KR101971104B1 - Biomarker Composition for Diagnosing Tuberculosis Comprising Sirt3 - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 환자에게 심리적, 육체적 부담이 없이 결핵을 조기에 빠르게 진단하는데 유용하게 이용될 수 있는 새로운 바이오마커를 포함하는 결핵 진단용 바이오마커 조성물과, 결핵 진단 키트에 관한 것이다. The present invention relates to a biomarker composition for diagnosing tuberculosis including a new biomarker that can be usefully used for early and early diagnosis of tuberculosis without any psychological and physical burden on a patient, and a tuberculosis diagnostic kit.
결핵(tuberculosis)은 미코박테륨, 특히 결핵균의 감염에 의해 발생하는 전염성 질환이다. 세계적으로 전체 인구의 1/3이 결핵균에 감염되어 있는 것으로 추정되며 매년 약 800백만명의 새로운 환자가 발생한다. 대부분의 감염자들은 증상이 없고 그 중 1/10 정도가 발병하며, 발병 시 적절한 치료를 하지 않으면 그 중 절반 이상이 사망에 이르게 된다. 전형적인 증상은 피가 섞인 가래를 동반한 기침, 오한, 식은땀, 체중 감소로 몸의 어느 기관에나 감염될 수 있기 때문에 감염된 기관에 따라 다양한 증상을 초래한다.Tuberculosis is a contagious disease caused by infection with Mycobacterium, especially Mycobacterium tuberculosis. One-third of the world's population is estimated to be infected with tuberculosis, and about 800 million new cases occur each year. Most infected people have no symptoms, about one-tenth of them develop, and if not properly treated at the onset, more than half of them will die. Typical symptoms include coughing, chills, cold sweats, and weight loss accompanied by sputum mixed with blood, which can cause infection in any organ of the body, resulting in a variety of symptoms depending on the affected organ.
결핵의 초기 진단은 결핵의 확산을 방지하고 적절한 치료를 위하여 필수적이나 결핵은 진단이 어려운 질병중의 하나다. 결핵 진단의 가장 표준적인 방법(gold standard)은 선택된 배지에서 결핵균의 성장을 확인하는 것이다. 그러나 미코박테륨은 성장 속도가 느리기 때문에 검체 내에서 이러한 배양에는 3~12주의 오랜 시간이 소요된다. 객담 도말(sputum smear)은 빠른 결말을 얻을 수 있어 임상 실험실에서 널리 이용되고 있지만, 민감도가 낮다. PCR 기반의 핵산 증폭 방법과 면역학적 방법은 결핵의 초기 진단 및 빠른 진단에 커다란 진전을 가져왔다. 그러나 위양성 또는 위음성의 결과를 초래하는 결핵균의 내생성 증폭 저해 인자(endogenous amplification inhibition factor)나 신뢰도 낮은 품질관리(quality control) 등은 PCR 방법의 임상적 사용에 방해요소로 작용한다. 이에 결핵의 진단을 위한 새로운 바이오마커나 새로운 진단방법이 요구되고 있다. 본 발명자들은 등록특허 제10-1643748호, 등록특허 제10-1476781호에서 결핵 진단을 위한 바이오마커로서 마이크로RNA를 사용할 수 있음을 개시한 바 있다. Early diagnosis of tuberculosis is one of the diseases that prevent the spread of tuberculosis and is essential for proper treatment, but tuberculosis is difficult to diagnose. The gold standard for diagnosis of tuberculosis is to confirm the growth of Mycobacterium tuberculosis in selected media. However, since mycobacterium has a slow growth rate, it takes 3 to 12 weeks for this kind of incubation in a sample. Sputum smear is widely used in clinical laboratories because of its quick ending, but is less sensitive. PCR-based nucleic acid amplification and immunological methods have made great progress in the early diagnosis and rapid diagnosis of tuberculosis. However, endogenous amplification inhibition factors and unreliable quality control of Mycobacterium tuberculosis, which result in false positive or false negative results, interfere with the clinical use of PCR methods. Therefore, new biomarkers and new diagnostic methods for the diagnosis of tuberculosis are required. The present inventors have disclosed that microRNAs can be used as biomarkers for diagnosis of tuberculosis in Korean Patent No. 10-1643748 and Japanese Patent No. 10-1476781.
시르투인(Sirt, Sirtuin)은 세포 내의 특정 부분에 존재하여 정해진 타겟 단백질에 대하여 주로 탈아세틸화 활성을 갖는다. 사람과 마우스에는 시르투인 1∼7까지 존재하며, Sirt1은 핵과 세포질, Sirt2는 세포질에만, Sirt3~5는 미토콘드리아, Sirt6는 핵에만, Sirt7은 핵소체에 존재한다. Sirtuin (Sirt, Sirtuin) is present in a specific part of the cell and has mainly deacetylation activity on the target protein. Sirt1 is nuclear and cytoplasmic, Sirt2 is cytoplasmic only, Sirt3 ~ 5 is mitochondria, Sirt6 is nuclear only, and Sirt7 is nuclear.
클라스 III 히스톤 디아세틸라제인 Sirt3는 미토콘드리아의 NAD+-의존적인 디아세틸라제로서, 미토콘드리아의 에너지 대사 및 항상성을 조절하는 데 필수적이다. Sirt3는 미토콘드리아에서 산화적 인산화에 관련된 여러 가지 대사 효소와 단백질의 아세틸화 상태의 조절에 필요하다. 또한 Sirt3는 MnSOD(manganese superoxide dismutase)와 활성산소종(ROS, reactive oxygen species)의 환원을 통한 카날레아제(catalase)를 활성화시키기 때문에, DNA 손상과 산화 스트레스에 의한 세포 사멸로부터 미토콘드리아를 보호하는 데에도 필수적이다. Sirt3의 발현증가와 활성화는 신장의 기능을 향상시키고 미트콘드리아의 기능장애와 만성 신장 손상에서의 단열(fragmentation)을 개선한다. 노화 및 심장병과 당뇨병을 포함하는 다발성 병변(multiple pathologies), 추위에 대한 과민증, 폐 동맥 고혈압 등에서 Sirt3 활성의 조절 장애가 보고되기도 하였다. 그러나 결핵균 감염과 Sirt3의 상관관계에 대해서는 아직 알려진 바 없다. Class III histone diacetylase Sirt3 is a NAD + -dependent diacetylase of mitochondria, essential for regulating the energy metabolism and homeostasis of mitochondria. Sirt3 is required to regulate the acetylation status of various metabolic enzymes and proteins involved in oxidative phosphorylation in mitochondria. Sirt3 also activates catalase through the reduction of manganese superoxide dismutase (MnSOD) and reactive oxygen species (ROS), thus protecting mitochondria from DNA damage and oxidative stress-induced cell death It is also essential. Increased expression and activation of Sirt3 improve kidney function and improve mitochondrial dysfunction and fragmentation in chronic kidney injury. It has also been reported that Sirt3 activity is regulated in multiple pathologies including aging and heart disease and diabetes, hypersensitivity to cold, and pulmonary arterial hypertension. However, the relationship between Mycobacterium tuberculosis infection and Sirt3 is not yet known.
본 발명은 결핵의 조기 진단 및 빠른 진단에 유용한 결핵 진단용 바이오마커 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.It is an object of the present invention to provide a biomarker composition for tuberculosis diagnosis useful for early diagnosis and rapid diagnosis of tuberculosis.
또한 본 발명은 결핵의 진단을 위한 정보 제공방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.It is another object of the present invention to provide a method for providing information for diagnosis of tuberculosis.
본 발명은 상기 바이오마커의 발현 수준을 측정하는 데 사용될 수 있는 결핵진단용 진단 키트를 제공하는 것을 다른 목적으로 한다. Another object of the present invention is to provide a diagnostic kit for diagnosis of tuberculosis that can be used for measuring the expression level of the biomarker.
전술한 목적을 달성하기 위한 본 발명은 결핵 감염에 의해 발현이 감소되는 Sirt3를 포함하는 것을 특징으로 하는 결핵 진단용 바이오마커 조성물에 관한 것이다. In order to accomplish the above object, the present invention relates to a biomarker composition for diagnosing tuberculosis, which comprises Sirt3 whose expression is decreased by tuberculosis infection.
"바이오마커"는 정상이나 병적인 상태를 구분할 수 있거나 치료반응을 예측할 수 있고 객관적 측정이 가능한 표지자를 말한다. 결핵환자로부터 채취한 혈액의 말초혈액 유래 단핵세포에서 Sirt3의 발현 수준은 결핵에 감염되지 않은 정상군에서의 발현 수준에 의해 유의적으로 감소하였다. 이로부터 진단하고자 하는 개체의 생물학적 시료에서 발현량을 측정함으로써 결핵균의 감염 여부를 유의적으로 진단할 수 있음을 확인할 수 있었다.A "biomarker" is a marker that can distinguish between normal or pathological conditions, or predictable and objective measures of therapeutic response. The expression level of Sirt3 in peripheral blood mononuclear cells from blood samples taken from patients with tuberculosis was significantly decreased by the level of expression in the normal group not infected with tuberculosis. From these results, it was confirmed that the infection rate of M. tuberculosis can be significantly diagnosed by measuring the expression level in a biological sample of a subject to be diagnosed.
이에 본 발명은, 검사대상자로부터 채취한 시료로부터 Sirt3의 농도를 정량분석하는 것을 특징으로 하는 결핵의 진단을 위해 필요한 정보의 제공 방법을 제공한다. 상기 시료는 결핵균 감염 의심환자의 혈액 또는 결핵균 감염 의심 조직일 수 있으나, 채취의 용이성과 잠재 환자에게 주는 심적·육체적 부담감을 고려하면 혈액을 시료로 사용하는 것이 보다 바람직하다. 상기 Sirt3의 농도는 Sirt3 단백질 또는 Sirt3 단백질을 암호화하는 유전자의 발현 수준으로부터 측정될 수 있으며, 단백질 또는 유전자의 발현 수준을 측정하기 위하여 당업계에서 사용되는 어떤 방법을 사용하여도 무방하다. 예를 들면, 상기 Sirt3 단백질의 발현 수준은 면역형광 이미지 분석이나 웨스턴블랏, 유세포분석 등의 방법을 이용하여 측정할 수 있으며, Sirt3 단백질을 암호화하는 mRNA의 발현 수준은 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR, 실시간 RT-PCR, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅 또는 DNA 마이크로어레이 등을 활용할 수 있다. 상기 유전자 분석을 위하여 종래 기술에 의해 알려진 Sirt3 단백질을 암호화하는 유전자를 특이적으로 증폭시키는 프라이머나 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프로브를 사용할 수 있음은 당연하며, 종래 알려진 서열 이외에도 새로운 서열의 프라이머나 프로브를 디자인하는 것 역시 당업자라면 용이할 것이다. 상기 방법에 의해 Sirt3의 발현 수준을 측정하였을 때, 결핵에 감염되지 않은 정상군에 비해 발현 수준이 낮다면 결핵으로 진단할 수 있다.Accordingly, the present invention provides a method for providing information necessary for diagnosis of tuberculosis characterized by quantitatively analyzing the concentration of Sirt3 from a sample collected from a subject. The sample may be a blood or a suspect tissue of a Mycobacterium tuberculosis infection suspicious patient, but it is more preferable to use blood as a sample considering the ease of harvesting and the psychological and physical burden to potential patients. The concentration of Sirt3 can be measured from the expression level of a gene encoding Sirt3 protein or Sirt3 protein, and any method used in the art can be used to measure the expression level of protein or gene. For example, the expression level of the Sirt3 protein can be measured by immunofluorescence image analysis, Western blot, flow cytometry, etc. The expression level of mRNA encoding the Sirt3 protein can be measured by RT-PCR, competitive RT-PCR , Real-time RT-PCR, RNase protection assay, northern blotting or DNA microarray. It is of course possible to use a primer that specifically amplifies a gene encoding the Sirt3 protein known by the prior art for analyzing the gene or a probe that specifically binds to the gene. In addition to a known sequence, a primer of a novel sequence Designing probes will also be readily available to those skilled in the art. When the expression level of Sirt3 is measured by the above method, the diagnosis of tuberculosis can be made if the expression level is lower than that of the normal group not infected with tuberculosis.
또한 본 발명은 Sirt3의 발현 수준을 측정하기 위한 제제를 포함하는 것을 특징으로 하는 결핵 진단용 진단 키트에 관한 것이다. 예를 들면, 상기 제제는 Sirt3 단백질 또는 해당 단백질을 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 프로브나 프라이머를 포함하는 것이다. 이에 본 발명의 진단 키트는 상기 Sirt3 단백질 또는 단백질을 암호화하는 유전자의 분석 방법에 따라 적절한 형태로 구성되며, 각 분석 방법에 적합한 한 종류 이상의 다른 구성을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, Sirt3 단백질을 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정하기 위한 RT-PCR용 키트는 상기 유전자를 증폭하기 위한 프라이머 이외에 테스트 튜브, 완층액, 데옥시 뉴클레오타이드(dNTPs), 각종 효소, 사용 매뉴얼 등을 포함할 수 있다.The present invention also relates to a diagnostic kit for diagnosis of tuberculosis, which comprises an agent for measuring the expression level of Sirt3. For example, the agent comprises a probe or a primer capable of measuring the expression level of a Sirt3 protein or a gene encoding the protein. Therefore, the diagnostic kit of the present invention may be appropriately configured according to the method of analyzing the gene encoding the Sirt3 protein or protein, and may further include one or more other structures suitable for each assay method. For example, a kit for RT-PCR for measuring the expression level of a gene encoding Sirt3 protein can be used as a test tube, a complete layer solution, deoxynucleotides (dNTPs), various enzymes, manuals . ≪ / RTI >
이상과 같이 본 발명의 바이오마커 조성물에 의하면 검체로부터 Sirt3의 발현량을 측정하는 것에 의해 종래 결핵 감염검사에 비해 환자에게 심적·육체적·시간적 부담을 주지 않고 빠르고 안전하게 결핵을 진단할 수 있으므로 결핵의 진단에 유용하게 사용될 수 있다. As described above, according to the biomarker composition of the present invention, by measuring the expression amount of Sirt3 from a specimen, it is possible to diagnose tuberculosis quickly and safely without giving the patient a psychological, physical and temporal burden as compared with the conventional tuberculosis infection test, . ≪ / RTI >
도 1은 결핵환자 및 정상군의 말초혈액 유래 단핵세포에서 Sirt3 및 TNF의 발현량을 보여주는 그래프.FIG. 1 is a graph showing the expression levels of Sirt3 and TNF in peripheral blood mononuclear cells of tuberculosis patient and normal group.
이하 첨부된 실시예를 들어 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 그러나 이러한 실시예는 본 발명의 기술적 사상의 내용과 범위를 쉽게 설명하기 위한 예시일 뿐, 이에 의해 본 발명의 기술적 범위가 한정되거나 변경되는 것은 아니다. 이러한 예시에 기초하여 본 발명의 기술적 사상의 범위 안에서 다양한 변형과 변경이 가능함은 당업자에게는 당연할 것이다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to the following examples. However, these embodiments are merely examples for explaining the content and scope of the technical idea of the present invention, and thus the technical scope of the present invention is not limited or changed. It will be apparent to those skilled in the art that various changes and modifications can be made within the scope of the technical idea of the present invention based on these examples.
[실시예][Example]
활성 폐결핵 감염 환자군(TB) 48명(연령 중앙값 52.82±23.91세, 남성 23명, 여성 25명)과, 결핵에 감염되지 않은 대조군(HC) 50명(연령 중앙값 48.92±29.26세, 남성 23명, 여성 27명)으로부터 정맥혈을 제공받았다. 환자의 활성 폐결핵 감염은 흉곽 X-ray, Ziehl-Neelsen 염색, 미코박테리아의 배양 및 PCR에 의해 다중 확인하였으며, 화학 치료 전의 정맥혈 시료를 사용하였다. 각 정맥혈 시료로부터 Histopaque-1077(Sigma-Aldrich)을 이용한 밀도구배 원심분리로 말초혈액단핵세포 (PBMCs, peripheral blood mononuclear cells)를 수집하였다. (Median age 48.92 ± 29.26 years, male: 23, male: 50) who were not infected with tuberculosis, and 48 patients with active pulmonary tuberculosis infection (median age 52.82 ± 23.91 years, 23 males and 25 females) 27 women) received venous blood. The patient's active pulmonary tuberculosis infection was confirmed by chest X-ray, Ziehl-Neelsen staining, mycobacterial culture and PCR, and venous blood samples before chemotherapy were used. Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were collected from each venous blood sample by density gradient centrifugation using Histopaque-1077 (Sigma-Aldrich).
수집된 말초혈액단핵세포로부터 TRIzol 시약(Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 제조사의 방법에 따라 전체 RNA를 분리하였다. 분리한 RNA로부터 제조사 방법에 따라 Superscript II reverse transcriptase (Invitrogen, 18064)을 사용하여 cDNA를 합성하였다. From the collected peripheral blood mononuclear cells, total RNA was isolated according to the manufacturer's method using TRIzol reagent (Thermo Fisher Scientific). CDNA was synthesized from the separated RNA using Superscript II reverse transcriptase (Invitrogen, 18064) according to the manufacturer's method.
cDNA와 하기 표 1의 프라이머 및 PCR Kits(Qiagen, 204074)를 사용하여 Real-time PCR cycler Rotor-Gene Q 2plex system(Qiagen GmbH, 9001620, Hilden, Germany)에서 qPCR을 수행하였다. qPCR은 95℃ 10초, 60℃ 20초의 사이클을 40회 반복하여 증폭하였으며, PCR 데이터의 분석은 내부 대조 유전자로서 Gapdh를 사용하여 2ΔΔCt method로 정량하여 상대적인 비율의 차이로 나타내었다.qPCR was performed in real-time PCR cycler Rotor-Gene Q 2plex system (Qiagen GmbH, 9001620, Hilden, Germany) using cDNA and primers and PCR Kits (Qiagen, 204074) The qPCR was amplified by repeating 40 cycles of 95 ° C for 10 seconds and 60 ° C for 20 seconds. The PCR data were quantified by the 2ΔΔCt method using Gapdh as an internal control gene and expressed as a difference in the relative ratios.
도 1에서 확인할 수 있듯이, 결핵균 감염 환자는 염증관련 사이토카인인 TNF의 발현이 증가한 것과 함께 Sirt3의 발현 수준이 크게 감소하였다(p<0.001). 이는 정맥혈을 시료로 사용하여 Sirt3의 발현량을 측정함으로써, 결핵균을 직접 배양하지 않고도 결핵균 감염을 빠르고 안전하게 진단할 수 있음을 나타낸다. As can be seen in FIG. 1, the expression level of Sirt3 was significantly decreased in patients with Mycobacterium tuberculosis infection (p <0.001) while the expression of inflammatory cytokine TNF was increased. By measuring the expression level of Sirt3 using venous blood as a sample, it is possible to diagnose TB infection quickly and safely without directly culturing M. tuberculosis.
<110> The Industry & Academic Cooperation in Chungnam National University (IAC) <120> Biomarker Composition for Diagnosing Tuberculosis Comprising Sirt3 <130> P0118-012 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 ccctggaaac tacaagccca ac 22 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 gcagaggcaa aggttccatg ag 22 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 ctcttctgcc tgctgcactt tg 22 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 atgggctaca ggcttgtcac tc 22 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 catcactgcc acccagaaga ctg 23 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 atgccagtga gcttcccgtt cag 23 <110> The Industry & Academic Cooperation in Chungnam National University (IAC) <120> Biomarker Composition for Diagnosing Tuberculosis Comprising Sirt3 <130> P0118-012 <160> 6 <170> KoPatentin 3.0 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 ccctggaaac tacaagccca ac 22 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 gcagaggcaa aggttccatg ag 22 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 ctcttctgcc tgctgcactt tg 22 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 atgggctaca ggcttgtcac tc 22 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 catcactgcc acccagaaga ctg 23 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 atgccagtga gcttcccgtt cag 23
Claims (6)
Wherein the concentration of Sirt3 is quantitatively analyzed from the sample collected from the subject.
상기 시료는 결핵균 감염 의심환자의 혈액 또는 결핵균 감염 의심 조직인 것을 특징으로 하는 정보의 제공 방법.
3. The method of claim 2,
Wherein the sample is a blood or a suspect tissue of a Mycobacterium tuberculosis infection of a patient suspected of having a tuberculosis infection.
상기 Sirt3의 농도는 Sirt3 단백질 또는 Sirt3 단백질을 암호화하는 유전자의 발현 수준에 의해 결정되는 것을 특징으로 하는 방법.
The method according to claim 2 or 3,
Wherein the concentration of Sirt3 is determined by an expression level of a gene encoding Sirt3 protein or Sirt3 protein.
Sirt3의 발현 수준이 정상 대조군에서 결정된 Sirt3의 발현 수준에 비해 낮은 경우 결핵으로 진단되는 것을 특징으로 하는 정보의 제공 방법.
5. The method of claim 4,
Wherein the expression level of Sirt3 is lower than the expression level of Sirt3 determined in the normal control group.
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| KR101476781B1 (en) | 2014-05-09 | 2014-12-29 | 충남대학교산학협력단 | Biomarker MicroRNA for Diagnnosis of Tuberculosis |
| KR101643748B1 (en) | 2015-08-13 | 2016-07-29 | 충남대학교산학협력단 | Biomarker MicroRNA for Diagnnosis of Tuberculosis |
| KR101751930B1 (en) * | 2015-05-04 | 2017-06-30 | 충남대학교산학협력단 | Pharmaceutical Composition for Treating Mycobacterium tuberculosis or Mycobacterium abscessus Infection |
-
2018
- 2018-01-03 KR KR1020180000721A patent/KR101971104B1/en active IP Right Grant
Patent Citations (3)
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