KR101982671B1

KR101982671B1 - Succinate-poly(ε-caprolactone)-succinate Polymers, Self-assembled Drug Delivery Nanoparticles Made thereby, and Composition Comprising the Same

Info

Publication number: KR101982671B1
Application number: KR1020170120398A
Authority: KR
Inventors: 강한창; 권기윤
Original assignee: 가톨릭대학교 산학협력단
Priority date: 2017-09-19
Filing date: 2017-09-19
Publication date: 2019-05-27
Also published as: KR20190032002A

Abstract

본 발명은 폴리(입실론-카프로락톤)[poly(ε-caprolactone; PCL)]의 양 말단에 석시네이트(succinate)가 공유결합된, 하기 화학식 1로 표시되는 석시네이트-PCL-석시네이트(snPCL) 고분자, 이로 제조된 snPCL 나노입자 및 이를 포함하는 항암용 또는 나노 약물 전달용 조성물에 관한 것으로, 아령 모양으로 합성된 snPCL 고분자는 수상에서 자기조립을 통해 나노입자를 형성하고, 이렇게 형성된 snPCL 나노입자는 자체로 암세포를 선택적으로 죽일 수 있는 나노 항암 약물의 역할을 할 수 있으며, 또한 다양한 약물을 봉입하여 세포 내로 약물을 전달하여 정상세포의 기능강화 또는 암세포의 사멸을 유도할 수 있다;
[화학식 1]

상기 화학식 1에서 n은 3 내지 30이다.The present invention relates to succinate-PCL-succinate (snPCL) represented by the following formula (1) wherein succinate is covalently bonded to both ends of poly (ε-caprolactone; Polymer, snPCL nanoparticles prepared therefrom, and anticancer or nano drug delivery compositions comprising the snPCL nanoparticles, wherein the snPCL polymer synthesized in the dumbbell shape forms nanoparticles through self-assembly in an aqueous phase, and the thus formed snPCL nanoparticles Can act as a nano-anti-cancer drug that can selectively kill cancer cells, and can also deliver drugs into cells by encapsulating various drugs, thereby enhancing normal cell function or inducing the death of cancer cells;
[Chemical Formula 1]

In Formula 1, n is 3 to 30.

Description

(Epsilon-caprolactone) -succinate Polymers, Self-assembled Drug Delivery Nanoparticles Made by the Polymer, and Self-assembled Nanoparticles Using the Polymers, and Composition Comprising the Same}

본 발명은 석시네이트-폴리(입실론-카프로락톤)-석시네이트 고분자, 상기 고분자가 자기조립된 나노입자, 이를 포함하는 항암용 조성물 및 나노 약물 전달용 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a succinate-poly (epsilon-caprolactone) -succinate polymer, a nanoparticle in which the polymer is self-assembled, an anticancer composition containing the same and a composition for nano drug delivery.

생체적합성 고분자는 지난 수십 년간 나노 약물 전달체의 구성물질로 이용되어 왔으며, 특히 특정 위치(예, 기관, 조직, 세포, 세포소기관 등)를 표적할 수 있는 기능성 고분자를 포함한 표적 나노 약물전달체는 약물의 부작용을 감소시키고, 효능을 개선하는 데에 활용되고 있다. 특정 위치를 표적할 수 있는 나노 약물전달체는 표적 부위의 생리학적 또는 병리학적 차이(예: pH, 효소, 글루타치온, 화학물질 등의 농도 또는 존재 유무) 조직학적 또는 해부학적 특성(예: 암 또는 염증 주변 조직의 느슨하고 불완전한 혈관계 형성 및 불완전한 림프계 형성)을 수동적으로 활용 또는 인지하여 표적능을 나타내는 방법과, 표적에 존재하는 수용체(receptor) 또는 항원과 물리적 결합이 가능한 리간드(ligand) 또는 항체를 능동적으로 활용하여 표적능을 나타내는 방법을 단독 또는 복수 이용하여 표적능을 개선하려는 노력을 보여 왔다. 그러나 단일 구조를 활용하여 다양한 표적능을 동시에 나타내는 방법은 흔하지 않다.Biocompatible polymers have been used as constituents of nanomaterials for several decades and target nanomaterials including functional polymers capable of targeting specific sites (eg, organs, tissues, cells, cell organelles, etc.) Is being used to reduce side effects and improve efficacy. Nanomaterials that can target a specific location include the physiological or pathological differences in the target site (eg, concentration, presence or absence of pH, enzymes, glutathione, chemicals, etc.), histological or anatomical characteristics A ligand or an antibody capable of physically binding to a receptor or an antigen present in the target can be actively and selectively detected by a method of displaying the target function by passively utilizing or recognizing the target protein (for example, a loose and incomplete vascular system formation of the surrounding tissue and incomplete lymph system formation) As a result, the efforts to improve the target ability have been shown by using single or multiple methods showing the target ability. However, it is not common to use a single structure to simultaneously display various target functions.

수상에서 자기조립에 사용되는 대부분의 양친매성 고분자는 소수성을 띠는 고분자와 친수성을 띠는 고분자가 직선, 가지화, 별모양 등의 다양한 형태로 연결되기 때문에 5 kDa 이상의 고분자량을 가지며, 베시클 형태의 폴리머좀과 미셀 형태의 고분자 미셀을 형성할 수 있어 다양한 성질의 화학 약물 및 생물 약물을 효율적으로 봉입할 수 있다. 또한, 일반적으로 사용되는 5 kDa 이상의 양친매성 고분자는 중량비율이 약 27%에서 약 50% 수준의 친수성 부분을 주로 갖는다.Most amphipathic polymers used for self-assembly in water phase have a high molecular weight of 5 kDa or more because hydrophobic polymers and hydrophilic polymers are connected in various forms such as linear, branched, star-shaped, Polymeric micelles in the form of micelles and polymeric micelles in the form of micelles can be formed to efficiently encapsulate various chemicals and biologics. In addition, generally used amphipathic polymers of 5 kDa or more mainly have hydrophilic moieties having a weight ratio of about 27% to about 50%.

그러나 고분자량 물질은 생체 내 느린 분해 속도로 인해 세포 내 축적 가능성과 세포 내 주요 성분과의 원하지 않는 상호작용 등을 야기할 수 있어, 생체 및 세포 환경에 더 친화적인 나노 약물전달체의 구성물질은 세포막을 구성하는 저분자량 양친매성 물질인 인지질 및 지질과 같은 생체 내 구성성분의 특성을 모사하는 것이 필요하다. 특히, 리포좀 제형에 일반적으로 사용되는 지질은 중량비율이 약 20%에서 약 26% 수준의 친수성 부분을 주로 갖는다.However, high molecular weight substances may cause the possibility of intracellular accumulation and undesired interaction with the intracellular major components due to the slow degradation rate in vivo, so that a constituent substance of the nanomaterials carrier, which is more friendly to the living body and cell environment, To mimic the properties of in vivo constituents such as phospholipids and lipids, which are low molecular weight amphipathic substances that make up the lipid membrane. In particular, lipids commonly used in liposomal formulations have predominantly hydrophilic moieties at a level of from about 20% to about 26% by weight.

한편, 세포소기관 중 미토콘드리아는 신호전달, 세포분화, 세포자살, 세포성장, Ca² ⁺의 농도조절, 활성산소종, ATP 생성 등과 같은 다양한 생리적인 기능의 항상성을 조절하는데 미토콘드리아가 이 기능들을 적절하게 수행하지 못하게 되면 퇴행성 뇌질환, 심장질환, 대사질환 등의 다양한 질병을 유발하게 된다. 미토콘드리아를 표적할 수 있는 기능을 포함하고 있는 물질로는 미토콘드리아-표적시그널(mitochondria-targeting signal, MTS)과 친유성 양이온(lipophilic cation)이 알려져 있다. 대부분의 MTS는 긴 아미노산 배열을 갖는 펩타이드로, 이런 MTS 펩타이드를 이용해 포스포리파제 A 올소로그(phospholipase A ortholog; AoPlaA), 알라닌 아미노트랜스퍼라제(alanine aminotransferase), 종양 억제자 p53(tumor suppressor p53), 디하이드로포레이트리덕타제(dihydrofolate reductase) 등과 같은 다양한 치료 단백질을 전달할 수 있다. 또한, (사이클로헥실 알라닌-아르기닌)_n[(cyclohexyl alanine-arginine)_n](n=3-6)을 이용해 독소루비신과 같은 화학 항암제를 미토콘드리아로 표적시키기도 하였다. 그러나 일반적으로 펩타이드는 비싸고 면역반응을 유발시킬 수 있는 단점을 나타낸다.On the other hand, the mitochondria of the cell organelle is the mitochondria in the regulation of homeostasis of various physiological functions, such as signaling, cell differentiation, cell death, cell growth, concentration control of the Ca ² ^+, active oxygen, ATP generated accordingly these features Failure to do so will lead to various diseases such as degenerative brain disease, heart disease, and metabolic disease. Mitochondrial-targeting signals (MTS) and lipophilic cations are known to contain mitochondrial targeting functions. Most of the MTSs are peptides with long amino acid sequences, and these MTS peptides are used as phospholipase A orthologs (AoPlaA), alanine aminotransferase, tumor suppressor p53, Dihydrofolate reductase, and the like. &Lt; / RTI > In addition, chemotherapeutic agents such as doxorubicin were targeted to mitochondria using n (cyclohexyl alanine-arginine) _n [cyclohexyl alanine-arginine _n ] (n = 3-6). However, in general, peptides are expensive and exhibit disadvantages that can cause an immune response.

한국공개특허 제10-2010-0100254호(2010.09.15 공개)Korean Patent Laid-Open No. 10-2010-0100254 (published on September 15, 2010)

본 발명의 목적은 미토콘드리아 표적 활성이 있는 나노입자, 항암용 조성물 내지는 나노 약물 전달용 조성물로 활용될 수 있는 신규한 고분자를 제공하는 것이다.It is an object of the present invention to provide a novel polymer which can be used as nanoparticles, anticancer compositions or nano drug delivery compositions having mitochondrial target activity.

본 발명의 다른 목적은 미토콘드리아 표적 활성이 있는, 상기 고분자가 자기조립된 나노입자를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide nanoparticles in which the polymer is self-assembled with mitochondrial targeting activity.

본 발명의 또 다른 목적은 미토콘드리아 표적 활성이 있는 항암용 조성물을 제공하는 것이다.Yet another object of the present invention is to provide an anticancer composition having mitochondrial target activity.

본 발명의 또 다른 목적은 미토콘드리아 표적 활성이 있는 나노 약물 전달용 조성물을 제공하는 것이다.It is another object of the present invention to provide a nanomaterial delivery composition having mitochondrial target activity.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 폴리(입실론-카프로락톤)[poly(ε-caprolactone; PCL)]의 양 말단에 석시네이트(succinate)가 공유결합된, 하기 화학식 1로 표시되는 석시네이트-PCL-석시네이트(snPCL) 고분자를 제공한다;In order to achieve the above object, the present invention provides a succinate-caprolactone compound represented by the following general formula (1) wherein succinate is covalently bonded to both ends of poly (ε-caprolactone; PCL) PCL-succinate (snPCL) polymer;

[화학식 1][Chemical Formula 1]

상기 화학식 1에서 n은 3 내지 30임.Wherein n is 3 to 30 in the formula (1).

상기 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 snPCL 고분자가 수상에서 자기조립된 snPCL 나노입자를 제공한다.To achieve these and other objects, the present invention provides snPCL nanoparticles self-assembled in an aqueous phase.

상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 snPCL 나노입자를 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물을 제공한다.According to another aspect of the present invention, there is provided an anticancer composition comprising snPCL nanoparticles as an active ingredient.

상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 snPCL 나노입자를 유효성분으로 포함하는 나노 약물 전달용 조성물을 제공한다.According to another aspect of the present invention, there is provided a nano drug delivery composition comprising snPCL nanoparticles as an active ingredient.

본 발명은 석시네이트(succinate; sn)-폴리(입실론-카프로락톤)[poly(ε-caprolactone; PCL)]-석시네이트(snPCL) 고분자, 상기 고분자가 자기조립된 나노입자, 이를 이용한 미토콘드리아 표적 항암용 조성물 및 나노 약물 전달용 조성물에 관한 것으로서, 아령 모양으로 합성된 석시네이트-PCL-석시네이트(snPCL) 고분자는 수상에서 자기조립을 통해 나노입자를 형성할 수 있으며, 그 자체로 암세포를 선택적으로 죽일 수 있는 나노 항암 약물의 역할을 할 수 있고, 또한 다양한 약물을 봉입하여 세포 내로 약물을 전달하여 정상세포의 기능강화 또는 암세포의 사멸을 유도할 수 있다.The present invention relates to a method for producing a nanoparticle comprising a succinate sn-poly (epsilon-caprolactone (PCL)] -succinate (snPCL) polymer, a nanoparticle self- (SnPCL) polymer synthesized in the form of dumbbells can form nanoparticles through self-assembly in a water phase, and can selectively form cancer cells selectively It can act as a nano-anticancer drug that can kill cancer cells. In addition, it can encapsulate various drugs and deliver drugs into cells, thereby enhancing normal cell function or inducing the death of cancer cells.

도 1은 항암제를 봉입한 석시네이트-PCL-석시네이트(snPCL) 나노입자의 미토콘드리아 대사과정 표적 및 이의 항암효과의 개념도를 나타낸 것이다.
도 2는 snPCL 고분자의 합성과정을 나타낸 것이다.
도 3은 snPCL 고분자의 ¹H-NMR 스펙트럼을 확인한 결과이다.
도 4는 snPCL 고분자의 GPC 스펙트럼을 확인한 결과이다.
도 5는 snPCL 나노입자의 임계미셀농도를 확인한 결과이다.
도 6은 snPCL 나노입자의 입자크기와 제타전위를 확인한 결과이다.
도 7는 pH에 변화 따른 snPCL₂ 나노입자의 입자크기 및 투과율 변화를 나타낸 것이다(이때, snPCL₂ 나노입자의 농도는 0.5 mg/mL이다).
도 8은 snPCL 나노입자를 암세포인 자궁경부암세포(HeLa)와 간암세포(HepG2)에 48시간 동안 처리한 후, MTT 방법으로 평가한 세포 사멸 능력을 나타낸 것이다.
도 9는 snPCL 나노입자를 정상세포인 섬유아세포(NIH-3T3)와 인간신장세포(HEK293T)에 48시간 동안 처리한 후, MTT 방법으로 평가한 세포사멸 능력을 나타낸 것이다.
도 10은 snPCL 나노입자를 암세포인 자궁경부암세포(HeLa)에 2시간 동안 처리한 후, MTT 방법으로 평가한 석시네이트 탈수소효소(SDH) 활성을 나타낸 것이다.
도 11은 snPCL 나노입자를 암세포인 자궁경부암세포(HeLa)에 4시간 동안 처리한 후, 유세포 분석기와 공초점현미경을 활용하여 JC-1의 방출된 빛의 형광 세기 비율(JC-1 Red/Green 비)로 평가한 미토콘드리아 막의 전위를 나타낸 것이다.
도 12는 snPCL 나노입자를 암세포인 자궁경부암세포(HeLa)에 24시간 동안 처리한 후, 유세포 분석기를 활용하여 프로피디움 요오드화물(PI) 및 아넥신-V(Annexin-V)의 세포 내 형광 세기를 구분하여 초기 및 말기 세포자멸사(apoptosis)와 세포괴사(necrosis)를 평가한 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 snPCL 나노입자를 암세포인 자궁경부암세포(HeLa)에 6시간 동안 처리한 후, 공초점 현미경을 활용하여 디하이드로에티듐(DHE)의 세포 내 형광 세기를 측정하여 활성산소종의 생성을 평가한 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 snPCL 나노입자를 암세포인 자궁경부암세포(HeLa)에 4시간 동안 처리한 후, CellTiter-Glo　Luminescent Cell Viability Assay를 활용한 ATP의 생성을 평가한 결과를 나타낸 것이다.
도 15는 snPCL 나노입자를 암세포인 자궁경부암세포(HeLa)에 24시간 동안 처리한 후, 세포주기(cell cycle)를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 16은 항암제 독소루비신(Dox)이 봉입된 snPCL 나노입자의 입자크기와 제타전위를 확인한 결과이다.
도 17은 항암제 독소루비신(Dox)이 봉입된 snPCL 나노입자를 암세포인 자궁경부암세포(HeLa)와 간암세포(HepG2)에 48시간 동안 처리한 후, MTT 방법으로 평가한 세포 사멸 능력을 나타낸 것이다.
도 18은 항암제 독소루비신(Dox)이 봉입된 snPCL 나노입자를 암세포인 자궁경부암세포(HeLa)에 4시간 동안 처리한 후, 유세포 분석기를 이용하여 세포 및 미토콘드리아 내에 유입된 독소루비신의 양을 독소루비신의 형광 세기를 측정하여 평가한 결과를 나타낸 것이다.
도 19는 항암제 독소루비신(Dox)이 봉입된 snPCL 나노입자를 암세포인 자궁경부암세포(HeLa)에 4시간 동안 처리한 후, 공초점 현미경을 이용하여 세포 내, 핵 내 및 미토콘드리아 내 유입된 독소루비신의 분포를 평가한 결과를 나타낸 것이다.
도 20은 항암제 독소루비신(Dox)이 봉입된 snPCL 나노입자를 암세포인 자궁경부암세포(HeLa)에 4시간 동안 처리한 후, 공초점 현미경을 이용하여 세포 내, 핵 내 및 미토콘드리아 내 유입된 독소루비신의 분포 결과를 독소루비신, 핵 염색시약 및 미토콘드리아 염색시약의 방출형광빛의 세기의 위치 프로파일을 이용하여 동일 위치에 존재하는지를 평가한 결과를 나타낸 것이다.
도 21은 항암제 독소루비신(Dox)이 봉입된 snPCL 나노입자를 암세포인 자궁경부암세포(HeLa)에 4시간 동안 처리한 후, 세포 밖의 pH 환경과 석시네이트의 존재 유무에 따른 snPCL 나노입자의 세포 내 유입량의 변화를 유세포 분석기로 측정하여 얻어진 형광세기를 나타낸 것이다.FIG. 1 is a conceptual diagram of a mitochondrial metabolic pathway target and its anticancer effect of succinate-PCL-succinate (snPCL) nanoparticles encapsulating an anticancer drug.
2 shows the synthesis process of the snPCL polymer.
Fig. 3 shows the result of ¹ H-NMR spectrum of the snPCL polymer.
Fig. 4 shows the result of confirming the GPC spectrum of the snPCL polymer.
5 shows the results of confirming the critical micelle concentration of snPCL nanoparticles.
6 shows the results of confirming the particle size and zeta potential of snPCL nanoparticles.
FIG. 7 shows changes in particle size and transmittance of snPCL ₂ nanoparticles as a function of pH, wherein the concentration of snPCL ₂ nanoparticles is 0.5 mg / mL.
FIG. 8 shows the cell apoptotic ability evaluated by the MTT method after treatment of snPCL nanoparticles with cancer cells (HeLa) and liver cancer cells (HepG2) for 48 hours.
FIG. 9 shows the apoptotic ability of snPCL nanoparticles treated with fibroblasts (NIH-3T3) and human kidney cells (HEK293T) as normal cells for 48 hours and evaluated by MTT method.
10 shows the activity of succinate dehydrogenase (SDH) evaluated by the MTT method after treating snPCL nanoparticles with cancer cells (HeLa) for 2 hours.
FIG. 11 is a graph showing the fluorescence intensity ratio (JC-1 Red / Green) of JC-1 emitted by JC-1 using a flow cytometer and a confocal microscope after treating snPCL nanoparticles for 4 hours with cervical cancer cells (HeLa) And the potential of the mitochondrial membrane was evaluated.
12 is a graph showing the intracellular fluorescence intensities of propidium iodide (PI) and annexin-V using a flow cytometer after treating snPCL nanoparticles for 24 hours with cervical cancer cells (HeLa) And the results of evaluation of apoptosis and necrosis in early and late stages.
FIG. 13 is a graph showing the intracellular fluorescence intensity of dihydroetidium (DHE) by using a confocal microscope after treating snPCL nanoparticles with cancer cells (HeLa) for 6 hours. The results of the evaluation are shown.
FIG. 14 shows the results of evaluating the production of ATP using the CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay after treating snPCL nanoparticles with cancer cells (HeLa) for 4 hours.
FIG. 15 shows the result of analyzing cell cycle after treating snPCL nanoparticles with cancer cells (HeLa) for 24 hours.
16 shows the particle size and zeta potential of snPCL nanoparticles encapsulating doxorubicin (Dox).
FIG. 17 shows the cell killing ability of snPCL nanoparticles encapsulated with the anticancer drug doxorubicin (Dox) in cancer cells (HeLa) and hepatocellular carcinoma cells (HepG2) for 48 hours and evaluated by MTT method.
FIG. 18 is a graph showing changes in the amount of doxorubicin infused into cells and mitochondria by using a flow cytometer after treating snPCL nanoparticles encapsulated with anticancer agent doxorubicin (Dox) in cancer cells (HeLa) The results are shown in FIG.
FIG. 19 shows the distribution of doxorubicin infiltrated intracellularly, intracranially, and mitochondria using a confocal microscope after treating snPCL nanoparticles encapsulated with an anticancer drug doxorubicin (Dox) in cancer cells, cervical cancer cells (HeLa) As shown in FIG.
20 is a graph showing the distribution of doxorubicin infiltrated intracellularly, intracranially, and mitochondria using a confocal microscope after treating snPCL nanoparticles encapsulated with an anticancer agent doxorubicin (Dox) in cancer cells, cervical cancer cells (HeLa) The results are shown in the result of evaluating whether or not they are present at the same position using the positional profile of the intensity of emission fluorescence of doxorubicin, nuclear staining reagent and mitochondrial staining reagent.
FIG. 21 shows the results of treatment of snPCL nanoparticles encapsulated with anticancer drug doxorubicin (Dox) in cancer cells (HeLa) for 4 hours, and the intracellular pH environment and the intracellular inflow of snPCL nanoparticles And fluorescence intensity obtained by measuring the change of fluorescence intensity with a flow cytometer.

본 발명의 발명자들은 단일 구조를 활용한 다양한 표적능을 구현하고, 저분자량의 생분해성 고분자를 이용하여 세포 내 축적과 비특이적 상호작용을 억제하면서 세포 구성성분의 특성을 모사하기 위해, 분자량이 5 kDa 이하이면서 고분자 내에 존재하는 에스테르 결합에 의한 생분해성을 갖는 폴리(입실론-카프로락톤)[poly(ε-caprolactone; PCL)]을 소수성 블록으로, 석시네이트를 친수성 블록으로 사용하여 고분자를 합성하였다. 결과적으로, PCL 양 말단의 디올(diol)에 석시네이트(succinate)를 각각 도입해 아령 모양의 석시네이트(succinate, sn)-폴리(입실론-카프로락톤)[poly(ε-caprolactone; PCL)]-석시네이트 고분자(이하 snPCL 고분자로 표현한다)를 합성하였고, 합성된 snPCL 고분자로부터 수상 환경 하에서 자기조립에 의해 생성되는 snPCL 나노입자를 제조하였으며, 이렇게 합성된 snPCL 나노입자는 그 자체로 암세포를 죽일 수 있는 나노 항암 약물의 역할을 할 수 있으며, 더불어 다양한 약물을 세포 내로 전달할 수 있는 전달체로서의 역할도 할 수 있다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.The inventors of the present invention have developed a novel biodegradable polymer having a molecular weight of 5 kDa to inhibit intracellular accumulation and nonspecific interaction with a low molecular weight biodegradable polymer, Polymers were synthesized by using poly (ε-caprolactone; PCL), which is biodegradable by ester bond in polymer, as a hydrophobic block and succinate as a hydrophilic block. As a result, succinate, sn-poly (ε-caprolactone) (PCL)], which is obtained by introducing succinate into the diol at both ends of PCL, SNPCL nanoparticles synthesized by self-assembly under the aquatic environment were prepared from the synthesized snPCL polymer. SnPCL nanoparticles synthesized in this way were able to kill cancer cells by themselves. And can act as a carrier capable of transferring various drugs into cells. Thus, the present invention has been completed.

따라서, 본 발명은 본 발명은 폴리(입실론-카프로락톤)[poly(ε-caprolactone; PCL)]의 양 말단에 석시네이트(succinate; sn)가 공유결합된, 하기 화학식 1로 표시되는 석시네이트-PCL-석시네이트(snPCL) 고분자를 제공한다.Accordingly, the present invention provides a succinate-caprolactone compound represented by the following general formula (1) wherein succinate (sn) is covalently bonded to both ends of poly (ε-caprolactone; PCL-succinate (snPCL) polymer.

[화학식 1][Chemical Formula 1]

상기 화학식 1에서 n은 3 내지 30이다.In Formula 1, n is 3 to 30.

본 발명의 고분자에서 친수성인 석시네이트는 암세포 주변 환경이나 세포 내 소기관인 엔도솜(endosome) 및 리소솜(lysosome)의 산성 pH를 표적하여 친수성 카르복실레이트(carboxylate)가 소수성인 카르복실산(Carboxylic acid)으로 바뀔 수 있어 암세포 내로 약물전달체를 빠르게 유입시킬 수 있고, 또한 양성자 완충과 엔도솜/리소솜 막 등과의 상호작용을 통해 약물전달체를 세포질로 탈출시킬 수 있다는 것을 확인하였다. 본 발명에 따른 snPCL 고분자에서 석시네이트는 저분자량을, 소수성 부분은 올리고머 분자량을 가지므로, 기존의 PCL 포함 자기조립형 나노입자와는 차별화된다.The hydrophilic succinate in the polymer of the present invention can be obtained by targeting the acidic pH of the endosomes and lysosomes, which are the intracellular organelles in the surrounding environment of cancer cells, and the hydrophilic carboxylate is a carboxylic acid acid to rapidly transfer the drug delivery system into the cancer cell, and it was confirmed that the drug delivery system can escape into the cytoplasm through interaction with the proton buffer and the endosome / lisosome membrane. Since the succinate in the snPCL polymer according to the present invention has a low molecular weight and the hydrophobic portion has an oligomer molecular weight, it is differentiated from conventional PCL-containing self-assembled nanoparticles.

또한, 석시네이트는 세포막에 존재하는 석시네이트 수용체(SUCNR1 or GPR91)를 갖는 세포를 능동적으로 표적할 수 있는 리간드로서, 도 1에 개시된 바와 같이, 수용체-매개 엔도사이토시스(receptor-mediated endocytosis)를 통해 약물전달체가 세포 내로 빠르게 유입될 수 있도록 하며, 암세포의 미토콘드리아 내 대사과정을 특이적으로 표적할 수 있다. 즉, 미토콘트리아 TCA 회로 및 전자전달계를 구성하는 석시네이트 탈수소효소(succinate dehydrogenase; SDH)는 석시네이트를 푸마르산으로 산화시켜 전자전달계가 정상적으로 작동될 수 있도록 하는데, 정상세포가 아닌 암세포에서만 나노입자에 연결된 석시네이트가 SDH에 결합하여 푸마르산으로 대사되지 못하게 막고, 활성 산소종을 생성을 유발할 수 있으며, SDH의 기능을 억제해 암세포 성장을 억제할 수 있다.In addition, succinate is a ligand capable of actively targeting cells having a succinate receptor (SUCNR1 or GPR91) present in the cell membrane, and has receptor-mediated endocytosis as shown in Fig. 1 Allowing the drug delivery system to be rapidly introduced into cells and specifically targeting the metabolic process in the mitochondria of cancer cells. That is, the succinate dehydrogenase (SDH), which constitutes the mitochondrial TCA circuit and the electron transport system, oxidizes succinate to fumaric acid, thereby allowing the electron transport system to operate normally. In normal cells, Connected succinate binds to SDH, prevents it from being metabolized to fumaric acid, can induce production of reactive oxygen species, and inhibits the function of SDH to inhibit cancer cell growth.

더욱이, 본 발명은 상기 snPCL 고분자가 수상에서 자기조립된 snPCL 나노입자를 제공한다.Furthermore, the present invention provides snPCL nanoparticles wherein the snPCL polymer is self-assembled in an aqueous phase.

상기 snPCL 나노입자는 다음과 같은 방법으로 제조될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The snPCL nanoparticles can be prepared by the following method, but are not limited thereto.

snPCL 고분자를 디메틸설폭시드(DMSO)에 녹여 10분간 교반한 후, 정제수를 첨가하고 30분간 더 교반하였다. 이 분산액에 포함되어 있는 DMSO를 투석(dialysis) 방법을 통해 제거하고 snPCL 나노입자를 얻었다. 본 발명에서는, 분자량이 530 Da, 1250 Da, 2000 Da인 PCL을 각각 PCL₀ _.5, PCL₁, PCL₂로 명명하고, 이의 snPCL 고분자를 각각 snPCL₀ _.5, snPCL₁, snPCL₂로 명명하였으며, 상기 공용매 분산법(co-solvent dispersion, CD)을 통해 만들어진 나노입자를 각각 snPCL₀ _.5 나노입자(Nanoparticle, NP), snPCL₁ NP, snPCL₂ NP로 명명했다.The snPCL polymer was dissolved in dimethylsulfoxide (DMSO), stirred for 10 minutes, added with purified water, and further stirred for 30 minutes. DMSO contained in the dispersion was removed by dialysis to obtain snPCL nanoparticles. In the present invention, PCLs having molecular weights of 530 Da, 1250 Da and 2000 Da were named PCL ₀ _.5 , PCL ₁ and PCL ₂ , respectively, and their snPCL polymers were named snPCL ₀ _.5 , snPCL ₁ and snPCL ₂ , And nanoparticles produced by co-solvent dispersion (CD) were named snPCL ₀ _.5 nanoparticles (SNP), snPCL ₁ NP and snPCL ₂ NP, respectively.

더불어, 본 발명은 상기 snPCL 나노입자를 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides an anticancer composition comprising the snPCL nanoparticles as an active ingredient.

이때, 상기 암은 간암 또는 자궁경부암으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.At this time, the cancer may be any one selected from the group consisting of liver cancer and cervical cancer, but is not limited thereto.

상기 snPCL 나노입자는 미토콘드리아를 표적으로 하여 작용하는 바, 본 발명의 일 실시예에서 snPCL 자체가 암 세포의 미토콘드리아에서 전자전달계에 영향을 주어 활성 산소종을 생성시키고 ATP 에너지 생성을 줄임으로써 표적 항암 활성을 나타내는 것을 확인하였다.The snPCL nanoparticle serves as a target for mitochondria. In one embodiment of the present invention, snPCL itself affects the electron transport system in the mitochondria of cancer cells to produce active oxygen species and reduce ATP energy production, .

또한, 상기 snPCL 나노입자는 석시네이트 수용체를 갖는 세포에서 세포유입 증진 효과를 나타내므로, 세포 또는 수용체를 표적하여 작용할 수 있다.In addition, since the snPCL nanoparticles exhibit cell infiltration enhancing effect in a cell having a succinate receptor, the snPCL nanoparticle can act to target a cell or a receptor.

더욱이, 본 발명은 상기 snPCL 나노입자를 유효성분으로 포함하는 나노 약물 전달용 조성물을 제공한다.Furthermore, the present invention provides a nanomaterial delivery composition comprising the snPCL nanoparticles as an active ingredient.

이때, 상기 약물은 항암제일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. At this time, the drug may be an anticancer agent, but is not limited thereto.

바람직하게는, 상기 항암제는 독소루비신일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.Preferably, the anticancer agent may be doxorubicin, but is not limited thereto.

전술한 바와 같이, 상기 snPCL 자기조립 나노입자는 수상에서 자체적으로 항암 나노 약물로도 응용 가능하고, 또한 수용성 화학약물 및 수불용성 화학약물을 담지할 수 있어 나노 약물 전달체로도 응용 가능하다. As described above, the snPCL self-assembled nanoparticle can be applied as an anticancer nanoparticle by itself in a water phase, and also can be applied as a nanoparticle drug carrier because it can carry a water-soluble chemical and a water-insoluble chemical drug.

본 발명의 일 실시예에서, 친수성 항암제인 독소루비신 염화염을 봉입한 snPCL 나노입자는 단독 투여한 독소루비신(doxorubicin)에 비해 미토콘드리아에 더 많이 표적 축적되었다. 또한, snPCL 나노입자의 pH 반응 특징 때문에 주변환경을 이용한 수동성 나노 약물 전달체로 응용가능하다.In one embodiment of the present invention, snPCL nanoparticles encapsulating doxorubicin hydrochloride, a hydrophilic anticancer drug, were more targeted to mitochondria than single-administered doxorubicin. In addition, due to the pH response characteristic of snPCL nanoparticles, it can be applied as a passive nanomaterials carrier using the surrounding environment.

즉, 상기 조성물은 미토콘드리아를 표적으로 할 수 있는 바, 종래의 항암제들보다도 훨씬 더 효과적이고 우수한 약물 전달능을 나타낼 수 있다.That is, since the composition can target mitochondria, it can exhibit an effective drug delivery performance far more effective than conventional anticancer drugs.

또한, 상기 snPCL 나노입자는 석시네이트 수용체를 갖는 세포에서 세포유입 증진 효과를 나타내므로, 세포 또는 수용체를 표적하여 효과적으로 약물을 전달할 수 있다.In addition, since the snPCL nanoparticles exhibit an effect of enhancing cell entry in a cell having a succinate receptor, the snPCL nanoparticle can target a cell or receptor and effectively deliver the drug.

본 발명에 따른 항암용 조성물 또는 나노 약물 전달용 조성물은 약학적으로 유효한 양의 약물을 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기에서 약학적으로 유효한 양이란 약물이 동물 또는 사람에게 투여되어 목적하는 생리학적 또는 약리학적 활성을 나타내기에 충분한 양을 말한다. 그러나 상기 약학적으로 유효한 양은 투여 대상의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료기간 등에 따라 적절히 변화될 수 있다.The anticancer composition or nano drug delivery composition according to the present invention may contain a pharmaceutically effective amount of a drug alone or may include one or more pharmaceutically acceptable carriers, excipients or diluents. The pharmaceutically effective amount as used herein refers to an amount sufficient for a drug to be administered to an animal or a human to exhibit a desired physiological or pharmacological activity. However, the pharmaceutically effective amount may be appropriately changed depending on the age, body weight, health condition, sex, administration route and treatment period of the subject to be administered.

또한, 상기에서 "약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 것을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.The term " pharmaceutically acceptable " as used herein means physiologically acceptable and does not generally cause an allergic reaction such as gastrointestinal disorder, dizziness, or the like when administered to a human. Examples of the carrier, excipient and diluent include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methylcellulose, Polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil. Further, it may further include a filler, an anticoagulant, a lubricant, a wetting agent, a flavoring agent, an emulsifying agent and an antiseptic agent.

본 발명에 따른 항암용 조성물 또는 약물 전달용 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있으며, 약물의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있다. 또한, 본 발명의 약물 전달용 고분자 조성물은 약물이 목적하는 효과를 상승시킬 수 있는 공지의 화합물과도 병행하여 투여할 수 있다.The anticancer composition or drug delivery composition according to the present invention may be administered through various routes including oral, transdermal, subcutaneous, intravenous, or muscular, and the dose of the drug may vary depending on the route of administration, the age, sex, The severity of the disease, and the like. In addition, the polymer composition for drug delivery of the present invention may be administered in combination with a known compound capable of enhancing the desired effect of the drug.

본 발명에서 사용되는 상기 "약물"은 동물 또는 사람의 체내에서 생리적인 기능을 촉진 또는 억제하여 목적하는 생물학적 또는 약리학적 효과를 유도할 수 있는 물질로서, 동물 또는 사람에게 투여하기 적합한 화학적 또는 생물학적 물질 또는 화합물을 의미하며, (1) 감염 예방과 같은 원하지 않은 생물학적 효과를 예방하여 유기물에 대한 예방효과를 가지고, (2) 질병으로 생기는 컨디션을 경감시키며, 예를 들어 질병의 결과로 생기는 고통 또는 감염을 완화시키며, (3) 유기물로부터 질병을 완화, 감소 또는 완전히 제거할 수 있는 역할을 할 수 있다.The " drug " used in the present invention is a substance capable of inducing a desired biological or pharmacological effect by promoting or inhibiting a physiological function in the body of an animal or human, and is a chemical or biological substance (1) prevent undesired biological effects such as infection prevention and have a preventive effect on the organism, (2) alleviate the condition caused by the disease, for example, the pain or infection resulting from the disease And (3) mitigate, reduce or completely eliminate disease from organic matter.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이며 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐이므로 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to the following examples. It is to be understood that both the foregoing description and the following detailed description are exemplary and explanatory and are intended to provide further explanation of the invention as claimed. no.

<실시예 1> 석시네이트-PCL-석시네이트(succinate-PCL-succinate; snPCL) 고분자의 합성 및 분석Example 1 Synthesis and Analysis of succinate-PCL-succinate (snPCL) Polymer

도 2에 나타낸 바와 같이, snPCL 고분자는 폴리(입실론-카프로락톤)(PCL)의 양 말단에 있는 수산화기(OH)와 미토콘드리아 표적기인 석시네이트를 유도하는 석신산 무수물(succinic anhydride)을 화학적으로 결합시켜 얻었다. 구체적으로, 분자량 530 달톤, 1250 달톤 또는 2000 달톤인 폴리카프로락톤-디올(PCL-diol) 0.2 g을 2 mL의 테트라하이드로퓨란(tetrahydrofuran)에 녹이고, PCL-디올의 수산화기 몰수의 6배에 해당하는 석신산 무수물(succinic anhydride), 4-(디메틸아미노)피리딘[4-(dimethylamino)pyridine; DMAP]을 따로 미량의 트리에틸아민(triethylamine, TEA)과 함께 8 mL의 테트라하이드로퓨란에 녹였다. 두 반응물 용액을 상온에서 2일간 교반 반응시키고, 분자량 0.53 kDa인 PCL(PCL₀ _.5), 1.25 kDa인 PCL(PCL₁), 2 kDa인 PCL(PCL₂)을 포함하는 고분자 반응 용액은 노르말 헥산(n-hexane)에 침전시켰다. 침전된 물질을 디메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide, DMSO)에 녹인 후, 같은 부피의 정제수를 첨가하여 투석을 통해 고분자를 정제하였고, 얻어진 고분자 용액을 동결건조하여 석시네이트-PCL₀ _.5-석시네이트(snPCL₀ _.5), 석시네이트-PCL₁-석시네이트(snPCL₁), 석시네이트-PCL₂-석시네이트(snPCL₂) 고분자를 얻었다. 합성된 고분자를 대상으로, 도 3에 개시된 바와 같이, DMSO-d6 용매에서 ¹H-NMR 분광 스펙트럼을 분석하였고, 또한 도 4에 개시된 바와 같이, THF 용매 상에서 얻은 GPC 스펙트럼과 폴리스티렌 분자량 표준물질을 이용하여 분자량 분포를 분석하였다. 그 결과, snPCL₀ _.5 snPCL₁, snPCL₂는 PCL 1개당 석시네이트가 각각 약 1.8개, 약 2개, 약 1.9개가 결합되었음을 확인할 수 있었다.As shown in Fig. 2, the snPCL polymer chemically binds hydroxyl groups (OH) at both ends of poly (Epsilon-caprolactone) (PCL) with succinic anhydride to induce succinate as a mitochondrial targeting moiety . Specifically, 0.2 g of a polycaprolactone-diol (PCL-diol) having a molecular weight of 530 daltons, 1250 daltons, or 2000 daltons was dissolved in 2 mL of tetrahydrofuran to obtain a solution of 6 g of the hydroxyl group of the PCL- Succinic anhydride, 4- (dimethylamino) pyridine [4- (dimethylamino) pyridine; DMAP] was dissolved in a small amount of triethylamine (TEA) in 8 mL of tetrahydrofuran. The reaction solutions of the two reactants were reacted at room temperature for 2 days with stirring, and the polymer reaction solution containing PCL (PCL ₀ _.5 ), PCL (PCL ₁ ) and PCL (PCL ₂ ) with molecular weights of 0.53 kDa and 1.25 kDa, (n-hexane). And then the precipitated material was dissolved in dimethyl sulfoxide (dimethyl sulfoxide, DMSO), added to the same volume of purified water by means of dialysis was purified polymer, the polymer solution was lyophilized and the resulting succinate -PCL ₀ _.5 - succinate ( snPCL ₀ _.5 ), succinate - PCL ₁ - succinate (snPCL ₁ ) and succinate - PCL ₂ - succinate (snPCL ₂ ) were obtained. The synthesized polymer was analyzed for ¹ H-NMR spectroscopy in a solvent of DMSO-d6 as shown in Fig. 3, and the GPC spectrum obtained on THF solvent and the polystyrene molecular weight standard material To analyze the molecular weight distribution. As a result, it was confirmed that snPCL ₀ _.5 snPCL ₁ and snPCL ₂ were combined with about 1.8, about 2 and about 1.9 succinate per PCL, respectively.

<실시예 2> snPCL의 임계미셀농도 확인, 나노입자의 제조 및 물리화학적 특성 확인<Example 2> Confirmation of critical micelle concentration of snPCL, preparation of nanoparticles and confirmation of physicochemical properties

상기에서 제조한 4 mg의 snPCL 고분자들을 0.2 mL의 DMSO에 녹여 10분간 교반한 후, 4 mL의 정제수를 첨가하고 30분 더 교반하였다. 이 분산액에 포함되어 있는 DMSO를 수상에서 투석(dialysis)을 통해 제거하고 snPCL 나노입자를 얻었다. 이와 같은 공용매 분산법(co-solvent dispersion, CD)을 통해 만들어진 나노입자를 snPCL₀ _.5 나노입자(Nanoparticle, NP), snPCL₁ NP, snPCL₂ NP로 명명하였고, 임계미셀농도를 확인한 결과, 도 5에 개시된 바와 같이, snPCL₀ _.5, snPCL₁, snPCL₂가 각각 약 0.01 mg/mL, 약 0.009 mg/mL, 약 0.007 mg/mL 이었다.4 mg of the snPCL polymer prepared above was dissolved in 0.2 mL of DMSO and stirred for 10 minutes. 4 mL of purified water was added and stirred for 30 minutes. DMSO contained in this dispersion was removed from the aqueous phase by dialysis to obtain snPCL nanoparticles. The nanoparticles produced by this co-solvent dispersion (CD) were named snPCL ₀ _.5 nanoparticles (SNP), snPCL ₁ NP and snPCL ₂ NP. as disclosed in FIG _{_{_{5, snPCL 0 .5, snPCL 1}}} , snPCL 2 a was about 0.01 mg / mL, from about 0.009 mg / mL, from about 0.007 mg / mL, respectively.

또한, 도 6에 개시된 바와 같이, snPCL₀ _.5 NP는 약 110 ± 16 nm의 크기와 -32 ± 4 mV의 제타전위를, snPCL₁ NP는 약 47 ± 9 nm의 크기와 -47 ± 3 mV의 제타전위를, snPCL₂ NP는 약 30 ± 8 nm의 크기와 -49 ± 4 mV의 제타전위를 나타내었다.Also, as shown in Fig. 6, snPCL ₀ _.5 NP has a size of about 110 ± 16 nm and a zeta potential of -32 ± 4 mV, while snPCL ₁ NP has a size of about 47 ± 9 nm and a size of -47 ± 3 mV And snPCL ₂ NP showed a zeta potential of about 30 ± 8 nm and -49 ± 4 mV, respectively.

또한, 산성 pH 환경 하에서의 snPCL 나노입자의 표면에 존재하는 친수성 석시네이트가 소수성 석신산으로 변화되는지 확인하기 위해 pH에 따른 탁도 및 입자크기 변화를 평가하였다. In addition, turbidity and particle size changes according to pH were evaluated to confirm that the hydrophilic succinate present on the surface of snPCL nanoparticles under acidic pH conditions was changed to hydrophobic succinic acid.

그 결과, 도 7에서 보는 바와 같이, pH 7.4에서 0.5 mg/mL을 갖는 snPCL₂ NP의 투과율(transmittance)은 100%로 투명하였으나, HCl을 첨가하면서 투과율이 낮아지기 시작하였으며 pH 6.6에서 80%, pH 5.4에서 약 55%가 되었고, pH 5.2 이하에서는 20%의 값을 나타내었다. 또한, snPCL 나노입자의 크기는 pH 7.4에서 약 20 nm, pH 6.6에서 약 50 nm, pH 5.4에서 약 110 nm로 pH가 낮아짐에 따라 점진적으로 증가하였고, pH 5.2에서 약 180 nm, pH 4.7에서 약 400 nm로 급격히 커졌다. 더욱이, pH 감소에 따른 snPCL 나노입자의 입자크기 증가와 투과율 감소 현상은, pH 증가에 따라 다시 입자크기의 감소와 투과율의 증가로 나타나는 가역적 반응임을 확인하였다. As a result, as shown in FIG. 7, the transmittance of snPCL ₂ NP having a concentration of 0.5 mg / mL at pH 7.4 was 100%, but the permeability began to decrease with the addition of HCl, 5.4 and 55%, respectively, and it was 20% at pH 5.2 and below. In addition, the size of snPCL nanoparticles gradually increased as pH decreased from pH 7.4 to about 20 nm, from pH 6.6 to about 50 nm, from pH 5.4 to about 110 nm, and from pH 5.2 to about 180 nm, pH 4.7 And rapidly increased to 400 nm. Furthermore, it was confirmed that the increase of the particle size and the decrease of the transmittance of snPCL nanoparticles due to the decrease in pH were reversible due to the decrease of the particle size and the increase of the transmittance.

<실시예 3> snPCL 나노입자의 암세포 사멸 효과 확인<Example 3> Confirmation of cancer cell death effect of snPCL nanoparticles

snPCL 나노입자의 세포 사멸효과 평가를 통한 독성 유무를 평가하기 위해 96-웰 플레이트의 1개 웰 당 5000개 세포를 깔아 24시간 동안 배양한 후, 다양한 농도의 snPCL 나노입자들을 48시간동안 세포에 처리하고 세포의 생존능(cell viability)을 MTT 방법을 이용하여 평가하였다. In order to evaluate the toxicity of snPCL nanoparticles, 5000 cells per well of 96-well plate were cultured for 24 hours, and various concentrations of snPCL nanoparticles were treated for 48 hours And cell viability was assessed using the MTT method.

그 결과, 도 8에 개시된 바와 같이, 암세포인 자궁경부암세포(HeLa)에서 50% 생존능을 보이는 농도인 IC₅₀이 snPCL_0.5 NP는 약 300 μg/mL, snPCL₁ NP는 약 133 μg/mL, snPCL₂ NP는 약 52 μg/mL이었고, 간암세포(HepG2)에 대한 snPCL NP의 IC₅₀는 PCL의 분자량에 상관없이 약 500 μg/mL이었다. As a result, as shown in Fig. 8, the IC _{50, which} is a 50% viable concentration of cancer cell (HeLa), was about 300 μg / mL for snPCL _0.5 NP, about 133 μg / mL for snPCL ₁ NP, ₂ NP was about 52 μg / mL, and the IC ₅₀ of snPCL NP against liver cancer cells (HepG2) was about 500 μg / mL regardless of the molecular weight of PCL.

그러나, 도 9에 개시된 바와 같이 정상세포인 섬유아세포(NIH-3T3)와 인간신장세포(HEK239T)는 실험에 사용된 snPCL 나노입자의 최대 농도(500 μg/mL)에서 약 70% 이상의 세포 생존능을 보였으며 IC₅₀가 관찰되지 않았다. However, as shown in Fig. 9, the normal cells fibroblast (NIH-3T3) and human kidney cells (HEK239T) had cell viability of about 70% or more at the maximum concentration of snPCL nanoparticles (500 μg / And IC ₅₀ was not observed.

이러한 결과는 snPCL 나노입자 자체로 정상세포가 아닌 암세포만 선택적으로 사멸시킬 수 있는 나노항암제의 기능을 가졌음을 보여준다.These results show that SNPCL nanoparticle itself has the function of a nano-anticancer agent capable of selectively killing only cancer cells, not normal cells.

<실시예 4> snPCL 나노입자의 암세포 사멸효과의 기전규명Example 4: Mechanism of the cancer cell killing effect of snPCL nanoparticles

나노 항암제로 작용하는 snPCL 나노입자의 세포 사멸 기전을 규명하기 위해 미토콘드리아 내 전자전달계에 존재하는 효소인 석시네이트 탈수소효소(Succinate dehydrogenase; SDH)의 활성, 미토콘드리아 막의 전위차, 활성산소종의 생성, 생체에너지인 ATP 생성 및 세포주기를 평가하였다.In order to investigate the apoptotic mechanism of snPCL nanoparticle acting as a nano-anticancer drug, the activity of succinate dehydrogenase (SDH), the enzyme present in the mitochondrial electron transport system, the potential difference of mitochondrial membrane, the production of reactive oxygen species, ATP production and cell cycle were evaluated.

먼저, snPCL 나노입자에 의한 SDH 활성 변화를 평가하기 위해 96-웰 플레이트의 1개 웰 당 5,000개의 간암세포(HepG2)를 깔아 24시간 동안 DMEM 세포배양 배지에서 배양한 후, 20 mM의 석시네이트를 포함한 신선 배지로 바꿔 1시간 동안 추가 배양하였다. 250 μg/mL를 갖는 snPCL 나노입자 또는 SDH 활성 억제제인 4 mM의 3-니트로프로피온산(nitropropionic acid; 3NPA)을 각각 또는 동시에 암세포에 2시간 동안 노출시킨 후, MTT 분석법을 이용하여 SDH 활성을 평가하였다.First, 5,000 hepatocellular carcinoma cells (HepG2) per well of a 96-well plate were plated on a DMEM cell culture medium for 24 hours to evaluate changes in SDH activity by snPCL nanoparticles. Then, 20 mM succinate And the cells were further cultured for 1 hour. SDP activity was assessed using MTT assay after 2 hours of exposure to either snPCL nanoparticles with 250 μg / mL or 4 mM nitropropionic acid (3NPA), which is an SDH inhibitor, .

그 결과, 도 10에 개시된 바와 같이, 3NPA, snPCL₀ _.5 NP, snPCL₁ NP, snPCL₂ NP를 단독 처리하면 SDH 활성은 각각 61%, 59%, 51%, 52%로 감소하였다. 반면에 snPCL₀ _.5 NP, snPCL₁ NP, snPCL₂ NP를 3NPA와 동시에 처리하면, SDH 활성은 각각 25%, 27%, 29%로 감소하였다. 이는 snPCL 나노입자가 3NPA처럼 SDH 활성을 억제하는 역할을 하며, 두 물질이 SDH에 붙는 위치가 같지 않아 동시에 처리 시 더 낮은 SDH 활성을 보이기 때문이다.As a result,, 3NPA, snPCL ₀ _.5 if only treatment for NP, snPCL NP _1, NP ₂ snPCL SDH activity was reduced by 61%, 59%, 51% and 52%, respectively, as disclosed in FIG. On the other hand, when SNPCL ₀ _.5 NP, snPCL ₁ NP, and snPCL ₂ NP were treated simultaneously with 3NPA, SDH activity decreased to 25%, 27% and 29%, respectively. This is because SNPCL nanoparticles play a role in inhibiting SDH activity like 3NPA, and both substances exhibit lower SDH activity at the same time because they are not located at the same position on SDH.

더욱이, snPCL 나노입자에 의한 미토콘드리아 막 전위의 분극화 변화를 평가하기 위해 6-웰 플레이트의 1개 웰 당 500,000개의 자궁경부암세포(HeLa)를 깔아 24시간 동안 세포배양 배지에서 배양한 후, 125 μg/mL를 갖는 snPCL 나노입자를 세포에 4시간 동안 노출시켰다. MitoProbe^TM JC-1 assay kit의 분석방법에 따라, 실험종료 15분 전에 2 μM의 JC-1 시약을 투여하여 미토콘드리아 막 전위의 분극 정도를 488 nm에서 여기(excitation)시켜 530 nm 및 585 nm에서 방출(emission)된 빛을 유세포 분석기와 공초점 현미경을 이용하여 분석하였다. 일반적으로, JC-1은 미토콘드리아 막 전위가 정상일 때 빨간빛을 방출하고, 미토콘드리아 막 전위에 이상이 생겨 탈분극 현상이 일어나 세포자멸사(apoptosis)가 되면 초록빛을 방출하게 된다. 시료가 처리되지 않은 정상 세포에서 JC-1 Red/Green 비를 100%로 놓고, 실험이 진행된 세포에서 JC-1 Red/Green 비가 낮아질수록 탈분극 되었다고 판단하며, 추가적으로 세포자멸사가 일어났다고 예측할 수 있다. Furthermore, 500,000 cervical cancer cells (HeLa) per well of a 6-well plate were cultured in a cell culture medium for 24 hours in order to evaluate the polarization change of the mitochondrial membrane potential by the snPCL nanoparticles, mL of snPCL nanoparticles were exposed to the cells for 4 hours. According to the assay method of the MitoProbe ^™ JC-1 assay kit, 2 μM of JC-1 reagent was administered 15 minutes before the end of the experiment to excite the polarization degree of the mitochondrial membrane potential at 488 nm and emit at 530 nm and 585 nm The emitted light was analyzed using a flow cytometer and a confocal microscope. In general, JC-1 emits red light when the mitochondrial membrane potential is normal, and depolarization occurs when the mitochondrial membrane potential is abnormal, resulting in the release of green light when apoptosis occurs. The ratio of JC-1 Red / Green was 100% in the untreated normal cells, and the decrease in JC-1 Red / Green ratio in the experimental cells was presumed to be depolarization and further apoptosis could be predicted.

그 결과, 도 11에 개시된 바와 같이, 정상세포(control)의 JC-1 Red/Green 비에 비해 탈분극을 유도한다고 알려진 카보닐시아나이드 m-클로로페닐하이드라존(carbonylcyanide m-chlorophenylhydrazone; CCCP)이 처리된 세포는 녹색빛의 형광세기에 비해 적색빛의 형광세기가 매우 작아 JC-1 Red/Green 비가 약 27% 정도였으나, snPCL 나노입자가 처리된 세포는 JC-1 Red/Green 비가 약 75%-85% 정도였다. snPCL 나노입자가 처리된 세포에서 미토콘드리아 막 전위의 탈분극 정도가 15%-25% 수준이므로 snPCL 나노입자는 미토콘드리아 막 전위에 큰 영향을 주지 않는 것을 확인할 수 있었다.As a result, carbonylcyanide m-chlorophenylhydrazone (CCCP), known to induce depolarization compared to the JC-1 Red / Green ratio of normal cells, The ratio of JC-1 red / green ratio was about 27% in the treated cells, but the ratio of JC-1 red / green ratio was about 75% in the cells treated with snPCL nanoparticles. -85%. It was confirmed that snPCL nanoparticles did not significantly affect the mitochondrial membrane potential because the degree of depolarization of the mitochondrial membrane potential was in the range of 15% -25% in the cells treated with snPCL nanoparticles.

상기와 같이, snPCL 나노입자는 미토콘드리아 막 전위에 큰 영향을 주지 않는 결과로부터 snPCL 나노입자가 세포자멸사에 영향을 주지 않는다고 예측할 수 있다. 이에, snPCL 나노입자에 의해 유발되는 암세포 사멸이 세포자멸사와 무관함을 확인하기 위하여 6-웰 플레이트의 1개 웰 당 100,000개의 자궁경부암세포(HeLa)를 깔아 24시간 동안 세포배양 배지에서 배양한 후, 125 μg/mL에서 500 μg/mL 갖는 snPCL 나노입자를 세포에 24시간 동안 노출시켰다. 프로피디움 요오드화물(Propidium iodide; PI)과 아넥신 V(Annexin V)를 이중염색하여 snPCL 나노입자에 노출된 암세포의 세포괴사 및 세포자멸사를 평가하였다. As described above, snPCL nanoparticles have no significant effect on the mitochondrial membrane potential, and it can be predicted that snPCL nanoparticles do not affect apoptosis. In order to confirm that cancer cell death caused by snPCL nanoparticles is independent of apoptosis, 100,000 cervical cancer cells (HeLa) per well of a 6-well plate were cultured in a cell culture medium for 24 hours , SnPCL nanoparticles with 125 μg / mL and 500 μg / mL were exposed to the cells for 24 hours. Propidium iodide (PI) and Annexin V were double stained to assess apoptosis and apoptosis of cancer cells exposed to snPCL nanoparticles.

그 결과, 도 12에서 보는 바와 같이, 125 μg/mL로 처리된 모든 snPCL 나노입자는 세포괴사 및 세포자멸사를 유발하지 않았다. 또한, 250 μg/mL와 500 μg/mL를 처리하는 경우도 세포괴사 및 세포자멸사를 관찰하지 못했다(data not shown).As a result, as shown in Fig. 12, all snPCL nanoparticles treated with 125 μg / mL did not induce apoptosis and apoptosis. In addition, no treatment with either 250 μg / mL or 500 μg / mL cell necrosis and apoptosis was observed (data not shown).

더불어, snPCL 나노입자에 의한 활성산소종 생성을 평가하기 위해 공초점 현미경 전용 디쉬 당 30,000개의 자궁경부암세포(HeLa)를 깔아 24시간 동안 세포배양 배지에서 배양한 후, 125 μg/mL를 갖는 snPCL₂ 나노입자를 세포에 6시간 동안 노출시켰다. 실험종료 20분 전에 5 μM의 디하이드로에티듐(Dihydroethidium; DHE) 시약을 처리한 후, 공초점 현미경을 이용하여 평가하였다.To evaluate the production of reactive oxygen species by snPCL nanoparticles, 30,000 cervical cancer cells (HeLa) per confluent microscope dish were cultured in a cell culture medium for 24 hours, and then snPCL ₂ with 125 μg / mL The nanoparticles were exposed to the cells for 6 hours. Twenty minutes before the end of the experiment, 5 μM of dihydroethidium (DHE) reagent was treated and then evaluated using a confocal microscope.

그 결과, 도 13에서 보는 바와 같이, 전자전달계 복합체 III의 억제제로 알려진 안티마이신 A(Antimycin A)를 5 μM 처리한 세포와 snPCL₂ 나노입자를 처리한 세포는 정상세포(control)보다 약 4배 많이 활성산소종을 생성하였다.As a result, as shown in FIG. 13, cells treated with 5 μM antimycin A and snPCL ₂ nanoparticles, which are known as inhibitors of the electron transport system complex III, A lot of active oxygen species were produced.

일반적으로, 미토콘드리아의 전자전달계는 산소를 소비하면서 전자를 전달시키고 미토콘드리아의 외막과 내막 사이로 수소이온을 전달하여, 미토콘드리아의 막 사이의 수소이온 격차를 만든다. 미토콘드리아 막 사이 고농도로 모인 수소이온은 ATP 생성효소 복합체를 통과하면서 세포에 필요한 ATP 에너지를 생산한다. 이에, snPCL 나노입자에 의한 ATP 생성을 평가하기 위해 96-웰 플레이트의 1개 웰 당 5,000개의 자궁경부암세포(HeLa)를 깔아 24시간 동안 세포배양 배지에서 배양한 후, 125 μg/mL에서 500 μg/mL를 갖는 snPCL 나노입자를 세포에 4시간 동안 노출시키고, CellTiter-Glo Luminescent Cell viability kit를 이용하여 ATP 에너지 생성을 평가하였다. In general, the mitochondrial electron transport system transports electrons while consuming oxygen and transfers hydrogen ions between the outer and inner membranes of the mitochondria, creating a hydrogen ion gap between membranes of the mitochondria. Hydrogen ions, which collect at high concentrations in the mitochondrial membrane, pass through the ATP-producing enzyme complex and produce the ATP energy required for the cells. To evaluate the ATP production by snPCL nanoparticles, 5,000 cervical cancer cells (HeLa) were plated per well in 96-well plates and cultured in a cell culture medium for 24 hours. Then, 125 μg / mL to 500 μg / mL of snPCL nanoparticles was exposed to the cells for 4 hours and ATP energy production was evaluated using the CellTiter-Glo Luminescent Cell viability kit.

그 결과, 도 14에서 보는 바와 같이, snPCL 나노입자의 농도가 높아질수록 ATP 생성이 낮아지며, snPCL 나노입자의 PCL 분자량이 커질수록 ATP 생성이 낮아졌다. 즉, 정상세포(control)의 ATP 생성에 비해 125 μg/mL의 snPCL₀ _.5 NP, snPCL₁ NP, 또는 snPCL₂ NP를 처리하면 ATP 생성은 각각 92%, 91%, 77%로 낮아졌고, 500 μg/mL을 처리하면 각각 70%, 58%, 51%로 낮아졌다. snPCL 나노입자는 미토콘드리아의 전자전달계에 영향을 주어 ATP 에너지 생성을 줄이는 것으로 판단된다.As a result, as shown in FIG. 14, as the concentration of snPCL nanoparticles was increased, ATP production was lowered, and as PCL molecular weight of snPCL nanoparticles was larger, ATP production was lowered. In other words, when 125 μg / mL of snPCL ₀ _.5 NP, snPCL ₁ NP, or snPCL ₂ NP were treated with ATP, the ATP production was reduced to 92%, 91%, and 77%, respectively, Treatment with 500 μg / mL lowered them to 70%, 58% and 51%, respectively. The snPCL nanoparticles are thought to reduce ATP energy production by affecting the mitochondrial electron transport system.

마지막으로, snPCL 나노입자에 의한 세포사멸 현상의 기전을 확인하기 위해 세포 주기(cell cycle)에 대한 영향을 평가하였다. 6-웰 플레이트의 1개 웰 당 100,000개의 자궁경부암세포(HeLa)를 깔아 24시간 동안 세포배양 배지에서 배양한 후, 125 μg/mL에서 500 μg/mL를 갖는 snPCL₂ 나노입자를 세포에 24시간 동안 노출시켰다. snPCL₂ 나노입자가 처리된 암세포를 70% 에탄올로 고정시킨 후, 0.6% Triton X-100과 RNase A를 포함하는 RNA 워킹(working) 용액에 담가 10 μg/mL인 PI로 염색하여 유세포 분석기를 통해 세포 주기를 확인했다. Finally, we examined the effect of SNPCL nanoparticles on the cell cycle in order to determine the mechanism of apoptosis. 100,000 cervical cancer cells (HeLa) per well of a 6-well plate were plated on a cell culture medium for 24 hours, and then snPCL ₂ nanoparticles having 125 μg / mL to 500 μg / mL were added to the cells for 24 hours Lt; / RTI > The cancer cells treated with snPCL ₂ nanoparticles were immobilized in 70% ethanol and then immersed in a working solution containing 0.6% Triton X-100 and RNase A, stained with 10 μg / mL of PI, and analyzed with a flow cytometer The cell cycle was confirmed.

그 결과, 도 15에서 보는 바와 같이, snPCL 나노입자가 처리되지 않은 정상세포(control)의 G0/G1 페이즈(phase)와 G2 페이즈는 각각 67%, 16%였고, 125 μg/mL을 갖는 snPCL 나노입자를 처리한 세포의 G0/G1 페이즈와 G2 페이즈는 각각 67%, 16%였으며, 250 μg/mL을 갖는 snPCL 나노입자를 처리한 세포의 G0/G1 페이즈와 G2 페이즈는 각각 75%, 9%였고, 500 μg/mL을 갖는 snPCL 나노입자를 처리한 세포의 G0/G1 페이즈와 G2 페이즈가 각각 78%, 8%였는 바, snPCL 나노입자에 의해 암세포의 세포주기 중 G0/G1 페이즈가 증가되고, G2 페이즈가 감소되는 것을 확인하였다.As a result, as shown in Fig. 15, the G0 / G1 phase and the G2 phase of the normal cell control without the treatment of snPCL nanoparticles were 67% and 16%, respectively, and snPCL nano The G0 / G1 phase and G2 phase of the cells treated with snPCL nanoparticles with a concentration of 250 μg / mL were 75% and 9%, respectively, , And G0 / G1 phase and G2 phase of cells treated with snPCL nanoparticles having 500 μg / mL were 78% and 8%, respectively. As a result, the G0 / G1 phase of the cell cycle of cancer cells was increased by the snPCL nanoparticles , And the G2 phase was decreased.

<실시예 5> 항암제 독소루비신(Dox)이 봉입된 snPCL 나노입자의 제조 및 물리화학적 특성<Example 5> Preparation and physicochemical properties of snPCL nanoparticles encapsulating doxorubicin (Dox), an anticancer drug

snPCL 고분자와 독소루비신(Dox)를 DMSO에 녹여 각각 20 mg/mL과 5 mg/mL의 농도로 준비하였다. 준비된 snPCL 고분자 용액와 독소루비신(Dox) 용액을 각각 0.2 mL씩 취해 두 용액을 섞었다. 4 mL의 정제수에 0.4 mL의 고분자-약물 혼합 용액을 첨가하고, 4시간동안 교반하였다. 이 고분자-약물 분산액을 투석막에 넣고 수상에서 투석을 통해 분산액에 포함된 DMSO를 제거하여, 최종적으로 독소루비신이 봉입된 Dox-snPCL 나노입자(NP, nanoparticle)를 얻었다. 이와 같은 공용매 분산법(co-solvent dispersion, CD)을 통해 만들어진 나노입자를 PCL 분자량에 따라 Dox-snPCL_0.5 NP, Dox-snPCL₁ NP, Dox-snPCL₂ NP로 명명했다. The snPCL polymer and doxorubicin (Dox) were dissolved in DMSO and prepared at concentrations of 20 mg / mL and 5 mg / mL, respectively. Take 0.2 mL of the prepared snPCL polymer solution and doxorubicin (Dox) solution, and mix the two solutions. 0.4 mL of the polymer-drug mixture solution was added to 4 mL of purified water, and the mixture was stirred for 4 hours. This polymer-drug dispersion was placed in a dialysis membrane and DMSO contained in the dispersion was removed by dialysis to obtain Dox-snPCL nanoparticles (NP, snp) encapsulated with doxorubicin. The nanoparticles prepared by co-solvent dispersion (CD) were named Dox-snPCL _0.5 NP, Dox-snPCL ₁ NP, and Dox-snPCL ₂ NP according to PCL molecular weight.

상기 나노입자들의 입자 크기 및 제타전위를 확인한 결과, 도 16에 개시된 바와 같이, 제조된 Dox-snPCL_0.5 NP, Dox-snPCL₁ NP, Dox-snPCL₂ NP의 평균 직경은 각각 약 118 ± 14 nm, 약 104 ± 24 nm, 약 93 ± 27 nm이었으며, 이들의 제타전위는 각각 약 -29 ± 7 mV, 약 -33 ± 4 mV, 약 -44 ± 7 mV 이었다.As shown in FIG. 16, the average diameters of the prepared Dox-snPCL _0.5 NP, Dox-snPCL ₁ NP and Dox-snPCL ₂ NP were about 118 ± 14 nm, About 104 ± 24 nm and about 93 ± 27 nm, respectively. Their zeta potentials were about -29 ± 7 mV, about -33 ± 4 mV, and about -44 ± 7 mV, respectively.

<실시예 6> 항암제 독소루비신(Dox)이 봉입된 snPCL 나노입자의 항암 효과<Example 6> Anticancer effect of snPCL nanoparticles encapsulated with anticancer drug doxorubicin (Dox)

상기 실시예 5에서 준비된 Dox-snPCL NP의 항암제 효과를 평가하기 위해 96-웰 플레이트의 1개 웰 당 5,000개의 자궁경부암세포(HeLa) 또는 간암세포(HepG2)를 깔아 24시간 동안 세포배양 배지에서 배양한 후, 다양한 독소루비신 농도를 갖는 Dox-snPCL NP를 세포에 48시간 동안 노출시켜 MTT 분석법을 활용하여 암세포의 생존능(cell viability)을 평가하고, Dox-snPCL NP의 항암효과를 예측하였다.To evaluate the anticancer effect of Dox-snPCL NP prepared in Example 5, 5,000 cervical cancer cells (HeLa) or hepatocarcinoma cells (HepG2) were plated per well in 96-well plates and cultured in a cell culture medium for 24 hours After that, Dox-snPCL NP with various concentrations of doxorubicin was exposed to the cells for 48 hours, and the cell viability of the cancer cells was evaluated using MTT assay, and the anticancer effect of Dox-snPCL NP was predicted.

그 결과, 도 17에 개시된 바와 같이, HeLa 세포에 대한 독소루비신의 IC₅₀는 약 6.0 μg/mL이었고, Dox-snPCL_0.5 NP, Dox-snPCL₁ NP, Dox-snPCL₂ NP의 IC₅₀는 각각 약 2.1 μg/mL, 약 0.68 μg/mL, 약 0.30 μg/mL이었다. 이러한 결과는 Dox-snPCL_0.5 NP, Dox-snPCL₁ NP, Dox-snPCL₂ NP는 Dox보다 각각 약 2.9배, 약 8.8배, 약 20배 우수한 항암효과를 보이는 것을 의미한다. 또한, HepG2 세포에 대한 독소루비신의 IC₅₀는 약 1.2 μg/mL이었고, Dox-snPCL_0.5 NP, Dox-snPCL₁ NP, Dox-snPCL₂ NP의 IC₅₀는 각각 약 0.67 μg/mL, 약 0.48 μg/mL, 약 0.23 μg/mL이었다. Dox-snPCL_0.5 NP, Dox-snPCL₁ NP, Dox-snPCL₂ NP는 Dox보다 각각 약 1.8배, 약 2.5배, 약 5.2배 우수한 항암효과를 보이는 것을 의미한다.As a result, as described in 17, IC ₅₀ for doxorubicin to the HeLa cell is approximately 6.0 μg / mL _{were, Dox-snPCL 0.5 NP, Dox} -snPCL 1 NP, IC 50 of the Dox-snPCL ₂ NP is about 2.1 each μg / mL, about 0.68 μg / mL, and about 0.30 μg / mL. These results indicate that Dox-snPCL _0.5 NP, Dox-snPCL ₁ NP, and Dox-snPCL ₂ NP have an anticancer effect that is about 2.9 times, 8.8 times, and 20 times better than Dox, respectively. In addition, IC ₅₀ for doxorubicin for HepG2 cells was about 1.2 μg / mL, Dox-snPCL 0.5 NP, Dox-snPCL 1 NP, IC 50 of the Dox-snPCL ₂ NP from about 0.48 μg / about 0.67 μg / mL, respectively, mL and about 0.23 μg / mL, respectively. Dox-snPCL _0.5 NP, Dox-snPCL ₁ NP, and Dox-snPCL ₂ NP are superior to Dox at about 1.8, 2.5 and 5.2 times, respectively.

<< 실시예Example 7> 항암제 7> Anticancer drug 독소루비신(Dox)이Doxorubicin (Dox) 봉입된Enclosed snPCLsnPCL 나노입자의 세포 내 유입과 분포 및 Intracellular inflow and distribution of nanoparticles and 세포소기관Cell organelle 표적능 확인 Identification of target function

상기 실시예 5에서 준비된 Dox-snPCL NP의 세포 내 유입(cellular uptake, CU)량을 평가하기 위해, 6-웰 플레이트의 1개 웰 당 500,000개의 자궁경부암세포(HeLa)를 깔아 24시간 동안 세포배양 배지에서 배양한 후, 5 μg/mL의 독소루비신 농도를 갖는 Dox-snPCL NP를 세포에 4시간 동안 노출시켰다. 인산완충액으로 세포를 씻어낸 후, 유세포 분석기를 이용해 세포 내에 존재하는 Dox의 형광세기를 측정하여 Dox-snPCL NP의 세포 내 유입량을 예측하였다.In order to evaluate the amount of cellular uptake (CU) of Dox-snPCL NP prepared in Example 5, 500,000 cervical cancer cells (HeLa) per one well of a 6-well plate were plated and cultured for 24 hours After culturing in the medium, Dox-snPCL NP with a concentration of doxorubicin of 5 μg / mL was exposed to the cells for 4 hours. After washing the cells with phosphate buffer, the intracellular flux of Dox-snPCL NP was estimated by measuring the fluorescence intensity of Dox present in the cells using a flow cytometer.

그 결과, 도 18에 개시된 바와 같이, Dox를 처리한 세포의 세포 내 Dox의 형광 세기를 1로 놓았을 때, Dox-snPCL₀ _.5 NP, Dox-snPCL₁ NP, Dox-snPCL₂ NP를 처리한 세포 내에 존재하는 Dox의 형광세기는 각각 약 1.3 ± 0.08배, 약 1.6 ± 0.07배, 약 1.8 ± 0.08배 높았다.As a result, when the fluorescence intensity of intracellular Dox in the cells treated with Dox was set to 1 as shown in Fig. 18, Dox-snPCL ₀ _.5 NP, Dox-snPCL ₁ NP, and Dox-snPCL ₂ NP The fluorescence intensities of Dox in one cell were about 1.3 ± 0.08, 1.6 ± 0.07 and 1.8 ± 0.08, respectively.

또한, 상기 실시예 5에서 준비된 Dox-snPCL NP의 미토콘드리아 내 유입(mitochondrial uptake)량을 평가하기 위해, 6-웰 플레이트의 1개 웰 당 500,000개의 자궁경부암세포(HeLa)를 깔아 24시간 동안 세포배양 배지에서 배양한 후, 5 μg/mL의 독소루비신 농도를 갖는 Dox-snPCL NP를 세포에 4시간 동안 노출시켰다. 인산완충액으로 세포를 씻어낸 후, 미토콘드리아 분리 키트(mitochondria isolation kit)를 이용해 미토콘드리아만을 분리해내었다. 유세포 분석기를 이용해 미토콘드리아 내에 존재하는 Dox의 형광 세기를 측정하여 Dox-snPCL NP의 미토콘드리아 내 유입량을 예측하였다. In order to evaluate the amount of mitochondrial uptake of Dox-snPCL NP prepared in Example 5, 500,000 cervical cancer cells (HeLa) per well of a 6-well plate were plated and cultured for 24 hours After culturing in the medium, Dox-snPCL NP with a concentration of doxorubicin of 5 μg / mL was exposed to the cells for 4 hours. The cells were washed with phosphate buffer, and mitochondria were isolated using a mitochondria isolation kit. The fluorescence intensity of Dox present in the mitochondria was measured using a flow cytometer to predict the inflow of mitochondria into Dox-snPCL NP.

그 결과, 도 18에서 보는 바와 같이, Dox를 처리한 세포의 미토콘드리아 내 Dox의 형광 세기를 1로 놓았을 때, Dox-snPCL₀ _.5 NP, Dox-snPCL₁ NP, Dox-snPCL₂ NP를 처리한 미토콘드리아 내에 존재하는 Dox의 형광세기는 각각 약 1.2 ± 0.16배, 약 1.3 ± 0.41배, 약 1.3 ± 0.21배 높았다.As a result, as shown in FIG. 18, Dox-snPCL ₀ _.5 NP, Dox-snPCL ₁ NP, and Dox-snPCL ₂ NP were treated when the fluorescence intensity of Dox in the mitochondria of the cells treated with Dox was set to ₁ The fluorescence intensities of Dox in one mitochondria were about 1.2 ± 0.16, 1.3 ± 0.41 and 1.3 ± 0.21, respectively.

마지막으로, 상기 실시예 5에서 준비된 Dox-snPCL NP의 세포 내 분포 및 미토콘드리아 또는 핵 분포를 평가하기 위해, 공초점 현미경 전용 디쉬 당 30,000개의 자궁경부암세포(HeLa)를 깔아 24시간 동안 세포배양 배지에서 배양한 후, 2 μg/mL의 독소루비신 농도를 갖는 Dox-snPCL NP를 세포에 4시간 동안 노출시켰다. 실험종료 10분 전에 핵 염색시약(Hoechst33342)과 미토콘드리아 염색시약(MitoTracker)을 처리한 후, 공초점 현미경을 이용하여 평가했다. Finally, in order to evaluate the intracellular distribution and mitochondrial or nuclear distribution of Dox-snPCL NP prepared in Example 5, 30,000 cervical cancer cells (HeLa) per dish for confocal microscopy were placed on the cell culture medium for 24 hours After incubation, Dox-snPCL NP with a concentration of doxorubicin of 2 μg / mL was exposed to the cells for 4 hours. Ten minutes before the end of the experiment, the nuclear staining reagent (Hoechst 33342) and the mitochondrial staining reagent (MitoTracker) were treated and evaluated using a confocal microscope.

그 결과, 도 19에 개시된 바와 같이, 독소루비신만을 세포에 처리하면, 약물은 핵보다는 미토콘드리아에 분포되는 것을 확인할 수 있었으며, Dox-snPCL NP에 의해 전달되는 독소루비신 또한 핵보다는 미토콘드리아에 분포되는 것을 확인하였다. 이러한 결과는, 도 20에 개시된 바와 같이, 독소루비신 자체가 가지는 방출형광빛 세기, 핵 염색시약의 방출형광빛 세기, 미토콘드리아 염색시약의 방출형광빛 세기가 같은 위치에 존재하는지 확인한 결과에서, 독소루비신의 세포 내 분포는 도 19의 결과와 같이 미토콘드리아의 위치와 겹치지만, 핵의 위치와는 겹치지 않는다는 것을 나타낸다.As a result, as shown in Fig. 19, when the cells were treated with only doxorubicin, it was confirmed that the drug was distributed in the mitochondria rather than the nucleus, and that doxorubicin delivered by Dox-snPCL NP was also distributed in the mitochondria rather than the nucleus. These results indicate that, as shown in Fig. 20, the fluorescence intensity of emitted fluorescence, fluorescence emission intensity of nuclear staining reagent, and emission fluorescence intensity of mitochondrial staining reagent, which are present in doxorubicin itself, The distribution shows that the position of the mitochondria overlaps with the position of the nucleus, as shown in Fig. 19.

<< 실시예Example 8> 항암제 8> Anticancer drug 독소루비신(Dox)이Doxorubicin (Dox) 봉입된Enclosed snPCLsnPCL 나노입자의 세포 외 산성 환경 Extracellular environment of nanoparticles 표적능과Target function and 유입과 석시네이트 수용체 표적능 Influx and succinate receptor targeting ability

세포 밖의 pH 환경(세포 외 산성 환경 표적능)과 석시네이트의 존재 유무(석시네이트 수용체 표적능)에 따른 Dox-snPCL NP의 세포 내 유입량을 평가하기 위해, 6-웰 플레이트의 1개 웰 당 500,000개의 자궁경부암세포(HeLa)를 깔아 24시간 동안 세포배양 배지에서 배양한 후, 5 μg/mL의 독소루비신 농도를 갖는 Dox-snPCL NP를 세포에 4시간 동안 노출시켰다. 이때, 세포 밖의 pH 환경(세포 외 산성 환경 표적능)에 따른 효과를 확인하기 위해서 세포배양 배지의 pH를 7.4 또는 6.8로 조절하였다. 또한, 석시네이트의 존재 유무(석시네이트 수용체 표적능)에 따른 효과를 확인하기 위해서 pH 7.4를 갖는 세포 배양 배지에 20 mM의 석시네이트를 첨가하였고, 이때의 pH는 6.8이었다. 4시간 동안 Dox-snPCL NP를 처리한 세포를 인산완충액으로 씻어낸 후, 유세포 분석기를 이용해 세포 내에 존재하는 Dox의 형광세기를 측정하여 Dox-snPCL NP의 세포 내 유입량을 예측하였다. To evaluate the intracellular influx of Dox-snPCL NP according to the extracellular pH environment (extracellular environment target ability) and the presence or absence of succinate (succinate receptor targeting ability), 500,000 per well of a 6-well plate (HeLa) was cultured in a cell culture medium for 24 hours, and Dox-snPCL NP having a concentration of doxorubicin of 5 μg / mL was exposed to cells for 4 hours. At this time, the pH of the cell culture medium was adjusted to 7.4 or 6.8 in order to confirm the effect of extracellular pH environment (extracellular environment target function). In order to confirm the effect of succinate on the presence or absence of succinate (succinate receptor targeting ability), 20 mM succinate was added to the cell culture medium having pH 7.4, and the pH was 6.8. The cells treated with Dox-snPCL NP for 4 hours were rinsed with phosphate buffer, and the intracellular flux of Dox-snPCL NP was estimated by measuring the fluorescence intensity of Dox present in the cells using a flow cytometer.

그 결과, 도 21에서 보는 바와 같이, pH 6.8 세포배양 배지에서의 Dox-snPCL NP의 세포 내 유입량은 pH 7.4 세포배양 배지를 사용한 세포 내 유입량 결과보다 Dox-snPCL₀ _.5 NP, Dox-snPCL₁ NP, Dox-snPCL₂ NP에 대해 각각 약 1.03배, 약 1.14배, 약 1.17배 증가하였다. 이러한 pH 7.4 환경보다 pH 6.8 환경에서의 Dox-snPCL NP의 세포 내 유입량 증가는 Dox-snPCL NP의 표면에 존재하는 석시네이트가 석신산으로 변해 친수성인 나노입자 표면이 소수성 정도가 다소 증가하여 세포 내 유입량의 증가를 유발하는 것으로 판단된다.As a result, as shown in FIG. 21, the intracellular influx of Dox-snPCL NP in pH 6.8 cell culture medium was higher than that of Dox-snPCL ₀ _.5 NP, Dox-snPCL ₁ NP, and Dox-snPCL ₂ NP, respectively, by about 1.03 times, about 1.14 times, and about 1.17 times, respectively. The increase in intracellular flux of Dox-snPCL NP in pH 6.8 environment than in pH 7.4 environment is due to the fact that the succinate present on the surface of Dox-snPCL NP is converted to succinic acid and the surface of hydrophilic nanoparticles is slightly increased in hydrophobicity. It is believed that it causes the increase of inflow amount.

또한, pH 7.4 세포배양 배지에 석시네이트를 넣어 만들어진 세포배양 배지(최종적으로 pH 6.8)에서의 Dox-snPCL NP의 세포 내 유입량은 pH 6.8 세포배양 배지를 사용한 세포 내 유입량 결과보다 Dox-snPCL_0.5 NP, Dox-snPCL₁ NP, Dox-snPCL₂ NP에 대해 각각 약 84%, 약 85%, 약 64% 수준으로 감소하였다. 석시네이트를 세포 배양배지에 넣어 Dox-snPCL NP의 세포 내 유입량 감소는 Dox-snPCL NP의 표면에 존재하는 석시네이트가 세포막에 존재하는 석시네이트 수용체를 사용하기 때문인 것으로 판단된다.In addition, the intracellular influx of Dox-snPCL NP in the cell culture medium (final pH 6.8) prepared by adding succinate to pH 7.4 cell culture medium was higher than that of Dox-snPCL _0.5 NP , About 84%, about 85%, and about 64%, respectively, for Dox-snPCL ₁ NP and Dox-snPCL ₂ NP, respectively. The decrease in the intracellular flux of Dox-snPCL NP by adding succinate to the cell culture medium is considered to be due to the use of the succinate receptor on the surface of the Dox-snPCL NP.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 즉, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다.While the present invention has been particularly shown and described with reference to specific embodiments thereof, those skilled in the art will appreciate that such specific embodiments are merely preferred embodiments and that the scope of the present invention is not limited thereby. Do. That is, the practical scope of the present invention is defined by the appended claims and their equivalents.

Claims

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(Succinate) is covalently bound to both ends of a poly (ε-caprolactone; PCL) having a number average molecular weight of 0.53 kDa to 2 kDa and a cell having a succinate receptor and mitochondria SNPCL nanoparticles self-assembled in a water phase, the active succinate-PCL-succinate (snPCL) polymer represented by the following formula 1:
[Chemical Formula 1]

Wherein n is 3 to 20 in the formula (1).

An anticancer composition comprising snPCL nanoparticles according to claim 2 as an active ingredient.

The anticancer composition according to claim 3, wherein the cancer is liver cancer or cervical cancer.

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A nano drug delivery composition comprising snPCL nanoparticles according to claim 2 as an active ingredient.

The nano drug delivery composition according to claim 6, wherein the drug is an anticancer drug.

The nano drug delivery composition according to claim 7, wherein the anticancer agent is doxorubicin.

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