KR101970471B1

KR101970471B1 - Vibrio cholerae strain that can be infected by CTX phages and can produce cholera toxin

Info

Publication number: KR101970471B1
Application number: KR1020170144851A
Authority: KR
Inventors: 김동욱; 김은진; 유현진
Original assignee: 한양대학교 에리카산학협력단
Priority date: 2016-12-16
Filing date: 2017-11-01
Publication date: 2019-04-19
Also published as: KR20180070456A

Abstract

본 발명은 CTX 파지에 감염되고 콜레라 독소를 생산할 수 있는 비브리오 콜레라 균주에 관한 것으로, toxT 유전자의 점돌연변이를 통해 139번째 아미노산이 티로신(Tyr)에서 페닐알라닌(Phe)으로 치환된 toxT 단백질을 발현하는 비브리오 콜레라 변이 균주는 CTX 파지의 수용체로 작용하는 TcpA의 발현을 증가시키고, 이에 따라 CTX 파지에 의해 감염될 수 있는 형질도입 수용체 균주가 될 수 있다. 또한, toxT 돌연변이 균주에서 콜레라 독소의 발현이 증가되며, 단상 배양에서도 콜레라 독소의 생산이 가능하다. The present invention relates to a Vibrio cholera strain that is infected with CTX phage and can produce cholera toxin. The present invention relates to a Vibrio cholera strain capable of producing a cholera toxin, which comprises a Vibrio cholera strain expressing a toxT protein in which the 139th amino acid is substituted with phenylalanine (Phe) The cholera mutant strain increases the expression of TcpA, which acts as a receptor for the CTX phage, and thus can be a transduction receptor strain that can be infected by the CTX phage. In addition, cholera toxin expression is increased in toxT mutant strains, and cholera toxin production is possible in single phase culture.

Description

[0002] Vibrio cholerae strains that can be infected by CTX phage and produce cholera toxin, which can be infected with CTX phage and produce cholera toxin,

본 발명은 CTX 파지에 감염될 수 있거나 콜레라 독소를 생산할 수 있는 비브리오 콜레라 변이 균주에 관한 것이다.The present invention relates to a Vibrio cholera mutant strain capable of infecting CTX phage or producing a cholera toxin.

독소를 생성하는 콜레라균(Vibrio cholerae)은 독소유전자를 가진 CTX 파지가 용원균으로 콜레라균의 염색체에 끼어들어 생성된다. classical, El Tor, atypical El Tor의 세 가지 바이오타입(biotype)으로 세분될 수 있는 혈청형 O1 균주와 O139 혈청형 균주들이 독소를 생산하며 이에 따라 유행성 콜레라를 발생시킨다. Classical 바이오타입 균주들은 CTX-cla 파지(phage)를 가지고 있으며 프로토타입 El Tor 균들은 CTX-1을 가지고 있고, atypical El Tor 균주들은 CTX-2를 가지는 Wave 2균주와 CTX-3 ~ CTX-6를 가지는 Wave 3 균주들이다. O139 혈청형 균주는 CTX-1 또는 CTX-O139를 가지고 있다. 독소를 생성하는 균주들은 콜레라 독소 유전자를 가지고 있는 바이러스인 CTX 파지에 감염되어 용원화(lysogenization)되어 생성된다. 각각의 바이오타입 균주들이 바이오타입-특이적인 파지에 감염되어 독소를 생산하는 균주가 생성되는 진화 기전에 대한 모델이 제시되었으나, CTX 파지의 감염과 복제는 숙주 균주의 바이오타입에 의해 제한되지는 않는다. 최근에는 CTX-cla와 CTX-1의 모자이크로 형성된 것처럼 보이는 CTX 파지를 가지고 있는 atypical El Tor 균주들이 세계적으로 대세를 이루고 있다.Cholerae producing toxins ( Vibrio cholerae ) is a CTX phage that has a toxin gene and is a yeast germ, which is produced by interrupting the chromosomes of cholera bacteria. Serotype O1 strains and O139 serotype strains, which can be subdivided into three types of biotypes, classical, El Tor, and atypical El Tor, produce toxins and thus produce epidemic cholera. Classical biotypes have CTX-cla phage, prototype El Tor strains have CTX-1, atypical El Tor strains have CTX-2 Wave 2 strains and CTX-3 ~ CTX-6 Branches are the three strains of Wave. The O139 serotype strain has CTX-1 or CTX-O139. The toxin-producing strains are produced by lysogenization of the CTX phage, a virus with the cholera toxin gene. A model for an evolutionary mechanism in which each of the bio-type strains is infected with a bio-type-specific phage to produce a toxin-producing strain is presented, but infection and replication of the CTX phage is not limited by the host strain's biotype . In recent years, atypical El Tor strains with CTX phages that appear to be formed by the mosaics of CTX-cla and CTX-1 have been around the world.

CTX-1과 CTX-O139 파지의 복제가 실험실 조건에서 가능하다는 증거와, Wave 2, 3 atypical El Tor 균주가 만들어지는 기전 등의 증거들은 CTX-cla 파지와 그 유사 파지인 CTX-2의 복제가 자연계에서는 발생하고 있으나, 실험적으로 증명되지는 않고 있다는 것을 암시하고 있다. Evidence that cloning of CTX-1 and CTX-O139 phage is possible under laboratory conditions and evidence of the mechanism by which the Wave 2 and 3 atypical El Tor strains are made suggest that the cloning of the CTX-cla phage and its analogous phage, CTX-2 It occurs in the natural world, but it implies that it is not proven experimentally.

한편, 종래의 CTX 파지의 복제는 CTX 파지가 이미 용원화되어 있는 El Tor 바이오타입 콜레라균을 이용하여 CTX 파지를 복제하였고(도 1, Brigid M Davis et al. Current Opinion in Microbiology, 2003, 6: 35-42), CTX^E1 ^Tor(CTX-1)는 프로파지 상태에서 복제형으로 만들어지는 것도 가능하고, 형질도입도 가능한 것으로 알려져 있다. 다만, CTX-CTX 리피트나 CTX-RS1의 배열이 필요하며, 이때 복제된 CTX-1은 classical 바이오타입 균주로만 형질도입이 가능한 것으로 알려져 있었다. CTX-1의 복제형은 플라스미드와 같은 형태를 가지며(pCTX-1), classical 바이오타입으로 형질도입된 복제형의 CTX-1은 CTX 파지를 복제하고 다른 classical 균주로 CTX 파지를 형질도입시킬 수 있다.On the other hand, conventional cloning of CTX phage replicated the CTX phage using El Tor biotypic cholera, which CTX phage has already been used (Fig. 1, Brigid M Davis et al. Current Opinion in Microbiology , 2003, 35-42), and CTX ^E1 ^Tor (CTX-1) can be made into a replicative form in a prophage state, and it is known that transduction is also possible. However, CTX-CTX repeats and CTX-RS1 sequences are required, and it is known that the replicated CTX-1 can only be transfected with classical biotypes. The replicative form of CTX-1 is plasmid-like (pCTX-1), and the cloned CTX-1 transduced with the classical biotypes can replicate the CTX phage and transduce the CTX phage into other classical strains .

반면, CTX^cla는 CTX-CTX 배열도 없고, 형질도입이 가능한 E1 Tor 균주가 없어 복제가 되지 않는 것으로 알려져 있으며, CTX^cla 와 CTX-2의 실험실 조건에서의 복제는 증명된 바 없었다.On the other hand, CTX ^cla has no CTX-CTX sequence and is not replicable because there is no transgenic E1 Tor strain. CTX ^cla And CTX-2 in laboratory conditions have not been proven.

Waldor MK et al. 1996. Science. 272: 1910-1914 Waldor MK et al. 1996. Science. 272: 1910-1914 Davis BM et al. 1999. J. Bacteriol. 181: 6779-6787 Davis BM et al. 1999. J. Bacteriol. 181: 6779-6787 Davis BM et al. 2000. J Bacteriol. 182: 6992-6998 Davis BM et al. 2000. J Bacteriol. 182: 6992-6998 Faruque SM et al. 2007. Proc Natl Acad Sci U S A. 104: 5151-5156 Faruque SM et al. 2007. Proc Natl Acad Sci U S A. 104: 5151-5156

본 발명의 목적은 CTX 파지 감염을 위한 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae) 변이 균주 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.An object of the present invention is Vibrio for CTX phage infection, cholera (Vibrio cholerae ) mutant strain and a method for producing the same.

본 발명의 다른 목적은 상기 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae) 변이 균주를 이용하여 CTX 파지의 감염 효율을 개선하는 방법을 제공하는 것이다.Another object of the invention is the V. cholera (Vibrio cholerae mutant strains to improve the infection efficiency of the CTX phage.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae) 변이 균주를 이용하여 콜레라 독소의 생산 수율을 개선하는 방법을 제공하는 것이다.A further object of the present invention is the V. cholera (Vibrio cholerae mutant strains to improve production yield of cholera toxin.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 toxT 유전자의 점돌연변이를 통해 139번째 아미노산이 티로신(Tyr)에서 페닐알라닌(Phe)으로 치환된 SEQ ID NO: 2의 toxT 단백질을 발현하는 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae) 변이 균주를 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention is amino acid 139 of SEQ ID NO is substituted with phenylalanine (Phe) in the tyrosine (Tyr) from the point mutation of the gene toxT: Vibrio expressing 2 protein toxT cholera (Vibrio cholerae mutant strains.

본 발명은 또한 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae) 균주의 toxT 유전자의 139번째 코돈 UAU 에 대해 UUU로의 점돌연변이를 유발하여 139번째 아미노산이 티로신(Tyr)에서 페닐알라닌(Phe)으로 치환된 SEQ ID NO: 2의 toxT 단백질이 발현되도록 하는 단계를 포함하는 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae) 변이 균주의 제조 방법을 제공한다.The invention also V. cholera (Vibrio cholerae ) to cause a point mutation in UUU with respect to the 139th codon UAU of the toxT gene so that the 139th amino acid is expressed in the toxT protein of SEQ ID NO: 2 substituted with phenylalanine (Phe) in tyrosine (Tyr) Vibrio cholerae including (Vibrio cholerae mutant strains.

본 발명은 또한 CTX-1, CTX-cla, CTX-2, CTX-env 및 CTX-O139로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 CTX 파지 복제용 재조합 플라스미드를 toxT 유전자의 점돌연변이를 통해 139번째 아미노산이 티로신(Tyr)에서 페닐알라닌(Phe)으로 치환된 SEQ ID NO: 2의 toxT 단백질을 발현하는 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae) 변이 균주에 형질도입하는 단계를 포함하는 CTX 파지의 감염 효율 개선 방법을 제공한다.The present invention also provides a recombinant plasmid for cloning one or more CTX phages selected from the group consisting of CTX-1, CTX-cla, CTX-2, CTX-env and CTX-O139 through a point mutation of the toxT gene, Tyr) with phenylalanine (Phe), which expresses the toxT protein of SEQ ID NO: 2 ( Vibrio cholerae ) mutant strain of the CTX phage.

본 발명은 또한 CTX-1, CTX-cla, CTX-2, CTX-env 및 CTX-O139로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 CTX 프로파지를 포함하는 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae) 균주를 도너 균주로 사용하여, toxT 유전자의 점돌연변이를 통해 139번째 아미노산이 티로신(Tyr)에서 페닐알라닌(Phe)으로 치환된 SEQ ID NO: 2의 toxT 단백질을 발현하는 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae) 변이 균주에 감염시키는 단계를 포함하는 CTX 파지의 감염 효율 개선 방법을 제공한다.The present invention also provides a method for screening a donor strain using Vibrio cholerae strains comprising one or more CTX promoters selected from the group consisting of CTX-1, CTX-cla, CTX-2, CTX-env and CTX- through point mutations in the gene toxT 139th amino acids of SEQ ID NO replaced with phenylalanine (Phe) in the tyrosine (Tyr): Vibrio expressing 2 protein toxT cholera (Vibrio cholerae ) mutant strain of the CTX phage.

본 발명은 또한 CTX-1, CTX-cla, CTX-2, CTX-env 및 CTX-O139로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 CTX 프로파지를 포함하는 상기의 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae) 변이 균주를 30 내지 37℃, pH 6 내지 8의 조건에서 단상(single phase) 배양하는 단계를 포함하는 콜레라 독소의 생산 수율 개선 방법을 제공한다.The present invention also provides a method for producing the above Vibrio cholerae mutant strain comprising at least one CTX protein selected from the group consisting of CTX-1, CTX-cla, CTX-2, CTX-env and CTX- And a step of culturing the cells in a single phase under the conditions of a pH of 6 to 8, and a method for improving the production yield of cholera toxin.

본 발명의 toxT 유전자의 점돌연변이를 통해 Tyr139이 Phe로 치환된 toxT 단백질을 발현하는 비브리오 콜레라 변이 균주는 CTX 파지가 감염되기 위한 파지 수용체인 TcpA의 발현을 증가시키고, 이에 따라 CTX 파지에 의해 감염될 수 있는 형질도입 수용체 균주가 될 수 있다. 또한, toxT 돌연변이 균주에서 콜레라 독소의 발현이 증가되며, 단상 배양에서도 콜레라 독소의 생산이 가능하다.The Vibrio cholera mutant strain expressing the toxT protein in which Tyr139 is substituted with Phe through the point mutation of the toxT gene of the present invention increases the expression of TcpA, a phage receptor for the CTX phage infection, Lt; RTI ID = 0.0 > receptor < / RTI > In addition, cholera toxin expression is increased in toxT mutant strains, and cholera toxin production is possible in single phase culture.

또한, 본 발명은 CTX 파지 복제용 재조합 플라스미드의 형질도입, 상기 재조합 플라스미드와 프로파지의 재조합 등을 통해 비브리오 콜레라 변이 균주에서 다양한 CTX 배열을 갖는 비브리오 콜레라 변이 균주를 제공한다.The present invention also provides a Vibrio cholera mutant strain having various CTX sequences in a Vibrio cholera mutant strain through transfection of a recombinant plasmid for CTX phage replication, recombination of the recombinant plasmid and a protease.

도 1은 toxT에 139Y를 가지는 균주와 139F로 점돌연변이를 도입한 균주에서 CTX 파지 감염시 수용체로 작용하는 TcpA의 발현양을 웨스턴 블랏으로 비교한 결과이다. 동일한 균주의 toxT 유전자의 139번 아미노산을 Tyr로 가지는 경우와 Phe로 치환된 경우의 TcpA의 발현양을 비교하였다. 화살표로 표시된 TcpA 단백질 발현을 볼 수 있으며, 어떤 균주든지 139번 아미노산이 Phe로 치환된 경우에는 TcpA가 발현되지만 139번 아미노산이 Tyr인 경우 발현이 되지 않는다. O395는 classical 바이오타입 균주로 TcpA의 발현이 기존에 증명되어 있는 균주이다.
도 2는 ctxA 발현에 대한 분석결과로, CtxA 발현을 보여주는 웨스턴 블랏 사진도(a)와 웨스턴블랏에 사용된 동일한 시료를 쿠마시 블루 염색한 젤 사진도(b)이다. CtxA의 발현은 항-콜레라 독소 항체를 이용한 면역 블랏을 통해 시험하였다. 약 5×10⁷ 세포를 각 레인에 로딩하였다. 레인 1과 2는 O395, 레인 3과 4는 MG116025-toxT-139F, 레인 5와 6은 MG116025-toxT-139Y, 레인 7과 8은 IB4122-toxT-139Y, 레인 9와 10은 IB4122-toxT-139F, 레인 11과 12는 A213-toxT-139Y, 레인 13과 14는 A213-toxT139F이다. 홀수는 37℃에서 LB 배지에서 배양된 박테리아 샘플이며, 짝수는 30℃에서 LB 배지(pH 6.5)에서 배양된 박테리아 샘플이고, 화살표는 ctxA를 의미한다. 어떠한 균주라도 toxT의 139번 아미노산이 Phe인 경우 30℃에서 배양하였을 때 콜레라 독소가 발현된다. O395는 classical 바이오타입 균주로 30℃, pH 6.5로 배양하였을 경우 독소가 생산되는 것이 기존에 검증되어 있는 균주이다.
도 3은 pCTX-1과 CTX-2 프로파지의 탠덤 리피트 간의 재조합에 의한 pCTX-2의 생성 과정을 도시한 것으로, (a)는 B33에서 pCTX-1-kan-N1과 CTX-2의 탠덤 리피트 간의 rstR 교환을 도시하고, (b)는 가상의 classical 균주에서 pCTX-1과 CTX-cla의 탠덤 리피트 간의 재조합에 의한 pCTX-2의 생성 가능성을 도시한다.
도 4는 classical 바이오타입 균주, O395 및 균주 PM37에서 CTX 배열을 도시한 것이다.
도 5는 MG116025 및 이의 유도체 균주의 CTX 배열을 도시한 것으로, PM25~PM29는 CTX-1, RS1, 및 TLC의 단계적 제거를 통해 구축되며, PM30~PM36은 모 균주에 CTX-2-kan-N2 및 CTX-1-kan-N2의 삽입을 통해 구축된 것이다.
도 6은 균주 B33 및 이의 유도체 균주의 CTX 배열을 도시한 것으로, PM38은 B33의 1번 염색체에 pCTX-1-kan-N2이 삽입되어 구축되며, PM21은 B33의 2번 염색체로부터 CTX-1 프로파지를 제거하여 구축되며, PM39와 PM40은 PM21의 1번 염색체에 각각 pCTX-1-kan-N2 및 pCTX-2-kan-N2이 삽입되어 구축된 것이다.
도 7은 A213으로부터 구축된 균주의 CTX 배열을 도시한 것으로, 다양한 CTX 배열을 이용한 균주의 디자인 및 구축에 대한 개념이 증명됨에 따라, TLC만을 함유하는 비-독성 균주 A213으로부터 구축된 다양한 균주를 나타낸다.FIG. 1 shows the results of Western blot comparing the amount of expression of TcpA acting as a receptor for CTX phage infection in strains having 139Y and 139F mutants in toxT and 139F, respectively. We compared the expression of TcpA with the amino acid 139 of the toxT gene of the same strain and the case of The substitution with Phe. TcpA protein expressed by the arrow can be seen. In any strain, TcpA is expressed when the amino acid 139 is substituted with Phe, but not when the amino acid 139 is Tyr. O395 is a classical biotypic strain that has been proven to be an expression of TcpA.
Fig. 2 shows the Western blot photograph showing CtxA expression and the gel photograph (b) showing Coomassie blue staining of the same sample used in western blot analysis as a result of analysis of ctxA expression. Expression of CtxA was tested by immunoblotting with anti-cholera toxin antibody. Approximately 5 x 10 < ⁷ > cells were loaded into each lane. Lanes 1 and 2 are O395, lanes 3 and 4 are MG116025-toxT-139F, lanes 5 and 6 are MG116025-toxT-139Y, lanes 7 and 8 are IB4122-toxT-139Y, lanes 9 and 10 are IB4122- Lanes 11 and 12 are A213-toxT-139Y, and lanes 13 and 14 are A213-toxT139F. The odd number is the bacterial sample cultured in LB medium at 37 ° C, the even number is the bacterial sample cultured at 30 ° C in LB medium (pH 6.5), and the arrow indicates ctxA. When any of the strains of toxT is Phe at amino acid 139, the cholera toxin is expressed when cultured at 30 ° C. O395 is a classical biotypic strain that has been proven to produce toxins when cultured at 30 ° C and pH 6.5.
Figure 3 shows the production of pCTX-2 by recombination between pCTX-1 and tandem repeats of CTX-2 prophage. (A) shows the tandem repeats of pCTX-1-kan-N1 and CTX- It illustrates the exchange between rstR and, (b) shows a generation probability of pCTX-2 by recombination between the tandem repeat of pCTX-1 and CTX-cla in classical strains of the virtual.
Figure 4 shows CTX sequences in the classical bio-type strain, O395 and strain PM37.
Figure 5 shows the CTX sequence of MG116025 and its derivative strains, PM25 to PM29 being constructed through the phased elimination of CTX-1, RS1, and TLC, and PM30 to PM36 as CTX-2-kan-N2 And insertion of CTX-1-kan-N2.
FIG. 6 shows the CTX sequence of the strain B33 and its derivative strain. PM38 is constructed by inserting pCTX-1-kan-N2 into chromosome 1 of B33 and PM21 from CTX-1 pro PM39 and PM40 were constructed by inserting pCTX-1-kan-N2 and pCTX-2-kan-N2 into PM21 chromosome 1, respectively.
Figure 7 shows the CTX sequence of the strain constructed from A213 and demonstrates various strains constructed from non-toxic strain A213 containing only TLC, as evidenced by the concept of design and construction of strains using various CTX sequences .

일반적으로 CTX^El ^Tor(CTX-1)는 프로파지 상태에서 복제형으로 만들어지는 것도 가능하고 형질도입 역시 가능하나, CTX-CTX 리피트나 CTX-RS1의 배열이 필요하며, classical 바이오타입의 균주만 CTX-1 파지의 형질도입을 받을 수 있는 것으로 알려져 있었다. 또한, CTX^cla (CTX-cla)는 CTX:CTX나 CTX:RS1 배열도 없고, 형질도입으로 받을 수 있는 El Tor 균주가 없어서 복제가 실험실 조건에서 증명되지 않았다.CTX ^El ^Tor (CTX-1) can be replicated in the prophage state and can be transfected, but CTX-CTX repeats and CTX-RS1 sequences are required. Only the classical biotypes are CTX -1 phage. &Lt; / RTI > Also, CTX ^cla (CTX-cla) did not have CTX: CTX or CTX: RS1 sequences and no El Tor strains were available for transduction, so cloning was not proven in laboratory conditions.

이에, 본 발명자들은 CTX-cla의 실험실 조건에서의 플라스미드 기반의 CTX 파지 복제 시스템을 구축하고, CTX 파지에 의해 형질도입될 수 있는 El Tor 변이 균주를 제작하여 복제 과정을 증명하였다.Thus, the present inventors constructed a plasmid-based CTX phage cloning system in a laboratory condition of CTX-cla and proved the replication process by producing an El Tor mutation strain capable of being transduced by CTX phage.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 본 발명자들은 El Tor 바이오타입의 균주들 중에서 CTX-2와 CTX-cla에 의해 형질도입되는 균주를 찾아내었다. 이 El Tor 균주는 tcpA와 ctxAB의 전사활성인자인 toxT 유전자에 다른 비브리오 콜레라(V. cholerae)와 비교하여 하나의 단일염기다형성(SNP)를 가지고 있는데, 다른 El Tor 균주들은 139번째 아미노산이 티로신(Tyr)인데 비하여(SEQ ID NO: 1), 이 균주는 toxT 유전자의 139번째 아미노산이 페닐알라닌(Phe)이다(SEQ ID NO: 2). 이 돌연변이로 인해 이 균주는 CTX 파지에 의해 형질도입되고, 실험실 조건에서 콜레라 독소를 생산할 수 있다. toxT의 이 SNP를 (139Phe) 다른 El Tor 균주의 toxT 대립형질(139Tyr)로 바꾸면 형질도입 수용체 균주(transduction recipient)로 작용하지 못하게 된다. 다른 El Tor 균주들의 toxT에 SNP(139Phe)를 도입하면 CTX 파지에 의해 감염될 수 있다. toxT가 tcp의 발현과 동시에 ctxAB의 발현도 직접 전사 활성화할 수 있으므로 El Tor 균주들을 단상(single phase) 배양하였을 때 독소 발현도 증가할 수 있는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 복수개의 CTX 파지 복제용 재조합 플라스미드를 사용하여 복수의 CTC 프로파지를 동시에 가지는 E1 Tor 균주의 제작이 가능하였다.According to one embodiment of the present invention, the inventors have found strains transformed by CTX-2 and CTX-cla among strains of El Tor bio-type. This El Tor strain has one single nucleotide polymorphism (SNP) compared to other V. cholerae in the toxT gene, which is a transcription activator of tcpA and ctxAB , while the other El Tor strains have the 139th amino acid tyrosine (SEQ ID NO: 1), whereas the 139th amino acid of the toxT gene is phenylalanine (Phe) (SEQ ID NO: 2). Because of this mutation, this strain is transduced by CTX phage and can produce cholera toxin under laboratory conditions. Replacing this SNP of toxT with (139Phe) the toxT allele of other El Tor strains (139Tyr) will not work as a transduction recipient. Introducing SNP (139Phe) into toxT of other El Tor strains can be infected by CTX phage. Since toxT can directly activate ctxAB expression simultaneously with the expression of tcp , it can be confirmed that the expression of toxin can be increased when a single phase of El Tor strains is cultured. Furthermore, it was possible to produce an E1 Tor strain having a plurality of CTC promoters simultaneously using a plurality of recombinant plasmids for CTX phage replication.

따라서, 본 발명은 toxT 유전자의 점돌연변이를 통해 139번째 아미노산이 티로신(Tyr)에서 페닐알라닌(Phe)으로 치환된 SEQ ID NO: 2의 toxT 단백질을 발현하는 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae) 변이 균주를 제공한다. Accordingly, the invention is amino acid 139 of SEQ ID NO is substituted with phenylalanine (Phe) in the tyrosine (Tyr) from the point mutation of the gene toxT: Vibrio expressing 2 protein toxT cholera (Vibrio cholerae mutant strains.

본 발명은 또한 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae) 균주의 toxT 유전자의 139번째 코돈 UAU 에 대해 UUU로의 점돌연변이를 유발하여 139번째 아미노산이 티로신(Tyr)에서 페닐알라닌(Phe)으로 치환된 SEQ ID NO: 2의 toxT 단백질이 발현되도록 하는 단계를 포함하는 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae) 변이 균주의 제조 방법을 제공한다. The invention also V. cholera (Vibrio cholerae ) to cause a point mutation in UUU with respect to the 139th codon UAU of the toxT gene so that the 139th amino acid is expressed in the toxT protein of SEQ ID NO: 2 substituted with phenylalanine (Phe) in tyrosine (Tyr) Vibrio cholerae including (Vibrio cholerae mutant strains.

본 발명의 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae) 변이 균주를 제조하기 위해 사용되는 균주로, classical 바이오타입, E1 Tor 바이오타입, atypical E1 Tor 바이오타입 또는 O139 바이오타입의 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae)를 사용할 수 있다.V. of the present invention cholera (Vibrio cholerae) variation in the strain used to make the strain, classical bio type, E1 Tor bio type, atypical E1 Tor V. cholera O139 bio type or types of bio (Vibrio cholerae ) can be used.

상기 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae) 변이 균주는 toxT 유전자의 점돌연변이를 통해 139번째 아미노산이 티로신(Tyr)에서 페닐알라닌(Phe)으로 치환된 SEQ ID NO: 2의 toxT 단백질을 발현하는 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae) 균주라면 제한없이 사용할 수 있고, 예컨대, MG116025(Matlab type III)-toxT^Y139F 균주, B33-toxT^Y139F 균주, A213-toxT^Y139F 균주 또는 IB4122-toxT^Y139F 균주 등을 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. The V. cholera (Vibrio cholerae) mutant strain is the 139 amino acid tyrosine (the SEQ ID NO replaced with phenylalanine (Phe) at Tyr) via a point mutation of the gene toxT: Vibrio expressing 2 protein toxT cholera (Vibrio cholerae strains can be used without limitation. Examples ^include strains MG116025 (Matlab type III) -toxT ^Y139F , B33-toxT ^Y139F , A213-toxT ^Y139F and IB4122-toxT ^Y139F . Do not.

본 발명의 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae) 변이 균주는 CTX-1, CTX-cla, CTX-2, CTX-env, CTX-O139 또는 이들의 조합에서 선택된 CTX 프로파지를 포함할 수 있다.V. of the present invention cholera (Vibrio cholerae mutant strains may comprise a CTX probe selected from CTX-1, CTX-cla, CTX-2, CTX-env, CTX-O139 or combinations thereof.

상기 CTX 프로파지는 CTX-1, CTX-cla, CTX-2, CTX-env 및 CTX-O139로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 CTX 파지 복제용 재조합 플라스미드를 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae) 변이 균주에 형질도입하거나; 또는 CTX-1, CTX-cla, CTX-2, CTX-env 및 CTX-O139로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 CTX 프로파지를 포함하는 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae) 균주를 도너 균주로 사용하여 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae) 변이 균주에 감염시켜 포함할 수 있다.The CTX Pro phage cholera vibrio the CTX-1, CTX-cla, CTX-2, CTX-env and one or more CTX phage cloning recombinant plasmids for a selected from the group consisting of CTX-O139 (Vibrio cholerae ) mutant; Or CTX-1, CTX-cla, Vibrio cholera (Vibrio comprising one or more pro CTX phage selected from the group consisting of 2-CTX, CTX and CTX-env-O139 Use cholerae) strains with a donor strain of Vibrio cholera (Vibrio cholerae ) mutant strains.

본 명세서에서, 용어 "프로파지, prophage"는 비감염성 형태로 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae) 세포 내에 유지되는 파지 상태로, 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae)의 염색체의 특정부위에 삽입되어 있거나, 염색체 밖에 플라스미드 형태로 존재하는 것일 수 있다.As used herein, the term "pro phage, prophage" is a gripping state is held in the V. cholera (Vibrio cholerae) cells with non-infectious form, Vibrio cholera (Vibrio cholerae ), or may exist in a plasmid form outside the chromosome.

본 명세서에서, 용어 "도너 균주, 또는 공여체"는 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae) CTX 파지의 공여체로서 CTX 파지가 용원성 파지(lysogen)로 염색체에 삽입되어 있는 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae) 균주를 의미한다.As used herein, the term "donor strains, or donor" is V. cholera (Vibrio cholerae ) as a donor of the CTX phage and a CTX phage inserted into the chromosome as a lysogen ( Vibrio cholerae ).

본 명세서에서, 용어 "수용체 균주"는 공여체에서 생산된 CTX 파지가 감염되는 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae) 균주를 의미한다.As used herein, the term "receptor strain" is Vibrio cholerae which the CTX phage production from infected donors (Vibrio cholerae ).

본 발명의 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae) 변이 균주는 TcpA 단백질의 발현양이 야생형 toxT 단백질을 발현하는 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae) 균주 대비 증가함으로써 ctxAB 발현도 직접 전사 활성화할 수 있으므로 콜레라 독소의 발현을 증가시킬 수 있다.V. of the present invention cholera (Vibrio cholerae) mutant strain of Vibrio cholerae that expression of the wild-type protein TcpA toxT protein (Vibrio cholerae ), the expression of ctxAB can also directly activate transcription, thus increasing the expression of cholera toxin.

본 발명의 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae) 변이 균주는 CTX 파지 감염을 위한 수용체 균주로 사용되어 형질도입의 효율을 개선할 수 있다.V. of the present invention cholera (Vibrio cholerae ) mutant strain can be used as a receptor strain for CTX phage infection to improve the efficiency of transduction.

따라서, 본 발명은 또한 CTX-1, CTX-cla, CTX-2, CTX-env 및 CTX-O139로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 CTX 파지 복제용 재조합 플라스미드를 toxT 유전자의 점돌연변이를 통해 139번째 아미노산이 티로신(Tyr)에서 페닐알라닌(Phe)으로 치환된 SEQ ID NO: 2의 toxT 단백질을 발현하는 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae) 변이 균주에 형질도입하는 단계를 포함하는 CTX 파지의 감염 효율 개선 방법을 제공한다.Accordingly, the present invention also provides a recombinant plasmid for cloning one or more CTX phages selected from the group consisting of CTX-1, CTX-cla, CTX-2, CTX-env and CTX-O139 through a point mutation of the toxT gene, A method for improving the infection efficiency of a CTX phage comprising the step of transfecting a Vibrio cholerae mutant strain expressing a toxT protein of SEQ ID NO: 2 substituted with phenylalanine (Phe) in tyrosine (Tyr).

또한, 본 발명은 CTX-1, CTX-cla, CTX-2, CTX-env 및 CTX-O139로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 CTX 프로파지를 포함하는 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae) 균주를 도너 균주로 사용하여, toxT 유전자의 점돌연변이를 통해 139번째 아미노산이 티로신(Tyr)에서 페닐알라닌(Phe)으로 치환된 SEQ ID NO: 2의 toxT 단백질을 발현하는 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae) 변이 균주에 감염시키는 단계를 포함하는 CTX 파지의 감염 효율 개선 방법을 제공한다.The present invention also provides a method for producing a CTX-1 strain, which comprises using a Vibrio cholerae strain containing at least one CTX protein selected from the group consisting of CTX-1, CTX-cla, CTX-2, CTX-env and CTX- , via a point mutation of the gene toxT 139th amino acid of SEQ ID NO it is substituted with phenylalanine (Phe) in the tyrosine (Tyr): Vibrio expressing 2 protein toxT cholera (Vibrio cholerae ) mutant strain of the CTX phage.

본 발명은 또한 CTX-1, CTX-cla, CTX-2, CTX-env 및 CTX-O139로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 CTX 프로파지를 포함하는 상기의 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae) 변이 균주를 30 내지 37℃, pH 6 내지 8의 조건에서 단상(single phase) 배양하는 단계를 포함하는 콜레라 독소의 생산 수율 개선 방법에 관한 것이다. The invention also CTX-1, CTX-cla, CTX-2, CTX-env and V. cholera in the comprising at least one pro CTX phage selected from the group consisting of CTX-O139 (Vibrio cholerae mutant strains at a temperature of 30 to 37 DEG C and a pH of 6 to 8. The present invention relates to a method for improving the production yield of cholera toxin.

일반적으로 E1 Tor 균주는 일반적인 실험 조건에서는 콜레라 독소 생산을 유도할 수 없어 AKI 조건(2상 배양, 정지 상태에서 16시간 배양하다가 진탕 배양으로 배양 조건을 달리하는 방법), 산소 분압을 낮추고 CO₂ 분압을 높이는 방법을 사용하여 콜레라 독소가 생산되는 조건을 유도하나 단상 배양(진탕 배양으로만 균주를 배양하는 조건)에서는 콜레라 독소가 만들어 지지 않는다.Typically, E1 Tor strain can not be induced to cholera toxin production in the general experimental conditions AKI condition (two-phase culture, while 16 hours of incubation in a stationary way to different culture conditions by shaking culture), lowering the oxygen partial pressure of CO ₂ partial pressure To induce the conditions under which the cholera toxin is produced, but no cholera toxin is produced in a single phase culture (a condition in which a strain is cultured only by shake culture).

이에 반해, 본 발명의 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae) 변이 균주는 30 내지 37℃, pH 6 내지 8의 조건에서 단상 배양을 통해 콜레라 독소가 생산될 수 있다. On the other hand, according to the present invention V. cholera (Vibrio cholerae mutant strains can produce cholera toxin through single phase culture at 30 to 37 DEG C and pH 6 to 8.

상기 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae) 변이 균주로, toxT 유전자의 점돌연변이를 통해 139번째 아미노산이 티로신(Tyr)에서 페닐알라닌(Phe)으로 치환된 SEQ ID NO: 2의 toxT 단백질을 발현하는 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae) 균주라면 제한없이 사용할 수 있고, 예컨대, MG116025(Matlab type III)-toxT^Y139F 균주, B33-toxT^Y139F 균주, A213-toxT^Y139F 균주 또는 IB4122-toxT^Y139F 균주 등을 사용할 수 있다. The V. cholera (Vibrio cholerae ) mutant, which expresses the toxT protein of SEQ ID NO: 2 in which the 139th amino acid has been substituted with phenylalanine (Phe) in tyrosine (Tyr) through point mutation of the toxT gene ( Vibrio cholerae strains can be used without limitation. For example, MG116025 (Matlab type III) -toxT ^Y139F strain, B33-toxT ^Y139F strain, A213-toxT ^Y139F strain or IB4122-toxT ^Y139F strain can be used.

본 발명에 따라 사용될 수 있는 배지는 일반적으로 하나 이상의 탄소 공급원, 질소 공급원, 무기염, 비타민 및 (또는) 미량 원소를 포함한다. 바람직한 탄소 공급원은 단당류, 이당류 또는 다당류와 같은 당류이다. 질소 공급원은 일반적으로 유기 또는 무기 질소 화합물, 또는 이들 화합물을 포함하는 물질이다. 질소 공급원의 예로는 암모니아 기체 또는 암모늄 염, 예컨대 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 또는 질산암모늄, 니트레이트, 우레아, 아미노산, 또는 복합 질소 공급원, 예컨대 옥수수 침지액, 대두 분말, 대두 단백질, 효모 추출물, 육류 추출물 등이 있다. 질소 공급원은 단독으로 또는 혼합물로 사용할 수 있다. 배지에 존재할 수 있는 무기염 화합물은 칼슘, 마그네슘, 나트륨, 코발트, 몰리브데늄, 칼륨, 망간, 아연, 구리 및 철의 염화물, 인산염 또는 황산염을 포함한다. 인 공급원으로서, 인산, 인산2수소 칼륨 또는 인산수소 2칼륨, 또는 대응하는 나트륨-함유 염을 사용할 수 있다. 용액 중 금속 이온을 유지시키기 위해 배지에 킬레이팅제를 첨가할 수 있다. 보다 구체적으로, CTX 파지의 복제를 증진시키기 위해 나노몰 농도의 마이토마이신 C를 첨가할 수 있다. 배지의 모든 성분은 가열 (1.5 bar 및 121℃에서 20분) 또는 멸균 여과에 의해 멸균시킨다. 이 성분들은 함께, 또는 필요에 따라 개별적으로 멸균시킬 수 있다. 배지의 모든 성분은 배양 시작 시에 존재할 수 있거나, 임의로는 연속 또는 배치식으로 첨가될 수 있다.The media which can be used according to the present invention generally comprise at least one carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, vitamins and / or trace elements. Preferred carbon sources are sugars such as monosaccharides, disaccharides or polysaccharides. The nitrogen source is generally an organic or inorganic nitrogen compound, or a material comprising these compounds. Examples of nitrogen sources include ammonia gas or ammonium salts such as ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium carbonate or ammonium nitrate, nitrates, urea, amino acids, or complex nitrogen sources such as corn steep liquor, Yeast extract, and meat extract. The nitrogen source may be used alone or as a mixture. Inorganic salt compounds which may be present in the medium include chloride, phosphate or sulfate of calcium, magnesium, sodium, cobalt, molybdenum, potassium, manganese, zinc, copper and iron. As the phosphorus source, phosphoric acid, potassium dihydrogenphosphate or dipotassium hydrogenphosphate, or the corresponding sodium-containing salts may be used. A chelating agent may be added to the medium to maintain metal ions in solution. More specifically, to promote replication of the CTX phage, a nanomolar concentration of mitomycin C can be added. All components of the medium are sterilized by heating (1.5 bar and 121 ° C for 20 minutes) or by sterile filtration. These ingredients can be sterilized together, or individually as needed. All components of the medium may be present at the start of the culture, or may optionally be added continuously or batchwise.

상기의 형질전환 균주를 단상 배양하고, 이의 균체, 상기 균주 배양물, 상기 균주의 파쇄물 또는 배양물의 파쇄물로부터 콜레라 독소를 분리 정제하여 콜레라 독소를 얻을 수 있다.The cholera toxin can be obtained by single-phase culture of the above-mentioned transformant strain, isolating and purifying the cholera toxin from the microbial cells, the culture of the strain, the lysate of the strain or the lysate of the culture.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to examples. However, the following examples are illustrative of the present invention, and the present invention is not limited to the following examples.

<실시예 1> El Tor 균주인 N16961에서 생산되는 CTX 파지의 형질도입Example 1 Transfection of CTX phage produced by El Tor strain N16961

El Tor 균주인 N16961은 1번 염색체에 CTX:RS1 배열을 가지며 이 배열로부터 CTX-1 파지가 복제, 생산될 수 있다. CTX-1이 생산되는 것은 CTX 게놈에 카나마이신 카세트를 도입한 균주인 PM20으로부터 CTX-1kan이 만들어져서 O395 형질도입 수용체 균주로 전달되어 O395 균주가 카나마이신에 내성을 가진 균주로 변화하는 것으로 증명될 수 있다. El Tor strain N16961 has a CTX: RS1 sequence on chromosome 1, from which CTX-1 phage can be cloned and produced. The production of CTX-1 can be demonstrated by the production of CTX-1 kan from PM20, a strain that introduced a kanamycin cassette into the CTX genome, and then to O395 transduction receptor strains, transforming the strain O395 into a strain resistant to kanamycin .

표 1 내지 3은 다양한 콜레라 균주와 그 유도체 균주들을 보여준다. 표 4는 실험에 사용된 pCTX 파지를 나타낸다.Tables 1 to 3 show various cholera strains and their derivative strains. Table 4 shows the pCTX phage used in the experiment.

PM20 균주로부터 CTX-1kan 파지가 만들어져서 형질도입 수용체 균주인 O395 균주로 약 10⁵ 형질도입 균주가 만들어질 수 있다(공여체 균주 배양액 1 mL당 수용체 균주의 형질도입 빈도). 수용체 균주를 MG116025-toxT-139F, MG116025-toxT-139Y, A213-toxT-139Y, A213-toxT-139F, IB4122 toxT-139Y, IB4122-toxT-139F 균주를 사용하였을 경우, toxT에 139F 돌연변이가 도입된 균주에서만 CTX-1kan에 의해 형질도입되는 것을 확인할 수 있다(표 5). CTX-1Kan phage was generated from the PM20 strain to produce about 10 ⁵ transgenic strains as the transformed receptor strain O395 (the frequency of transduction of the receptor strains per 1 mL of the donor strain culture). A 139F mutation was introduced in toxT when the receptor strains MG116025-toxT-139F, MG116025-toxT-139Y, A213-toxT-139Y, A213-toxT-139F, IB4122 toxT-139Y and IB4122- It is confirmed that CTX-1 kan is transduced only in the strain (Table 5).

동일한 균주들의 TcpA 단백질 발현 양상을 웨스턴 블랏으로 확인하면 toxT에 139F 돌연변이가 도입된 경우 TcpA의 발현이 증가함을 확인할 수 있다(도 1). 즉 toxT 139F 돌연변이를 통해 CTX 파지 감염시 수용체로 작용하는 TcpA의 발현이 증가하고 이에 따라 CTX 파지에 의한 감염(형질도입) 효율이 증가하는 것을 확인할 수 있다.Western blot analysis of TcpA protein expression in the same strains revealed that expression of TcpA was increased when 139F mutation was introduced into toxT (FIG. 1). In other words, the mutation of toxT 139F increases the expression of TcpA, which acts as a receptor in CTX phage infection, and thus the infection (transduction) efficiency by CTX phage is increased.

<실시예 2> Wave 2 El Tor 균주의 염색체 2에 있는 CTX-2 탠덤 리피트(tandem repeat)에서 CTX-2 파지 생산Example 2 Production of CTX-2 Phage from CTX-2 Tandem Repeat on Chromosome 2 of a Wave 2 El Tor Strain

Wave 2 atypical El Tor 균주가 가지고 있는 특징인 염색체 2의 CTX-2 탠덤 리피트(tandem repeat)에서 CTX-2가 만들어질 수 있을지 확인해 볼 수 있다. 이러한 구조를 가지는 대표적 균주인 B33 균주에서는 CTX 파지 자손이 만들어지지 않는다고 알려져 있었지만(참고문헌: Faruque SM et al. 2007. Proc Natl Acad Sci U S A. 104: 5151-5156), 이는 CTX-2 파지가 생산되었더라도 CTX-2 파지가 감염되기 위한 수용체 균주가 적당하지 않아서 형질도입을 실험실 조건에서 볼 수 없었기 때문이었을 것이다.We can confirm that CTX-2 can be made in CTX-2 tandem repeats of chromosome 2, a feature of the Wave 2 atypical El Tor strain. It has been known that the B33 strain, which is a representative strain having this structure, does not produce CTX phage progeny (Reference: Faruque SM et al. 2007. Proc Natl Acad Sci US A. 104: 5151-5156) Even if it was produced, the receptor for CTX-2 phage infection would not be suitable, and the transduction could not be observed under laboratory conditions.

V212-1의 염색체 2의 탠덤 리피트로 되어 있는 CTX-2의 앞쪽 CTX-2를 kan으로 바꾼 다음(균주 PM9), 자손 바이러스가 나오는지 O395, MG116025-toxT-139F, MG116025-toxT-139Y, A213-toxT-139Y, A213-toxT-139F, IB4122 toxT-139Y, IB4122-toxT-139F 균주에 CTX-2kan 파지의 형질도입을 확인해 보면 MG116025-toxT-139F 균주와 A213-toxT-139F 균주에서 10³, IB4122-toxT-139F 균주에서 10개 정도의 형질도입체가 만들어지는 것을 확인할 수 있다(공여체 균주 배양액 1 ml당 수용체 균주의 형질도입 효율)(표 6). classical 균주인 O395나 toxT의 139Tyr를 가지는 균주는 형질전환되지 않는다. 즉, toxT의 139Phe SNP가 El Tor 균주를 CTX 파지에 의해 형질도입될 수 있도록 해준다는 것이다.MG116025-toxT-139Y, MG116025-toxT-139Y, A213-MG116025-toxT-139Y, and MG16025-toxT-139Y were obtained by replacing the anterior CTX-2 of CTX-2 with the tandem repeats of chromosome 2 of V212-1 toxT-139Y, A213-toxT- 139F, IB4122 toxT-139Y, IB4122-toxT-139F strain checking the transduction of CTX-2kan phage MG116025-toxT-139F strain in A213-toxT-139F strain 10 ^3, IB4122 -toxT-139F (about 10 transfection efficiencies of the receptor strains per 1 ml of the donor strain culture) (Table 6). Strains with classical strains O395 and 139Tyr of toxT are not transformed. That is, the 139Phe SNP of toxT allows the El Tor strain to be transduced by the CTX phage.

또한, 이 결과는 콜레라균의 염색체에 삽입되어 있는 프로파지 형태의 CTX-cla나 CTX-2가 탠덤으로 배열되어 있는 경우 CTX-1처럼 CTX 파지가 복제될 수 있음을 나타내며, 현재까지는 CTX 파지가 콜레라균의 염색체 1번에 삽입되어 있는 경우만 CTX 파지의 복제가 실험적으로 증명되었으나 2번 염색체에 CTX가 파지로 삽입되어 있어도 파지의 복제가 가능함을 나타낸다. These results indicate that CTX-phage can be replicated as CTX-1 in the case of tandem arrangement of CTX-cla or CTX-2 in the chromosome of cholera, Replication of the CTX phage was confirmed only when it was inserted into the chromosome 1 of cholera, but it is possible to replicate the phage even if CTX is inserted into the chromosome 2.

CTX 파지는 콜레라 균주의 염색체에 용원화 된(lysogen) 프로파지 상태에서 복제되는 파지뿐만 아니라 플라스미드에 클로닝된 CTX 파지에서 복제될 수 있으므로, 본 발명에서 제시한 toxT 139Phe 돌연변이가 도입된 비브리오 콜레라 균주에 플라스미드에서 복제된 CTX 파지를 형질도입하는 것도 가능하다. 이와 같이 toxT 139Phe 돌연변이가 도입된 비브리오 콜레라 균주는 다양한 CTX 파지를 복수로 가지는 비브리오 콜레라 균주를 제조하는데 활용할 수 있다.The CTX phage can be cloned in CTX phage cloned into the plasmid as well as the phage cloned in the lysogen prophage state on the chromosome of the cholera strain. Therefore, the CTX phage can be cloned into the V. cholera strain introduced with the mutant toxT 139Phe It is also possible to transduce the CTX phage cloned in the plasmid. Vibrio cholera strains introduced with the mutant toxT 139Phe can be used for producing Vibrio cholera strains having a plurality of CTX phages.

<실시예 3> toxT 및 콜레라 독소 생산Example 3 Production of toxT and cholera toxin

toxT는 직접적으로 tcpA와 ctxAB의 전사를 활성화시킬 수 있는데, MG116025의 toxT-139Phe 대립형질은 30℃, pH 6.5 조건에서 tcpA의 발현을 증가시켜 El Tor 균주들이 CTX 파지로 감염될 수 있게 한 것이라고 볼 수 있다. 그렇다면, 같은 조건에서 El Tor 균주의 독소의 발현도 증가시킬 수 있다고 생각할 수 있다.ToxT can directly activate transcription of tcpA and ctxAB. The toxT-139Phe allele of MG116025 increased the expression of tcpA at 30 ° C and pH 6.5, allowing El Tor strains to infect CTX phage. . Therefore, it can be considered that the expression of the toxin of El Tor strain can be increased under the same conditions.

El Tor 균주는 일반적인 실험조건에서 독소 생산을 유도할 수 없어 AKI 조건이나(2상 배양, 정지 상태로 16시간 배양하다가 진탕 배양으로 배양 조건을 달리하는 방법), 산소 분압을 낮추고 CO₂ 분압을 높이는 방법을 사용하여 독소가 만들어지는 조건을 유도하기는 하였으나, 단상 배양(single phase culture, 진탕배양으로만 균주를 배양하는 조건)에서 독소가 만들어지는 것은 보이지 않았다. El Tor, classical 균주, El Tor 균주의 ToxT를 139Phe로 치환시킨 균주를 30℃ pH 6.5에서 키우고 CT 항체를 이용하여 웨스턴 블랏으로 확인해보면 IB4122 toxT 139Phe 균주에서 콜레라 독소가 생산되는 것을 확인할 수 있다(도 2).The El Tor strain can not induce toxin production under normal experimental conditions, so it can not induce toxin production. It can be produced by AKI conditions (2-phase incubation, 16-hour incubation under static conditions and different culture conditions by shaking culture), lowering oxygen partial pressure and increasing CO ₂ partial pressure Method was used to induce the conditions under which the toxin was produced, but no toxin was found to be produced in a single phase culture (a condition in which the strain was cultured only by shaking culture). El Tor, classical strain, and E. coli transformed with ToxT of El Tor strain at 139Phe at 30 ° C, pH 6.5, and confirmed by Western blot using CT antibody, showed that cholera toxin was produced in strain IB4122 toxT 139Phe 2).

상기 결과로부터, 본 발명은 1) 비브리오 콜레라 균주의 toxT에 139phe 돌연변이를 도입하여 콜레라 균주를 CTX 파지에 대한 형질도입 수용체 균주로 작용할 수 있도록 만들 수 있다는 것과, 2) 동일한 toxT 돌연변이 균주에서는 콜레라 독소를 단상 배양으로도 생산하는 방법을 확립했다는 점이다.From the above results, it can be concluded that 1) the introduction of a 139phe mutation in toxT of Vibrio cholera strains can make the cholera strain act as a transduction receptor strain for the CTX phage, and 2) the cholera toxin in the same toxT mutant strain It has also established a method of producing single-phase culture.

<실시예 4> 복수의 CTX 파지를 동시에 가지는 E1 Tor 균주의 제작Example 4 Production of E1 Tor strain having a plurality of CTX phages simultaneously

상기 실시예 1 내지 3에서 CTX-2와 CTX-cla의 복제와 전파 방법이 실험실에서 셋업되었기 때문에 좀 더 다양한 CTX 파지와 배열을 갖는 균주들을 디자인하고 제작하였다. CTX 파지들을 형질도입으로 전달하고, 삽입 후 플라스미드 형태를 제거하여 CTX-1과 CTX-2를 동시에 가지는 El Tor 균주들을 제작하였다. El Tor 바이오타입 균주 이외에도 classical 바이오타입 균주에 CTX-1을 삽입시킨 비-전형 classical 균주 역시 제작하였다.Since the replication and propagation methods of CTX-2 and CTX-cla were set up in the laboratory in Examples 1 to 3, strains having more various CTX phages and sequences were designed and manufactured. The CTX phages were transduced by transduction, and the plasmid form was removed after insertion to generate El Tor strains having both CTX-1 and CTX-2. In addition to the El Tor biotypes, CTX-1 was inserted into the classical biotypes and non-classical classical strains were also produced.

본 실시예에 사용된 콜레라 균주들은 상기 표 1 내지 3에 나열하였다.The cholera strains used in this example are listed in Tables 1 to 3 above.

(pCTX 파지의 제작)(Production of pCTX phage)

pCTX-1-kan-N1은 원형의 pCTX-1과 같은 비-코딩 서열을 가지며 ctxA와 ctxB의 첫 166 bp가 카나마이신 카세트(kanamycin cassette)로 치환된 것이 다른 점이다(표 1 내지 3). pCTX-1-kan-N1은 PM20과 같은 균주에서 용원성 CTX-1-kan의 복제로 만들어질 수 있거나 플라스미드 기반 CTX 파지 복제 시스템에서 만들어질 수 있다. pCTX-1-kan-N2는 PM9 균주에서 CTX-1과 CTX-2 간의 재조합을 통해 만들어질 수 있다. pCTX-1-kan-N2는 pCTX-2/pCTX-cla의 비-코딩 서열을 가지고 있다. pCTX-1-cm-N1은 CTX-1-kan-N1처럼 플라스미드 기반 CTX 파지 복제 시스템을 통해 만들어질 수 있다. 이 시스템은 카나마이신 카세트 대신 클로람페니콜 카세트로 대체된 것이다. pCTX-1-cm-N2는 PM48에서 만들어진 것이다.pCTX-1-kan-N1 has a non-coding sequence such as circular pCTX-1 and the first 166 bp of ctxA and ctxB are replaced with a kanamycin cassette (Tables 1-3). pCTX-1-kan-N1 can be made with a clone of the active CTX-1-kan in a strain such as PM20 or can be made in a plasmid-based CTX phage cloning system. pCTX-1-kan-N2 can be produced by recombination between CTX-1 and CTX-2 in the PM9 strain. pCTX-1-kan-N2 has a non-coding sequence of pCTX-2 / pCTX-cla. pCTX-1-cm-N1 can be made through a plasmid-based CTX phage cloning system, such as CTX-1-kan-N1. This system was replaced by a chloramphenicol cassette instead of a kanamycin cassette. pCTX-1-cm-N2 was made from PM48.

pCTX-cla-kan-N1은 pCTX-1의 비-코딩 서열을 가지며 플라스미드 기반 CTX 파지 복제 시스템에서 만들어진 것이다. pCTX-2-kan-N1은 플라스미드 기반 CTX 파지 복제 시스템에서 만들어진 것이다. pCTX-2-kan-N1은 pCTX-1의 비-코딩 서열을 가진다. pCTX-2-kan-N2는 B33에서 만들어진 PM22의 CTX-2 탠덤 리피트에서 만들어진 것이다.pCTX-cla-kan-N1 has a non-coding sequence of pCTX-1 and is made in a plasmid-based CTX phage cloning system. pCTX-2-kan-N1 was made in a plasmid-based CTX phage cloning system. pCTX-2-kan-N1 has a non-coding sequence of pCTX-1. pCTX-2-kan-N2 was made in a CTX-2 tandem repeat of PM22 made in B33.

플라스미드 기반 CTX 파지 복제 시스템에서 만들어지거나 용원성 CTX 프로파지에서 만들어진 pCTX 파지들은 새끼 파지들이 더 많이 나올 수 있도록 적당한 수용체 균주, 즉 pCTX-1은 O395 classical 균주, pCTX-2는 PM27-toxT-139F 균주에 형질도입시켜 유지시키고, 2차 형질도입 시 사용하였다. The pCTX phages produced in the plasmid-based CTX phage cloning system or generated from the phage CTX probes were cloned into the appropriate receptor strains, O395 classical strain, pCTX-2, PM27- toxT -139F strain , And used for secondary transfection.

(MG116025와 B33의 유도체 균주의 제작)(Production of derivative strains of MG116025 and B33)

MG116025의 동종 균주들(PM25~PM29) 균주들은 CTX-1과 RS1을 차례대로 제거하여 만들었다. B33의 유도체 균주인 PM21은 CTX-2를 2번 염색체에 하나만 가지고 있는데 PM6와 유사하게 만들어진다. 이들 균주들은 다양한 CTX 배열을 가지는 균주를 만드는데 사용된다.MG116025 homologous strains (PM25 to PM29) were generated by sequential removal of CTX-1 and RS1. PM21, a derivative strain of B33, has CTX-2 on chromosome 2, which is similar to PM6. These strains are used to produce strains with various CTX sequences.

(CTX 파지 형질도입 수용체 균주의 제작)(Preparation of CTX phage-derived receptor strain)

Classical 바이오타입 균주인 O395는 응집 조건에서(LB pH6.5, 30℃) 배양하면 pCTX-1 파지를 받아들인다. El Tor 바이오타입 균주들은 toxT -139F allele을 가진 경우 CTX 파지에 의해 형질도입된다. A213, B33, MG116025 등의 균주들은 toxT-139F로 바꿔주어서 형질도입 수용체로 작용할 수 있도록 준비하였다. O395, a classical bio-type strain, is cultured under coagulation conditions (LB pH 6.5, 30 ° C) to accept pCTX-1 phage. El Tor biotypes are transduced by the CTX phage in the presence of the toxT - 139F allele. The strains A213, B33 and MG116025 were transformed into toxT -139F and prepared to act as transduction receptors.

(콜레라 균주로의 CTX 파지 삽입)(Insertion of CTX phage into cholera strains)

CTX 파지 도너 균주에서 복제된 CTX 파지는 수용체 균주에 표준 프로토콜에 따라 형질도입되어 전달된다. pCTX가 1번 염색체나 2번 염색체에 삽입된 상태와 최종 CTX 배열은 다양한 PCR 조합을 통해 확인되었다. pCTX의 삽입은 pCTX를 잃어버린 균주를 스크리닝하여 확인하였다. The CTX phage cloned in CTX phage donor strains are transduced and delivered to the receptor strain according to standard protocols. The state of insertion of pCTX on chromosome 1 or chromosome 2 and the final CTX sequence were confirmed by various PCR combinations. Insertion of pCTX was confirmed by screening strains that lost pCTX.

<실험예 1> CTX 파지와 비-코딩 서열Experimental Example 1 CTX phage and non-coding sequence

pCTX-1과 pCTX-cla의 비-코딩 서열(ctxB와 rstR 사이의 서열)는 서로 다르다. pCTX-1과 pCTX-cla의 비-코딩 서열의 염기서열 차이는 CTX 파지가 콜레라 균의 1번 염색체나 2번 염색체에 삽입되는 방향성을 결정한다. pCTX-1의 비-코딩 서열을 가지는 경우 1번 염색체로만 삽입되며, pCTX-cla의 비-코딩 서열을 가지면 1번 염색체나 2번 염색체에 모두 삽입될 수 있다고 알려져 있다. 이 비-코딩 서열은 pCTX-1과 pCTX-2에서 서로 반대로 바꿔줄 수도 있다. CTX-1-kan-N1은 원형 pCTX-1의 비-코딩 서열을 가지며, CTX-1-kan-N2는 pCTX-cla의 비-코딩 서열을 가진다. 따라서, pCTX-1-kan-N2는 1번 염색체나 2번 염색체에 모두 끼어들어갈 수 있을 것으로 예상할 수 있으며 PM34(PM45, 49, 50 등 역시)는 실제로 pCTX-1-kan-N2가 2번 염색체에 끼어들어가서 만들어졌다.The non-coding sequences (sequence between ctxB and rstR ) of pCTX-1 and pCTX- cla are different. The difference in the nucleotide sequence of the non-coding sequences of pCTX-1 and pCTX-cla determines the direction in which the CTX phage is inserted into Chromosome 1 or Chromosome 2 of cholera. It is known that it is inserted only on chromosome 1 if it has a non-coding sequence of pCTX-1 and can be inserted on chromosome 1 or 2 if it has a non-coding sequence of pCTX-cla. These non-coding sequences may be reversed from each other in pCTX-1 and pCTX-2. CTX-1-kan-N1 has a non-coding sequence of circular pCTX-1 and CTX-1-kan-N2 has a non-coding sequence of pCTX-cla. Therefore, pCTX-1-kan-N2 can be predicted to penetrate chromosome 1 or chromosome 2, and PM34 (PM45, 49, 50 etc.) It was built into the chromosome.

pCTX 의 비-코딩 서열은 CTX 프로파지의 복제 과정 중 CTX 파지의 뒤쪽에 있는 RS1이나 다른 프로파지에서 비롯된 것이다. 대부분의 El Tor 균주들은 CTX-1:CTX-1 배열이나 CTX-1:RS1 배열을 가지기 때문에 pCTX-1은 원형 CTX-1의 비-코딩 서열을 가지게 된다. 그러나 만약 CTX-1:CTX-2, CTX-1:CTX-cla와 같은 배열이 있다면 CTX-1이 복제되면서 CTX-cla의 비-코딩 서열을 가지는 CTX-1이 만들어 질 수 있을 것이다. 그러므로 pCTX-1 게놈을 가지면서 CTX-cla의 비-코딩 서열을 가지는 pCTX-1-N2 파지가 pCTX-1-N1처럼 존재할 수 있을 것이다. pCTX-1-N2 파지가 다른 균주의 CTX-1 뒤쪽에 삽입되면 또 다른 pCTX-1-N2 파지가 만들어질 수도 있을 것이다. 실제로 이 연구에서 pCTX-1-cm-N2는 PM48에서 만들어졌다(표 1 내지 3). The non-coding sequence of pCTX is derived from RS1 or other promoters located behind the CTX phage during the replication of the CTX promoter. Since most El Tor strains have CTX-1: CTX-1 or CTX-1: RS1 sequences, pCTX-1 has a non-coding sequence of circular CTX-1. However, if there is an arrangement such as CTX-1: CTX-2, CTX-1: CTX-cla, CTX-1 may be cloned and CTX-1 with a non-coding sequence of CTX-cla may be produced. Thus, the pCTX-1-N2 phage with the pCTX-1 genome and a non-coding sequence of CTX-cla may be present as pCTX-1-N1. When the pCTX-1-N2 phage is inserted behind the CTX-1 of another strain, another pCTX-1-N2 phage may be produced. Indeed, pCTX-1-cm-N2 was made in PM48 in this study (Tables 1-3).

<실험예 2> pCTX와 프로파지 간의 재조합Experimental Example 2 Recombination between pCTX and prophage

하나의 콜레라 균주 내에 두 가지 다른 CTX 파지가 각각의 염색체에 들어 있어서 이들 간에 재조합을 통해 모자이크 CTX 파지가 생성되는 기전은 이미 증명된 바 있다. 이와 비슷하게 pCTX와 프로파지 간의 재조합도 가능할 것이다. pCTX-1-kan-N1이 B33-toxT-139F 균주에 전달되어 B33(pCTX-1-kan-N1)이 만들어지고 여기서 만들어진 새끼 파지인 pCTX-1-kan-N1은 파지 면역성(phage immunity)을 피하기 위해 O395로 형질도입될 수 있다. 그러나 B33(pCTX-1-kan-N1)에서는 pCTX-1-kan-N1과 CTX-2 프로파지 간에 재조합이 일어날 수 있는데 각 CTX 파지의 rstR 양쪽의 rstA 와 비-코딩 서열에서 재조합이 일어나면 pCTX-2-kan-N1이 만들어질 수 있을 것이다(도 3a). 이렇게 만들어진 pCTX-2-kan-N1은 MG116025와 같은 El Tor 균주로 전달될 수 있다. 실제 MG116025로 형질도입된 pCTX-2-kan-N1을 확인할 수 있었다. 이 결과는 CTX-cla 프로파지가 탠덤으로 들어 있는 classical 균주에 pCTX-1이 전달되어 pCTX-2가 만들어질 수 있음을 보여준다(도 3b). 물론 pCTX-1과 pCTX-cla 간의 재조합도 가능할 것이다.The mechanism by which mosaic CTX phages are generated through recombination between two different CTX phages in each chromosome is already proven in a single cholera strain. Similarly, recombination between pCTX and prophage will be possible. pCTX-1-kan-N1 was transferred to B33- tox T-139F strain to produce B33 (pCTX-1-kan-N1), and the phage immunoglobulin pCTX- RTI ID = 0.0 > O395 < / RTI > However B33 (pCTX-1-kan- N1) In pCTX-1-kan-N1 and CTX-2 there is a recombination can occur between the ratio of pro phage rstA rstR both sides of each phage CTX-recombination occurs in the coding sequence pCTX- 2-kan-N1 can be made (Fig. 3A). The thus produced pCTX-2-kan-N1 can be delivered to an El Tor strain such as MG116025. We could confirm pCTX-2-kan-N1 transfected with MG116025. This result shows that pCTX-1 can be transferred to a classical strain containing the tandem CTX-claprography to produce pCTX-2 (FIG. 3B). Of course, recombination between pCTX-1 and pCTX-cla will also be possible.

<실험예 3> CTX-1을 가지는 classical 바이오타입 균주의 제작<Experimental Example 3> Construction of classical bio-type strain having CTX-1

CTX-2를 가지는 atypical El Tor 균주(Wave 2)들은 발견되었으나 rstR ^El ^Tor와 ctxB ^{El Tor}를 가지는 CTX-1을 가지는 classical 균주는 발견된 적이 없다. Classical 바이오타입 균주들은 CTX-1에 의해 형질도입되며 pCTX-1은 classical 바이오타입 균주내에서 유지되기도 하지만, CTX-1이 classical 바이오타입 균주의 염색체에 삽입된 균주는 아직 발견된 일이 없다. 도 4에 도시된 바와 같이, pCTX-1-kan-N2를 classical 바이오타입 균주인 O395의 1번 염색체에 삽입된 균주를 제작하였다(PM37). 이 결과는 자연계에 atypical classical 균주가 존재할 수 있음을 보여준다. Atypical El Tor strains (Wave 2) with CTX-2 have been found, but no classical strains with CTX-1 with rstR ^El ^Tor and ctxB ^{El Tor} have been found. Classical bio-type strains are transduced by CTX-1 and pCTX-1 is maintained in classical biotypes. However, strains in which CTX-1 has been inserted into the chromosome of classical biotypes have not been found. As shown in FIG. 4, pCTX-1-kan-N2 was inserted into chromosome 1 of O395, a classical biotypic strain (PM37). These results show that atypical classical strains can exist in nature.

<실험예 4> 다양한 El Tor 균주의 디자인과 제작<Experimental Example 4> Design and production of various El Tor strains

독소를 생성하는 El Tor 타입의 균주들은 TLC, CTX-1, RS1이 1번 염색체의 dif1 염기 서열에 끼어들면서 만들어진다. 또한, El Tor 바이오타입 균주에서 CTX-1, RS1이 제거되어 독소를 생성하지 못하는 균주가 만들어지는 것도 이미 보고되어 있다. 예를 들어 MG116025 균주는 1번 염색체에 TLC:RS1:CTX-1:RS1 배열을 가지는데 RS과 CTX-1, 그리고 TLC까지 차례대로 제거하여 만들어진 동종의 균주들(PM25~PM29)을 만드는 과정이 이미 보고되어 있다. 이 연구에서는 MG116025와 그로부터 만들어진 균주들, B33, A213 등의 El Tor 균주에 다른 종류의 pCTX들을 전달하여 다양한 CTX 배열을 가지는 균주들을 제작하였다.TLC, CTX-1, and RS1 are produced by interrupting the dif1 nucleotide sequence of chromosome 1. In addition, it has already been reported that strains of CTX-1 and RS1 are deleted from El Tor bio-type strains to produce a toxin-producing strain. For example, the MG116025 strain has a TLC: RS1: CTX-1: RS1 sequence on chromosome 1, and the same strain (PM25 to PM29) was constructed by sequentially removing RS, CTX-1 and TLC It has already been reported. In this study, strains with different CTX sequences were constructed by transferring different types of pCTX to MG116025 and strains made therefrom, El Tor strains such as B33 and A213.

MG116025와 그 유도체 균주: 도 5에 도시된 바와 같이, MG116025와 그 유도체 균주들은 이미 CTX 파지와 RS1이 염색체에 삽입되어 있는 균주들이다. 이들에게 CTX-1이나 CTX-2 파지를 전달하여 염색체에 삽입시킴으로써 기존에 볼 수 없었던 다양한 CTX 배열을 가지는 균주를 실제로 디자인하고 제작하는 것이 가능하다는 것을 증명하였다. MG116025 and its derivative strains: As shown in Fig. 5, MG116025 and its derivative strains are already strains in which CTX phage and RS1 are inserted into the chromosome. By introducing CTX-1 or CTX-2 phage into the chromosome, it is possible to actually design and construct strains with various CTX sequences that were not previously available.

PM30과 PM31 균주는 MG116025에 CTX-2를 각각 1번 염색체와 2번 염색체에 삽입시켜 만들어진 균주이다(도 4, 표 1 내지 3). 이와 유사하게 PM25 균주로부터 TLC:CTX-1:RS1:CTX-2-kan을 가지는 PM32도 만들 수 있었다. PM33은 TLC:RS1:RS1:CTX-1을 1번 염색체에 가지는데 PM26에 pCTX-1-kan-N2를 삽입시켜 만들 수 있다. PM28은 1번 염색체에 TLC만 가지고 있는 균주인데 pCTX-1-kan-N2를 PM28의 2번 염색체에 삽입시켜서 PM34를 만들 수 있었다. 그리고 PM35는 PM28의 1번 염색체에 CTX-2를 삽입시켜서 만든 균주이다. TLC만 가지고 있던 균주로부터 좀 더 다양한 배열을 가지는 균주를 제작하는 것은 A213 균주에서 만든 균주들이 아래 더 자세히 설명되어 있다. TLC도 없는 균주인 PM29에 CTX-2-kan-N2를 1번 염색체에 삽입시켜서 PM36 균주를 만들었다. 이러한 결과들은 기존에 CTX, RS1 등을 가지는 균주에 추가로 CTX 파지를 도입하거나, 기존에 있던 CTX, RS1을 제거한 후 새로운 CTX 파지를 삽입시키는 것이 가능하다는 것을 보여준다.PM30 and PM31 strains are strains produced by inserting CTX-2 into chromosome 1 and chromosome 2 of MG116025 (FIG. 4, Tables 1 to 3). Similarly, PM32 with TLC: CTX-1: RS1: CTX-2-kan could be made from the PM25 strain. PM33 can be generated by inserting pCTX-1-kan-N2 into PM26, with TLC: RS1: RS1: CTX-1 on chromosome 1. PM28 is a strain that only has TLC on chromosome 1 and PM34 can be made by inserting pCTX-1-kan-N2 into the chromosome 2 of PM28. And PM35 is a strain made by inserting CTX-2 into chromosome 1 of PM28. The strains made in strain A213 are described in more detail below in order to produce strains with more diverse sequences from those strains that only had TLC. The PM36 strain was constructed by inserting CTX-2-kan-N2 into chromosome 1 on PM29, a strain without TLC. These results show that it is possible to introduce CTX phage in addition to existing strains having CTX and RS1, or to insert new CTX phage after removing existing CTX and RS1.

B33과 그 유도체 균주: 도 6에 도시된 바와 같이, B33은 1번 염색체에는 TLC도 없고, 2번 염색체에는 CTX-2가 연달아 2개 들어 있는 Wave 2 atypical El Tor 균주이다. B33의 1번 염색체에 CTX-1을 삽입시켜 PM38 균주를 만들 수 있으며 이 균주도 각각의 염색체에 다른 종류의 CTX 파지를 가진 균주이다. PM21은 B33에서 CTX-2 하나를 제거하여 만든 균주인데, PM21에 CTX-1과 CTX-2를 각각 1번 염색체에 더해서 PM39와 PM40을 만들 수 있다. B33 and its derivative strain: As shown in Fig. 6, B33 is a 2-atypical El Tor strain of Wave 2, which has no TLC on chromosome 1 and two consecutive CTX-2 on chromosome 2. PM33 strain can be constructed by inserting CTX-1 into chromosome 1 of B33. This strain is also a strain having CTX phage of different kinds on each chromosome. PM21 is a strain created by removing one CTX-2 from B33. PM39 and PM40 can be made by adding CTX-1 and CTX-2 to PM21, respectively, on chromosome 1.

A213과 유도체 균주: A213은 US Gulf Coast 균주, 또는 pre-seventh pandemic 균주라 불리는 균주이며, CTX를 가지지 않는 균주인데 아마도 동정이나 보관 과정에서 잃어버린 것일 것이다. 이 연구에서는 A213으로부터 다양한 균주를 제작하는데 좀 더 집중하였는데, 그 이유는 A213이 TLC만 가지는 균주이기 때문에 이로부터 다양한 CTX 파지 배열을 가지는 균주를 제작하는 방법에 대한 원리를 증명하기 위해서이다. A213 and derivative strains: A213 is a strain called the US Gulf Coast strain, or a pre-seventh pandemic strain, and has no CTX, probably lost during identification or storage. In this study, we focused more on the production of various strains from A213, because A213 is a TLC-only strain, so to prove the principle of how to construct strains with various CTX phage sequences.

도 7에 도시된 바와 같이, CTX-1과 CTX-2를 각각 염색체에 각각 하나만 가지는 균주도 제작되었으며 CTX-1이 연달아 들어있는 균주(PM43)도 제작하였다. 두 개의 염색체에 각각 CTX-1을 가지는 균주(PM50), 그리고 1번 염색체에는 CTX-1이 연달아 들어있고 2번 염색체에는 CTX-1이 들어 있는 균주(PM49)도 제작하였다. 1번 염색체에는 CTX-1을 가지고 2번 염색체에는 CTX-2를 가지는 균주(PM51)과 CTX-2가 2번 염색체에 한 개 들어 있는 균주(PM53)도 제작할 수 있었다.As shown in FIG. 7, a strain having only one CTX-1 and one CTX-2 in each chromosome was prepared, and a strain (PM43) in which CTX-1 was sequentially introduced was also prepared. A strain (PM50) with two CTX-1s on each of the two chromosomes, a CTX-1 strain on the chromosome 1, and a strain (PM49) containing CTX-1 on the chromosome 2 were also prepared. A strain (CT51) with CTX-1 on chromosome 1, a CTX-2 strain on chromosome 2, and a strain (PM53) with CTX-2 on chromosome 2 were also prepared.

<110> IUCF-HYU (Industry-University Cooperation Foundation Hanyang University) <120> Vibrio cholerae strain that can be infected by CTX phages and can produce cholera toxin <130> P17U22C1075 <150> KR 10-2016-0172684 <151> 2016-12-16 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 276 <212> PRT <213> Vibrio cholerae <400> 1 Met Ile Gly Lys Lys Ser Phe Gln Thr Asn Val Tyr Arg Met Ser Lys 1 5 10 15 Phe Asp Thr Tyr Ile Phe Asn Asn Leu Tyr Ile Asn Asp Tyr Lys Met 20 25 30 Phe Trp Ile Asp Ser Gly Ile Ala Lys Leu Ile Asp Lys Asn Cys Leu 35 40 45 Val Ser Tyr Glu Ile Asn Ser Ser Ser Ile Ile Leu Leu Lys Lys Asn 50 55 60 Ser Ile Gln Arg Phe Ser Leu Thr Ser Leu Ser Asp Glu Asn Ile Asn 65 70 75 80 Val Ser Val Ile Thr Ile Ser Asp Ser Phe Ile Arg Ser Leu Lys Ser 85 90 95 Tyr Ile Leu Gly Asp Leu Met Ile Arg Asn Leu Tyr Ser Glu Asn Lys 100 105 110 Asp Leu Leu Leu Trp Asn Cys Glu His Asn Asp Ile Ala Val Leu Ser 115 120 125 Glu Val Val Asn Gly Phe Arg Glu Ile Asn Tyr Ser Asp Glu Phe Leu 130 135 140 Lys Val Phe Phe Ser Gly Phe Phe Ser Lys Val Glu Lys Lys Tyr Asn 145 150 155 160 Ser Ile Phe Ile Thr Asp Asp Leu Asp Ala Met Glu Lys Ile Ser Cys 165 170 175 Leu Val Lys Ser Asp Ile Thr Arg Asn Trp Arg Trp Ala Asp Ile Cys 180 185 190 Gly Glu Leu Arg Thr Asn Arg Met Ile Leu Lys Lys Glu Leu Glu Ser 195 200 205 Arg Gly Val Lys Phe Arg Glu Leu Ile Asn Ser Ile Arg Ile Ser Tyr 210 215 220 Ser Ile Ser Leu Met Lys Thr Gly Glu Phe Lys Ile Lys Gln Ile Ala 225 230 235 240 Tyr Gln Ser Gly Phe Ala Ser Val Ser Tyr Phe Ser Thr Val Phe Lys 245 250 255 Ser Thr Met Asn Val Ala Pro Ser Glu Tyr Leu Phe Met Leu Thr Gly 260 265 270 Val Ala Glu Lys 275 <210> 2 <211> 276 <212> PRT <213> Vibrio cholerae <400> 2 Met Ile Gly Lys Lys Ser Phe Gln Thr Asn Val Tyr Arg Met Ser Lys 1 5 10 15 Phe Asp Thr Tyr Ile Phe Asn Asn Leu Tyr Ile Asn Asp Tyr Lys Met 20 25 30 Phe Trp Ile Asp Ser Gly Ile Ala Lys Leu Ile Asp Lys Asn Cys Leu 35 40 45 Val Ser Tyr Glu Ile Asn Ser Ser Ser Ile Ile Leu Leu Lys Lys Asn 50 55 60 Ser Ile Gln Arg Phe Ser Leu Thr Ser Leu Ser Asp Glu Asn Ile Asn 65 70 75 80 Val Ser Val Ile Thr Ile Ser Asp Ser Phe Ile Arg Ser Leu Lys Ser 85 90 95 Tyr Ile Leu Gly Asp Leu Met Ile Arg Asn Leu Tyr Ser Glu Asn Lys 100 105 110 Asp Leu Leu Leu Trp Asn Cys Glu His Asn Asp Ile Ala Val Leu Ser 115 120 125 Glu Val Val Asn Gly Phe Arg Glu Ile Asn Phe Ser Asp Glu Phe Leu 130 135 140 Lys Val Phe Phe Ser Gly Phe Phe Ser Lys Val Glu Lys Lys Tyr Asn 145 150 155 160 Ser Ile Phe Ile Thr Asp Asp Leu Asp Ala Met Glu Lys Ile Ser Cys 165 170 175 Leu Val Lys Ser Asp Ile Thr Arg Asn Trp Arg Trp Ala Asp Ile Cys 180 185 190 Gly Glu Leu Arg Thr Asn Arg Met Ile Leu Lys Lys Glu Leu Glu Ser 195 200 205 Arg Gly Val Lys Phe Arg Glu Leu Ile Asn Ser Ile Arg Ile Ser Tyr 210 215 220 Ser Ile Ser Leu Met Lys Thr Gly Glu Phe Lys Ile Lys Gln Ile Ala 225 230 235 240 Tyr Gln Ser Gly Phe Ala Ser Val Ser Tyr Phe Ser Thr Val Phe Lys 245 250 255 Ser Thr Met Asn Val Ala Pro Ser Glu Tyr Leu Phe Met Leu Thr Gly 260 265 270 Val Ala Glu Lys 275 <110> IUCF-HYU (Industry-University Cooperation Foundation Hanyang University) <120> Vibrio cholerae strain that can be infected by CTX phages and can produce cholera toxin <130> P17U22C1075 <150> KR 10-2016-0172684 <151> 2016-12-16 <160> 2 <170> Kopatentin 2.0 <210> 1 <211> 276 <212> PRT <213> Vibrio cholerae <400> 1 Met Ile Gly Lys Lys Ser Phe Gln Thr Asn Val Tyr Arg Met Ser Lys 1 5 10 15 Phe Asp Thr Tyr Ile Phe Asn Asn Leu Tyr Ile Asn Asp Tyr Lys Met 20 25 30 Phe Trp Ile Asp Ser Gly Ile Ala Lys Leu Ile Asp Lys Asn Cys Leu 35 40 45 Val Ser Tyr Glu Ile Asn Ser Ser Ile Leu Leu Lys Lys Asn 50 55 60 Ser Ile Gln Arg Phe Ser Leu Thr Ser Leu Ser Asp Glu Asn Ile Asn 65 70 75 80 Val Ser Val Ile Thr Ile Ser Asp Ser Phe Ile Arg Ser Leu Lys Ser 85 90 95 Tyr Ile Leu Gly Asp Leu Met Ile Arg Asn Leu Tyr Ser Glu Asn Lys 100 105 110 Asp Leu Leu Leu Trp Asn Cys Glu His Asn Asp Ile Ala Val Leu Ser 115 120 125 Glu Val Val Asn Gly Phe Arg Glu Ile Asn Tyr Ser Asp Glu Phe Leu 130 135 140 Lys Val Phe Phe Ser Gly Phe Phe Ser Lys Val Glu Lys Lys Tyr Asn 145 150 155 160 Ser Ile Phe Ile Thr Asp Asp Leu Asp Ala Met Glu Lys Ile Ser Cys 165 170 175 Leu Val Lys Ser Asp Ile Thr Arg Asn Trp Arg Trp Ala Asp Ile Cys 180 185 190 Gly Glu Leu Arg Thr Asn Arg Met Ile Leu Lys Lys Glu Leu Glu Ser 195 200 205 Arg Gly Val Lys Phe Arg Glu Leu Ile Asn Ser Ile Arg Ile Ser Tyr 210 215 220 Ser Ile Ser Leu Met Lys Thr Gly Glu Phe Lys Ile Lys Gln Ile Ala 225 230 235 240 Tyr Gln Ser Gly Phe Ala Ser Val Ser Tyr Phe Ser Thr Val Phe Lys 245 250 255 Ser Thr Met Asn Val Ala Pro Ser Glu Tyr Leu Phe Met Leu Thr Gly 260 265 270 Val Ala Glu Lys 275 <210> 2 <211> 276 <212> PRT <213> Vibrio cholerae <400> 2 Met Ile Gly Lys Lys Ser Phe Gln Thr Asn Val Tyr Arg Met Ser Lys 1 5 10 15 Phe Asp Thr Tyr Ile Phe Asn Asn Leu Tyr Ile Asn Asp Tyr Lys Met 20 25 30 Phe Trp Ile Asp Ser Gly Ile Ala Lys Leu Ile Asp Lys Asn Cys Leu 35 40 45 Val Ser Tyr Glu Ile Asn Ser Ser Ile Leu Leu Lys Lys Asn 50 55 60 Ser Ile Gln Arg Phe Ser Leu Thr Ser Leu Ser Asp Glu Asn Ile Asn 65 70 75 80 Val Ser Val Ile Thr Ile Ser Asp Ser Phe Ile Arg Ser Leu Lys Ser 85 90 95 Tyr Ile Leu Gly Asp Leu Met Ile Arg Asn Leu Tyr Ser Glu Asn Lys 100 105 110 Asp Leu Leu Leu Trp Asn Cys Glu His Asn Asp Ile Ala Val Leu Ser 115 120 125 Glu Val Val Asn Gly Phe Arg Glu Ile Asn Phe Ser Asp Glu Phe Leu 130 135 140 Lys Val Phe Phe Ser Gly Phe Phe Ser Lys Val Glu Lys Lys Tyr Asn 145 150 155 160 Ser Ile Phe Ile Thr Asp Asp Leu Asp Ala Met Glu Lys Ile Ser Cys 165 170 175 Leu Val Lys Ser Asp Ile Thr Arg Asn Trp Arg Trp Ala Asp Ile Cys 180 185 190 Gly Glu Leu Arg Thr Asn Arg Met Ile Leu Lys Lys Glu Leu Glu Ser 195 200 205 Arg Gly Val Lys Phe Arg Glu Leu Ile Asn Ser Ile Arg Ile Ser Tyr 210 215 220 Ser Ile Ser Leu Met Lys Thr Gly Glu Phe Lys Ile Lys Gln Ile Ala 225 230 235 240 Tyr Gln Ser Gly Phe Ala Ser Val Ser Tyr Phe Ser Thr Val Phe Lys 245 250 255 Ser Thr Met Asn Val Ala Pro Ser Glu Tyr Leu Phe Met Leu Thr Gly 260 265 270 Val Ala Glu Lys 275

Claims

Vibrio cholerae mutant strain expressing the toxT protein of SEQ ID NO: 2 in which the 139th amino acid was substituted with phenylalanine (Phe) in tyrosine (Tyr) through point mutation of toxT gene.

The method according to claim 1,
V. cholera (Vibrio cholerae) is a mutant strain, V. cholera amount of expression of the TcpA protein, cholera toxin will increase over the wild-type V. cholera (Vibrio cholerae) strains (Vibrio cholerae) mutant strain.

The method according to claim 1,
Vibrio cholerae) mutant strain classical bio type, E1 Tor bio type, atypical E1 Tor vibrio cholera O139 type or bio-bio-types (those derived from Vibrio cholerae) strains of Vibrio cholera (Vibrio cholerae) mutant strains.

The method according to claim 1,
Vibrio cholera (Vibrio cholerae) Mutant strains were MG116025 (Matlab type III) -toxT^Y139F Strain, B33-toxT^Y139F Strain, A213-toxT^Y139F Strain or IB4122-toxT^Y139F Vibrio cholera, which is one of the strainsVibrio choleraeMutant strains.

The method according to claim 1,
Vibrio cholerae) is a mutant strain, V. cholerae comprises one or more pro CTX phage selected from the group consisting of 1-CTX, CTX-cla, CTX-2, CTX-env and CTX-O139 (Vibrio cholerae) mutant strains.

The method according to claim 1,
Vibrio cholerae ) mutants have utility as receptor strains for CTX phage infection, such as Vibrio &lt; RTI ID = 0.0 > cholerae) mutant strains.

Vibrio cholerae ) to cause a point mutation in UUU to the 139th codon UAU of the toxT gene so that the 139th amino acid is expressed in the toxT protein of SEQ ID NO: 2 substituted with phenylalanine (Phe) in tyrosine (Tyr) Vibrio cholerae including (Vibrio A method for producing a mutant strain.

8. The method of claim 7,
Vibrio cholerae) strain classical bio type, E1 Tor bio type, atypical E1 Tor V. cholera O139 bio type or types of bio (Vibrio cholerae) in strain V. cholera (Vibrio A method for producing a mutant strain.

8. The method of claim 7,
A recombinant plasmid for transcription of one or more CTX phage clones selected from the group consisting of CTX-1, CTX-cla, CTX-2, CTX-env and CTX-O139 is transduced into a mutant of Vibrio cholerae ,
CTX-1, CTX-cla, Vibrio cholera (Vibrio comprising one or more pro CTX phage selected from the group consisting of 2-CTX, CTX and CTX-env-O139 Use cholerae) strains with a donor strain of Vibrio cholera (Vibrio lt ; RTI ID = 0.0 > Vibrio &lt; / RTI > A method for producing a mutant strain.

A recombinant plasmid for cloning one or more CTX phages selected from the group consisting of CTX-1, CTX-cla, CTX-2, CTX-env and CTX-O139 is amplified through a point mutation of the toxT gene to a phenylalanine the SEQ ID NO substituted with (Phe): Vibrio cholerae expressing toxT protein 2 (Vibrio cholerae ) mutant strain of CTX phage.

11. The method of claim 10,
Vibrio cholerae mutant strain is any one of MG116025 (Matlab type III) -toxT ^Y139F strain, B33-toxT ^Y139F strain, A213-toxT ^Y139F strain or IB4122-toxT ^Y139F strain.

CTX-1, CTX-cla, Vibrio cholera (Vibrio comprising one or more pro CTX phage selected from the group consisting of 2-CTX, CTX and CTX-env-O139 cholerae strain was used as a donor strain to express the toxT protein of SEQ ID NO: 2 in which the 139th amino acid was replaced with phenylalanine (Phe) in tyrosine (Tyr) through a point mutation of the toxT gene ( Vibrio cholerae ) mutant strain of the CTX phage.

13. The method of claim 12,
Vibrio cholerae mutant strain is any one of MG116025 (Matlab type III) -toxT ^Y139F strain, B33-toxT ^Y139F strain, A213-toxT ^Y139F strain or IB4122-toxT ^Y139F strain.

CTX-1, CTX-cla, CTX-2, paragraph 1 of V. cholera (Vibrio comprising one or more pro CTX phage selected from the group consisting of env-CTX and CTX-O139 cholerae mutant strain at 30 to 37 占 폚 and a pH of 6 to 8 in a single phase.

15. The method of claim 14,
Vibrio cholerae mutant strain is one of MG116025 (Matlab type III) -toxT ^Y139F strain, B33-toxT ^Y139F strain, A213-toxT ^Y139F strain, or IB4122-toxT ^Y139F strain.