KR101980484B1

KR101980484B1 - CHI3L1(Chitinase 3-like protein 1)을 포함하는 동맥경화 예방 또는 치료용 약학 조성물

Info

Publication number: KR101980484B1
Application number: KR1020180037741A
Authority: KR
Inventors: 정태우; 이태승; 박형섭
Original assignee: 서울대학교병원
Priority date: 2018-03-30
Filing date: 2018-03-30
Publication date: 2019-05-20

Abstract

본 발명은 CHI3L1(Chitinase 3-like protein 1)을 유효성분으로 포함하는 동맥경화 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 포함된 CHI3L1에 의하여 (1) ICAM-1(intracellular adhesion molecule 1), VCAM-1(vascular cell adhesion molecule 1) 또는 E-셀렉틴(E-selectin) 등의 부착분자의 단백질 발현을 억제함으로써 혈관내피세포내 단핵구(monocyte) 유착을 억제시키고, (2) TNFα(tumor necrosis factorα) 또는 MCP-1(Monocyte Chemoattractant Protein-1) 등의 염증성 사이토카인의 발현을 억제시켜 염증반응을 감소 시키고, (3) 소포체(ER) 스트레스 및 세포사멸을 감소시킴으로써 동맥경화 예방 및 치료에 유용하게 활용될 수 있다. 위 반응은 모두 PPARδ(peroxisome proliferator-activated receptor delta)에 의해 매개된다.

Description

CHI3L1(Chitinase 3-like protein 1)을 포함하는 동맥경화 예방 또는 치료용 약학 조성물{Pharmaceutical composition comprising CHI3L1 for preventing or treating atherosclerosis}

본 발명은 동맥경화 예방 및 치료용 약학 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 CHI3L1(Chitinase 3-like protein 1)을 유효성분으로 포함하는 동맥경화 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

동맥경화증은 동맥 내 지질과 섬유상 요소가 축적되는 만성적인 염증질환이다. 특히 죽상동맥경화증(atherosclerosis)이란 콜레스테롤, 인지질, 칼슘 등을 함유한 지방성 물질(plaque)이 혈관 내막에 축적되어 동맥이 단단해지거나 좁아져서 혈액공급이 저해되어 압력이 높아지고 그로 인해 동맥이 파열, 박리 등이 일어나는 상태를 말한다. 죽상동맥경화증은 내피세포(endothelial cells), 대식세포 (macrophages), 평활근세포(smooth muscle cells) 사이의 복잡한 상호작용에 의해 일어난다고 알려져 있다(Libby et al ., Circ Res 116:307-11, 2015).

최근 동맥경화의 발병과 진행 및 심혈관 질환으로의 진행에서 염증반응이 핵심요인이라는 것이 밝혀졌다(Libby, P., Nature 420:868-74, 2002). 혈관내피세포가 여러 위험인자(예를 들면 높은 LDL 콜레스테롤, 포화지방, 고칼로리 식단, 흡연, 고혈압등)에 의해 손상되어 기능부전 상태가 되면 염증반응이 일어난다. 만성염증시 염증성 사이토카인과 부착분자의 발현 증가는 단핵구(monocyte)의 부착과 혈관내피로의 침투를 자극시켜 죽상동맥경화를 일으킨다(Galkina and Ley., Annu Rev Immunol 27:165-97, 2009; Sprague and Khalil., Biochem Pharmacol 78:539-52, 2009).

이외에도 이전의 연구는 CHOP(C/EBP homologous protein)과 GRP78(glucose-regulated protein 78)과 같은 소포체(ER) 스트레스 마커와 죽상동맥성 플라크(plaque) 사이에 밀접한 관계가 있다는 것을 보여주었고, 소포체(ER) 스트레스가 내피 기능장애에 중요한 역할을 한다는 것을 시사했다(Myoishi et al., Circulation 116:1226-33, 2007). 게다가 소포체(ER) 스트레스에 의해 유도된 내피의 세포사멸은 죽상혈전증(atherothrombosis) 매개 메커니즘을 촉진시킨다고 알려져 있다(Civelek et al., Circ Res 105:453-61, 2009).

PPAR(peroxisome proliferator-activated receptor)은 핵 내 수용체 수퍼 패밀리에 속하며 리간드에 의해 활성화되어 특정 유전자의 발현을 조절하는 전사인자이다. PPAR은 α, β/δ, γ 세 종류의 아이소타입이 있으며, 특히 PPARδ의 리간드는 단핵구의 이주 및 대식세포의 침투를 억제하고(Barish et al., Proc Natl Acad Sci U S A 105:4271-62008, 2008), MCP-1, ICAM-1 또는 TNFα의 발현도 줄어들게 한다(Graham et al., Atherosclerosis 181:29-37, 2005).

심혈관계 질환에 대한 치료방법들이 많이 있음에도 불구하고 동맥경화는 전 세계 사망 원인에 높은 비율을 차지하고 있으므로 분자적인 관점에 기초한 새로운 치료 전략의 필요성이 대두되고 있다. 이에 본 발명자들은 CHI3L1이 PPARδ의 발현을 조절하는 경로를 통하여 동맥경화증을 완화시킬 수 있는지를 확인하여 본 발명을 완성하였다.

대한민국 공개특허공보 제10-2015-0049989호

본 발명의 목적은 CHI3L1(Chitinase 3-like protein 1)을 유효성분으로 포함하는 동맥경화 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 CHI3L1을 투여하는 단계를 포함하는 동맥경화를 치료하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 일 양상은 CHI3L1(Chitinase 3-like protein 1)을 유효성분으로 포함하는 동맥경화 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구체예에서, 동맥경화는 죽상동맥경화증(atherosclerosis)일 수 있다.

본 발명에서 사용된 CHI3L1(Chitinase 3-like protein 1)은 사람의 1번 염색체에 존재하는 유전자에 의해 코딩되는 40kDa의 당단백질로, YKL-40, HC-gp39, BRP-39(breast regression protein 39)로도 알려져 있으며 포유류 키티나아제(chitinase)의 패밀리를 형성하는 18개의 글리코실 가수분해 효소중의 하나이다.

본 발명에서 사용된 CHI3L1은 다양한 종류의 세포에서 성장인자로서 작용하고 세포외기질 생성 및 혈관 생성에 중요한 역할을 한다. 또한 CHI3L1은 격한 운동후에 골격근에서 근육세포 증식을 야기하는 마이오카인(myokine)으로서 작용한다.

본 발명의 일 구체예에서 상기 조성물은 CHI3L1이 PPARδ의 발현을 증가시키는 것일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서 상기 조성물은 하기 특성 중 하나 이상을 가지는 것일 수 있다:

1) PPARδ(peroxisome proliferator-activated receptor delta)의 발현 증가;

2) NFκB의 인산화(phosphorylation) 억제;

3) 부착분자 ICAM-1(intracellular adhesion molecule 1), VCAM-1(vascular cell adhesion molecule 1) 또는 E-셀렉틴(E-selectin)의 발현 억제;

4) 염증성 사이토카인 TNFα(tumor necrosis factorα) 또는 MCP-1(Monocyte Chemoattractant Protein-1)의 발현 억제;

5) 소포체(endoplasmic reticulum; ER) 스트레스 억제; 및

6) 세포사멸(apoptosis)의 억제.

본 발명의 일 구체예에서 CHI3L1은 인간 CHI3L1으로서 서열 NCBI Reference Sequence: NP_001267.2를 가지는 것 일 수 있으며, CHI3L1의 변이체 또는 CHI3L1의 단편일 수 있다.

본 발명의 동맥경화 예방 및 치료용 약학 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 더 포함할 수 있다. 사용가능한 담체, 부형제 또는 희석제로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자이리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시 벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 또한, 동맥경화 예방 및 치료용 약학 조성물이 약제인 경우 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 중 선택되는 하나 이상을 추가적으로 포함할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 동맥경화 예방 및 치료용 약학 조성물의 제형은 사용방법에 따라 바람직한 형태일 수 있으며, 특히 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제형화 할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들면 정맥 내, 피하, 복강내 또는 국소 적용)할 수 있으며, 투여량은 투여방법, 복용자의 연령, 성별, 체중, 및 질환의 중증도 등을 고려하여 결정하는 것이 좋다. 일 예로, 본 발명의 동맥경화 예방 및 치료용 약학 조성물은 유효성분을 기준으로 하였을 때 1일 0.00001 내지 100 ㎎/㎏(체중)으로 1회 이상 투여가능하다. 그러나, 상기의 투여량은 예시하기 위한 일 예에 불과하며, 복용자의 상태에 따라 의사의 처방에 의해 변화될 수 있다. 또한 본 발명의 약학 조성물은 동맥경화의 예방 또는 치료를 위하여 단독으로 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 CHI3L1 또는 이의 단편을 포함하는 약학 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 동맥경화증의 치료 방법을 제공한다.

본 발명의 치료방법이 적용되는 대상 개체는 동맥경화증이 발병하였거나 발병할 수 있는 인간을 포함한 쥐, 가축 등을 포함하는 포유 동물을 의미하나 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 CHI3L1을 포함하는 약학 조성물을 대상 개체에 투여함으로써, 개체를 효율적으로 치료할 수 있다.

본 발명에서 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 대상 개체에게 본 발명의 약학 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구(예를 들면 정맥 내, 피하, 복강내 또는 국소 적용)의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다.

본 발명의 치료 방법은 CHI3L1를 포함하는 약학 조성물을 약학적 유효량으로 투여하는 것을 포함할 수 있다. 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치에 의해 결정될 수 있으며, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 본 발명의 목적상, 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 약학 조성물은 PPARδ의 발현을 증가시키고 NFκB의 인산화를 억제하여 염증성 사이토카인과 부착분자의 발현을 감소시키고, ORP150을 통한 경로에 의해 소포체(ER) 스트레스 및 세포사멸을 방지하므로 동맥경화 또는 죽상동맥경화의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 동맥경화반응을 감소시키는 CHI3L1에 의한 메커니즘을 도식적으로 표현한 것이다.
도 2a 내지 2d는 CHI3L1이 PPARδ의 발현과 NFκB의 인산화에 미치는 효과를 나타낸다. 도 2a(THP-1 세포)와 도 2b(HUVEC)는 CHI3L1이 PPARδ의 단백질 발현을 증가시키는 결과를 보여주고, 도 2c(THP-1 세포)와 도 2d(HUVEC)는 CHI3L1이 PPARδ에 의해 매개된 경로에 의해 NFκB의 인산화를 감소시킨 결과를 보여준다.
도 3a 및 3b는 CHI3L1이 세포의 부착에 미치는 효과를 나타낸다. 도 3a는 HUVEC에서 CHI3L1이 PPARδ를 통하여 접착분자 ICAM-1, VCAM-1 또는 E-셀렉틴의 단백질 발현을 감소시키는 결과를 보여주고, 도 3b는 세포 부착 실험을 통해 CHI3L1이 HUVEC과 THP-1의 세포 부착을 감소시키는 결과를 보여준다.
도 4a 내지 4d는 HUVEC(도 4a, 4c)과 THP-1 세포(도 4b, 4d)에서 CHI3L1이 PPARδ에 의해 매개된 경로에 의해 염증성 사이토카인 TNFα(도 4a, 4b) 또는 MCP-1(도 4c, 4d)의 발현을 감소시키는 결과를 보여준다.
도 5a 내지 5c는 CHI3L1이 소포체 스트레스와 세포사멸에 미치는 효과를 나타낸다. 도 5a는 HUVEC에서 MTT 실험을 통하여 LPS에 의해 감소된 세포의 생존율이 CHI3L1의 첨가로 회복되는 결과를 보여주고, 도 5b는 HUVEC에서 세포사멸의 마커인 카스파제 3(caspase 3)의 활성을 측정한 결과를 보여준다. 도 5c는 HUVEC에서 CHI3L1이 PPARδ에 의해 매개된 경로에 의해 소포체(ER) 스트레스의 마커인 IRE-1과 eIF2α의 인산화 및 CHOP의 발현을 억제하는 결과를 보여준다.
도 6a 내지 6d는 CHI3L1이 ORP150를 통하여 세포사멸에 미치는 효과를 나타낸다. 도 6a는 다양한 CHI3L1의 농도에서 다양한 샤페론(chaperone)들의 mRNA의 발현을 나타낸다. 도 6b는 CHI3L1이 PPARδ에 의해 매개된 경로에 의해 ORP150(oxygen-regulated protein 150)의 mRNA 발현을 증가시키는 결과를 보여준다. 도 6c는 HUVEC에서 MTT 실험을 통한 세포의 생존율을 측정한 결과이고, 도 6d에서는 세포사멸의 마커인 카스파제 3(caspase 3)의 활성을 측정함으로써 HUVEC에서 CHI3L1이 OPR150에 의해 매개된 경로에 의해 세포사멸을 억제하는 결과를 보여준다.

이하, 본 발명의 하나 이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

세포 배양

인간 제대정맥내피세포인 HUVEC(Human umbilical vein endothelial cells; ATCC, Manassas, VA, USA)을 0.2% 젤라틴이 코팅된 플레이트에서 혈청(low serum growth supplement; Invitrogen)이 첨가된 M200PRF배지(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)로 배양하였다. 인간 단핵구 THP-1(Korean Cell Line Bank, Seoul, Korea) 세포를 10% 소태아혈청(fetal bovine serum), 100 units/ml 페니실린 및 100 ㎍/ml의 스트렙토마이신(Invitrogen)이 보충된 RPMI 1640 배지에서 배양하였다. 배양은 5 % CO₂, 37 ℃의 조건에서 수행하였다. 세포들이 마이코플라스마(mycoplasma)에 감염되지 않았음을 확인하였다. 3 내지 4회 계대배양 한 후 실험에서 사용하였다.

시약 및 항체

재조합 인간 CHI3L1(Abcam, Cambridge, MA, USA)를 PBS(phosphate-buffered saline; Biosesang, Seoul, Korea)에 용해하여 사용하였다. Anti-phospho NFκBp65 (1:1,000)와 anti-NFκBp65(1:2,500) 항체는 Cell Signaling Technology(Beverly, MA, USA)에서 구입하여 사용하였다. anti-ICAM-1(1:1,000), anti-VCAM-1(1:1,000), anti-E-selectin(1:1,000), anti-phospho eIF2α(1:1,000), anti-eIF2α(1:1,000), anti-phospho IRE-1(1:1,000), anti-IRE-1(1:1,000), anti-CHOP(1:1,000), anti-PPARδ(1:1,000) 및 항-β액틴(1:5,000)은 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)에서 구입하여 사용하였다.

유전자 사일런싱(silencing)을 위한 siRNA 도입

PPARδ와 ORP150의 발현을 사일런싱 할 수 있는 siRNA(small interfering RNA) 올리고뉴클레이티드(20 nM)는 산타크루즈(Santa Cruz Biotechnology)에서 제작된 siRNA를 사용하였다. siRNA의 세포로의 도입은 리포펙타민 2000(Lipofectamine 2000; Invitrogen)을 이용하여, 제조사의 설명서에 따라 수행하였다.

통계학적 분석

실험 결과는 통계 프로그램(SPSS/PC statistical program (version 23 for Windows; SPSS, Chicago, IL, USA))을 이용하여 분석하였다. 모든 결과값은 적어도 3회 이상의 독립적인 반복실험을 통해 수득하였다. 통계학적인 분석을 위해서 스튜던트 t-테스트(Student's t-test) 또는 이원 변량 분석(two-way ANOVA)을 수행하였다.

첨부된 도면에서 모든 데이터는 3회의 독립적인 실험으로부터 평균값 ± 표준오차로 나타내었다. 도면에서 *, !, #의 표시들은 다음의 사항을 의미한다. 대조군과 비교하였을 때 ^*** 는 p<0.001, ^** 는 p<0.01, ^* 는 p<0.05를 의미하고, LPS에 CHI3L1이 첨가된 샘플과 비교하였을 때 ^### 는 p<0.001,^## 는 p<0.01, ^# 는 p<0.05를 나타낸다. 도 2에서는 100 ng/ml CHI3L1 이나 LPS가 첨가된 샘플 대비 ^!!! 는 p<0.001, ^!! 는 p<0.01, ^! 는 p<0.05를 의미한다. 도 3 내지 6에서는 LPS가 첨가된 샘플 대비 ^!!! 는 p<0.001, ^!! 는 p<0.01, ^! 는 p<0.05를 의미한다.

실시예 1. PPARδ의 발현과 NFĸB의 인산화에 대한 CHI3L1의 효과

<1-1> 웨스턴 블롯(Western blot) 분석

세포들을 수집하여 용해버퍼(PRO-PREP; Intron Biotechnology, Seoul Korea)를 60분 동안 4 ℃ 에서 처리하여 단백질을 수득한다. 단백질 샘플 30㎍을 10% SDS-PAGE에 사용하였고, 웨스턴 블롯 실험을 위하여 니트로셀룰로스 멤브레인(nitrocellulose membrane; Amersham Bioscience, Westborough, MA, USA)에 전이시켰다. 1차 항체와 반응시킨 뒤 HRP(horseradish peroxidase; Santa Cruz Biotechnology)와 결합된 2차 항체로 표지하였다. 신호는 ECL키트(enhanced chemiluminescence kits; Amersham Bioscience)를 사용하여 감지하였다. Image J(National Institute of Mental Health, Bethesda, MD, USA)를 밀도측정을 위하여 사용하였다.

<1-2> CHI3L1의 첨가시 NFĸB의 인산화와 PPARδ의 발현양 감소

동맥경화의 발달에 중요한 역할을 하는 PPARδ의 발현과 NFĸB의 인산화에 대해 CHI3L1이 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위해서 HUVEC과 THP-1세포에 LPS(200ng/ml)와 CHI3L1(0, 30 또는 100ng/ml)을 첨가하였다. 24시간 뒤에 웨스턴 블롯 실험을 수행하였다.

THP-1 세포와 HUVEC에서 CHI3L1의 첨가는 PPARδ 단백질의 발현양을 증가시켰다. 도 2a 및 2b는 각각 THF-1 세포 및 HUVEC에서의 결과를 도해한다.

THP-1 세포와 HUVEC에서 LPS(200ng/ml)에 의해서 NFĸB의 인산화는 증가하는데 이는 CHI3L1이 첨가 됨에 따라 감소되었다. LPS에 의해 유도된 NFĸB의 인산화는 CHI3L1의 양에 의존하여 억제된다. 그러나 siRNA에 의한 PPARδ의 발현 억제에 의해서 감소된 NFĸB의 인산화는 다시 회복되었다. 도 2c 및 2d는 각각 THP-1 세포 및 HUVEC에서의 결과를 도해한다.

이러한 결과는 CHI3L1이 PPARδ의 발현을 증가시키고 그에 의해서 NFĸB의 인산화를 억제하는 것을 보여준다.

실시예 2. 부착분자의 발현 및 단핵구(monocyte)와 HUVEC과의 부착에 대한 CHI3L1의 효과

본 실시예에서는 부착분자의 발현을 웨스턴 블롯(Western blot)을 통해 측정하고 세포 부착실험을 통해 CHI3L1이 단핵구와 혈관내피세포의 부착에 어떠한 영향을 미치는지 살펴보았다. 웨스턴 블롯은 상기 <1-1>에서 살펴본 것과 같은 방법으로 수행하였다.

<2-1> 세포 부착 실험

HUVEC은 LPS(100 ng/ml)와 CHI3L1(100 ng/ml)로 24시간 전처리 하고, 녹색 형광 염료인 BCECF/AM(2`,7`-bis(2-carboxyethyl)-5(6)-carboxyfluorescein acetoxymethylester)로 표지된 THP-1 세포와 함께 배양하였다. 상기 공배양을 1시간 수행한 후에 PBS 버퍼를 이용하여 세 차례 세척한 후 부착된 세포의 수를 측정하였다.

<2-2> CHI3L1의 첨가시 부착분자의 발현 감소 및 단핵구(monocyte)와 HUVEC의 부착 감소

무작위(scramble) siRNA 또는 PPARδ siRNA로 감염된 세포에 CHI3L1(100ng/ml) 또는 LPS(200ng/ml)을 첨가했다. 24시간 뒤에 HUVEC에서 부착분자의 단백질 발현 양을 측정하기 위하여 웨스턴 블롯 실험을 수행했다. 부착분자에는 ICAM-1(intracellular adhesion molecule 1), VCAM-1(vascular cell adhesion molecule 1), E-셀렉틴(E-selectin)이 있다.

LPS의 첨가에 의해 ICAM-1, VCAM-1, E-셀렉틴의 단백질의 양은 증가하고, LPS에 의해 증가된 것은 CHI3L1의 첨가에 의해서 다시 감소되었다(도 3a). 또한 LPS에 의해서 HUVEC과 THP-1 세포간의 부착이 증가하였고, LPS에 의해 유도된 세포의 부착은 CHI3L1에 의해 감소되었다(도 3b). siRNA에 의한 PPARδ의 억제에 의해서 CHI3L1의 효과는 상쇄되었다(도 3a, 3b).

부착분자의 발현이 증가되면 동맥경화를 유발한다고 알려져 있고(Gareus et al., Cell Metab 8:372-83.2008), 상기와 같은 결과는 본 발명의 CHI3L1은 PPARδ를 통해서 부착분자의 발현을 억제하는 것을 보여준다.

실시예 3. 염증성 사이토카인의 발현에 대한 CHI3L1의 효과

본 실시예에서는 CHI3L1에 의해서 염증성 사이토카인의 일종인 TNFα와 MCP-1이 억제되는지 여부를 측정하였다.

<3-1> ELISA 실험

세포로부터 분비되는 TNFα와 MCP-1는 상업화되어 있는 ELISA 키트(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)를 이용하였으며, 해당 키트에 기재된 매뉴얼을 방법을 기초로 수행하였다.

<3-2> CHI3L1의 첨가시 염증성 사이토카인의 억제

무작위(scramble) siRNA 또는 PPARδ siRNA로 감염된 세포에 CHI3L1(100ng/ml) 또는 LPS(200ng/ml)을 첨가했다. 24시간 뒤에 HUVEC과 THP-1 세포에서 ELISA 실험을 수행하였다. 염증성 사이토카인 TNFα와 MCP-1의 발현은 HUVEC과 THP-1 세포에서 CHI3L1의 첨가에 의해 감소되었다. 그러나 siRNA에 의한 PPARδ의 억제에 의해서 이러한 효과는 상쇄된다. 도 4a와 4c는 HUVEC에서의 결과를 나타내고 도 4b와 4d는 THP-1 세포에서의 결과를 나타낸다.

염증반응은 동맥경화의 발달에 핵심요건임이 알려져 있고 본 실시예는 CHI3L1이 염증성 사이토카인의 발현을 억제하는 것을 보여준다.

실시예 4. 소포체(ER) 스트레스와 세포사멸(apoptosis)에 대한 CHI3L1의 효과

본 실시예에서는 세포 생존율을 측정하고 세포사멸의 마커로 알려진 카스파제 3의 활성을 측정함으로써 CHI3L1이 세포사멸에 미치는 효과를 알아보고, 소포체(ER) 스트레스의 마커 단백질의 발현을 웨스턴 블롯 실험을 통해 측정함으로써 CHI3L1이 소포체 스트레스에 미치는 영향을 살펴보았다. 웨스턴 블롯은 상기 <1-1>에서 살펴본 것과 같은 방법으로 수행하였다.

<4-1> 세포 생존율 측정

세포의 생존율을 MTT 분석 방법을 이용하였다. MTT 용액을 멀티웰 플레이트에 존재하는 세포에 첨가하고 37 ℃ 온도에서 1시간 가량 배양하였다. 이후에 PBS 버퍼를 이용하여 세 차례 세척한 후 실험세포에 축적된 빨간 formazan을 DMSO에 용해하였다. 550nm에서 흡광도를 측정하였다.

<4-2> 카스파제3(caspase 3) 활성 분석

카스파제 3의 활성은 카스파제3 활성 분석 키트(Caspase 3 Colorimetric Assay kit; Abcam, Cambridge, MA)를 이용하여 측정하였으며, 측정 방법은 매뉴얼에 기재된 방법을 기초로 수행하였다.

<4-3> PPARδ 매개된 신호체계를 통한 CHI3L1에 의한 소포체(ER) 스트레스와 세포사멸(apoptosis)의 감소

무작위(scramble) siRNA 또는 PPARδ siRNA로 감염된 세포에 CHI3L1(100ng/ml) 또는 LPS(200ng/ml)을 첨가했다. 24시간 뒤에 상기의 방법에 의해 세포 생존율, 카스파제 3의 활성 및 소포체 스트레스 마커들의 발현을 측정했다.

도 5a는 세포 생존율을 측정한 결과를 나타내고, 도 5b는 카스파제 3의 활성을 측정한 결과를 보여준다. HUVEC에서 LPS의 첨가시에 세포 생존율이 감소하였다. CHI3L1을 첨가하면 LPS에 의해 유도된 세포 생존율의 감소는 다시 회복되었다(도 5a). 더욱이 세포사멸의 마커인 카스파제 3(caspase 3)의 활성은 LPS에 의해 증가되지만 CHI3L1이 첨가된 HUVEC에서 감소되었다(도 5b). siRNA에 의한 PPARδ의 억제에 의해서 이러한 CHI3L1의 효과는 상쇄된다(도 5a, 5b).

도 5c는 소포체 스트레스의 마커로 알려진 단백질들의 발현을 웨스턴 블롯을 통해 확인한 결과를 나타낸다. IRE-1, eIF2α, CHOP(CCAAT/enhancer-binding protein-homologous protein)은 소포체(ER) 스트레스의 마커로 알려져 있다. HUVEC에서 LPS에 의해서 IRE-1, eIF2α의 인산화 및 CHOP(CCAAT/enhancer-binding protein-homologous protein) 단백질의 발현이 증가한다. LPS에 의해 증가된 IRE-1, eIF2α의 인산화 및 CHOP의 발현은 CHI3L1에 의해 다시 감소 하였고, siRNA에 의한 PPARδ의 억제에 의해서 이러한 효과는 상쇄된다(도 5c).

이전 연구들은 소포체 스트레스가 내피 기능장애등에 중요한 역할을 한다는 것을 시사했고(Myoishi et al., Circulation 116:1226-33, 2007), 소포체 스트레스에 의해 유도된 내피의 세포사멸은 죽상혈전증 매개 메커니즘을 촉진시킨다고 알려져 있다(Civelek et al., Circ Res 105:453-61, 2009). 본 실시예는 CHI3L1이 소포체 스트레스 및 세포사멸을 억제하는 것을 보여준다.

실시예 5. ORP150에 의해 매개된 CHI3L1의 세포사멸 감소 효과

본 실시예에서는 CHI3L1이 ORP150의 mRNA 발현에 미치는 영향을 살펴보고 PPARδ와 ORP150에 의해 매개된 경로에 의해서 CHI3L1이 세포사멸을 감소시키는지 여부를 확인하였다. 세포의 생존율을 측정하는 실험과 세포사멸의 마커인 카스파제 3의 활성을 측정하는 실험은 상기 <4-1>, <4-2>에서 살펴본 것과 같은 방법으로 수행하였다.

<5-1> RNA 추출 및 분석을 위한 real-time PCR

트라이 졸(TRIzol reagent; Invitrogen, Carlsbad, CA)을 이용하여 total RNA를 추출하였다. 유전자 발현은 TaqMan 5´nuclease assay을 사용하여 real-time PCR 기기(Applied Biosystems 7000 sequence detection system; Foster City, CA, USA)로 측정하였다. qPCR은 cDNA와 2Х TaqMan Master Mix, 20Х premade TaqMan gene expression assays(Applied Biosystems)을 사용하여 수행하였다. 95 ℃ 에서 10분 후에 95 ℃ 15초 및 60 ℃ 1분으로 이루어진 사이클을 40회 수행하였다. 특정 유전자를 증폭하기 위한 프라이머로는 human ORP150 (Hs00197328_m1), GRP78 (Hs00946084_g1), HSP47 (Hs01060397_g1), Calnexin (Hs01558409_m1), HSP70 (Hs00359163_s1) 등을 사용하였다. 내재적으로 발현되는 대조구 유전자(β-actin)을 증폭하기 위해서는 다음의 프라이머 세트(5'-CGATGCTCCCCGGGCTGTAT-3' and 5'-TGGGGTACTTCAGGGTCAGG-3')를 이용하였다.

<5-2> PPARδ 매개된 ORP150을 통한 경로에 의한 CHI3L1의 세포사멸 감소 효과

PPARδ에 의해 매개된 CHI3L1의 메커니즘을 설명하기 위하여 HUVEC에서 다양한 샤페론의 발현에 대한 CHI3L1의 영향을 실험했다. 세포를 다양한 농도의 CHI3L1(0, 30 또는 100ng/ml)으로 첨가 하였다. 24시간 뒤에 qPCR을 수행하였다.

CHI3L1의 첨가는 대부분의 샤페론들의 mRNA 발현에 영향을 미치치 않았으나 ORP150의 mRNA 발현을 명확하게 증가시켰다(도 6a). 무작위(scramble) siRNA 또는 PPARδ siRNA로 감염된 세포에 CHI3L1(100ng/ml)을 첨가했다. 24시간 뒤에 HUVEC에서 qPCR을 통해 ORP150 mRNA 발현을 측정하였다. CHI3L1에 의해 ORP150 mRNA발현은 증가하나 siRNA에 의한 PPARδ의 억제에 의해서 ORP150의 mRNA에대한 CHI3L1의 효과는 상쇄된다(도 6b).

MTT 실험을 통해 세포 생존율을 측정하였고, 카스파제 3의 활성도 측정하였다. 도 6c는 세포 생존율의 결과를 보여주고 도 6d는 카스파제 3의 활성에 대한 결과를 보여준다. 실시예 4에서와 같이 LPS는 세포 생존율을 감소시키고 카스파제 3의 활성을 증가시키지만 CHI3L1은 LPS에 의해 감소된 세포 생존율을 회복시키고, 카스파제 3의 활성을 감소시킨다. 하지만 siRNA에 의한 ORP150의 억제는 세포사멸에 대한 CHI3L1의 보호적인 효과를 상쇄시킨다(도 6c, 6d).

본 실시예는 CHI3L1가 샤페론인 ORP150의 발현을 증가시키는 것을 통해서 세포사멸을 억제하는 효과를 가지는 것을 보여준다.

Claims

CHI3L1(Chitinase 3-like protein 1)을 유효성분으로 포함하는 동맥경화 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 동맥경화는 죽상동맥경화증(atherosclerosis)인 것인 동맥경화 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 조성물은 PPARδ(peroxisome proliferator-activated receptor delta)의 발현을 증가시키는 것인 약학 조성물.