KR101984945B1

KR101984945B1 - 산화적 손상 물질을 검출하는 바이오리포터 균주의 민감성 증진용 조성물

Info

Publication number: KR101984945B1
Application number: KR1020170158944A
Authority: KR
Inventors: 제임스 미첼 로버트; 소 마베코우 산드린; 최성열
Original assignee: 울산과학기술원
Priority date: 2016-11-25
Filing date: 2017-11-24
Publication date: 2019-05-31
Also published as: KR20180059382A

Abstract

본 발명은 폴리에틸렌이민 (PEI)을 포함하는, 산화적 손상 물질을 검출하는 바이오리포터 균주의 민감성 증진용 조성물 및 상기 조성물을 이용한 바이오리포터 균주의 민감성을 증진시키는 방법에 관한 것으로서, 구체적으로 폴리에틸렌이민 (PEI)을 포함하는 산화적 손상 물질을 검출할 수 있는 유전자가 도입된 바이오리포터 균주의 반응 및 감도 개선용 조성물 및 상기 조성물을 이용한 세균 바이오리포터의 반응 및감도 개선 방법에 관한 것이다.

Description

산화적 손상 물질을 검출하는 바이오리포터 균주의 민감성 증진용 조성물{Composition for enhancing the sensitivity of a bioreactor strain that detects oxidative damage substances}

본 발명은 폴리에틸렌이민 (PEI)을 포함하는, 산화적 손상 물질을 검출하는 바이오리포터 균주의 민감성 증진용 조성물 및 상기 조성물을 이용한 바이오리포터 균주의 민감성을 증진시키는 방법에 관한 것이다.

세균 바이오리포터는 특정 화학물질이나 자극에 반응하여 측정 가능한 신호를 발생시키는 능력이 있으며 활용하기가 편하며 가격 역시 저렴해 사용에 편리한 것으로 알려져 있어서, 폐수 처리 및 환경 독성 평가를 포함하는 광범위한 영역에서 활용되어 왔다.

종래에 바이오리포터를 사용하여 세포 내부의 스트레스를 감지하는 기술에 대해서는 알려져 있지만, 종래 기술을 이용하여 바이올로젠의 농도를 측정하는 경우 바이올로젠의 산화적 스트레스로 기인한 독성에 의해서 바이오센서로 사용되었던 생물체가 사멸하면서 바이오센서 자체의 민감도가 하락하는 문제점이 있었다.

상기와 같은 문제점을 해결하여 바이오리포터의 기능을 최적화하기 위하여 조력제를 사용하는 기술이 개발되고 있으며, 실제로 혈청보체를 이용하여 바이오리포터의 민감도를 증가시키는 기술이 개발되고 있지만, 단백계인 혈청보체의 특성상, 환경적 요인에 민감한 문제점이 있었다.

따라서, 바이오리포터를 이용하여 세포 내부의 스트레스를 정확하게 감지하는 기술의 개발이 요구된다.

이에, 본 발명의 하나의 목적은 폴리에틸렌이민 (PEI)을 포함하는, 산화적 손상 물질을 검출하는 바이오리포터 균주의 민감성 증진용 조성물을 제공하는 것이다.

또 다른 목적은 상기 조성물을 바이오리포터 균주에 처리하는 단계를 포함하는, 바이오리포터 균주의 민감성을 증진시키는 방법을 제공하는 것이다.

또 다른 목적은 폴리에틸렌이민 및 산화적 손상 물질을 검출하는 바이오리포터 균주를 포함하는 산화적 손상 물질 검출용 조성물 또는 산화적 손상 탐지용 조성물을 제공하는 것이다.

또 다른 목적은 산화적 손상 물질을 검출하는 바이오리포터 균주를 폴리에틸렌이민과 함께 시료에서 배양하는 단계를 포함하는, 시료 내 산화적 손상 물질 검출 방법 또는 시료 내 유기체 (예컨대, 세포)의 산화적 손상 여부 탐지 방법을 제공한다. 상기 시료는 산화적 손상 물질 존재 여부 또는 산화적 손상 여부를 측정하고자 하는 모든 물질일 수 있으며, 예컨대, 환경 시료 (e.g., 토양, 물 (하수, 오수, 폐수, 하천수, 해수, 지하수 등), 대기, 농작물 등)일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명은 폴리에틸렌이민 (PEI)를 이용하여 산화적 손상 물질을 검출하는 바이오리포터 균주의 산화적 스트레스를 감지 반응 및 감도 개선 방법에 관한 것이다.

구체적으로, 본 발명자들은, pDEW201 플라스미드에 sodA 프로모터를 삽입하여 제작한 pDEW201-sodA::luxCDABE 플라스미드를 세균에 형질전환 후, 상기 세균에 대하여 폴리에틸렌이민을 첨가하여 상기 바이오리포터 균주의 산화적 손상 물질을 검출 또는 산화적 스트레스 감지 반응 및 감도가 개선됨을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명에서 용어, "바이오리포터" 란 시료로부터 특정 정보를 감지하고 측정하여 그 값을 관찰자가 읽을 수 있는 형태의 유용한 신호로 변환하는 물질이나 장치를 의미하며, 일반적으로 바이오리포터는 생물학적 요소(예를 들면 유전자, 효소, 항원, 항체, 생화학 물질, 호르몬, 수용체 등)와 시료 내 분석대상이 되는 물질과의 반응에서 나타나는 전기화학적 변화, 열에너지의 변화, 형광 또는 색의 변화 등을 인식 가능한 신호로 변환시켜주는 장치와 결합하여 구성된다.

본 발명에서 용어, "바이오리포터 균주" 란 상기 바이오리포터 시스템이 도입된 유전자 조작 균주를 말한다. 바람직하게, 본 발명의 바이오리포터 균주는, 특정 스트레스 또는 특정 자극 조건 하에서 활성화되는 유도성 프로모터 및 상기 프로모터에 작동 가능하게 연결된 리포터 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환된 재조합 균주로서, 특정 스트레스 또는 특정 자극 조건이 존재할 경우 프로모터의 활성화에 의하여 리포터 유전자의 발현이 증가함에 따라 형광 또는 발광 등의 인식가능한 신호를 생성하는 균주를 의미할 수 있다.

상기 특정 스트레스 또는 특정 자극 조건이란, 이에 제한되는 것은 아니나, 유전자 손상 물질 (genotoxins), 산화적 스트레스 유발 물질 (oxidative radicals 등), 페놀류 화합물, 농약 등을 예시할 수 있으며, 이러한 특정 조건에 반응하는 바이오리포터 균주를 사용하면 시료 내 특정 스트레스 유발 물질 또는 특정 자극 물질의 존재 여부 및 이에 따른 유해성과 독성 등을 신속하게 검출할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 바로서, 용어 "산화적 스트레스 (Oxidative stress)"는 생체 (또는 세포) 내에서 발생하는 산화물질과 이에 대응하는 항산화 물질 사이의 균형이 파괴되어 산화 비율 (활성 산소 비율)이 증가함에 따라 생체 (또는 세포) 내 항산화력이 저하되면서 발생하는 스트레스를 의미하고, 용어 "산화적 손상"은 이러한 산화적 스트레스에 의하여 유발되는 생체 또는 세포 내의 각종 손상 (유전자 손상, 세포 대사 이상 등)을 총칭하기 위하여 사용되는 것일 수 있다. 본 명세서에서, 특별한 언급이 없는 한, 산화적 손상 물질(또는 산화적 손상 유발 물질)와 산화적 스트레스 물질 (또는 산화적 스트레스 유발 물질)은 동등한 의미로 사용된다.

본 발명에서 용어, "유도성 프로모터" 란 특정 스트레스 또는 특정 자극 조건 하에서만 프로모터가 활성화 되어 프로모터 하부에 작동 가능하도록 연결된 유전자의 발현을 유도하는 프로모터를 말한다. 일 예에서, 산화적 스트레스 유발 물질의 존재 하에서 활성화되는 sodA 유전자 프로모터를 예시할 수 있으나, 본 발명의 범위가 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 용어, "리포터 유전자" 란 유전자 발현시 생물발광, 형광 또는 발색 등을 나타냄으로써 그 발현 여부를 시각적으로 쉽게 확인할 수 있는 유전자를 말하며, 예를 들어 Photinus sp. 또는 Phyrophourus sp. 등에서 유래한 luc 유전자, Vibrio fisheri 또는 Photorhabdus luminescens 등에서 유래한 lux 유전자, Renila reniformis 에서 유래한 Rluc 유전자, Aequorea Victoria 또는 Renilla reniformis 등에서 유래한 gfp 유전자 등을 예시할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직하게, 리포터 유전자로서 luxCDABE 유전자를 사용할 수 있다.

본 발명에서 용어, "luxCDABE " 란 luxC, luxD, luxA, luxB 및 luxE 로 구성된 유전자 복합체를 말하며, Vibrio fisheri 또는 Photorhabdus luminescens 등에 존재하는 오페론으로 보고되기도 하였다. 본 발명에서 luxCDABE 유전자는 합성하거나 생물체 내에서 분리하거나 또는 구입하는 등의 방법을 사용하여 얻을 수 있으며, 예를 들어 luxCDABE 를 갖고 있는 pDEW201 (Dupont Co., USA; 도 8) 를 구입하여 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 명세서에서 용어 '바이오리포터 균주의 민감성 증진'이란 바이오리포터가 물질과 반응하는 정도를 개선시키는 것 및 물질과 반응을 위한 민감도 (sensitivity) 정도를 개선시키는 것을 의미할 수 있다.

일 예에서, 본 발명에서 바이오리포터는 균주에 pDEW201 플라스미드에 sodA 프로모터를 삽입하여 제작한 pDEW201-sodA::luxCDABE 플라스미드를 E. coli BW25113에 형질전환하여 제작할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 바이오리포터 균주는 산화적 손상 물질을 검출 또는 산화적 스트레스를 감지하는 것일 수 있다.

본 명세서에서 상기 pDEW201-sodA::luxCDABE 플라스미드를 이용하여 산화적 손상 물질에 의해서 유발된 산화적 스트레스에 반응하여 발광반응이 유도될 수 있으며, 상기 발광반응을 검출하여 산화적 손상 물질의 존재 여부를 측정할 수 있다.

상기 SodA의 프로모터는 산화적 손상 물질에 의해서 유발된 산화적 스트레스에 반응하여 작동이 개시되는 프로모터로서 산화적 손상 물질을 검출하는데 사용될 수 있다.

즉, 본 발명은 산화적 스트레스를 측정하여 산화적 스트레스를 유발하는 피검출 물질 또는 산화적 손상 물질의 존재여부, 및 그 농도를 측정할 수 있다.

또한, 본 명세서에서 산화적 손상 물질을 검출하기 위해서, 표준화된 바이오센서의 양(바이오리포터를 포함한 박테리아의 세포수를 OD를 통해 표준화한 양, 600nm 파장에서 흡광도를 측정하였을 때 약 8억(8 x 10^8) CFU를 의미함)에서 산화적 손상 물질에 의한 산화적 스트레스가 발생할 때 나타나는 생물발광량을 수치화하는 방법을 사용하며, 상기 생물발광량의 수치값은 산화적 스트레스 (예를 들어, 바이올로젠에 의해서 유발된)에 의해 sodA 프로모터가 생물발광유전자를 발현시켜 얻은 값이다.

다만, 상기 세균이 산화적 스트레스에 반응하여 발광반응이 유도될 때, 독성 반응이 일어나면 그 발광반응이 감소될 수 있으므로, 상기 세균이 산화적 스트레스에 반응하여 발광반응이 유도될 때에는 독성 반응이 일어나지 않거나, 최소가 되도록 하는 것이 필요하다.

따라서, 산화적 손상 물질을 검출하기 위해서 바이오리포터 균주를 사용하는 경우 세균에 대한 독성을 유발하지 않도록, 피검출 물질에 대한 민감도가 높아야 피검출 물질의 검출 정확도가 향상될 수 있다.

이하, 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.

하나의 양태로서, 본 발명은 폴리에틸렌이민 (PEI)을 포함하는, 산화적 손상 물질을 검출하는 바이오리포터 균주의 민감성 증진용 조성물에 관한 것이다.

상기 바이오리포터 균주에 폴리에틸렌이민 (PEI)를 첨가하여 산화적 손상 물질을 검출하는 민감성을 증진시킬 수 있다.

일예로, 산화적 손상 물질을 검출하는 바이오리포터 균주는, sodA 프로모터 (서열번호 1)및 상기 프로모터의 다운스트림에 작동 가능하게 연결된 리포터 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환된 재조합 균주일 수 있다. 상기 리포터 유전자로는 luxCDABE 를 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

sodA 프로모터는 생물체가 산화적인 스트레스에 대한 방어와 회복에 있어서 가장 필수적인 효소인 SOD(Superoxide dismutase)를 코딩하는 유전자의 업스트림에 위치하는 프로모터로, 산화적 스트레스 조건 하에서 그 활성이 유도 및 증가되는 특징을 가지고 있어, 시료 내 포함된 산화적 손상 물질을 검출하기 위한 바이오센서에 사용될 수 있다.

보다 상세하게, sodA 프로모터를 리포터 유전자(예를 들어, lux 유전자)와 융합시켜 균주에 도입할 경우, 산화적 손상 물질에 노출되는 환경에서 상기 균주의 프로모터 활성이 유도됨에 따라 상기 균주로부터 발광 또는 형광 등 탐지 가능한 신호가 생성되므로, 이를 통하여 시료 내 산화적 손상 물질의 존재 여부 및 그 존재 정도를 용이하게 검출 및 정량할 수 있다. 따라서, sodA 프로모터 및 리포터 유전자 융합체가 도입된 균주는 산화적 손상을 야기하는 독성 화학물질에 대한 위험 정도를 판단하는데 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는, 산화적 손상 물질을 검출하는 바이오리포터 균주로서, pDEW201 에 다양한 제한효소 부위를 도입하여 pDEWMCS 플라스미드를 제조하고, 상기 pDEWMCS 플라스미드에 포함되어 있는 lux 유전자의 업스트림에 sodA 프로모터 영역을 삽입하여 재조합 플라스미드 pSDK 및 pSDS 를 제조하고, 이를 E. coli MG1655 에 도입하여 수득한 바이오리포터 균주를 사용하였다.

본 발명의 바이오리포터의 숙주 균주로는 특별한 제한은 없으나, 그람 음성 균주인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 E. coli 균주를 사용할 수 있다.

본 발명에서 바이오리포터 균주의 발광 또는 형광을 측정은 모든 광 측정 기구를 사용할 수 있으며, 예를 들어 광전자증배기(photomultipliers), 전하결합장치(charge coupled devices), 발광측정기(luminometers), 광측정기(photometers), 광섬유케이블 또는 액체 섬광 카운터(liquid scintillation counters) 등을 예시할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서, 상기 산화적 손상 물질을 검출하는 바이오리포터 균주에 폴리에틸렌이민을 넣었을 경우 폴리에틸렌이민을 넣지 않았을 때에 비해서 산화적 스트레스를 감지하는 바이오리포터로서의 반응 및 감도가, 예컨대, 산화적 손상 물질 (e.g., 바이올로젠) 1 ppm 기준으로, 약 1.5배 이상, 약 2배 이상, 약 2.5배 이상, 약 3배 이상, 약 3.5배 이상, 약 4배 이상, 약 4.5배 이상, 또는 약 5배 이상 증진된 것일 수 있다 (상한값은 약 30배, 약 25배, 또는 약 20배일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다).

상기 폴리에틸렌이민은 바이오리포터 균주의 막의 투과성을 높여 산화적 스트레스를 유발시키는 분자를 세포막안으로 투과시켜, 상기 바이오리포터 균주의 산화적 손상 물질 검출 반응 및 민감도를 향상시킬 수 있다.

상기 폴리에틸렌이민 (PEI)은 분지형 폴리에틸렌이민, 또는 선형 폴리에틸렌이민일 수 있고, 상기 분지형 폴리에틸렌이민은 200 내지 2000 ppm의 농도, 200 내지 1800 ppm의 농도, 200 내지 1600 ppm의 농도, 200 내지 1400 ppm의 농도, 200 내지 1200 ppm의 농도, 400 내지 2000 ppm의 농도, 600 내지 2000 ppm의 농도, 800 내지 2000 ppm의 농도, 또는 1000 내지 2000 ppm의 농도를 사용하는 경우 상기 바이오리포터 균주의 산화적 손상 물질 또는 산화적 스트레스를 감지하는 바이오리포터로서의 반응 및 감도를 증가시킬 수 있고,

상기 선형 폴리에틸렌이민은 50 내지 2000 ppm의 농도, 150 내지 2000 ppm의 농도, 450 내지 2000 ppm의 농도, 750 내지 2000 ppm의 농도, 1000 내지 2000 ppm의 농도, 50 내지 1800 ppm의 농도, 50 내지 1600 ppm의 농도, 50 내지 1400 ppm의 농도, 50 내지 1200 ppm의 농도, 50 내지 1000 ppm의 농도를 사용하는 경우 상기 세균의 산화적 손상 물질 또는 산화적 스트레스를 감지하는 바이오리포터로서의 반응 및 감도를 증가시킬 수 있다.

또한, 산화적 손상 물질을 검출하는 바이오리포터 균주에 대해서 분지형 폴리에틸렌이민을 첨가하는 경우 선형 폴리에틸렌이민을 넣었을 때에 비해서 상기 바이오리포터 균주 독성의 확인지표인 생물 발광도가 600 mg/L PEI 첨가 기준으로, 약 10 내지 50%, 20 내지 50%, 30 내지 50%, 40 내지 50%, 20 내지 40%, 또는 20 내지 30% 감소할 수 있다.

상기 산화적 손상 물질은 바이올로젠 (Viologen), 과산화수소 (hydrogen peroxide) 또는 파라콰트(paraquat)를 포함한 다양한 물질에 의해서 유발된 것일 수 있으나, 바람직하게는 바이올로젠 (바이올로젠 그룹)에 의해서 유발된 것을 의미한다.

상기 바이올로젠은 벤질 바이올로젠(Benzyl Viologen, BV), 에틸 아미노프로필 바이올로젠(Ethyl Aminopropyl Viologen, EAV), 메틸 아미노프로필 바이올로젠(Methyl Aminopropyl Viologen, MAV), 에틸 바이올로젠(Ethyl Viologen, EV), 또는 헵틸 바이올로젠(Heptyl Viologen, HV)일 수 있다.

상기 바이오리포터 균주 독성은 배양 중인 세포의 생장을 저해, 사멸을 초래하는 것을 의미할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 0.8 kDa 분지형 폴리에틸렌이민 (BPEI) 이 가장 세포 독성이 적었고, 분지형 폴리에틸렌이민의 1.3kDa 이상 750kDa 이하의 분지형 폴리에틸렌이민 200ppm을 첨가했을 경우 30%의 생물 발광감소가 40분 내지 90분 이내에 발견되었고, 10kDa 이상 70kDa 이하의 선형 폴리에틸렌이민 200ppm을 첨가했을 경우 30%의 생물 발광감소가 40분 내지 50분 이내에 발견되었다 (도 6).

본 발명의 일 실시예에서는 BPEI를 0.8 kDa를 400 ppm (mg/L) 첨가했을 때 벤질 바이올로젠(Benzyl Viologen, BV), 에틸 아미노프로필 바이올로젠(Ethyl Aminopropyl Viologen, EAV), 메틸 아미노프로필 바이올로젠(Methyl Aminopropyl Viologen, MAV), 에틸 바이올로젠(Ethyl Viologen, EV), 또는 헵틸 바이올로젠(Heptyl Viologen, HV)을 측정하는 민감도가 2배 내지 16배까지 향상됨을 확인하였다 (도 7).

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 조성물을 바이오리포터 균주에 처리하는 단계를 포함하는, 바이오리포터 균주의 민감성을 증진시키는 방법에 관한 것이다.

상기 바이오리포터 균주의 민감성을 증진시키는 방법에 의해서 바이오리포터 균주의 생물발광도를 증가시킴으로서 그 민감도를 향상시킬 수 있다.

하나의 양태로서, 본 발명은 폴리에틸렌이민 및 산화적 손상 물질을 검출하는 바이오리포터 균주를 포함하는 산화적 손상 물질 검출용 조성물 또는 산화적 손상 탐지용 조성물에 관한 것이다.

하나의 양태로서, 본 발명은 산화적 손상 물질을 검출하는 바이오리포터 균주를 폴리에틸렌이민과 함께 시료에서 배양하는 단계를 포함하는, 시료 내 산화적 손상 물질 검출 방법 또는 시료 내 유기체 (예컨대, 세포)의 산화적 손상 여부 탐지 방법을 제공한다. 상기 시료는 산화적 손상 물질 존재 여부 또는 산화적 손상 여부를 측정하고자 하는 모든 물질일 수 있으며, 예컨대, 환경 시료 (e.g., 토양, 물 (하수, 오수, 폐수, 하천수, 해수, 지하수 등), 대기, 농작물 등)일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다

상기 산화적 손상 물질을 검출하는 바이오리포터 균주의 민감성 증진용 조성물에 대한사항은 바이오리포터 균주의 민감성을 증진시키는 방법, 산화적 손상 물질 검출용 조성물, 및 시료 내 산화적 손상 물질 검출 방법에 대하여 동일하게 적용될 수 있다.

본 발명은 폴리에틸렌이민 (PEI)을 포함하는, 산화적 손상 물질을 검출하는 바이오리포터 균주의 민감성 증진용 조성물 및 상기 조성물을 이용한 바이오리포터 균주의 민감성을 증진시키는 방법에 관한 것으로서, 상기 바이오리포터 균주의 반응 및 감도 개선 방법을 이용하여 산화적 손상 물질을 검출하는 경우 종래 방법에 비해서 민감도를 2배에서 4배까지 향상시킬 수 있으며. 이를 통해 적은 양의 화학물질을 좀더 효율적으로 관측 및 그 양을 비교할 수 있다.

도 1은 선형 폴리에틸렌이민(LPEI) 의 화학 구조식을 나타내는 그림이다.
도 2는 분지형 폴리에틸렌이민(BPEI)의 화학 구조식을 나타내는 그림이다.
도 3은 0.8 kDa BPEI 400 ppm을 사용하였을 경우 PEI를 첨가하지 않은 대조구에 비교한 상대적 생물발광도를 나타낸 그래프이다.
도 4은 0.8 kDa BPEI 1600 ppm을 사용하였을 경우 PEI를 첨가하지 않은 대조구에 비교한 상대적 생물발광도를 나타낸 그래프이다.
도 5은 10 kDa LPEI 100 ppm을 사용하였을 경우 PEI를 첨가하지 않은 대조구에 비교한 상대적 생물발광도를 나타낸 그래프이다.
도 6은 다양한 종류의 BPEI와 LPEI의 세포 독성을 확인한 그래프이다.
도 7은 400 ppm의 0.8 kDa BPEI를 사용하였을 경우와 BPEI를 사용하지 않은 대조구의 경우에서 5 종의 바이올로젠의 투입양에 따른 상대적 생물발광도의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 8는 pDEW201의 개열지도를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 바이오센서의 제작

1-1. 산화적 스트레스를 인지하는 플라스미드 제작

Biosens Bioelectron.　2013 Aug 15;46:175-82에 공지된 pDEW201 플라스미드 (도 8 참조)에 sodA 프로모터 (서열번호 1)를 삽입하여 pDEW201-sodA::luxCDABE 플라스미드를 제작하였다.

1-2. 산화적 스트레스를 인지하는 균주의 제작

실시예 1-1에서 제작한 산화적 스트레스를 인지하는 플라스미드를 이용하여 산화적 스트레스를 인지하는 균주를 제작하기 위해서, 상기 플라스미드를 E.coli BW25113에 형질전환하였다.

실시예 2. 산화적 스트레스의 측정 및 분석

2-1. 균주에 첨가할 화합물질의 준비

균주의 산화적 스트레스 검출 민감도를 향상시킬 화합물은 하기와 같은 방법으로 준비하였다.

선형 폴리에틸렌이민 2종 (linear PEI, 이하 LPEI 10 kDa, 70kDa)는 100% (v/v) 에탄올에 녹여서 10 g/L의 농도로 스톡 (Stock)을 준비하였다. 분지형 폴리에틸렌이민 5종 (Branched PEI, 이하 BPEI 0.8kDa, 1.3kDa, 2.0kDa, 25kDa, 750kDa)은 100% (v/v) 에탄올에 녹여서 625 g/L의 농도로 스톡을 준비하였다.

산화적 스트레스를 유발하는 바이올로젠은 다음 5종의 바이올로젠을 사용하였다: 벤질 바이올로젠(Benzyl Viologen, BV), 에틸 아미노프로필 바이올로젠(Ethyl Aminopropyl Viologen, EAV), 메틸 아미노프로필 바이올로젠(Methyl Aminopropyl Viologen, MAV), 에틸 바이올로젠(Ethyl Viologen, EV), 및 헵틸 바이올로젠(Heptyl Viologen, HV).

상기 5종의 바이올로젠은 100% (v/v) 에탄올에 녹여서 10 g/L의 농도로 스톡을 준비하였다.

상기의 화합물은 모두 Sigma aldrich에서 구입하였다.

모든 실험의 샘플 당 에탄올의 최종농도는 0.01% (v/v) 혹은 그 이하가 되도록 실험을 수행하였다.

2-2. 바이올로젠에 의한 산화적 스트레스의 감지

실시예 2-1의 형질전환된 균주를 이용하여 바이올로젠에 의한 산화적 스트레스를 감지하기 위해서, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

구체적으로, 실시예 1-2에서 제작한 균주를 LB 배지에서 18시간 이상 배양한 것을 1/100 희석하고, 바이올로젠을 LB에 희석하여 사용하고, 생물발광의 민감도를 향상시키기 위하여 LPEI, 또는 BPEI를 상기 LB에 첨가하여 샘플 플레이트를 준비하였다.

분광광도계를 이용하여 600 nm 파장에서 OD 0.1 ± 0.01를 측정하여 생물발광의 양을 표준화시켰다.

산화적 스트레스에 의해 발생하는 생물발광을 측정하기 위해서, 상기 준비된 샘플 플레이트를 즉시 생물발광 분석기, Glomax Multi-detection system (Promega, USA)를 통해 분석하였으며 섭씨 30℃에서 10분간격으로 4시간동안 회전 진탕 및 생물발광을 측정하였다.

2-3. 데이터 분석 방법

본 발명의 데이터는 3번 측정된 결과의 평균값을 정리하였으며, 오차막대는 표준편차로 설정되었다. 데이터는 상대적 생물발광량 (Relative bioluminescence, RBL)을 통해 분석되었으며 이는 대조군의 생물발광량을 샘플의 생물발광량으로 나눈값이다. 또한 RBL 값의 상대적 상승량은 같은 시간의 다른 조건의 비교대상의 두 데이터 값 중의 큰 값을 작은 값으로 나눠서 얻은 값을 의미한다.

실시예 3. 분지형 폴리에틸렌이민에 의한 바이올로젠에 의한 산화적 손상 물질의 감지 민감도의 변화

분지형 폴리에틸렌이민에 의한 바이올로젠에 의한 산화적 손상 물질의 감지 민감도의 변화를 확인하기 위해서 하기와 같은 실험을 수행하였다. 이하의 농도에서 ppm은 mg/L을 의미한다.

실시예 2와 같은 방법으로 실험을 수행하되 0.8 kDa BPEI 400 ppm (도 3) 또는 0.8 kDa BPEI 1600 ppm (도 4)를 사용하여 상대적 생물발광도를 확인하였다.

그 결과 도 3 및 4에 나타난 것과 같이, 0.8 kDa BPEI 400 ppm를 사용했을 때에는 PEI를 첨가하지 않은 대조구에 비해서 바이올로젠에 의한 산화적 스트레스의 신호가 1.87배에서 2.69배까지 증가함을 확인할 수 있었고, 0.8 kDa BPEI 1600 ppm를 사용했을 때에는 PEI를 첨가하지 않은 대조구에 비해서 바이올로젠에 의한 산화적 스트레스의 신호가 1.61배에서 14.3배까지 증가함을 확인할 수 있었다.

상기 결과를 통해서, 0.8 kDa BPEI 400 ppm 또는 0.8 kDa BPEI 1600 ppm에 의해서 실시예 1-1에서 제작한 산화적 손상 물질을 인지하는 플라스미드를 이용하여 산화적 손상 물질을 인지하는 균주의 산화적 손상 물질의 감지 민감도가 약 1.5배 내지 15배가량 증가함을 확인할 수 있었다.

실시예 4. 선형 폴리에틸렌이민에 의한 바이올로젠에 의한 산화적 손상 물질의 감지 민감도의 변화

선형 폴리에틸렌이민에 의한 바이올로젠에 의한 산화적 손상 물질의 감지 민감도의 변화를 확인하기 위해서 하기와 같은 실험을 수행하였다.

실시예 2와 같은 방법으로 실험을 수행하되 10 kDa LPEI 100 ppm (도 5)를 사용하였다.

그 결과 도 5에 나타난 것과 같이, 10 kDa LPEI 100 ppm를 사용했을 때에는 PEI를 첨가하지 않은 대조구에 비해서 바이올로젠에 의한 산화적 스트레스의 신호가 1.5배 내지 1.7배 증가함을 확인할 수 있었다.

상기 결과를 통해서, 10 kDa LPEI 100 ppm에 의해서 실시예 1-1에서 제작한 산화적 스트레스를 인지하는 플라스미드를 이용하여 산화적 손상 물질을 인지하는 균주의 산화적 손상 물질의 감지 민감도가 1.5배 내지 1.7배로 증가함을 알 수 있었다.

실시예 5. 폴리에틸렌이민에 의한 독성 영향

폴리에틸렌이민을 주입하여 바이올로젠에 의한 산화적 손상 물질의 감지 민감도를 증가시킬 때, 세포 독성이 있는지 여부를 확인하기 위해서 하기와 같은 실험을 수행하였다.

바이오리포터 균주의 상대적 생물발광도가 30% 감소하는데 까지 걸린 시간이 짧을 수록, 사용한 PEI의 세포 독성이 높음을 확인할 수 있다.

실시예 2와 같은 방법으로 실험을 수행하되 하기 7 종류의 폴리에틸렌 (PEI)을 사용하고, 바이오리포터 균주의 상대적 생물발광도가 30% 감소하는데 까지 걸린 시간을 측정하여 도 6에 나타냈다:

● 0.8 kDa BPEI; ○ - 1.3 kDa BPEI;

▼ 2.0 kDa BPEI; △ - 25 kDa BPEI;

■ - 750 kDa BPEI; □ - 10 kDa LPEI;

◆ - 70 kDa LPEI.

그 결과 도 6에 나타난 것과 같이, 0.8 kDa 분지형 폴리에틸렌이민 (BPEI) 이 가장 세포 독성이 적었고, 분지형 폴리에틸렌이민이 선형 폴리에틸렌이민에 비해서 (분자량은 유사) 세포 독성이 10% 내지 50% 더 적었음을 확인했고, 또한, 200 mg/L 폴리에틸렌이민 기준으로 분지형 폴리에틸렌이민의 분자량이 1.3 내지 750 kDa 이하일 때 세포 독성이 현저히 증가했고, 선형 폴리에틸렌의 경우 10 내지 70 kDa이하의 농도에서 세포 독성이 현저히 증가했음을 확인할 수 있었다.

상기 결과를 통해서 분지형 폴리에틸렌이민 (BPEI) 1.3 내지 750 kDa이하, 또는 선형 폴리에틸렌이민 (LPEI) 10 내지 70 kDa는 세포 독성이 높아 바이오리포터 균주의 산화적 손상 물질 감지 민감도를 증가시키기 위해서는 사용할 수 없음을 알 수 있었다.

실시예 6. 바이올로젠 종류에 따른 폴리에틸렌이민에 의한 산화적 손상 물질의 감지 민감도의 변화

분지형 폴리에틸렌이민이 다양한 바이올로젠을 검출의 민감도를 향상시킬 수 있는지 여부를 확인하기 위해서 하기와 같은 실험을 수행하였다.

하기 다섯종류의 바이올로젠을 다양한 농도를 사용하여 실시예 2와 같은 방법으로 실험을 수행하여 BPEI를 0.8 kDa를 400 ppm (mg/L) 첨가했을 때, 상대적 생물발광도를 측정하여 도 7에 나타냈다.

그 결과 도 7에 나타난 것과 같이, BPEI를 0.8 kDa를 400 ppm (mg/L) 첨가했을 때 5종의 바이올로젠을 측정하는 민감도가 2배 내지 16배까지 향상됨을 확인할 수 있었다.

시험된 바이올로젠의 종류는 다음과 같다:

● 벤질 바이올로젠(Benzyl Viologen, BV);

○ 에틸 아미노프로필 바이올로젠(Ethyl Aminopropyl Viologen, EAV);

▼ 메틸 아미노프로필 바이올로젠(Methyl Aminopropyl Viologen, MAV);

△ 에틸 바이올로젠(Ethyl Viologen, EV);

■ 헵틸 바이올로젠(Heptyl Viologen, HV).

<110> UNIST(ULSAN NATIONAL INSTITUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY) <120> Composition for enhancing the sensitivity of a bioreactor strain that <130> DPP20173033KR <150> KR 10/2016/0158630 <151> 2016-11-26 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 195 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sodA promoter <400> 1 ccgttgtcga tttactggca atcacggcat taagtgggtg atttgcttca catctcgggc 60 attttcctgc aaaaccatac ccttacgaaa agtacggcat tgataatcat tttcaatatc 120 atttaattaa ctataatgaa ccaactgctt acgcggcatt aacaatcggc cgcccgacaa 180 tactggagat gaata 195

Claims

분자량 1.3kDa 미만인 분지형 폴리에틸렌이민 (BPEI)을 포함하는, 산화적 손상 물질을 검출하는 바이오리포터 균주의 민감성 증진용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 산화적 손상 물질을 검출하는 바이오리포터 균주는, sodA 프로모터, 및 상기 프로모터에 작동 가능하게 연결된 리포터 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환된 균주인, 조성물.
제2항에 있어서, 상기 리포터 유전자가 luxCDABE 인 조성물.
제1항에 있어서, 상기 분지형 폴리에틸렌이민 (BPEI)은 분자량 0.8kDa 이하인 분지형 폴리에틸렌이민인, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 분지형 폴리에틸렌이민은 200 내지 2000 ppm의 농도인, 조성물.
제4항에 있어서, 상기 분지형 폴리에틸렌이민은 200 내지 2000 ppm의 농도인, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 산화적 손상 물질은 바이올로젠 (Viologen), 과산화수소 (hydrogen peroxide) 또는 파라콰트(paraquat)인, 조성물.
제7항에 있어서, 상기 바이올로젠은 벤질 바이올로젠(Benzyl Viologen, BV), 에틸 아미노프로필 바이올로젠(Ethyl Aminopropyl Viologen, EAV), 메틸 아미노프로필 바이올로젠(Methyl Aminopropyl Viologen, MAV), 에틸 바이올로젠(Ethyl Viologen, EV), 또는 헵틸 바이올로젠(Heptyl Viologen, HV)인, 조성물.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 조성물을 바이오리포터 균주에 처리하는 단계를 포함하는,
바이오리포터 균주의 민감성을 증진시키는 방법.
분자량 1.3kDa 미만인 분지형 폴리에틸렌이민(BPEI) 및 산화적 손상 물질을 검출하는 바이오리포터 균주를 포함하는 산화적 손상 물질 검출용 조성물.
제10항에 있어서, 상기 산화적 손상 물질을 검출하는 바이오리포터 균주는, sodA 프로모터, 및 상기 프로모터에 작동 가능하게 연결된 리포터 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환된 균주인, 조성물.
산화적 손상 물질을 검출하는 바이오리포터 균주를 분자량 1.3kDa 미만인 분지형 폴리에틸렌이민(BPEI)과 함께 시료에서 배양하는 단계를 포함하는, 시료 내 산화적 손상 물질 검출 방법.
제12항에 있어서, 상기 산화적 손상 물질을 검출하는 바이오리포터 균주는, sodA 프로모터, 및 상기 프로모터에 작동 가능하게 연결된 리포터 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환된 균주인, 방법.