KR101974274B1 - Biomarker for diagnosis of moyamoya disease - Google Patents
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Abstract
본 발명은, 카베올린-1(caveolin-1)을 포함하는, 모야모야병의 진단용 바이오마커 조성물, 진단용 조성물, 진단 키트, 진단 정보제공방법, 및 치료제 스크리닝 방법에 관한 것이다. 본 발명에 의할 경우, 유사 뇌혈관협착 질환인 동맥경화증과 구별되어 모야모야병에 특이적인 치료가 가능하므로, 불필요하거나 부작용이 동반될 수 있는 위험요소를 회피할 수 있는 바, 효과적인 모야모야병 치료요법에 적용할 수 있다.The present invention relates to a biomarker composition for diagnostic use of moyamoya disease comprising caveolin-1, a diagnostic composition, a diagnostic kit, a diagnostic information providing method, and a therapeutic agent screening method. According to the present invention, since it is possible to treat moyamoya disease distinctively from atherosclerosis, which is a pseudoaneurysmal artery stenosis disease, it is possible to avoid the risk factors that unnecessary or side effects may accompany, It can be applied to therapy.
Description
본 발명은, 카베올린-1(caveolin-1)을 포함하는, 모야모야병의 진단용 바이오마커 조성물, 진단용 조성물, 진단 키트, 진단 정보제공방법, 및 치료제 스크리닝 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a biomarker composition for diagnostic use of moyamoya disease comprising caveolin-1, a diagnostic composition, a diagnostic kit, a diagnostic information providing method, and a therapeutic agent screening method.
모야모야병(moyamoya disease)은 원인미상의 뇌혈관질환으로서, 대뇌로 들어가는 양측 내경동맥의 말단부 및 주요 분지(중대뇌동맥, 전대뇌동맥)의 점진적인 협착과 좁아진 동맥의 인접부위인 뇌기저부에서 가느다란 비정상적인 혈관들이 자라나와 모여 있는 혈관망(기저 측부순환 혈관; 모야모야 혈관)이 뇌혈관 조영상에서 나타나는 것을 특징으로 한다(도 1 참조). 주로, 한국을 비롯하여, 중국, 일본 등 극동아시아에서 호발하는 비교적 드문 희귀질환으로서, 소아의 경우 반복적인 일과성 뇌허혈 발작의 형태로 나타나고, 성인에서는 뇌출혈이 흔히 나타난다.Moyamoya disease is a noncancerous cerebrovascular disease that is characterized by gradual narrowing of the distal end of the carotid arteries in both sides and the major branches (middle cerebral artery, anterior cerebral artery) into the cerebrum, (Circulatory blood vessels of the basal side; vein of the fascia) are gathered in the blood vessels, and blood vessels are gathered and gathered (Fig. 1). It is a rare disease rarely found in Korea, China, Japan, and Far East Asia. In children, it occurs in the form of repeated transient ischemic attacks. In adults, cerebral hemorrhage is common.
모야모야병의 진단과 관련하여서는, 그 발병원인이 밝혀져 있지 않기 때문에 현재로서는 침습적인 혈관촬영술을 통한 진단이 유일한 방법이다. 그러나 혈관촬영상 특징적인 모야모야 혈관(moyamoya vessel)은 특이적인 소견이지만, 모든 환자에서 관찰되는 것은 아니며, 특히 성인 모야모야병에서는 소아와 달리 이러한 모야모야 혈관이 관찰되지 않는 경우가 흔하기 때문에 동맥경화증에 의한 협착과 감별이 어려운 경우가 많다. 또한, 모야모야 혈관은 질병의 경과에 따라 초기에는 관찰되지 않는 경우가 많아, 순차적인 혈관촬영술이 필요할 수 있다.With regard to the diagnosis of Moyamoya disease, the cause of the disease is not known, so the diagnosis through invasive angiography is the only method currently available. However, the moyamoya vessel characteristic of angiography is a specific finding, but it is not observed in all patients. Especially in adult moyamoya disease, unlike pediatric patients, it is common that no such moyamoya vessels are observed. It is difficult to distinguish between stenosis and differentiation. In addition, it is often the case that moyamoya blood vessels are not observed initially depending on the progression of the disease, so sequential angiography may be necessary.
모야모야병을 동맥경화증과 같은 혈관협착을 일으키는 다른 질환과 감별하여 진단하는 것은 환자의 치료에 있어서 매우 중요하다. 즉, 동맥경화증의 경우 항혈소판제인 스타틴(statin) 사용이 협착의 진행이나 뇌경색의 발병을 효과적으로 예방하며 스텐트 삽입술이 도움이 되지만, 모야모야병의 경우 약물적인 치료가 질병의 경과에 도움이 되지 않으며, 스텐트 삽입술 후에도 대부분 스텐트의 폐색이 일어나기 때문이다. 반대로, 모야모야병 치료법에 있어서 현재까지 알려진 혈관문합술(bypass surgery)은 동맥경화증으로 인한 폐색 환자에게는 권고되지 않는 실정이다.Diagnosing Moyamoya disease from other diseases that cause vascular stenosis such as arteriosclerosis is very important in the treatment of patients. In the case of arteriosclerosis, use of the antiplatelet agent statin effectively prevents the progression of stenosis or cerebral infarction, and stenting is helpful. However, pharmacologic treatment of moyamoya disease is not helpful in the course of the disease , And most of the stent occlusion occurs after stenting. Conversely, known bypass surgery in the treatment of moyamoya disease is not recommended for occlusive patients due to arteriosclerosis.
한편, 포낭(Caveolae)은 세포내 이입(endocytosis)에 있어 중요한 기능을 하는 50-100nm 크기의 플라스크형 홈으로서 내피세포(endothelial cell)에 풍부하며, 내피세포의 소낭성교류(vesicular trafficking)와 신호전달에 있어 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다(도 2 참조).On the other hand, Caveolae is a 50-100 nm flask-like groove that plays an important role in endocytosis. It is abundant in endothelial cells, and vesicular trafficking and signaling of endothelial cells It is known to play an important role in delivery (see FIG. 2).
이때, 포낭(Caveolae)을 형성/유지하는데 필수적인 막단백질인 카베올린-1(caveolin-1)은 단순히 포낭 스캐폴드 단백질로서의 기능을 넘어, 골수로부터 혈관전구세포의 동원에 있어 중요한 역할을 할 뿐만 아니라, 종양 등 질환의 발병에 관여한다는 보고가 있으나(Frank PG 등, Arterioscler Thromb Vasc Biol 2003;23:1161-8), 아직까지 모야모야병과의 관련성에 대하여는 보고된 바는 없다.At this time, caveolin-1, a membrane protein essential for formation / maintenance of caveolae, not only plays a role as a cyst scaffold protein but also plays an important role in the mobilization of vascular progenitor cells from bone marrow , And tumors (Frank PG et al., Arterioscler Thromb Vasc Biol 2003; 23: 1161-8). However, no association has been reported with moyamoya disease.
이에, 본 발명자들은 정상인 및 동맥경화증 환자와 비교하여, 모야모야병 환자의 혈액 시료에서는 카베올린-1의 수준이 특이적으로 감소한다는 사실을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.Thus, the present inventors have completed the present invention by confirming that the level of caveolin-1 specifically decreases in blood samples of patients with moyamoya disease as compared with patients with normal human and atherosclerosis.
따라서, 본 발명의 목적은, 카베올린-1(caveolin-1)을 포함하는, 모야모야병의 진단용 바이오마커 조성물, 진단용 조성물, 진단 키트, 진단 정보제공방법, 및 치료제 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.Accordingly, an object of the present invention is to provide a biomarker composition for diagnostic use of Moyamoya disease, a diagnostic composition, a diagnostic kit, a diagnostic information providing method, and a therapeutic agent screening method, including caveolin-1.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.However, the technical problem to be solved by the present invention is not limited to the above-mentioned problems, and other matters not mentioned can be clearly understood by those skilled in the art from the following description.
본 발명은 카베올린-1(caveolin-1)을 포함하는, 모야모야병의 진단용 바이오마커 조성물을 제공한다.The present invention provides a diagnostic biomarker composition for Moyamoya disease comprising caveolin-1.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 카베올린-1은 모야모야병 개체에서 mRNA 또는 단백질 수준이 감소되어 있는 것을 특징으로 한다.In one embodiment of the present invention, the caveolin-1 is characterized in that the level of mRNA or protein is reduced in a moyamoya disease subject.
본 발명은 카베올린-1(caveolin-1) mRNA 또는 단백질의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는, 모야모야병의 진단용 조성물을 제공한다.The present invention provides a diagnostic composition for Moyamoya disease, which comprises an agent for measuring the level of expression of caveolin-1 mRNA or protein.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 mRNA 발현수준을 측정하는 제제는 카베올린-1 유전자에 특이적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브를 포함하는 것을 특징으로 한다.In one embodiment of the present invention, the agent for measuring the mRNA expression level is characterized in that it comprises an antisense oligonucleotide that specifically binds to the caveolin-1 gene, a primer or a probe.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 단백질 발현수준을 측정하는 제제는 카베올린-1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 것을 특징으로 한다.In another embodiment of the present invention, the agent for measuring the protein expression level is characterized in that it comprises an antibody that specifically binds to the caveolin-1 protein.
본 발명은 상기 진단용 조성물을 포함하는, 모야모야병의 진단용 키트를 제공한다.The present invention provides a diagnostic kit for a moyamoya disease comprising the diagnostic composition.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 키트는 DNA 마이크로어레이 칩 또는 단백질 칩인 것을 특징으로 한다.In one embodiment of the present invention, the kit is a DNA microarray chip or a protein chip.
본 발명은 개체의 시료로부터 카베올린-1(caveolin-1) mRNA 또는 단백질의 발현수준을측정하는 단계를 포함하는, 모야모야병 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.The present invention provides a method for providing information for the diagnosis of moyamoya disease, comprising the step of measuring the level of expression of caveolin-1 mRNA or protein from a sample of an individual.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 개체의 시료로부터 카베올린-1 발현수준을 측정한 결과, 정상 대조군보다 감소한 경우 모야모야병이라고 판정하는 단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 한다.In one embodiment of the present invention, the method further comprises the step of determining the moyamoya disease when the level of caveolin-1 expression is measured from the sample of the individual, and the moyamoya disease is decreased as compared with the normal control.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 카베올린-1의 mRNA 발현수준을 측정하는 단계는 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Realtime RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 또는 노던 블랏팅(Northern blotting)을 이용하는 것을 특징으로 한다.In another embodiment of the present invention, the step of measuring the level of mRNA expression of caveolin-1 comprises the steps of RT-PCR, competitive RT-PCR, real-time reverse transcription polymerase chain reaction (Realtime RT-PCR), RNase protection assay (RPA), or Northern blotting.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 카베올린-1의 단백질 발현수준을 측정하는 단계는 항원-항체 반응을 이용하는 것을 특징으로 한다.In another embodiment of the present invention, the step of measuring the protein expression level of caveolin-1 is characterized by using an antigen-antibody reaction.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 항원-항체 반응은 ELISA(enzyme linked immunosorbent asay), 웨스턴 블랏, 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사면역확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation assay), 보체고정분석법(Complement Fixation Assay), FACS(Fluorescence activated cell sorter) 또는 마이크로어레이(microarray) 분석법으로 수행하는 것임을 특징으로 한다.In another embodiment of the present invention, the antigen-antibody reaction may be performed using an enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), Western blot, radioimmunoassay (RIA), radioimmunodiffusion, Ouchterlony, Immunoprecipitation assays, complement fixation assays, fluorescence activated cell sorters (FACS) or microarray assays, as described in the following examples: .
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 시료는 혈액, 혈청, 혈장, 타액, 림프액 또는 소변인 것을 특징으로 한다.In another embodiment of the present invention, the sample is blood, serum, plasma, saliva, lymph or urine.
본 발명은 (a) 개체로부터 얻어진 시료에 후보 약물을 처리하는 단계; 및 (b) 카베올린-1(caveolin-1)의 발현 프로파일을 검출하는 단계를 포함하는, 모야모야병 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.(A) treating a candidate drug with a sample obtained from the subject; And (b) detecting an expression profile of caveolin-1. The present invention also provides a method for screening a therapeutic agent for moyamoza disease.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 시료는 혈액, 혈청, 혈장, 타액, 림프액 또는 소변인인 것을 특징으로 한다.In one embodiment of the present invention, the sample is blood, serum, plasma, saliva, lymph or urine.
본 발명의 모야모야병 진단 방법에 의할 경우, 유사 뇌혈관협착 질환인 동맥경화증과 구별되어 모야모야병에 특이적인 치료가 가능하므로, 불필요하거나 부작용이 동반될 수 있는 위험요소를 회피할 수 있는바, 효과적인 모야모야병 치료요법에 적용할 수 있다.According to the method for diagnosing a moyamoya disease according to the present invention, since it is possible to treat moyamoya disease distinctively from atherosclerosis, which is a similar cerebrovascular stenosis disease, it is possible to avoid risk factors that may be unnecessary or have side effects Bar, can be applied to effective treatment of moyamoya disease.
또한, 본 발명은 모야모야병 환자의 혈액 시료에서 특이적으로 변화하는 카베올린-1 양을 측정하여 진단하는 방법으로서, 간편하고 비침습적이며 정확도가 높은 장점을 가지고 있다.The present invention also provides a simple, noninvasive, and accurate method for diagnosing and diagnosing the amount of caveolin-1 that specifically changes in blood samples of patients with moyamoya disease.
도 1은 정상인과 모야모야병 환자의 뇌혈관 조영 사진이다.
도 2는 포낭(Caveolae)과 카베올린-1(caveolin-1)을 나타내는 사진 및 모식도이다.
도 3은 RNF213 변이체로 검증된 모야모야병 환자(MMD)에서 카베올린-1 혈청 수준이 정상군(Control)과 동맥경화성 협착 환자군(ICAS)에 비해 감소되어 있음을 나타내는 결과이다.
도 4는 혈관촬영술로 진단한 모야모야병 환자에서 카베올린-1이 바이오마커로서 유용하다는 것을 보여주는 ROC curve이다.
도 5는 유전적으로 진단한 모야모야병 환자에서 카베올린-1이 바이오마커로서 유용하다는 것을 보여주는 ROC curve이다.
도 6a는 모야모야병 발병에 있어서 카베올린-1과, 모야모야병 관련 유전형, 혈관생성 관련 성장인자 등과의 관련성을 분석한 path analysis 결과이다.
도 6b는 상기 도 6a의 결과를 표로 정리한 것이다.
도 7은 카베올린-1의 발현을 일부 억제한 혈관을 구성하는 세포(혈관내피세포, 평활근육세포)에서 이동능을 관찰한 결과이다.
도 8은 카베올린-1의 발현을 일부 억제한 혈관내피세포에서 신생혈관생성 능력에 대해 시험한 결과이다.
도 9는 카베올린-1의 발현을 일부 억제한 혈관을 구성하는 세포(혈관내피세포, 평활근육세포)에서 Vessel maturation 관련된 인자(PDGF 및 PDGF receptor)의 변화를 검사한 결과이다.1 is a cerebral angiogram of a normal human and Moyamoya disease patient.
2 is a photograph and a schematic diagram showing caveolae and caveolin-1.
FIG. 3 shows that the level of caveolin-1 serum was decreased in patients with Moyamoya disease (MMD) as confirmed by the RNF213 mutant compared to the control group and the ICAS group.
Figure 4 is an ROC curve showing that caveolin-1 is useful as a biomarker in patients with Moyamoya disease diagnosed by angiography.
Figure 5 is an ROC curve showing that caveolin-1 is useful as a biomarker in genetically diagnosed patients with Moyamoya disease.
6A is a path analysis result of analysis of the relationship between caveolin-1 and Moyamoya disease-related genotypes and angiogenesis-related growth factors in the occurrence of Moyamoya disease.
FIG. 6B is a table summarizing the results of FIG. 6A.
FIG. 7 shows the results of observing migration ability in cells (vascular endothelial cells, smooth muscle cells) constituting blood vessels partially inhibiting the expression of caveolin-1.
FIG. 8 shows the results of testing for angiogenesis ability in vascular endothelial cells partially inhibiting the expression of caveolin-1.
FIG. 9 shows the results of examining changes in Vessel maturation-related factors (PDGF and PDGF receptor) in cells (vascular endothelial cells, smooth muscle cells) constituting blood vessels partially inhibiting the expression of caveolin-1.
본 발명은 카베올린-1이 모야모야병(MMD) 환자의 시료에서 특이적으로 감소한다는 발견에 기초한 것으로, 상기 카베올린-1을 바이오 마커로 이용하여 모야모야병을 진단하는 기술을 제공한다.The present invention is based on the finding that caveolin-1 is specifically reduced in a sample of patients with moyamoya disease (MMD), and provides a technique for diagnosing moyamoya disease using the caveolin-1 as a biomarker.
본 발명에서는, 모야모야병 환자(MMD), 두개내 동맥경화성 협착 환자(ICAS; intracranial atherosclerotic stroke), 정상군(control)에서, 혈청을 채취하여 다양한 단백질의 발현 수준을 측정하여 비교평가함으로서, 동맥경화증과 구별되는 모야모야병만의 특이적인 바이오마커인 카베올린-1을 선정하였다.In the present invention, sera are collected from patients with moyamoya disease (MMD), intracranial atherosclerotic stroke (ICAS), and normal control (control), and the level of expression of various proteins is measured and compared. We selected caveolin-1, a specific biomarker of moyamoya disease, which is distinct from sclerosis.
또한, 종래 모야모야병 환자 일부가 가족력(유전력)을 보였기 때문에, 모야모야병과 관련된 유전자로 밝혀진 RNF213(Ring finger 213)(GenBank accession number NM_001256071.1) 변이군과 카베올린-1 수준과의 관련성을 조사하여 유전적 소인과의 상관관계를 평가하였다.In addition, the relevance of the conventional moyamoya disease because it seemed to have some family history (heritability), moyamoya RNF213 (Ring finger 213) (GenBank accession number NM_001256071.1) identified a gene associated with disease and mutation group and caveolin levels -1 And correlated with genetic susceptibility.
또한, caveolin-1 수준 변화가 모야모야병의 발병에 있어, angiogenesis 인자(VEGF, VEGFR2, endostatin), endothelial dysfunction 인자(ADMA, NO, nitrite, nitrate) 들의 작용을 매개하는지 평가하기 위하여, path analysis를 수행하였다.In order to evaluate whether caveolin-1 level mediates the action of angiogenesis factors (VEGF, VEGFR2, endostatin) and endothelial dysfunction factors (ADMA, NO, nitrite and nitrate) in the pathogenesis of Moyamoya disease, Respectively.
더욱이, caveolin-1의 수준 변화가 모야모야병의 비정상적인 혈관 생성을 형성하는데 영향을 주는지 평가하기 위하여, 세포수준에서 caveolin-1을 일부 억제 후 migration test와 tubing formation test를 수행하였고, Vessel maturation에 관련된 인자(PDGF, PDGF receptor)의 발현을 조사하였다.In addition, migration and tubing formation tests were performed after partial inhibition of caveolin-1 at the cellular level in order to evaluate whether the level change of caveolin-1 affects the formation of abnormal angiogenesis of Moyamoya disease. (PDGF, PDGF receptor) were examined.
본 발명에서, 카베올린-1 단백질은 공지된 데이터베이스에서 그 서열 정보를 확인할 수 있다. 예를 들어, 인간 카베올린-1 단백질의 아미노산 서열은 Genbank accession number Q03135에서 확인할 수 있다. 이러한 카베올린-1은 모야모야병 환자군의 시료에서 특이적인/유의성 있는 발현 변화를 나타내기 때문에 모야모야병을 진단하는 진단 마커로 활용할 수 있다.In the present invention, the caveolin-1 protein can identify its sequence information in a known database. For example, the amino acid sequence of human caveolin-1 protein can be found in Genbank accession number Q03135. Since caveolin-1 exhibits a specific / significant expression change in samples of patients with Moyamoya disease, it can be used as a diagnostic marker for diagnosing moyamoya disease.
본 발명에서 용어, "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 모야모야병 발병 여부를 확인하거나, 나아가 질환의 진행 여부 또는 심화 여부를 확인하는 것이다.As used herein, the term " diagnosis " means identifying the presence or characteristic of a pathological condition. For the purpose of the present invention, the diagnosis is to confirm whether or not the disease has developed, and furthermore, whether the disease progresses or not.
본 발명에서 "마커"란 모야모야병을 진단할 수 있는 물질로, 모야모야병과 관련된 폴리펩타이드, 핵산 (예: mRNA 등), 지질, 당지질, 당단백질, 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다. 본 발명의 목적상, 마커는 카베올린-1으로서 모야모야병 환자에서 현저하게 발현이 감소하는 카베올린-1 mRNA 또는 단백질이다.In the present invention, the term " marker " is a substance capable of diagnosing Moyamoya disease, and includes polypeptides, nucleic acids (e.g., mRNA), lipids, glycolipids, glycoproteins, sugars (monosaccharides, disaccharides, oligosaccharides, etc.) And the like. For the purposes of the present invention, the marker is caveolin-1 mRNA or protein which is markedly decreased in Moyamoya disease patients as caveolin-1.
또한, 본 발명은 카베올린-1(caveolin-1) mRNA 또는 단백질의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는, 모야모야병의 진단용 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a diagnostic composition for Moyamoya disease, comprising an agent for measuring the level of expression of caveolin-1 mRNA or protein.
본 발명에서 mRNA 발현 수준 측정이란, 모야모야병을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 모야모야병 관련 유전자 caveolin-1의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, mRNA의 양을 측정하여 이루어진다. 이를 위한 분석 방법으로는 예를 들어, 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Realtime RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting), DNA 칩 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서 유전자의 mRNA 수준을 측정하는 제제는 바람직하게는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머 쌍 또는 프로브이다.In the present invention, the mRNA expression level is measured by measuring the amount of mRNA in the biological sample to determine the presence and expression level of moyamoya disease-associated gene caveolin-1 in order to diagnose moyamoya disease. For example, RT-PCR, competitive RT-PCR, real-time RT-PCR, and RNase protection assay (RPA). RNase protection assay, Northern blotting, DNA chip, and the like. The agent for measuring the mRNA level of a gene in the present invention is preferably an antisense oligonucleotide, a primer pair or a probe.
본 발명에서 "안티센스"는 안티센스 올리고머가 왓슨-크릭 염기쌍 형성에 의해 RNA 내의 표적 서열과 혼성화되어, 표적서열 내에서, 전형적으로 mRNA와 RNA:올리고머 헤테로이중체의 형성을 허용하는, 뉴클레오티드염기의 서열 및 서브 유닛간 백본을 갖는 올리고머를 지칭한다. 올리고머는 표적 서열에 대한 정확한 서열 상보성 또는 근사 상보성을 가질 수 있다. 이 안티센스 올리고머는 mRNA의 번역을 차단 또는 저해하고 mRNA의 스플라이스 변이체를 생산하는 mRNA의 프로세싱 과정을 변화시킬 수 있다.In the present invention, " antisense " means that the antisense oligomer is hybridized with the target sequence in the RNA by Watson-Crick base pairing to form the sequence of the nucleotide base, typically within the target sequence, And an oligomer having a backbone between subunits. Oligomers may have an exact sequence complement or approximate complementarity to the target sequence. This antisense oligomer can alter the processing of mRNA that blocks or inhibits translation of mRNA and produces splice variants of mRNA.
본 발명에서 "프라이머"는 짧은 자유 3말단 수산화기를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다.&Quot; Primer " in the present invention means a short nucleic acid sequence capable of forming a base pair with a complementary template with a short free 3-terminal hydroxyl group and serving as a starting point for template strand copying. The primer can initiate DNA synthesis in the presence of reagents and four different nucleoside triphosphates for polymerization reactions (i. E., DNA polymerase or reverse transcriptase) at appropriate buffer solutions and temperatures.
본 발명에서 "프로브"란 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 표지(Labelling)되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고 뉴클레오티드 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.The term " probe " in the present invention means a nucleic acid fragment such as RNA or DNA corresponding to a few nucleotides or hundreds of nucleotides that can specifically bind to mRNA and is labeled so that presence or absence of a specific mRNA Can be confirmed. The probe can be produced in the form of an oligonucleotide probe, a single stranded DNA probe, a double stranded DNA probe, or an RNA probe. Selection of suitable probes and hybridization conditions can be modified based on what is known in the art.
본 발명의 모야모야병 관련 caveolin-1의 핵산 서열은 유전자 은행에 Genbank accession number NC_000007.14, NC_018918.2, NT_007933.16로 등록되어 있으므로, 당업자는 상기 서열을 바탕으로 이들 유전자의 특정 영역을 특이적으로 증폭하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머쌍 또는 프로브를 디자인할 수 있다. 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브는 포스포르 아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다.Since the nucleic acid sequence of caveolin-1 related to Mojamyya disease of the present invention is registered in the gene bank as Genbank accession numbers NC_000007.14, NC_018918.2, and NT_007933.16, a person skilled in the art will recognize specific regions of these genes as specific Antisense oligonucleotides, primer pairs or probes can be designed which amplify homologously. The antisense oligonucleotides, primers or probes of the present invention can be chemically synthesized using the phosphoramidite solid support method, or other well-known methods.
본 발명에서 "단백질 발현 수준 측정"이란, 모야모야병을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 발현된 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 단백질의 양을 측정하여 이루어진다. 이를 위한 분석 방법으로는 웨스턴 블랏, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS), 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서 단백질 발현 수준을 측정하는 제제는 바람직하게는 항체이다.In the present invention, " measurement of protein expression level " is a process of determining the presence and expression level of a protein expressed in a biological sample to diagnose moyamoya disease, and measuring the amount of protein. Examples of the assay methods include Western blotting, enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), radioimmunoassay (RIA), radioimmunodiffusion, Ouchterlony immunodiffusion, rocket immunoelectrophoresis But are not limited to, tissue immuno staining, immunoprecipitation assays, complement fixation assays, fluorescence activated cell sorters (FACS), protein chips, and the like. The agent for measuring the protein expression level in the present invention is preferably an antibody.
여기에서, "항체"란 당해 분야에서 공지된 용어로서 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 본 발명의 카베올린-1 마커에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 본 발명의 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함될 수 있다. 나아가, 본 발명의 항체에는 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체 등의 특수항체도 포함된다. 본 발명에 사용되는 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며 Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.As used herein, the term " antibody " means a specific protein molecule that is indicated for an antigenic site as a term known in the art. For the purpose of the present invention, the antibody refers to an antibody that specifically binds to the caveolin-1 marker of the present invention, and the form of the antibody of the present invention is not particularly limited, and a polyclonal antibody, a monoclonal antibody, Some of them may be included in the antibody of the present invention as long as they have binding properties. Furthermore, the antibodies of the present invention include special antibodies such as chimeric antibodies, humanized antibodies, human antibodies and the like. Antibodies used in the present invention include functional fragments of antibody molecules as well as complete forms having two full-length light chains and two full-length heavy chains. A functional fragment of an antibody molecule refers to a fragment having at least an antigen-binding function, and includes Fab, F (ab ') 2, F (ab') 2 and Fv.
또한, 본 발명은 상기 진단용 조성물을 포함하는, 모야모야병의 진단용 키트를 제공한다. 본 발명의 키트는, 카베올린-1의 정량 수단(프라이머, 프로브, 항체 등) 뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치가 더 포함될 수 있으며, 바람직하게는 RT-PCR 키트, 마이크로어레이 칩 키트, DNA 칩 키트, 단백질 칩 키트, ELISA 키트의 형태일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.In addition, the present invention provides a diagnostic kit for a moyamoya disease comprising the diagnostic composition. The kit of the present invention may further comprise one or more other component compositions, solutions or devices suitable for assaying caveolin-1 as well as quantification means (primers, probes, antibodies, etc.) A kit, a microarray chip kit, a DNA chip kit, a protein chip kit, an ELISA kit, and the like.
예를 들어, RT-PCR 키트는 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), Taq-중합효소 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-물(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. ELISA 키트의 경우 항원-항체 복합체의 면역학적 검출을 위하여 기질, 적당한 완충용액, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 및 발색 기질 등을 포함할 수 있다.For example, RT-PCR kits can be used in addition to each pair of primers specific for the marker gene, as well as enzymes such as test tubes or other appropriate containers, reaction buffers, deoxynucleotides (dNTPs), Taq-polymerase and reverse transcriptase, DNase, RNase inhibitors, DEPC-water, sterile water, and the like. In the case of an ELISA kit, it may include a substrate, a suitable buffer solution, a secondary antibody labeled with a chromogenic or fluorescent substance, and a chromogenic substrate for immunological detection of the antigen-antibody complex.
또한, 본 발명은 개체의 시료로부터 카베올린-1(caveolin-1) mRNA 또는 단백질의 발현수준을 측정하는 단계를 포함하는, 모야모야병 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다. 본 발명에서는, 상기 개체의 시료로부터 카베올린-1의 발현수준을 측정한 결과, 정상 대조군보다 감소한 경우 모야모야병이라고 판정하는 단계를 더욱 포함할 수 있다.The present invention also provides a method for providing information for the diagnosis of moyamoya disease, comprising the step of measuring the level of expression of caveolin-1 mRNA or protein from a sample of an individual. In the present invention, it is possible to further include a step of determining the degree of moyamoya disease when the level of expression of caveolin-1 is measured from the sample of the individual, and the moyamoya disease is reduced as compared with the normal control group.
본 발명에서 mRNA 발현 수준을 측정하는 방법은 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Realtime RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting), DNA 칩 등이 있으나 이에 제한되지 않는다.Methods for measuring mRNA expression levels in the present invention include RT-PCR, competitive RT-PCR, real-time RT-PCR, RNase protection assay (RPA RNase protection assay, Northern blotting, DNA chip, and the like.
본 발명에서 단백질의 발현 수준을 측정하는 방법은 웨스턴 블랏, ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS), 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나 이에 제한되지 않는다.Methods for measuring the expression level of a protein in the present invention include Western blotting, enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), radioimmunoassay (RIA), radioimmunodiffusion, Ouchterlony immunodiffusion, Immunoprecipitation Assay, Complement Fixation Assay, Fluorescence Activated Cell Sorter (FACS), and Protein Chip. However, there are limitations on the use of immunoassays, It does not.
또한, 본 발명은 (a) 개체로부터 얻어진 시료에 후보 약물을 처리하는 단계; 및 (b) 카베올린-1(caveolin-1)의 발현 프로파일을 검출하는 단계를 포함하는, 모야모야병 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
구체적으로, 모야모야병 치료 후보 약물의 존재 및 부재 하에서 카베올린-1(caveolin-1)의 발현의 증가 또는 감소를 비교하는 방법으로 모야모야병 치료제를 스크리닝하는데 유용하게 사용할 수 있고, 카베올린-1(caveolin-1)의 발현을 증가시키는 후보 약물을 모야모야병 치료제로 선택할 수 있다.The present invention also provides a method for preparing a pharmaceutical composition comprising the steps of: (a) treating a candidate drug from a subject; And (b) detecting an expression profile of caveolin-1. The present invention also provides a method for screening a therapeutic agent for moyamoza disease.
Specifically, a method of comparing the increase or decrease of the expression of caveolin-1 in the presence or absence of a candidate drug for treatment of moyamoya disease can be used to screen for the treatment of moyamoya disease, and caveolin- 1 (caveolin-1) may be selected as a treatment for moyamoya disease.
본 발명에서 용어 "시료"란 모야모야병에 의해 카베올린-1의 수준이 차이나는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 또는 소변 같은 시료 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 바람직한 예로는, 혈액, 혈청, 혈장 시료일 수 있다.The term " sample " in the present invention includes, but is not limited to, tissues, cells, whole blood, serum, plasma, saliva, sputum, urine or the like in which the level of caveolin- Preferred examples are blood, serum, and plasma samples.
본 발명에서 용어 "개체"란 피검체를 의미하는 것으로, 모든 동물, 바람직하게는 포유류, 더욱 바람직하게는 인간일 수 있다.The term " individual " in the present invention means a subject, and may be any animal, preferably a mammal, more preferably a human.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, embodiments are described to help understand the present invention. However, the following examples are provided only for the purpose of easier understanding of the present invention, and the present invention is not limited by the examples.
[실시예][Example]
실시예 1: 모야모야병 바이오마커 선별Example 1: Selection of a biomarker for illness
1-1. 단백질 발현수준 측정1-1. Measurement of protein expression level
동맥경화증과 구별되는 모야모야병만의 특이적인 바이오 마커를 선별하기 위하여, 혈관촬영술에 의해 구분된 모야모야병(MMD) 환자 139명, 두개내 동맥경화성 협착 환자(ICAS) 61명, 정상군(control) 68명에서 각각 혈청을 채취한 후, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assays) 키트를 사용하여 하기의 단백질들의 발현 수준을 측정하였다.In order to screen specific biomarkers of moyamoya disease distinct from arteriosclerosis, 139 patients with moyamoya disease (MMD) classified by angiography, 61 patients with intracranial arteriosclerotic stenosis (ICAS), the normal group control), serum levels of the following proteins were measured using ELISA (enzyme-linked immunosorbent assays) kit.
caveoline-1 ELISA kit (catalog #E0214h; EIAab),caveoline-1 ELISA kit (catalog # E0214h; EIAab),
ADMA ELISA kit (catalog #K7828; Immundiagnostik),ADMA ELISA kit (catalog # K7828; Immundiagnostik),
human sE-selectin ELISA kit (catalog #BEK-2089-2P; Biosensis),human sE-selectin ELISA kit (catalog # BEK-2089-2P; Biosensis),
human Endostatin ELISA (catalog #DNST0; R&D systems),human Endostatin ELISA (catalog # DNST0; R & D systems),
human lipoprotein-associated phospholipase A2 (Lp-PLA2) ELISA kit (cat #SEA867Hu; Cloud-Clone Corp.)human lipoprotein-associated phospholipase A2 (Lp-PLA2) ELISA kit (cat # SEA867Hu; Cloud-Clone Corp.)
이때, ELISA는 제조사의 프로토콜에 따라 수행하였으며, SpectraMax 340PC384 Microplate Reader 및 SoftMax® Pro Data Analysis Software (Molecular Devices)를 이용하여 분석하였다.At this time, the ELISA was performed according to the manufacturer's protocol, and analyzed using SpectraMax 340PC384 Microplate Reader and SoftMax® Pro Data Analysis Software (Molecular Devices).
그 결과, 도 3에서 확인할 수 있듯이, caveolin-1의 혈중 수준은 모야모야병 환자에서 통계적으로 유의하게 감소되었으며, 모야모야의 유형(허혈성, 출혈성)과 무관하게, 또한 증상발병의 시기와 무관하게 이러한 특징은 유지되고 있음을 알 수 있었다.As a result, as shown in FIG. 3, the blood level of caveolin-1 was statistically decreased in patients with Moyamoya disease, and regardless of the type of moyamoya (ischemic or hemorrhagic) These characteristics were maintained.
1-2. ROC curve1-2. ROC curve
ROC(receiver operating characteristic) 커브는 특정 검사의 성능을 평가하기 위한 모델로서, 민감도와 특이도의 상관관계를 표현한 그래프이다. 그래프의 X축은 False positive rate, Y축은 True positive rate를 나타내며, ROC 커브가 왼쪽 꼭대기에 가깝게 그려질수록 classification 성능이 우수함을 의미한다.The receiver operating characteristic (ROC) curve This is a model for evaluating the performance of a specific test, and is a graph expressing a correlation between sensitivity and specificity. The X-axis of the graph shows a false positive rate and the Y-axis shows a true positive rate. The closer the ROC curve is drawn to the top left, the better the classification performance.
AUC(Area Under Curve)는 classifier의 합리성을 나타내는 지표로서 ROC 커브의 아래 면적을 의미한다. AUC의 최대값은 1이고, 1에 가까운 값일수록 민감도(sensitivity)와 특이도(specificity)가 모두 높음을 의미하기 때문에 우수한 classification을 나타낸다.Area Under Curve (AUC) is an indicator of the rationality of the classifier, which is the area under the ROC curve. The maximum value of the AUC is 1, and a value close to 1 indicates an excellent classification because it means that both the sensitivity and the specificity are high.
ROC 커브에서, MMD와 ICAS의 caveolin-1 level의 차이를 나타내는 가장 적합한 농도는 Optimal criterion ≤0.79 (Sensitivity [95% CI], 81.95 [74.4 - 88.1], Specificity [95% CI], 60.66 [47.3 - 72.9])이다.In the ROC curve, the optimal concentration for the difference between caveolin-1 levels of MMD and ICAS was Optimal criterion ≤0.79 (Sensitivity [95% CI], 81.95 [74.4-88.1], Specificity [95% CI], 60.66 [ 72.9]).
구체적으로, ROC 커브 작성을 위하여 STATA, version 13.1; Stata Corp, College Station, TX, USA 프로그램을 사용하였으며, optimal criterion 선정과 민감도, 특이도 계산을 위하여 로지스틱 회귀 분석 기법을 활용하였다.Specifically, for ROC curve creation, STATA, version 13.1; Stata Corp, College Station, TX, USA were used. Logistic regression analysis was used for the selection of optimal criterion, sensitivity and specificity.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 혈관촬영술로 감별진단되는 모야모야병과 동맥경화성 협착에 있어서, 카베올린-1이 이들을 구분할 수 있는 바이오 마커로서 유용함을 확인할 수 있었다.As a result, as shown in Fig. 4, it was confirmed that caveolin-1 is useful as a biomarker capable of distinguishing between these two diseases, in the case of Moyamoya disease and arteriosclerotic stricture differentiated by angiography.
실시예 2: 모야모야병과 관련된 유전형 RNF213 polymorphism 분석Example 2: Analysis of genotype RNF213 polymorphism associated with illness
2-1. RNF213 변이와 caveolin-1 수준의 상관관계 평가2-1. Correlation between RNF213 mutation and caveolin-1 levels
상기 실시예 1과 같이 혈관촬영술에 의해 구분된 모야모야병과 동맥경화성 협착을 카베올린-1의 혈중 수준으로 감별하는 것 이외에, 모야모야병의 유전적 소인에 따라 카베올린-1의 혈중 수준에 차이가 있는지 확인하기 위하여, 두개내 협착이 있는 환자 및 정상인에서 혈청을 채취하여 카베올린-1 수준을 확인하였다. 즉, 모야모야병과 관련된 유전자로 밝혀진 RNF213(Ring finger 213)(GenBank accession number NM_001256071.1) 변이군과 카베올린-1 수준과의 관련성을 조사하였다.In addition to differentiating Moyamoya disease and arteriosclerotic stenosis distinguished by angiography from the blood level of caveolin-1 as in Example 1, the difference in blood level of caveolin-1 according to the genetic predisposition of Moyamoya disease Serum was collected from patients with intracranial stenosis and normal subjects to confirm caveolin-1 levels. In other words, the relationship between the mutation group of RNF213 ( Ring finger 213) (GenBank accession number NM_001256071.1) and caveolin-1 level,
이를 위하여, 우선 말초혈액 백혈구(leukocytes)에서 Wizard Genomic DNA Purification kit(Promega)를 이용하여 게놈 DNA를 추출한 후, 하기의 프라이머쌍을 이용하여, RNF213 gene(GenBank accession number NM_001256071.1)의 c.14429G>A (p.Arg4810Lys) mutation을 PCR(thermal cycler model 9700; Applied Biosystems) 증폭하였다.For this purpose, genomic DNA was first extracted from peripheral blood leukocytes using Wizard Genomic DNA Purification kit (Promega), and then the following primer pair was used to amplify the RNA of the RNF213 gene (GenBank accession number NM_001256071.1) c.14429G > A (p.Arg4810Lys) mutation was amplified by PCR (thermal cycler model 9700; Applied Biosystems).
Forward primer : 5'-GCTGCATCACAGGAAATGAC-3'Forward primer: 5'-GCTGCATCACAGGAAATGAC-3 '
Reverse primer : 5'-AAGGAGTGAGCCGAGTTTGA-3'Reverse primer: 5'-AAGGAGTGAGCCGAGTTTGA-3 '
이후, PCR 증폭산물은 Big-Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction kit (Applied Biosystems) on an ABI Prism 3730xl genetic analyzer (Applied Biosystems)을 이용하여 시퀀싱하여 RNF213 변이체를 검증하였다.The PCR product was then sequenced using the Big-Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction kit (Applied Biosystems) on an ABI Prism 3730xl genetic analyzer (Applied Biosystems) to verify the RNF213 mutant.
검증된 RNF213 변이군(유전적으로 진단한 모야모야병 환자)에서 혈중 카베올린-1의 발현수준을 측정(caveoline-1 ELISA kit; catalog #E0214h, EIAab)한 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, RNF213 변이군에서 혈중 카베올린-1의 수준 또한 정상군 그리고 동맥경화성 협착 환자와 비교하여 현저히 감소되어 있음을 확인하였다.(Caveoline-1 ELISA kit; catalog # E0214h, EIAab), the expression level of caveolin-1 in the blood was measured in the proved RNF213 mutation group (genetically diagnosed Moyamoya disease) The level of blood caveolin - 1 in the mutant group was also significantly reduced compared to the normal group and the atherosclerotic stenosis group.
2-2. ROC curve2-2. ROC curve
실시예 2-1의 검사 성능을 평가하기 위하여, STATA ver. 13.1 프로그램의 로지스틱 회귀 분석 (code: lroc, nograph) 방법으로 ROC curve를 작성하였다.To evaluate the test performance of Example 2-1, STATA ver. 13.1 ROC curves were generated by logistic regression analysis of the program (code: lroc, nograph).
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 카베올린-1 바이오마커는 개체가 모야모야병 관련 유전형을 갖고 있는지 감별 진단하는 데 있어 유용함을 알 수 있었다. 이러한 결과는, 유전적으로 진단한 모야모야병 환자에서 카베올린-1이 바이오 마커로서 유용하다는 것을 의미한다.As a result, as shown in Fig. 5, it was found that the caveolin-1 biomarker of the present invention is useful for distinguishing and diagnosing whether an individual has a genotype related to moyamoya disease. These results indicate that caveolin-1 is useful as a biomarker in genetically diagnosed patients with Moyamoya disease.
2-3. path analysis2-3. 경로 분석
카베올린-1 수준 변화가 모야모야병의 발병에 있어, angiogenesis 인자(VEGF, VEGFR2, endostatin), endothelial dysfunction 인자(ADMA, NO, nitrite, nitrate) 들의 작용을 매개하는지 평가하기 위하여, path analysis를 수행하였다.Path analysis was performed to assess whether caveolin-1 level mediates the action of angiogenesis factors (VEGF, VEGFR2, endostatin) and endothelial dysfunction factors (ADMA, NO, nitrite, nitrate) in the pathogenesis of Moyamoya disease Respectively.
즉, 모야모야병 환자(MMD), 두개내 동맥경화성 협착 환자(ICAS; intracranial atherosclerotic stroke), 정상군(control) 간에, 유전적 마커(RNF213 변이)와; 단백질 바이오마커로서 caveolae 인자(caveolin-1), angiogenesis 인자(VEGF, VEGFR2, endostatin), endothelial dysfunction 인자(ADMA, NO, nitrite, nitrate) 들간의 상관관계를 평가하였다.(MMN), intracranial atherosclerotic stroke (ICAS), and normal (control) genetic markers (RNF213 mutation); We evaluated the correlation between caveolin-1, angiogenesis factors (VEGF, VEGFR2, endostatin) and endothelial dysfunction factors (ADMA, NO, nitrite and nitrate) as protein biomarkers.
구체적으로, path analysis는 STATA ver. 13.1 프로그램을 활용하여 분석하였으며, 2개 이상의 회귀 분석의 복합 형태이다. STATA ver 13.1 프로그램의 "pathreg" 코드를 이용한 자세한 사항은 http://www.ats.ucla.edu/stat/stata/faq/pathreg.htm에 기술되어 있다.Specifically, path analysis was performed using STATA ver. 13.1 analyzed using the program, and it is a complex form of two or more regression analyzes. The details of using the "pathreg" code of the STATA ver 13.1 program are described at http://www.ats.ucla.edu/stat/stata/faq/pathreg.htm .
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 카베올린-1 수준 변화는 모야모야병 유전형(RNF213)과 혈관생성과 관련된 성장인자인 VEGF(vascular endothelial growth factor) 수준과 연관성이 있음을 확인하였다(P value <0.001). 또한, 모야모야병은 RNF213 유전형과 카베올린-1 수준이 동시에 연관성이 있음을 확인하였다(P value <0.001).As a result, as shown in Fig. 6, it was confirmed that the level of caveolin-1 was correlated with the level of Voyager's disease genotype (RNF213) and the vascular endothelial growth factor (VEGF) ≪ 0.001). In addition, moyamoya disease was found to be associated with the RNF213 genotype and the caveolin-1 level (P value <0.001).
따라서, 본 발명에 의하면, 혈액내 카베올린-1 수준을 측정함으로써, 민감도/특이도 높게 모야모야병을 진단할 수 있음을 알 수 있다.Therefore, according to the present invention, it is possible to diagnose Moyamoya disease with high sensitivity / specificity by measuring caveolin-1 level in blood.
실시예Example 3: 모야모야병의 병리적 현상과 3: Pathological phenomena of Moyamoya disease CaveolinCaveolin -1과의 연관성 확인Confirm the association with -1
3-1. 3-1. CaveolinCaveolin -1 감소에 의한 By -1 reduction 혈관세포Vascular cell 이동능Mobile ability 변화 분석 Change analysis
모야모야병의 병리현상인 비정상적인 혈관생성이 Caveolin-1 감소와 연관성이 있는지 확인하기 위해, 두가지 혈관세포(혈관내피세포, 평활근육세포)에서 Caveolin-1을 전사 후 조절 단계에서 부분적인 억제를 하고, 이동능을 관찰하였다.In order to determine whether abnormal angiogenesis, a pathological phenomenon of Moyamoya disease, is associated with a decrease in caveolin-1, partial inhibition of caveolin-1 in the post-transcriptional regulatory steps in two vascular cells (vascular endothelial cells, smooth muscle cells) , And migration ability were observed.
HUVEC-Primary Umbilical Vein Endothelial Cells (catalog #C2517A; LONZA)HUVEC-Primary Umbilical Vein Endothelial Cells (catalog # C2517A; LONZA)
CASMC-Coronary artery SM SmGM-2, cryo amp (catalog #cc-2583; LONZA)CASMC-Coronary artery SM SmGM-2, cryo amp (catalog # cc-2583; LONZA)
Caveolin-1 siRNA (catalog #sc-29241, Santa cruz)Caveolin-1 siRNA (catalog # sc-29241, Santa Cruz)
이때, 혈관내피세포(HUVEC)는 20% FBS, 5U/ml Heparin, 3ng/ml bFGF를 포함한 M199 media에서 배양되었고, 평활근육세포(CASMC)는 10% FBS를 포함한 Low glucose DMEM media에서 배양되었다. Caveolin-1 siRNA의 형질주입은 passage 5의 HUVEC과 passage 7의 CASMC에서 수행되었으며, siRNA의 제조사 프로토콜에 따라 Lipofectamine에 도입하여 OPTI-MEM media에서 6시간 배양되었다. 실험군에 따른 대조군은 Control siRNA를 사용하여 같은 조건에서 실험되었다. siRNA 도입 48시간 후 plate의 중앙을 피펫팁을 이용해 횡으로 긁어주고, 세포분화를 억제하기 위해 mitomycin을 포함하는 media로 배양액을 바꾸어준 후 12시간 관찰하였다.HUVECs were cultured in M199 medium containing 20% FBS, 5 U / ml Heparin and 3 ng / ml bFGF, and smooth muscle cells (CASMC) were cultured in low glucose DMEM media containing 10% FBS. The transfection of caveolin-1 siRNA was performed in passage 5 HUVEC and passage 7 CASMC, and was introduced into Lipofectamine according to the manufacturer's protocol of siRNA and cultured in OPTI-MEM media for 6 hours. Control groups according to experimental groups were tested under the same conditions using Control siRNA. 48 hours after the introduction of the siRNA, the plate was scratched transversely using a pipette tip, and the medium was replaced with mitomycin-containing media to inhibit cell differentiation, followed by observation for 12 hours.
그 결과, 도 7에서와 같이 caveolin-1의 부분적인 억제에 의해 두가지 혈관을 구성하는 세포의 이동능이 유의하게 감소됨을 확인하였다.As a result, as shown in FIG. 7, it was confirmed that the partial capacity of caveolin-1 inhibited the migration of cells constituting the two blood vessels.
3-2. 3-2. CaveolinCaveolin -1 감소에 의한 By -1 reduction 혈관생성능Vascularity 변화 분석 Change analysis
모야모야병의 병리현상인 비정상적인 혈관생성이 Caveolin-1 감소와 연관성이 있는지 확인하기 위해, 혈관내피세포(HUVEC)에서 Caveolin-1을 전사 후 조절 단계에서 부분적인 억제를 하고, 이동능을 관찰하였다.In order to confirm whether abnormal angiogenesis, which is a pathological phenomenon of Moyamoya disease, is associated with caveolin-1 reduction, partial inhibition of caveolin-1 in the post-transcriptional regulatory step in vascular endothelial cells (HUVEC) .
μ-Slide Angiogenesis (catalog #81506; ibidi)μ-Slide Angiogenesis (catalog # 81506; ibidi)
BD Matrigel™ Matrix Growth Factor Reduced (catalog #356231; BD Bioscience)BD Matrigel ™ Matrix Growth Factor Reduced (catalog # 356231; BD Bioscience)
HUVEC의 배양과정과 siRNA의 형질주입은 실시예 3-1과 동일한 과정으로 실험되었다. siRNA 도입 48시간 후 μ-Slide의 제조사 프로토콜에 따라 Matrigel을 분주하고, 그 위에 HUVEC을 계대배양하고, 8시간 후 관찰하였다.The culture of HUVEC and the transfection of siRNA were performed in the same manner as in Example 3-1. After 48 hours of siRNA introduction, Matrigel was dispensed according to the manufacturer's protocol of μ-Slide, and HUVEC was subcultured on it and observed 8 hours later.
그 결과, 도 8에서와 같이 caveolin-1의 부분적인 억제에 의해 혈관내피세포의 혈관생성능이 유의적으로 감소됨을 확인하였다.As a result, it was confirmed that the vascular endothelial cell vascularity was significantly reduced by partial inhibition of caveolin-1 as shown in FIG.
3-3. 3-3. CaveolinCaveolin -1 감소에 의한 vessel maturation 관련 인자의 변화 관찰-1 decrease in vessel maturation related factors
실시예 3-1과 3-2의 세포에서 보여진 변화가 잘 알려진 vessel maturation 관련 인자들의 변화에 근거한 것인지를 확인하기 위해, 세포들에서 단백질을 추출 후 Western blot analysis를 통해 인자들의 변화를 관찰하였다.To determine whether the changes shown in the cells of Examples 3-1 and 3-2 were based on well-known changes in vessel maturation-related factors, proteins were extracted from the cells and the changes of the factors were observed by Western blot analysis.
Caveolin-1 Antibody (7C8) (catalog #MA3-600; Thermo)Caveolin-1 Antibody (7C8) (catalog # MA3-600; Thermo)
Anti-PDGF-BB Antibody (catalog #LS-C192456; Lifespan Biosciences)Anti-PDGF-BB Antibody (catalog # LS-C192456; Lifespan Biosciences)
PDGF receptor b (28E1) rabbit mAb (catalog #3169; Cell signaling)PDGF receptor b (28E1) rabbit mAb (catalog # 3169; Cell signaling)
정량된 단백질을 이용하여 SDS-폴리아크릴아마이드겔 전기영동을 하여 단백질을 크기별로 분류 후 nitrocellulose membrane에 transfer하고, Immuno blotting법을 통해 Caveolin-1, PDGF 그리고 PDGF receptor의 양을 각각 탐지하였다.Proteins were quantitated by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis using quantified proteins, transferred to a nitrocellulose membrane, and detected by cryolin-1, PDGF and PDGF receptors by immuno blotting.
그 결과, 도 9에서와 같이 HUVEC과 SMC에서 Caveolin-1 siRNA에 의해 Caveolin-1의 양이 감소한 것을 확인할 수 있고, 그에 따라 PDGF와 PDGF receptor가 감소하였다.As a result, as shown in FIG. 9, the amount of caveolin-1 was decreased by Caveolin-1 siRNA in HUVEC and SMC, and thus PDGF and PDGF receptors decreased.
따라서 상기 실시예의 결과로부터, Caveolin-1의 감소가 혈관의 비정상적인 생성을 유발할 수 있는 근거가 될수 있음을 알 수 있고, 모야모야병에서 Caveolin-1이 Biomarker가 될 수 있음을 알 수 있다.Therefore, it can be seen from the results of the above examples that reduction of caveolin-1 can be a basis for causing abnormal formation of blood vessels, and it can be seen that caveolin-1 can be a biomarker in moyamoya disease.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해되어야 한다.It will be understood by those skilled in the art that the foregoing description of the present invention is for illustrative purposes only and that those of ordinary skill in the art can readily understand that various changes and modifications may be made without departing from the spirit or essential characteristics of the present invention. will be. It is therefore to be understood that the above-described embodiments are illustrative in all aspects and not restrictive.
Claims (15)
상기 개체의 시료로부터 카베올린-1 발현수준 측정 결과, 정상 대조군보다 감소한 경우 모야모야병이라고 판정하는 단계를 포함하는, 모야모야병 진단을 위한 정보제공방법.Measuring the level of expression of caveolin-1 mRNA or protein from a sample of an individual; And
And determining that the caveolin-1 expression level from the sample of the individual is less than that of the normal control group, thereby determining that the disease is moyamoya disease.
(a) 개체로부터 얻어진 시료에 후보 약물을 처리하는 단계;
(b) 카베올린-1(caveolin-1)의 발현 프로파일을 검출하는 단계; 및
(c) 상기 (b) 단계에서, 상기 카베올린-1(caveolin-1)의 발현이 증가한 경우, 상기 후보약물을 모야모야병 치료제로 판정하는 단계.A screening method for treating a moyamoza disease comprising the steps of:
(a) treating a candidate drug with a sample obtained from an individual;
(b) detecting an expression profile of caveolin-1; And
(c) when the expression of caveolin-1 is increased in step (b), the candidate drug is judged to be a therapeutic agent for moyamoza disease.
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Non-Patent Citations (2)
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|---|
| Oxidative Medicine and Cellular Longevity, (2016.03), Vol. 2016, pp 1-7. |
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