FOXO1 분해에서의 CRY1의 역학을 조사하기 위하여, CRY1이 MDM2의 준세포(subcellular) 위치를 조절할 수 있는지를 알아보았다. 야생형 CRY1 및 세포기질 CRY1 (DNLS-CRY1)은 핵 MDM2의 준세포 위치를 변경시키지 않았다. 그 대신, CRY1이 FOXO1 및 MDM2 사이의 관련을 강화시킨다는 것을 밝혔다(도 7의 b).Among the various ubiquitin E3 ligase of the FOXO1 protein, MDM2 ubiquitin E3 ligase has been shown to be involved in CRY1-mediated FOXO1 degradation. As shown in a of FIG. 7, the levels of FOXO1 protein were significantly recovered by MDM2 inhibition in CRY1-overexpressing cells, suggesting that MDM2 may participate in CRY1-dependent FOXO1 reduction. To investigate the dynamics of CRY1 in MDM2-mediated FOXO1 degradation, we examined whether CRY1 can regulate the subcellular location of MDM2. Wild type CRY1 and cell substrate CRY1 (DNLS-CRY1) did not alter the subcellular location of nuclear MDM2. Instead, it was found that CRY1 strengthens the association between FOXO1 and MDM2 (FIG. 7B).
다른 실험에서, CRY1이 MDM2-매개 FOXO1 분해를 조절할 수 있는지를 조사하였다. 도 7의 c,d에 나타난 바와 같이, CRY1 과발현에 의하여 FOXO1 단백질의 핵 형태의 MDM2-매개 폴리-유비퀴틴화가 촉진된 반면(도 7의 c), CRY1 억제에 의해 MDM2에 의한 FOXO1 폴리유비퀴틴화가 약화되었다(도 7의 d). 이러한 데이터는 CRY1이 MDM2-유도 FOXO1 분해에 의해 FOXO1-매개 간 포도당 생산을 억제할 수 있다는 것을 의미한다. In another experiment, it was investigated whether CRY1 could modulate MDM2-mediated FOXO1 degradation. As shown in c, d of FIG. 7, MDM2-mediated poly-ubiquitination of the nuclear form of FOXO1 protein was promoted by CRY1 overexpression (FIG. 7 c), whereas FOXO1 polyubiquitination by MDM2 was attenuated by CRY1 inhibition. (D of FIG. 7). These data mean that CRY1 can inhibit FOXO1-mediated liver glucose production by MDM2-induced FOXO1 degradation.
실시예Example
8. 8.
제 1 형
STZ 마우스는 1형 당뇨병의 대표 모델로서 인슐린을 분비하는 췌장의 베타 세포에 문제가 발생하여 인슐린이 분비되지 않는 마우스이다. db/db 마우스는 2형 당뇨병의 대표모델로 췌장의 베타 세포에서는 인슐린이 분비되나, 간, 지방세포 및 근육에서 인슐린 수용체 하위 신호가 문제가 발생하여 인슐린이 있음에도 인슐린 신호가 전달되지 않는 현상을 동반한다. 이와 같은 상황에서는 결국 베타세포에 과부하가 걸려 베타세포도 망가져서 인슐린도 분비되지 않는 상황이 발생한다. STZ mouse is a representative model of
각각의 마우스를 이용한 실험결과에서 인슐린 분비의 문제 뿐 아니라 인슐린 신호전달 경로의 문제 모두에서 CRY1의 과발현을 통해 포도당 생합성을 억제할 수 있는 현상을 관찰하였고, 이는 본원에 따른 CRY1의 제 1 형 당뇨병 뿐 아니라 제 2형 당뇨병의 치료적 표적이 될 수 있음을 나타내는 것이다. In each mouse experiment, we observed a phenomenon in which glucose biosynthesis could be inhibited by overexpression of CRY1 in both insulin secretion and insulin signaling pathways. Rather, it can be a therapeutic target for
스트렙토조토신(STZ)-처리 인슐린-결핍 마우스는 FOXO1 단백질 레벨을 포함하는 당 신생과정 프로그램 뿐만 아니라 고혈당 증상을 가지며, 이때 PEPCK 및 G6Pase 유전자 발현 증가가 동시에 일어났다(도 8의 a-c). SREBP1c-CRY1 축이 인슐린에 의해 상향조절되기 때문에 STZ-처리 인슐린-결핍 마우스의 간에 CRY1을 과발현시켰다. 도 8의 d에 나타난 바와 같이, CRY1 과발현은 STZ-처리 마우스에서 혈당 레벨을 감소시켰다. 또한, CRY1는 PEPCK 및 G6Pase 유전자 발현 뿐만 아니라 FOXO1 단백질 레벨도 감소시켰다(도 8의 e,f). 이러한 데이터는 CRY1이 인슐린 작용시 간 포도당 생산을 억제하는 주요한 인자 중 하나라는 것을 의미한다.Streptozotocin (STZ) -treated insulin-deficient mice had hyperglycemic symptoms as well as glucose angiogenesis programs involving FOXO1 protein levels, with simultaneous increase in PEPCK and G6Pase gene expression (FIG. 8 a-c). CRY1 was overexpressed in livers of STZ-treated insulin-deficient mice because the SREBP1c-CRY1 axis is upregulated by insulin. As shown in d of FIG. 8, CRY1 overexpression reduced blood glucose levels in STZ-treated mice. In addition, CRY1 reduced FOXO1 protein levels as well as PEPCK and G6Pase gene expression (FIG. 8 e, f). These data indicate that CRY1 is one of the major factors that inhibit liver glucose production during insulin action.
흥미롭게도, db/db 및 식이-유도 비만 마우스와 같은 비만 동물의 간에서, 간 당 신생과정이 억제되지 않는 동안에도 SREBP1c 레벨이 높아졌다. 간 당신생과정의 조절에서 어느 과정이 탈조절되는지를 조사하기 위하여, 당뇨 동물에서 SREBP1c-CRY1 축 및 당신생과정 유전자에 대한 mRNA 및 단백질 레벨을 조사하였다. 종래 연구와 유사하게도, SREBP1c 및 당신생과정 유전자의 mRNA 레벨이 db/db 마우스에서는 높았다(도 8의 g). 그러나 db/db 마우스에서 간 CRY1 단백질은 실질적으로 감소하였고 MDM2 단백질의 레벨은 유의하게 변하지는 않았다(도 8의 h). 유사하게도, 식이-유도 비만 마우스에서는 SREBP1c 및 당 신생과정 유전자 발현이 높게 나타난 반면 CRY1은 활성화되지 않았다. 당뇨 동물에서 탈조절된 CRY1 단백질이 FOXO1 단백질이 증가되어 있는 과혈당증을 매개할 수 있다는 것을 착안하여 이를 시험하고자, db/db 마우스의 간에 CRY1을 아데노바이러스로 과발현시켰다. 도 8의 i에 나타난 바와 같이, 피루브산염-유도 혈당 레벨은 CRY1-과발현 db/db 마우스에서 감소되었다. 또한 섭취(feeding) 혈당 레벨은 CRY1 과발현에 의하여 감소되었다(도 8의 j). 추가로, 이소성 CRY1 발현은 db/db 마우스에서 당신생과정 유전자 발현 뿐만 아니라 FOXO1 단백질 레벨을 감소시켰다(도 8의 k,l). 이러한 결과는 CRY1이 db/db 마우스에서 FOXO1 단백질의 레벨을 억제함으로써 고혈당을 완화시킬 수 있다는 것을 의미하며 선택적인슐린 저항성의 치료에 사용될 수 있음을 나타낸다. Interestingly, in livers of obese animals, such as db / db and diet-induced obese mice, SREBP1c levels were elevated while hepatic glycemic process was not inhibited. To investigate which processes are deregulated in the regulation of liver life processes, mRNA and protein levels for the SREBP1c-CRY1 axis and your life cycle genes in diabetic animals were examined. Similar to previous studies, mRNA levels of SREBP1c and your life cycle genes were high in db / db mice (FIG. 8 g). However, liver CRY1 protein in db / db mice was substantially reduced and the level of MDM2 protein did not change significantly (FIG. 8 h). Similarly, dietary-induced obese mice showed high expression of SREBP1c and glycoprotein genes while CRY1 was not activated. To test this, de-regulated CRY1 protein in diabetic animals could mediate hyperglycemia with increased FOXO1 protein, CRY1 was overexpressed with adenovirus in the liver of db / db mice. As shown in FIG. 8 i, pyruvate-induced blood glucose levels were reduced in CRY1-overexpressing db / db mice. Feeding blood glucose levels were also reduced by CRY1 overexpression (FIG. 8 j). In addition, ectopic CRY1 expression decreased FOXO1 protein levels as well as your life cycle gene expression in db / db mice (k, l in FIG. 8). These results indicate that CRY1 can alleviate hyperglycemia by inhibiting the level of FOXO1 protein in db / db mice and can be used to treat selective insulin resistance.
하루주기 리듬(circadian rhythmic) 조절의 주요 인자 중 하나로서, CRY1 발현은 다양한 전사 인자 및 후생적(epigenetic) 조절에 의해 영향을 받는다. 비록 본 발명의 인비보 및 인비트로 데이터에서 CRY1 발현은 인슐린 및 SREBP1c에 의해 촉진되었지만, CRY1 변화주기 중 트루프(trhough) 지점인 ZT 10일때 재섭취에 의하여 CRY1 mRNA 발현이 높아지지 않았다. 이러한 데이터는 증가된 SREBP1c가 ZT 10일 때 CRY1를 활성화시키기엔 충분하지 않을 수 있다는 것을 의미한다. 역으로, 상기 주기 중 피크 지점인 ZT 22일때 재섭취에 의하여 CRY1 mRNA 및 단백질의 레벨이 세게 증가하였는데, 이는 아마도 다른 생체주기 조절 인자와 함께, SREBP1c가 CRY1 발현을 증가시킨다는 것을 의미한다. 그럼에도 불구하고, 다른 생체시계 유전자 뿐만 아니라 CRY1도 ZT 22일때 간 당신생과정을 조절하는데 기여하는지가 설명되어야 한다. As one of the major factors of circadian rhythmic regulation, CRY1 expression is affected by various transcription factors and epigenetic regulation. Although CRY1 expression was promoted by insulin and SREBP1c in the in vivo and in vitro data of the present invention, CRY1 mRNA expression was not elevated by reingestion at
다른 한편으로, SREBP1c 결핍이 간 생체시계 유전자 주기(oscillation)을 변경시킬 수 있는지에 대해 알아보았다. SREBP1c+/+ 및 SREBP1c-/- 마우스에서 간 생체시계 유전자 주기가 서로 많이 다르지는 않았다. 물론, CRY1-/-CRY2-/- 이중-돌연변이 마우스와 비교하여 CRY1-/- 마우스가 생체시계 진동에서 더 적은 변화를 나타내기 때문에, SREBP1c-/- 마우스에서 간 생체시계 진동에 대해 SREBP1c-유도된 CRY1이 작은 역할을 할 수도 있다는 가능성을 배제할 수 없었다. 나아가, SREBP1c-/- 마우스에 남아있는 SREBP1a 및/또는 SREBP2 활성이 온전한 생체시계 유전자 진동을 유지시킬 가능성이 역시 있으며 이러한 항상성 조절을 장래 더 연구가 필요하다. 그럼에도 불구하고, 간 CRY1 유전자 발현은 분명히 섭취/인슐린-매개 SREBP1c에 의해 상향조절된다. On the other hand, we examined whether SREBP1c deficiency could alter liver bioclock gene cycle. In the SREBP1c + / + and SREBP1c − / − mice, the liver bioclock gene cycle was not significantly different. Of course, CRY1 - / - CRY2 - / - double-mutant mice compared with CRY1 - / - mice because it indicates less change in the biological clock oscillation, SREBP1c - / - for the biological clock in mouse liver vibrations induced SREBP1c- The possibility that CRY1 could play a small role could not be ruled out. Furthermore, the SREBP1a and / or SREBP2 activity remaining in SREBP1c − / − mice is also likely to maintain intact biological clock gene oscillation and further study of this homeostasis is needed in the future. Nevertheless, liver CRY1 gene expression is clearly upregulated by uptake / insulin-mediated SREBP1c.
종래 논문과 일치하게도, 야행성 동물에서 섭취 행동이 우세하게 일어날 때인 밤시간(ZT 12-24)에 간 CRY1이 증가하였다. 비록 SREBP1c-/- 마우스에서 생체시계 주기가 서로 많이 다르게 나타나지 않았지만, SREBP1c 발현은 또한 밤시간(ZT 12-24)에 증가하였다. SREBP1c 및 CRY1의 발현 프로파일과는 달리, FOXO1 단백질의 레벨이 밤시간에는 감소되는 것으로 나타났는데, 이는 SREBP1c 및 CRY1의 생체시계 주기가 FOXO1의 조절에 의한 주행성 포도당 생산을 억제하는데 기여할 수 있다는 것을 암시하는 것이다. Consistent with the previous paper, hepatic CRY1 increased at night time (ZT 12-24), when uptake behavior predominantly occurs in nocturnal animals. Although the bioclock cycle did not appear much different in SREBP1c − / − mice, SREBP1c expression was also increased at night time (ZT 12-24). Unlike the expression profiles of SREBP1c and CRY1, the levels of FOXO1 protein have been shown to decrease at night, suggesting that the bioclock cycle of SREBP1c and CRY1 may contribute to the suppression of traveling glucose production by the regulation of FOXO1. will be.
SREBP1c가 당 신생과정 및 지질생성과정 둘 다를 동시에 조절할 수 있으므로, 서로 다른 타겟 유전자 존재시의 인슐린 시그널링에 대해 지방산 대사를 상향조절하고 당 대사를 하향조절함으로써 간 SREBP1c가 동화작용 경로를 효율적으로 조정할 수 있다고 추측하는 것이 가능하다. 본 발명은, 동화작용 상태에서 간 당대사의 조절에 필수적인, CRY1 활성화에서의 SREBP1c의 역할을 최초로 밝혔다. SREBP1c-/- 마우스에서의 생체시계 진동 유전자 발현 프로파일을 기초로, SREBP1c가 간 생체시계를 능동적으로 지배하지는 못하는 것으로 보인다. 오히려, 식후 상태동안 간 CRY1의 증가된 발현은, 시계-의존적 방식(clock-gated manner)에서, 인슐린-활성화된 SREBP1c에 의하여 우선적으로 조절되고, 궁극적으로는 FOXO1 분해를 통해 포도당 생산의 억제로 이끈다(도 9). 본 발명은 생리적 병리적 상태에서 간 SREBP1c 및 포도당 항상성을 연결하는 분자 매카니즘을 이해하는데 중요한 실마리를 제공한다.Since SREBP1c can regulate both glycemic and lipid production processes simultaneously, hepatic SREBP1c can efficiently regulate anabolic pathways by up-regulating fatty acid metabolism and down-regulating sugar metabolism for insulin signaling in the presence of different target genes. It is possible to guess that. The present invention first revealed the role of SREBP1c in CRY1 activation, which is essential for the regulation of hepatic glucose metabolism in the assimilation state. Based on the bioclock vibrational gene expression profile in SREBP1c − / − mice, SREBP1c does not appear to actively dominate the liver bioclock. Rather, increased expression of hepatic CRY1 during postprandial conditions is preferentially regulated by insulin-activated SREBP1c in a clock-gated manner and ultimately leads to inhibition of glucose production through FOXO1 degradation. (FIG. 9). The present invention provides an important clue to understanding the molecular mechanisms that link liver SREBP1c and glucose homeostasis in physiological pathological conditions.
이상에서 본원의 예시적인 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본원의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본원의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본원의 권리범위에 속하는 것이다.Although the exemplary embodiments of the present application have been described in detail above, the scope of the present application is not limited thereto, and various modifications and improvements of those skilled in the art using the basic concepts of the present invention defined in the following claims are also provided. It belongs to.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다. All technical terms used in the present invention, unless defined otherwise, are used in the meaning as commonly understood by those skilled in the art in the related field of the present invention. The contents of all publications described herein by reference are incorporated into the present invention.
Claims (9)
CRY1의 발현 또는 활성이 감소된 세포 또는 인간을 제외한 동물을 제공하는 제 1 단계;
상기 세포를 CRY1의 발현 또는 활성을 증가시킬 것으로 기대되는 시험물질로 처리하는 제 2 단계;
상기 시험물질로 처리된 세포에서 FOXO1 단백질 농도를 측정하는 제 3 단계; 및;
상기 측정결과 상기 FOXO1 단백질 양이 상기 시험물질과 접촉되지 않은 대조군에서 FOXO1 단백질 양과 비교하여 감소한 경우 이를 당뇨병 치료제 또는 포도당 생합성 억제 후보물질로 선별하는 제 4 단계를 포함하는, 당뇨병 치료제 또는 포도당 생합성 억제제 스크리닝 방법.
A method for screening a diabetes therapeutic or glucose biosynthesis inhibitor that targets the SREBP1c-CRY1-FOXO1 signaling pathway,
A first step of providing a cell or a non-human animal with reduced expression or activity of CRY1;
A second step of treating said cells with a test substance that is expected to increase the expression or activity of CRY1;
A third step of measuring FOXO1 protein concentration in cells treated with the test substance; And;
And a fourth step of screening the FOXO1 protein as a diabetic therapeutic agent or a glucose biosynthesis inhibitor candidate if the amount of the FOXO1 protein is decreased in comparison with the FOXO1 protein in a control group not in contact with the test substance. Way.
상기 제 1 단계의 CRY1의 발현 또는 활성이 감소된 세포 또는 동물은 SREBP1c의 발현이 증가된 것인, 방법.
The method of claim 1,
The cell or animal in which the expression or activity of CRY1 in the first step is decreased is that the expression of SREBP1c is increased.
상기 제 1 단계의 동물은 제 1 형 또는 제 2 형 당뇨병 모델 마우스이고, 상기 제 1 단계의 세포는 상기 제 1 형 또는 제 2 형 당뇨병 마우스 유래의 일차 간세포, 또는 H4IIE 또는 HepG2 세포주를 포함하는 포도당 생합성능을 갖는 세포인, 방법.
The method according to claim 1 or 2,
The animal of step 1 is a type 1 or type 2 diabetes model mouse, and the cell of step 1 is a primary hepatocyte derived from the type 1 or type 2 diabetic mouse, or a glucose comprising an H4IIE or HepG2 cell line. The method is a cell having biosynthesis.
상기 제 3 단계 대신에 또는 이에 부가하여 상기 FOXO1에 의해 발현이 촉진되는 포도당 생합성에 관여하는 효소인 PEPCK 및/또는 G6Pase의 발현을 측정하는 단계를 포함하며, 그리고
이 경우 상기 제 4 단계에서 상기 후보물질은 상기 시험물질과 접촉된 세포에서 상기 시험물질과 접촉되지 않은 대조군 세포와 비교하여 상기 PEPCK 또는 G6Pase의 발현이 감소한 것인, 방법.
The method of claim 1,
Measuring the expression of PEPCK and / or G6Pase, an enzyme involved in glucose biosynthesis that is promoted by FOXO1 in lieu of or in addition to the third step, and
In this case, in the fourth step, the candidate is a decrease in the expression of the PEPCK or G6Pase in the cells in contact with the test material compared to the control cells not in contact with the test material.
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- 2016-10-31 KR KR1020160143025A patent/KR101985577B1/en active IP Right Grant
Non-Patent Citations (1)
Title |
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Eric E. Zhang, et al. Nat Med. 2010 Oct; 16(10): 1152-1156. (2010.09.19)* |
Also Published As
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---|---|
KR20180047188A (en) | 2018-05-10 |
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