KR101969975B1 - Novel Turn-On Probe Conjugates with Both Acidic and Basic pH-Reactivity and Uses Thereof - Google Patents

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Abstract

본 발명은 효소 어세이용 신규 턴-온 프로브 컨쥬게이트 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 프로브 컨쥬게이트는 중성 pH에서의 시그널과 비교하여 산성 pH(예컨대, pH 4 내지 pH 6) 및 염기성 pH(예컨대, pH 8 내지 pH 10) 모두에서 더 높은 형광/발광 시그널을 나타낸다. 이에 따라, 본 발명의 프로브 컨쥬게이트는 형광 시그널 변화를 통해 pH-변화 효소(예컨대, 페니실리나제 같은 베타-락타마제, 또는 아데노신 디아미나제) 또는 이를 포함하는 약물-저항성 박테리아의 존재 유무를 간편하고 효율적으로 검출할 수 있다. 따라서, 본 발명의 프로브 컨쥬게이트를 포함하는 조성물은 pH-변화 효소에 대한 어세이 시스템을 제공할 뿐 아니라, 상기 효소를 포함하는 약물-저항성 박테리아에 의해 유발되는 감염 질환의 검출에 효과적으로 이용될 수 있다.The present invention relates to novel turn-on probe conjugates for enzyme assays and uses thereof. The probe conjugates of the present invention exhibit higher fluorescence / emission signals in both acidic pH (e.g., pH 4 to pH 6) and basic pH (e.g., pH 8 to pH 10), as compared to signals at neutral pH. Accordingly, the probe conjugate of the present invention can detect the presence or absence of a pH-changing enzyme (for example, beta-lactamase such as penicillinase or adenosine diamine) or a drug-resistant bacterium containing the same, And can be detected efficiently. Therefore, the composition comprising the probe conjugate of the present invention not only provides an assay system for pH-changing enzymes, but also can be effectively used for the detection of infectious diseases caused by drug-resistant bacteria including the enzyme have.

Figure 112016060561111-pat00006
Figure 112016060561111-pat00006

Description

신규한 산성 및 염기성 pH―반응성 턴―온 프로브 컨쥬게이트 및 이의 용도{Novel Turn-On Probe Conjugates with Both Acidic and Basic pH-Reactivity and Uses Thereof}[0001] The present invention relates to novel acidic and basic pH-reactive turn-on probe conjugates,

본 발명은 효소 어세이용 신규 턴-온 프로브 컨쥬게이트 및 이의 용도에 관한 것이다.The present invention relates to novel turn-on probe conjugates for enzyme assays and uses thereof.

효소 어세이는 촉매성 단백질의 활성을 동정하고 정량하는 데 중요하다. 측정가능한 효소적 활성의 변환을 위해, 효소적 반응들에 대한 시그널을 발생시키는 형광발광성(fluorogenic) 프로브들이 널리 이용되고 있다[1]. 상술한 프로브들 중에서, pH-민감성 지시인자들이 촉매성 반응 후에 pH 변화들을 유발하는 에스터라제, 디아미나제 및 락타마제 같은 효소들에 대한 어세이들에서 매우 유용하다[2]. 이전에, 많은 바이오어세이들이 염기성 조건에서 턴-온(turn-on) 형광 시그널을 나타내도록 활성화된 지시인자들을 이용하였다[3]. 비록 염기성-활성화된 프로브들보다 덜 알려져 있을 지라도, 산성 pH에 반응하는 형광발광성 지시인자들도 상기 어세이들을 위해 이용되어 왔었다[4]. 하지만, 상술한 프로브들은 항상 중성 pH로부터 시작하는 한-방식의 턴-온 특성을 보이는데, 이것은 프로브들이 산-유발 효소들 및 염기-유발 효소들 모두에 대한 일반적인 프로브로서 사용되는 것을 불가능하게 만든다. 프로브가 산성 용액 뿐 아니라 염기성 용액을 센싱하는 턴-온 시그널을 생산한다면, 상기 프로브는 pH-변화 효소들의 어세이에서 보편적으로 이용될 수 있는 보다 바람직한 수단일 것이다(예컨대, 도 1a).Enzyme assays are important in identifying and quantifying the activity of catalytic proteins. For the conversion of measurable enzymatic activity, fluorogenic probes that generate signals for enzymatic reactions have been widely used [1]. Among the above-mentioned probes, pH-sensitive indicators are very useful in assays for enzymes such as estrase, diamine and lactamase which cause pH changes after catalytic reaction [2]. Previously, many bioassays have used activated indicators to display a turn-on fluorescent signal under basic conditions [3]. Although less known than basic-activated probes, fluorescent indicators that respond to acidic pH have also been used for these assays [4]. However, the above-mentioned probes always exhibit a one-way turn-on characteristic starting from a neutral pH, which makes it impossible for the probes to be used as a general probe for both acid-inducing enzymes and base-inducing enzymes. If the probe produces a turn-on signal that senses a basic solution as well as an acidic solution, then the probe may be a more preferred means that can be universally used in the assay of pH-changing enzymes (e.g., FIG.

따라서, 효소 어세이들에 적합한 산성 및 염기성 조건 모두에서 효과적으로 기능할 수 있는 단일 프로브의 동정/발굴이 당업계에서 시급히 요구되고 있다.Therefore, there is an urgent need in the art for identification / discovery of a single probe that can function effectively in both acidic and basic conditions suitable for enzyme assays.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.Numerous papers and patent documents are referenced and cited throughout this specification. The disclosures of the cited papers and patent documents are incorporated herein by reference in their entirety to better understand the state of the art to which the present invention pertains and the content of the present invention.

Reymond et al., Enzyme assays. Chem Commun. 2009 Jan 7;(1):34-46Reymond et al., Enzyme assays. Chem Commun. 2009 Jan 7; (1): 34-46

본 발명자들은 폭넓은 pH 범위에서 시그널 턴-온 활성을 가지는 신규한 효소 어세이용 프로브를 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 산성 및 염기성 pH 모두에서 형광 활성을 가지는 신규한 턴-온 프로브 컨쥬게이트(turn-on probe conjugate)를 고안하여 제조하였으며, 상기 턴-온 프로브 컨쥬게이트가 중성 pH에서의 시그널과 비교하여 산성 pH(예컨대, pH 4 내지 pH 6) 및 염기성 pH(예컨대, pH 8 내지 pH 10) 모두에서 더 높은 형광/발광 시그널 특성을 나타내고 pH-변화 효소(예컨대, 페니실리나제 같은 베타-락타마제, 또는 아데노신 디아미나제)를 포함하는 약물-저항성 박테리아의 검출에 효과적으로 이용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.The present inventors have sought to develop a novel enzyme-assay probe having signal turn-on activity over a wide pH range. As a result, the present inventors have devised a novel turn-on probe conjugate having fluorescence activity at both acidic and basic pH, and that the turn-on probe conjugate has a signal at neutral pH (Such as penicillinase), which exhibit higher fluorescence / luminescence signal characteristics in both acidic pH (e.g., pH 4 to pH 6) and basic pH (e.g., pH 8 to pH 10) Lactamase, or adenosine deaminase). The present invention has been accomplished on the basis of this finding.

따라서, 본 발명의 목적은 턴-온 프로브 컨쥬게이트를 제공하는데 있다.It is therefore an object of the present invention to provide a turn-on probe conjugate.

본 발명의 다른 목적은 효소 어세이용 조성물을 제공하는데 있다.Another object of the present invention is to provide an enzyme-utilizing composition.

본 발명의 다른 목적은 시료 내 박테리아 감염 진단용 키트를 제공하는데 있다.It is another object of the present invention to provide a kit for the diagnosis of bacterial infection in a sample.

본 발명의 또 다른 목적은 시료 내 효소 또는 이를 포함하는 박테리아의 존재를 검출 또는 진단하는 방법을 제공하는데 있다.It is yet another object of the present invention to provide a method for detecting or diagnosing the presence of an enzyme or a bacteria comprising the enzyme in a sample.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.Other objects and advantages of the present invention will become more apparent from the following detailed description of the invention, claims and drawings.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 (a) pH-반응성 모이어티(moiety); (b) 형광성 모이어티; 및 (c) 상기 pH-반응성 모이어티와 형광성 모이어티 사이를 연결하는 전이금속 복합체(transition metal complex)를 포함하는 턴-온 프로브 컨쥬게이트(turn-on probe conjugate)를 제공한다.According to one aspect of the present invention, the present invention provides a composition comprising (a) a pH-reactive moiety; (b) a fluorescent moiety; And (c) a turn-on probe conjugate comprising a transition metal complex connecting the pH-reactive moiety and the fluorescent moiety.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 턴-온 프로브 컨쥬게이트를 포함하는 효소 어세이용 조성물을 제공한다.According to another aspect of the present invention, there is provided an enzyme assays composition comprising the above-mentioned turn-on probe conjugate.

본 발명자들은 폭넓은 pH 범위에서 시그널 턴-온 활성을 가지는 신규한 효소 어세이용 프로브를 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 산성 및 염기성 pH 모두에서 형광 활성을 가지는 신규한 턴-온 프로브 컨쥬게이트를 고안하여 제조하였으며, 상기 턴-온 프로브 컨쥬게이트가 중성 pH에서의 시그널과 비교하여 산성 pH(예컨대, pH 4 내지 pH 6) 및 염기성 pH(예컨대, pH 8 내지 pH 10) 모두에서 더 높은 형광/발광 시그널 특성을 나타내고 pH-변화 효소(예컨대, 페니실리나제 같은 베타-락타마제, 또는 아데노신 디아미나제)를 포함하는 약물-저항성 박테리아의 검출에 효과적으로 이용될 수 있음을 확인하였다.The present inventors have sought to develop a novel enzyme-assay probe having signal turn-on activity over a wide pH range. As a result, the present inventors have devised a novel turn-on probe conjugate having a fluorescence activity at both acidic and basic pH, and that the turn-on probe conjugate has an acidic pH (for example, (pH 4 to pH 6) and basic pH (e.g., pH 8 to pH 10), and exhibit higher fluorescence / luminescence signal characteristics and exhibit a pH-changing enzyme (for example, beta-lactamase such as penicillinase or adenosine diamine Resistant bacterium containing a drug-resistant bacterium.

통상적으로, 배위 화합물들은 화학적, 생물학적, 환경적 및 촉매적 중요성으로 인해 광범위하게 연구되어 왔다. 금속(예컨대, 산소, 질소, 등)-포함 공여체 리간드들로 구성되는 3차 금속 복합체(complexone)가 다양한 생물학 분야(예컨대, 배위 결합된 금속을 통한 친화도 크로마토그래피 같은 단백질 정제)에서 채택되어 사용되어 왔지만, 중성 pH 또는 약염기성 pH에서 기능하는 복합체들에 대한 연구가 주로 이루어졌고 일부 산성 pH에서 기능하는 복합체들에 대한 보고가 있었다. 이와 관련하여, 효소 어세이를 위한 형광발광성 프로브들이 다양하게 사용되어 왔지만 종래의 프로브들은 pH에 따라 사용되는 프로브가 달라 적용 상에 큰 어려움이 존재한다. 종래의 효소 어세이용 프로브의 pH 조건에 따른 적용의 어려움 및 비효율성을 극복하기 위해, 본 발명자들은 산성 및 염기성 pH 조건 모두에서 작동가능한 턴-온 프로브 컨쥬게이트를 고안하였다.Conventionally, coordination compounds have been extensively studied due to their chemical, biological, environmental and catalytic importance. A tertiary metal complexone consisting of a metal (e.g., oxygen, nitrogen, etc.) -containing donor ligands has been employed in a variety of biological fields, such as protein purification such as affinity chromatography through coordinated metal, However, studies have focused on complexes that function at neutral or weakly basic pH, and there have been reports of complexes that function at some acidic pH. In this regard, although fluorescent probes for enzyme assays have been used extensively, conventional probes have great difficulties in application due to different probes used depending on pH. In order to overcome the difficulties and inefficiencies of application according to the pH conditions of conventional enzymatic assay probes, the present inventors have devised a turn-on probe conjugate operable under both acidic and basic pH conditions.

본 발명의 턴-온 프로브 컨쥬게이트는 (a) pH-반응성 모이어티(moiety); (b) 형광성 모이어티; 및 (c) 상기 pH-반응성 모이어티와 형광성 모이어티 사이를 연결하는 전이금속 복합체(transition metal complex)를 포함하며, 산성 및 염기성 pH 조건 모두에서 효과적으로 작동가능하다.The turn-on probe conjugate of the present invention comprises (a) a pH-reactive moiety; (b) a fluorescent moiety; And (c) a transition metal complex connecting the pH-reactive moiety and the fluorescent moiety, and is operable effectively in both acidic and basic pH conditions.

본 발명의 전이금속 복합체는 최소 하나 이상의 전이금속 원자와 최소 하나 이상의 리간드 분자를 포함할 수 있다.The transition metal complex of the present invention may contain at least one transition metal atom and at least one ligand molecule.

본 발명의 어떤 구현예에서, 상기 전이금속 복합체 내 전이금속 원자(즉, 중앙 금속 원자)는 Co(II), Cu(II), Ni(II) 또는 Zn(II)이며, 보다 더 구체적으로는 Co(II) 또는 Cu(II)이고, 가장 구체적으로는 Co(II)이다. 본 명세서에서 사용되는 용어 “전이금속 원자(transition metal atom)”는 상기 전이금속 복합체 내 중앙의 전이금속 원자를 나타내고, 이의 산화 상태는 0 내지 +4일 수 있으며 구체적으로는 +2 또는 +3이고 보다 구체적으로는 +2이다.In some embodiments of the present invention, the transition metal atom (i.e., the central metal atom) in the transition metal complex is Co (II), Cu (II), Ni (II) Co (II) or Cu (II), and most particularly Co (II). As used herein, the term " transition metal atom " refers to the transition metal atom in the center of the transition metal complex, whose oxidation state can be from 0 to +4, specifically +2 or +3 More specifically, it is +2.

상기 최소 하나 이상의 리간드 분자는 상기 전이금속 원자와 배위 결합을 형성할 수 있는 하나 이상의 원자들, 보다 구체적으로는 2-8개의 원자들, 보다 더 구체적으로는 3-5개의 원자들 및 가장 구체적으로는 4-5개의 원자들을 포함한다.Wherein the at least one ligand molecule comprises one or more atoms capable of forming a coordination bond with the transition metal atom, more specifically 2 to 8 atoms, more particularly 3 to 5 atoms, Contains 4-5 atoms.

본 발명의 어떤 구현예에서, 상기 리간드 분자 내 원자는 산소 원자, 질소 원자, 황 원자 또는 탄소 원자를 포함하고, 보다 구체적으로는 산소 원자 또는 질소 원자를 포함한다. 상기 산소 원자를 포함하는 적합한 작용기의 예는 알코올레이트(R-O-), 카르복실레이트(R-COO-), 퍼록사이드(R-O-O-), 또는 이와 유사한 작용기를 포함한다. 상기 질소 원자를 포함하는 적합한 작용기의 예는 1차, 2차 또는 3차 아민 기능을 포함하는 지방족 아민 작용기를 포함하거나, 또는 피롤, 이미다졸, 디아졸 또는 트리아졸 고리, 또는 이와 유사한 것을 포함하는 방향족성 또는 포화된 고리 시스템의 일부로 포함될 수 있으며, 예를 들어 히스티딘 모이어티 또는 His-택(tag)의 일부로 포함된다.In some embodiments of the present invention, the atoms in the ligand molecule include an oxygen atom, a nitrogen atom, a sulfur atom or a carbon atom, and more specifically an oxygen atom or a nitrogen atom. Examples of suitable functional group containing the oxygen atom is an alcoholate (RO -) and a, or the like functional group, carboxylate (R-COO - -), peroxide (ROO). Examples of suitable functional groups containing nitrogen atoms include aliphatic amine functional groups, including primary, secondary or tertiary amine functions, or functional groups containing pyrrole, imidazole, diazole or triazole rings, or the like Aromatic or saturated ring system, and is included, for example, as part of a histidine moiety or His-tag.

본 발명의 어떤 구현예에서, 상기 리간드 분자는 멀티자리수(multidentate) 리간드 분자로 중앙의 전이금속 원자와 배위결합을 형성하는 2-6개의 리간드 원자들(예컨대, 산소 원자 또는 질소 원자)를 포함하고 상기 배위결합을 형성하는 리간드 원자는 상기 중앙의 전이금속 원자의 모든 가능한 배위결합 위치들을 점유하지 않는다. 예를 들어, 항상 5-6개의 배위수(coordination number)를 가지는 중앙 코발트 원자(Co(II))에 대해 상기 배위결합을 형성하는 리간드 원자는 3-5개의 잠재적인 배위(결합) 위치들을 가질 수 있다.In some embodiments of the invention, the ligand molecule is a multidentate ligand molecule comprising 2-6 ligand atoms (e.g., oxygen or nitrogen atoms) that form a coordination bond with the central transition metal atom The ligand atoms forming the coordination bond do not occupy all possible coordinate bonding positions of the central transition metal atom. For example, a ligand atom that forms said coordination bond to a central cobalt atom (Co (II)), which always has a coordination number of 5-6, has 3-5 potential coordinate (bonding) positions .

본 발명의 어떤 구현예에서, 상기 리간드 분자는 아미노폴리카르복실산(aminopolycarboxylic acid)이다. 아미노폴리카르복실산은 2개 이상의 카르복실기 내 탄소 원자를 통해 연결되는 하나 이상의 질소 원자들을 포함하는 화합물로, 금속 이온들(예컨대, Ca2 +, Cu2 +, Co2 +, Ni2 +, Fe3 +, 등)과 강력한 복합체를 형성한다. 아미노폴리카르복실산은 NTA(nitrilotriacetic acid), MIDA((methylimino)diacetic acid), IDA(iminodiacetic acid), Fura-2, EDTA(ethylene diaminemono acetate), DTPA(diethylene triamine pentaacetate), BAPTA, NOTA((1,4,7-triazonane-1,4,7-triyl)triacetic acid), DOTA((1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetrayl)tetraacetic acid), TTHA(3,6,9,12-tetrakis(carboxymethyl)-3,6,9,12-tetraazatetradecanedioic acid), TETA((1,4,8,11-tetraazacyclotetradecane-1,4,8,11-tetrayl)tetraacetic acid) 등을 포함한다.In some embodiments of the invention, the ligand molecule is an aminopolycarboxylic acid. Amino polycarboxylic acid is a compound containing one or more nitrogen atoms are connected through in a carbon atom at least two carboxyl groups, metal ions (e.g., Ca 2 +, Cu 2 +, Co 2 +, Ni 2 +, Fe 3 + , Etc.). Aminopolycarboxylic acids include nitrilotriacetic acid, MIDA (methylimino) diacetic acid, IDA (iminodiacetic acid), Fura-2, EDTA (ethylene diaminemono acetate), DTPA (diethylene triamine pentaacetate), BAPTA, , 4,7-triazonane-1,4,7-triyl) triacetic acid), DOTA ((1,4,7,10-tetraazacyclododecane- 1,4,7,10- tetrayl) tetraacetic acid), TTHA (3, 6,9,12-tetrakis (carboxymethyl) -3,6,9,12-tetraazatetradecanedioic acid), TETA ((1,4,8,11-tetraazacyclotetradecane-1,4,8,11-tetrayl) tetraacetic acid) .

본 발명의 어떤 구현예에서, 본 발명에서 이용될 수 있는 리간드 분자는 4개의 배위수를 가지는 NTA로, 형광성 모이어티와 공유결합적으로 연결되고 Co(II)와 배위결합을 통해 전이금속 복합체를 형성하며 Co(II)의 나머지 배위수를 통해 pH-반응성 모이어티와 결합한다.In some embodiments of the present invention, the ligand molecule that can be used in the present invention is an NTA having four coordination numbers, covalently linked with a fluorescent moiety and coordinated with Co (II) to form a transition metal complex Reactive moiety through the remaining coordination number of Co (II).

본 명세서에서 사용되는 용어 “연결(link)" 또는 화학적 결합은 최소 하나의 화학적 결합을 통해 두 개의 구성요소들을 연결하는 것을 의미하며, 상기 화학적 결합은 배위 결합, 수소 결합, 이온 결합, 공유 결합, 등과 같이 당업계에 알려진 어떠한 결합을 포함할 수 있고, 구체적으로는 배위 결합(coordination bond) 및 공유 결합을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.The term " link " or chemical bond, as used herein, refers to connecting two components through at least one chemical bond, wherein the chemical bond is a bond such as a coordination bond, hydrogen bond, ionic bond, , And the like, and specifically include, but are not limited to, coordination bonds and covalent bonds.

본 발명의 어떤 구현예에서, 상기 연결은 최소 하나 이상의 화학적 결합을 통해 이루어지며, 보다 구체적으로는 전이금속 복합체와 형광성 모이어티는 공유 결합을 통해 연결되고 전이금속 복합체와 pH-반응성 모이어티는 배위 결합을 통해 연결된다. 또한, 상기 연결에서 본 발명의 턴-온 프로브 컨쥬게이트의 구성요소들 간의 결합을 방해하지 않는 한, 추가적인 결합을 포함할 수도 있다.In some embodiments of the present invention, the linkage is through at least one or more chemical bonds, more specifically the transition metal complex and the fluorescent moiety are linked via a covalent bond, and the transition metal complex and the pH- Lt; / RTI > It may also include additional coupling, as long as it does not interfere with the coupling between the components of the turn-on probe conjugate of the present invention in the connection.

따라서, 전이금속 복합체를 이용하여 pH-반응성 모이어티와 형광성 모이어티를 배위결합적 및 공유결합적으로 연결시킨 본 발명의 턴-온 프로브 컨쥬게이트는 pH-반응성 모이어티의 결합/해리에 따라 다양한 pH 조건 하에서의 형광 시그널 측정을 통해 pH-변화를 유발하는 효소의 어세이에 간편하고 효율적으로 적용가능하다.Therefore, the turn-on probe conjugate of the present invention, in which a pH-reactive moiety and a fluorescent moiety are connected in a coordinative and covalent manner using a transition metal complex, can be variously modified depending on the binding / dissociation of the pH- It can be easily and efficiently applied to the assay of the enzyme causing the pH-change by measuring the fluorescence signal under the pH condition.

본 발명의 어떤 구현예에서, 본 발명의 턴-온 프로브 컨쥬게이트는 산성 또는 염기성 pH에서 형광을 나타낸다.In some embodiments of the present invention, the turn-on probe conjugates of the present invention exhibit fluorescence at acidic or basic pH.

본 발명의 어떤 구현예에서, 본 발명의 pH-반응성 모이어티는 산성 또는 염기성 pH 하에서 상기 턴-온 프로브 컨쥬게이트로부터 해리되고, 보다 구체적으로는 산성 pH 하에서 해리되었다가 중성 pH 하에서 다시 결합된다(참고: 도 6).In some embodiments of the invention, the pH-reactive moieties of the invention dissociate from the turn-on probe conjugate under acidic or basic pH, more specifically dissociate under acidic pH and bind again under neutral pH 6).

본 발명에서 산성 pH의 범위는 pH 2.0 내지 pH 6.5이며, 보다 구체적으로는 pH 3.0 내지 pH 6.3이며, 보다 더 구체적으로는 pH 3.5 내지 pH 6.1이다. 본 발명에서 염기성 pH의 범위는 pH 7.5 내지 pH 11.0이며, 보다 구체적으로는 pH 7.8 내지 pH 10.5이며, 보다 더 구체적으로는 pH 8.0 내지 pH 10.0이다.In the present invention, the range of the acidic pH is from pH 2.0 to pH 6.5, more specifically from pH 3.0 to pH 6.3, and more specifically from pH 3.5 to pH 6.1. In the present invention, the basic pH ranges from pH 7.5 to pH 11.0, more specifically from pH 7.8 to pH 10.5, and more specifically from pH 8.0 to pH 10.0.

본 발명의 어떤 구현예에서, 본 발명의 pH-반응성 모이어티는 산성 및 염기성 pH 하에서 상기 프로브 컨쥬게이트로부터 해리됨으로써 상기 프로브의 형광을 유발시킬 수 있는 물질이라면 어떠한 것도 이용될 수 있으며, 보다 구체적으로는 폴리-L-히스티딘(poly-L-His)을 이용할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 어떤 구현예에서, 상기 폴리-L-히스티딘은 10개 이상의 히스티딘, 보다 구체적으로는 50개 이상의 히스티딘, 및 보다 더 구체적으로는 약 50-200개의 히스티딘으로 이루어진 혼합물을 포함한다.In some embodiments of the present invention, the pH-reactive moiety of the present invention can be any material capable of inducing fluorescence of the probe by dissociation from the probe conjugate under acidic and basic pH, and more specifically, Poly-L-histidine (poly-L-His) can be used, but the present invention is not limited thereto. In some embodiments of the invention, the poly-L-histidine comprises a mixture of at least 10 histidine, more particularly at least 50 histidine, and more particularly at least about 50-200 histidine.

본 명세서에서 사용되는 용어 “형광성 모이어티(fluorescent moiety)”는 상기 pH-반응성 모이어티가 프로브 컨쥬게이트로부터 해리됨에 따라 형광 시그널을 창출하는 형광 분자 또는 이의 유도체 또는 컨쥬게이트를 의미한다.The term " fluorescent moiety " as used herein refers to a fluorescent molecule or derivative or conjugate thereof that produces a fluorescence signal as the pH-reactive moiety dissociates from the probe conjugate.

본 발명의 어떤 구현예에서, 본 발명의 형광성 모이어티는 로다민, 쿠마린, 시아닌, EvoBlue, 옥사진, 카르보피로닌(carbopyronin), 나프탈렌, 바이페닐, 안트라센(anthracene), 페난트렌, 파이렌, 카르바졸 등을 기본 백본으로 가지는 형광 색소 또는 이의 유도체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 형광성 모이어티는 ATTO 390™ (479), ATTO　425™ (484), ATTO　465™ (508), ATTO　488™ (523), ATTO　495™ (527), ATTO　520™ (538), ATTO　532™ (553), ATTO　Rho6G™ (570), ATTO　550™ (576), ATTO　565™ (592), ATTO　Rho3B™ (565), ATTO　Rho11™ (608), ATTO　Rho12™ (532), ATTO　Thio12™ (579), ATTO　610™ (634), ATTO　611 X™ (681), ATTO　620™ (643), ATTO　Rho14™ (625), ATTO 633™ (657), ATTO　647™ (669), ATTO　647 N™ (669), ATTO　655™ (684), ATTO　Oxa12™ (663), ATTO　700™ (719), ATTO 725™ (752), ATTO　740™ (764), BODIPY TMR (568), BODIPY558/568 (568), BODIPY564/570 (570), EvoBlue10™, EvoBlue30™, MR121, Cy2™ (506), YO-PRO™-1 (509), YOYO™-1 (509), Calcein (517), FITC (518), FluorX™ (519), Alexa™ (520), 로다민(Rhodamine) 110 (520), 5-FAM (522), Oregon Green™ 500 (522), Oregon Green™ 488 (524), RiboGreen™ (525), 로다민 Green™ (527), 로다민 123 (529), Magnesium Green™ (531), Calcium Green™ (533), TO-PRO™-1 (533), TOTO1 (533), JOE (548), BODIPY530/550 (550), Dil (565), Cy3™ (570), Alexa™ 546 (570), TRITC (572), Magnesium Orange™ (575), 피코에리트린 R&B (575), 로다민 팔로이딘(Phalloidin) (575), Calcium Orange™ (576), 피로닌 Y (580), 로다민 B (580), TAMRA (582), 로다민 Red™ (590), Cy3.5™ (596), ROX (608), Calcium Crimson™ (615), Alexa™ 594 (615), Texas Red(615), Nile Red (628), YO-PRO™-3 (631), YOYO™-3 (631), R-피코시아닌 (642), C-피코시아닌 (648), TO-PRO™-3 (660), TOTO3 (660), DiD DilC(5) (665), Cy5™ (670), 티아디카르보시아닌 (671), Cy5.5(694), Biosearch Blue (447), CAL Fluor Gold 540 (544), CAL Fluor Orange 560 (559), CAL Fluor Red 590 (591), CAL Fluor Red 610 (610), CAL Fluor Red 635 (637), FAM (520), Fluorescein (520), Fluorescein-C3 (520), Pulsar 650 (566), Quasar 570 (667), Quasar 670 (705), Quasar 705 (610) 및 이의 유도체 또는 컨쥬게이트를 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 괄호의 숫자는 나노미터 단위로 표시한 발광 최대 파장이다. 또한, 본 발명의 형광성 모이어티 유도체는 자유 카르복실기, 에스테르(예컨대, N-하이드로숙신이미드(NHS) 에스테르) 또는 말레이미드 유도체를 추가적으로 포함할 수 있으며, 본 발명의 형광성 모이어티의 컨쥬게이트는 스트렙타비딘, 바이오틴, 팔로이딘, 아민, 아자이드 또는 이오도아세트아미드 컨쥬게이트를 포함할 수 있다.In some embodiments of the present invention, the fluorescent moiety of the present invention is selected from the group consisting of rhodamine, coumarin, cyanine, EvoBlue, oxazine, carbopyronin, naphthalene, biphenyl, anthracene, phenanthrene, , Carbazole, etc., as a basic backbone, or a derivative thereof. For example, the fluorescent moieties of the present invention can be synthesized using ATTO 390 ™ (479), ATTO 425 ™ (484), ATTO 465 ™ (508), ATTO 488 ™ (523), ATTO 495 ™ (527), ATTO 520 ™ 538), ATTO 532 ™ (553), ATTO Rho6G ™ (570), ATTO 550 ™ (576), ATTO 565 ™ (592), ATTO Rho3B ™ 565, ATTO Rho11 ™ 608, ATTO Rho12 ™ 532 ), ATTO Thio12 (579), ATTO 610 (634), ATTO 611 X (681), ATTO 620 (643), ATTO Rho14 (625), ATTO 633 (657), ATTO 647 ATTO 647 N (669), ATTO 655 (684), ATTO Oxa 12 (663), ATTO 700 (719), ATTO 725 (752), ATTO 740 (764), BODIPY TMR , BODIPY 558/568 (568), BODIPY 564/570 (570), EvoBlue 10 ™, EvoBlue 30 ™, MR121, Cy2 ™ 506, YO-PRO ™ -1 509, YOYO ™ -1 509, Calcein 517 ), FITC 518, FluorX 519, Alexa 520, Rhodamine 110 520, 5-FAM 522, Oregon Green 500 (522), Oregon Green 488 (524 ), RiboGreen ™ (525), Rhodamine Green ™ (527), Rhodamine 123 (529), Magnesium Green (531), Calcium Green ™ (533), TO-PRO ™ -1 533, TOTO1 533, JOE 548, BODIPY 530/550 550, Dil 565, Cy3 ™ 570, Phosphatidylin (575), Calcium Orange (576), Pyronin Y (580), Alexa ™ 546 (570), TRITC 572, Magnesium Orange 575, Picoeritrin R & ), Rhodamine B (580), TAMRA (582), Rhodamine Red (590), Cy3.5TM (596), ROX (608), Calcium CrimsonTM (615), AlexaTM 594 (631), R-picocyanin (642), C-picocyanin (648), TO-PRO (660), TOTO3 (660), DiD DilC (5) (665), Cy5 (670), Tiadicarbocyanine (671), Cy5.5 (694), Biosearch Blue CAL Fluor Red 610 (610), CAL Fluor Red 635 (637), FAM (520), Fluorescein (520), Fluorescein 540 (559) Including but not limited to -C3 520, Pulsar 650 566, Quasar 570 667, Quasar 670 705, Quasar 705 610 and derivatives or conjugates thereof, It is not limited to. The number in parentheses is the maximum emission wavelength in nanometers. In addition, the fluorescent moiety derivative of the present invention may further comprise a free carboxyl group, an ester (e.g., N-hydroxysuccinimide (NHS) ester) or a maleimide derivative, and the conjugate of the fluorescent moiety Tolidine, biotin, paloidine, amine, azide or iodoacetamide conjugate.

본 발명의 어떤 구현예에서, 본 발명의 형광성 모이어티는 옥사진(oxazine)-기반 표지를 포함하고, 보다 구체적으로는 ATTO　488™이다.In some embodiments of the invention, the fluorescent moiety of the present invention comprises an oxazine-based label, more specifically ATTO 488 (TM).

본 발명의 턴-온 프로브 컨쥬게이트는 pH-변화 유발 효소를 효과적으로 어세이할 수 있다. 본 발명의 턴-온 프로브 컨쥬게이트는 pH-변화(즉, 산성 또는 염기성 pH로의 변화)에 따라 pH-반응성 모이어티가 상기 프로브 컨쥬게이트로부터 해리되어 형광 시그널이 턴-온 된다. 예를 들어, 산성 pH 4에서는 pH-반응성 모이어티가 Co(II)와의 배위 결합이 파괴되어 상기 컨쥬게이트로부터 해리되고, 이에 따라 형광성 모이어티가 형광을 나타낸다. 또한, 중성 pH 7로의 변화는 pH-반응성 모이어티와 전이금속 복합체 내 리간드 분자가 Co(II)와 배위 결합을 형성함으로써 형광 시그널을 나타내지 않게 된다(참고; 도 1b, 도 4 및 도 6). 이에 반해, 염기성 pH 10에서는 산성 pH4와 마찬가지로 pH-반응성 모이어티의 해리에 따라 형광 시그널을 나타내지만, 중성 pH 7로 회귀시키는 경우 턴-온 프로브 컨쥬게이트의 형성을 이루지 못 하였는데, 이는 염기성 pH 하에서 불용성 Co(II) 하이드록사이드가 형성되어 리간드-형광성 모이어티가 Co(II)와 결합할 수 없기 때문이다. 결과적으로, 본 발명의 턴-온 프로브 컨쥬게이트는 산성 및 염기성 pH 모두에서 형광 시그널을 나타낼 수 있다. 따라서, 본 발명의 턴-온 프로브 컨쥬게이트를 포함하는 조성물은 pH-변화를 유발하는 효소를 검출하는 데 효과적으로 사용될 수 있다.The turn-on probe conjugate of the present invention can effectively assay the pH-change inducing enzyme. The turn-on probe conjugate of the present invention is dissociated from the probe conjugate by a pH-responsive moiety upon a pH-change (i.e., a change to acidic or basic pH) so that the fluorescence signal is turned on. For example, at an acidic pH of 4, the pH-reactive moiety destroys the coordination bond with Co (II) and is dissociated from the conjugate, so that the fluorescent moiety exhibits fluorescence. In addition, the change to neutral pH 7 causes the ligand molecules in the pH-reactive moiety and the transition metal complex to form a coordination bond with Co (II), resulting in no fluorescence signal (cf. FIG. 1B, FIG. 4 and FIG. 6). In contrast, at basic pH 10, the fluorescence signal was exhibited as the pH-reactive moiety dissociated as in the case of the acidic pH 4. However, when the pH was returned to the neutral pH 7, the turn-on probe conjugate could not be formed, This is because the insoluble Co (II) hydroxide is formed so that the ligand-fluorescent moiety can not bind Co (II). As a result, the turn-on probe conjugates of the present invention can display fluorescence signals in both acidic and basic pH. Thus, a composition comprising a turn-on probe conjugate of the present invention can be effectively used to detect enzymes that cause pH-change.

본 발명의 어떤 구현예에서, 상기 pH-변화를 유발하는 효소는 산성- 또는 염기성-유발 효소라면 어떠한 것도 포함할 수 있으며, 보다 구체적으로는 베타-락타마제 및 아데노신 디아미나제를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.In certain embodiments of the invention, the pH-altering enzyme may comprise any acidic or basic-inducible enzyme, and more specifically includes beta-lactamase and adenosine deaminase, But is not limited thereto.

유사하게, 본 발명의 조성물은 산성- 또는 염기성-유발 효소를 포함하는 약물-저항성 박테리아 감염 질환의 진단에 이용될 수 있다.Similarly, the compositions of the present invention can be used for the diagnosis of drug-resistant bacterial infectious diseases, including acidic or basic-inducible enzymes.

본 명세서에서 사용되는 용어 “감염 질환(infectious disease)”은 대상자(subject) 또는 환자 내에 또는 이와 접촉하는 생물체(감염성 제제)의 존재와 관계되는 질환 또는 상태를 의미한다. 상기 생물체는 박테리아, 곰팡이, 바이러스 또는 다른 미생물을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 “박테리아 감염 질환(bacterial infectious disease)”은 생물체가 박테리아인 것을 특징으로 하는 감염 질환이다. 예를 들어, “항생제-저항성 박테리아 감염 질환”은 상기 생물체가 하나 이상의 박테리아의 비-항생제 저항성 스트레인들에 의해 야기되는 질환의 치료에서 효과적인 하나 이상의 항생제에 대해 저항성을 가지는 박테리아인 것을 특징으로 하는 감염 질환이다. 특히, “베타-락탐 항생제 저항성 박테리아 감염 질환”은 베타-락탐 포함 항생제들에 의해 효과적으로 치료되지 않는 항생제 저항성 박테리아 감염 질환을 의미한다.The term " infectious disease " as used herein refers to a disease or condition associated with the subject or the presence of an organism (infectious agent) in or in contact with the subject. Such organisms include bacteria, fungi, viruses or other microorganisms. The term " bacterial infectious disease " as used herein is an infectious disease characterized in that the organism is a bacterium. For example, an " antibiotic-resistant bacterial infectious disease " is an infection that is characterized by the presence of a bacterium that is resistant to one or more antibiotics effective in the treatment of a disease caused by non-antibiotic resistant strains of one or more bacteria Disease. In particular, " beta-lactam antibiotic resistant bacterial infection disease " means an antibiotic resistant bacterial infection disease that is not effectively treated by beta-lactam containing antibiotics.

본 발명의 턴-온 프로브 컨쥬게이트가 이용될 수 있는 약물-저항성 박테리아는 엔테로박터(Enterobacter), 시트로박터(Citrobacter), 세라티아(Serratia), 슈도모나스(Pseudomonas), 에스체리시아(Escherichia), 살모넬라(Salmonella), 해모필러스(Haemophilus), 스트렙토코커스(Streptococcus), 스타필로코커스(Staphylococcus), 쉬겔라(Shigella), 마이코박테리움(Mycobacterium), 클로스트리디움(Clostridium), 리스테리다(Listeria), 스테노트로포모나스(Stenotrophomonas), 클로스트리디움(Clostridium), 아시네토박터(Acinetobacter), 박테로이데스(Bacteroides), 보르데텔라(Bordetella), 보렐리아(Borrelia), 브루셀라(Brucella), 캄필로박터(Campylobacter), 클라미디아(Chlamydia), 클라미도필라(Chlamydophila), 코리네박테리움(Corynebacterium), 프란시셀라(Francisella), 헬리코박터(Helicobacter), 레기오넬라(Legionella), 렙토스피라(Leptospira) 및 에시니아(Yersinia) 속에 속하는 박테리아를 포함하고, 보다 구체적으로는 엔테로박터, 시트로박터, 세라티아, 슈도모나스, 에스체리시아, 살모넬라, 해모필러스, 스트렙토코커스, 스타필로코커스, 쉬겔라, 마이코박테리움, 클로스트리디움 및 리스테리다 속에 속하는 박테리아를 포함하며, 보다 더 구체적으로는 대장균(E. coli), 장독소형 대장균(ETEC), 장출혈성 대장균(EHEC), 장병원성 대장균(EPEC), 대장균 0157:H7, 시트로박터 프레운디이(C. freundii), 세라티아 티피무리움(S. typhimurium), 세라티아 마르세센스(S. marcescens), 엔테로박터 클로아카에(E. cloacae), 슈도모나스 애루기노사(P. aeruginosa), 살모넬라 티피(S. typhi), 살모넬라 티피무리움(S. typhimurium), 해모필러스 인플루엔자(H. influenzae), 스트렙토코커스 뉴모니에(S. pneumoniae), 스트렙토코커스 피오게네스(S. pyogenes), 스트렙토코커스 아갈락티에(S. agalactiae), 스타필로코커스 아우레우스(S. aureus), 스타필로코커스 에피더미디스(S. epidermidis), 스타필로코커스 사프로피티쿠스(S. saprophyticus), 쉬겔라 소네이(S. sonnei), 마이코박테리움 레프레(M. leprae), 마이코박테리움 튜버큘로시스(M. tuberculosis), 클로스트리움 디피실(C. difficile) 및 리스테리다 모노시토게네스(L. monocytogenes)을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.Drugs that are on the probe conjugate can be used - the turn of the invention resistant bacteria Enterobacter bakteo (Enterobacter), bakteo (Citrobacter), Serratia marcescens (Serratia), Pseudomonas (Pseudomonas), S. Cherry cyano (Escherichia) into a sheet, Salmonella is (Salmonella), to a brush Russ (Haemophilus), Streptococcus (Streptococcus), Staphylococcus (Staphylococcus), relax Gela (Shigella), Mycobacterium (Mycobacterium), Clostridium (Clostridium), less Terry ( Listeria), Pomona's (Stenotrophomonas), Clostridium (Clostridium), Acinetobacter (Acinetobacter), night teroyi death (Bacteroides), Bordetella (Bordetella), borelri Ah (Borrelia), brucellosis (Brucella) in Ste Notes , Campylobacter (Campylobacter), chlamydia (Chlamydia), Cloud shown pillar (Chlamydophila), Corynebacterium (Corynebacterium), Fran when cellar (Francisella), Helicobacter pylori (Helicobacter), Reggie ohnel la (L egionella), including bacteria belonging to the genus Leptospira (Leptospira) and Ecija California (Yersinia), and more specifically Enterobacter bakteo, a sheet bakteo, Serratia, Pseudomonas, S. Cherry cyano, Salmonella, to a brush Russ, Streptococcus, star Philo Lactococcus, sH Gela, Mycobacterium, comprising a bacterium belonging to the genus Claus the tree Stadium and Terry less, still more specifically, Escherichia coli (E. coli), E. coli enterotoxins small (ETEC), Chapter hemorrhagic Escherichia coli (EHEC) , Enteric pathogenic Escherichia coli (EPEC), Escherichia coli 0157: H7, C. freundii , S. typhimurium , S. marcescens , Enterobacter cloacae in the (E. cloacae), Pseudomonas Ke rugi labor (P. aeruginosa), Salmonella typhimurium (S. typhi), Salmonella typhimurium (S. typhimurium), by a brush Russ influenza (H. influenzae), Streptococcus pneumoniae ( S. S. pneumoniae , S. pyogenes , S. agalactiae , S. aureus , S. epidermidis , and Staphylococcus aureus . S. saprophyticus , S. sonnei , M. leprae , M. tuberculosis , Clostridium difficile, M. tuberculosis , But are not limited to, C. difficile and L. monocytogenes .

본 발명의 어떤 구현예에서, 상기 약물-저항성 박테리아에 의해 유발되는 감염 질환은 피부 및 연조직 감염, 발열성 호중구감소증, 요로 감염증(UTI), 복강내 감염, 기도관 감염, 상기도관 감염, 폐렴(병원성), 뇌수막염, 수술 중 감염, 전염성 부비동염, 탄저병, 라임병, 브루셀라병(Brucellosis), 급성 장염, 공동체-획득성 호흡 감염, 비특이성요도염(NGU), 성병성 림프 육아종(LGV), 임질, 트라코마, 신생아의 봉입체결막염, 보눌리눔 식중독, 급성식중독, 설사, 출혈성 대장염, 기관지염, 위궤양, 심장 내막염, 살모넬라증, 위장염, 적리, 기회 감염, 중이염, 부비동염, 인두염, 여드름, 모공성각화증(keratosis pilaris), 주사비, 할리퀸 어린선, 색소성 건피증, 각화증, 습진, 뇌사성 근막염 및 결핵을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.In some embodiments of the invention, the infectious disease caused by the drug-resistant bacteria is selected from the group consisting of skin and soft tissue infections, febrile neutropenia, urinary tract infections (UTI), intraperitoneal infections, airway tube infections, Brucellosis, acute enteritis, community-acquired respiratory infection, nonspecific urethritis (NGU), sexually transmitted disease (LGV), gonorrhea, gonorrhea, Keratosis pilaris, acne vulgaris, acne vulgaris, bronchitis, gastric ulcer, endocarditis, salmonellosis, gastroenteritis, rubella, opportunistic infections, otitis media, sinusitis, pharyngitis, acne, pneumoconiosis, acute food poisoning, diarrhea, hemorrhagic colitis, , Rubella, Harlequin kidney line, pigmented scleroderma, keratosis, eczema, brain fascia fasciitis and tuberculosis.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 턴-온 프로브 컨쥬게이트를 포함하는 시료 내 박테리아 감염 진단용 키트를 제공한다.According to still another aspect of the present invention, there is provided a kit for detecting a bacterial infection in a sample comprising the above-mentioned turn-on probe conjugate.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 상술한 턴-온 프로브 컨쥬게이트와 목적 시료(sample of interest)를 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 시료에서 형광을 검출하는 단계를 포함하는 시료 내 효소 또는 이를 포함하는 박테리아의 존재를 검출 또는 진단하는 방법을 제공한다.According to another aspect of the present invention, there is provided a method of making a probe, comprising: (a) contacting a sample of interest with a turn-on probe conjugate; And (b) detecting fluorescence in the sample. The present invention also provides a method for detecting or diagnosing the presence of an enzyme in a sample or a bacteria containing the enzyme.

본 발명의 키트 및 방법은 상술한 턴-온 프로브 컨쥬게이트를 유효성분으로 이용하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.Since the kits and methods of the present invention utilize the above-described turn-on probe conjugate as an active ingredient, the description common to both is omitted in order to avoid the excessive complexity of the present specification.

본 발명의 프로브 컨쥬게이트에 의해 발생되는 형광은 시료 내 효소 또는 이를 포함하는 박테리아의 존재에 대한 지표가 될 수 있으며, 이를 통해 상기 박테리아에 의해 유발되는 감염 질환의 진단에 이용될 수 있다.Fluorescence generated by the probe conjugate of the present invention can be an indicator of the presence of an enzyme in a sample or a bacteria containing the same, and thus can be used for diagnosis of an infectious disease caused by the bacteria.

본 명세서에서 용어 “진단”은 특정 질병 또는 질환에 대한 한 객체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는 지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)(예컨대, 감염 질환 또는 상태의 동정, 상기 질환의 치료에 대한 반응성 및 이의 효과 판단)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것)을 포함할 수 있다.As used herein, the term " diagnosis " is intended to include determining the susceptibility of an object to a particular disease or disorder, determining whether an object currently has a particular disease or disorder, Determining the prognosis of an object (e.g., identifying an infectious disease or condition, reactivity to treatment of the disease and determining the effect thereof), or determining therametrics (e.g., providing information about therapeutic efficacy) And monitoring the state of the object to do so.

목적 시료와 접촉(반응)시켜 본 발명의 턴-온 프로브 컨쥬게이트의 해리/결합에 따른 형광 변화를 측정함으로써 최종적인 시그널의 세기를 분석함으로써 pH-변화를 유발시키는 약물-저항성 박테리아에 의한 감염 질환을 진단할 수 있다. 상기 형광 시그널 분석은 당업계에 공지된 다양한 방법을 이용하여 실시될 수 있다(참고: 실험방법). 즉, 형광 시그널은 당업계에서 이용가능한 적합한 장치(apparatus)에 의해 판독되고 프로세싱된다. 예를 들어, 형광 분석기, 마이크로플레이트 판독기, 로봇 장치들을 이용한 자동화 프로세싱, 레이저 스캐닝 시스템을 포함하는 당업계에 알려진 프로토콜 및 과정들이 이용될 수 있다.By analyzing the intensity of the final fluorescence by dissociation / binding of the turn-on probe conjugate of the present invention by contacting (reacting) with the objective sample, the intensity of the final signal is analyzed to determine the effect of the drug- Can be diagnosed. The fluorescence signal analysis can be carried out using various methods known in the art (reference: experimental method). That is, the fluorescence signal is read and processed by a suitable apparatus available in the art. For example, protocols and procedures known in the art can be used including fluorescence analyzers, microplate readers, automated processing using robotic devices, laser scanning systems.

본 발명의 어떤 구현예에서, 상기 (목적) 시료는 박테리아 세포의 용해물로부터 얻어지는 생물학적 시료들 또는 박테리아 세포 배양액의 상층액, 또는 동물 기관 또는 세포의 추출물(예컨대, 혈액, 혈청, 분비물, 림프액, 투석액(dialysate), 체액(sap), 단백질, 등)을 포함한다.In some embodiments of the invention, the (objective) sample is a biological sample obtained from a lysate of bacterial cells or a supernatant of a bacterial cell culture fluid, or an extract of animal organs or cells (e.g. blood, serum, secretions, lymph, Dialysate, sap, protein, and the like).

본 발명의 키트는 상기한 성분 이외에도, 다른 성분들을 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 분석의 결과, 본 발명의 턴-온 프로브 컨쥬게이트-유래된 형광 시그널이 대조군(즉, 정상군)과 비교하여 시료에서 2-5배 정도로 검출되는 경우 상기 시료 내에 효소 또는 박테리아가 존재하는 것으로 판단된다(참고: 도 4 및 도 6).The kit of the present invention may further include other components in addition to the above components. As a result of the above analysis, when the turn-on probe conjugate-derived fluorescence signal of the present invention is detected at 2-5 times in the sample as compared with the control group (that is, the normal group), the enzyme or the bacteria is present in the sample (See Figs. 4 and 6).

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:The features and advantages of the present invention are summarized as follows:

(a) 본 발명은 효소 어세이용 신규 턴-온 프로브 컨쥬게이트 및 이의 용도에 관한 것이다.(a) The present invention relates to novel turn-on probe conjugates for enzyme assays and uses thereof.

(b) 본 발명의 프로브 컨쥬게이트는 중성 pH에서의 시그널과 비교하여 산성 pH(예컨대, pH 4 내지 pH 6) 및 염기성 pH(예컨대, pH 8 내지 pH 10) 모두에서 더 높은 형광/발광 시그널을 나타낸다.(b) The probe conjugates of the present invention exhibit higher fluorescence / luminescent signals in both acidic pH (e.g., pH 4 to pH 6) and basic pH (e.g., pH 8 to pH 10) compared to signals at neutral pH .

(c) 이에 따라, 본 발명의 프로브 컨쥬게이트는 형광 시그널 변화를 통해 pH-변화 효소(예컨대, 베타-락타마제 또는 아데노신 디아미나제) 또는 이를 포함하는 약물-저항성 박테리아의 존재 유무를 간편하고 효율적으로 검출할 수 있다.(c) Thus, the probe conjugate of the present invention can detect the presence or absence of a pH-changing enzyme (for example, beta-lactamase or adenosine deaminase) or a drug-resistant bacterium containing the same by simple and efficient Can be detected.

(d) 따라서, 본 발명의 프로브 컨쥬게이트를 포함하는 조성물은 pH-변화 효소에 대한 어세이 시스템을 제공할 뿐 아니라, 상기 효소를 포함하는 약물-저항성 박테리아에 의해 유발되는 감염 질환의 검출에 효과적으로 이용될 수 있다.(d) Therefore, the composition comprising the probe conjugate of the present invention not only provides an assay system for pH-changing enzymes, but also provides an effective method for the detection of infectious diseases caused by drug-resistant bacteria including the enzyme Can be used.

도 1a는 pH 변화를 유발하는 효소 반응을 보여준다. 도 1b는 본 발명의 이준 턴-온 프로브(위쪽)의 활성 기작 및 상기 퀀처와 상기 형광단 NTA-Atto488의 화학적 구조(아래쪽)에 대한 도시적 예시를 보여준다.
도 2a는 NTA-Atto488(1 μM, 파란색 선), Co-NTA-Atto488 (1 μM, 빨간색 선), 및 폴리-L-His-Co-NTA-Atto488(1 μM, 검은색 선)에 대해 기록된 UV-Vis 흡광도 스펙트럼을 보여주고, 도 2b는 NTA-Atto488(100 nM, 파란색 선), Co-NTA-Atto488(100 nM, 빨간색 선), 및 폴리-L-His-Co-NTA-Atto488(100 nM, 검은색 선)에 대해 기록된 형광 방출 스펙트럼을 보여준다. 여기 파장은 488 nm였다.
도 3은 다른 온도들에서 폴리-L-His에 의한 Co-NTA-Atto488의 퀀칭에 관한 스테른-볼머 플롯 결과이다: ■, 25℃; ●, 30℃; 및 ▲, 37℃. Fo 및 F는 각각 폴리-L-His의 부존재 및 존재 하에서 Co-NTA-Atto488의 형광 강도를 표시한다.
도 4는 폴리-L-His/Co-NTA-Atto488 프로브(100 nM)의 이중 pH-민감도를 보여준다.
도 5는 다른 pH 값에서 100 nM의 NTA-Atto488(●) 및 Co-NTA-Atto488(■)의 형광 강도(FI)를 보여준다.
도 6은 pH 4.0 및 pH 7.0 사이에서 폴리-L-His/Co-NTA-Atto488의 pH 가역성 연구를 보여준다. 본 실험은 10 mM 시트르산-나트륨 시트레이트 완충액(pH 7.0)에서 100 nM 프로브로 실시되었다. 상기 pH 조정은 NaOH 및 HCl로 적정하여 실시되었다.
도 7a는 본 발명의 이중-반응성 프로브에 의해 모니터링되는 페니실리나제에 대한 억제 어세이를 보여주며, 도 7b는 본 발명의 이중-반응성 프로브에 의해 모니터링되는 ADA에 대한 억제 어세이를 보여준다. 효소들의 활성은 억제제의 부재(-) 및 낮은 농도의 억제제 존재(+, 0.01 μM 클라불란산칼륨 및 0.01 mM EHNA) 대 높은 농도의 억제제 존재(++, 500 μM 클라불란산칼륨 및 2 mM EHNA) 하에서 측정되었다.
도 8a는 페니실리나제에 대한 클라불란산칼륨의 IC50 값(3.25 μM)의 결정을 보여준다. 도 8b는 ADA에 대한 이리트로-9-(2-하이드록시-3-논일)아데닌(EHNA)의 IC50 값(1.23 mM)의 결정을 보여준다.
도 9는 프로브를 이용한 페니실린 저항성 분리주들의 검출을 보여준다. 프로브와 분리주들의 0분부터 90분까지의 반응 시간에 의해 형광 시그널이 변화한다.
도 10은 환자들로부터 분리된 β-락타마제 비-생산자들(음성)(파란색 막대들) 및 24개의 β-락타마제 생산자들(보라색 막대들)이 본 발명의 이중-반응성 프로브를 이용하여 스크리닝된다는 것을 보여준다. 상대적인 형광은 (a) 30분, (b) 60분, 또는 (c) 90분에서의 형광 강도에서 백그라운드 시그널을 차감함으로써 결정되었다(참고: 도 9).Figure 1A shows the enzymatic reactions that cause pH changes. FIG. 1B shows an illustration of the active mechanism of the bi-turn-on probe (top) of the present invention and the chemical structure of the quencher and the fluorescent moiety NTA-Atto 488 (bottom).
Figure 2a is a record for NTA-Atto488 (1 [mu] M, blue line), Co-NTA-Atto488 (1 [mu] M, red line), and poly-L- His-Co- NTA-Atto488 (100 nM, blue line), Co-NTA-Atto 488 (100 nM, red line), and poly-L-His-Co-NTA-Atto 488 100 nM, black line). The excitation wavelength was 488 nm.
3 is a Stern-Volmer plot of the quenching of Co-NTA-Atto 488 with poly-L-His at different temperatures: ●, 30 ° C; And?, 37 占 폚. Fo and F denote the fluorescence intensity of Co-NTA-Atto488 in the absence and presence of poly-L-His, respectively.
Figure 4 shows the double pH-sensitivity of the poly-L-His / Co-NTA-Atto 488 probe (100 nM).
Figure 5 shows the fluorescence intensity (FI) of NTA-Atto 488 () and Co-NTA-Atto 488 (I) at 100 nM at different pH values.
Figure 6 shows the pH reversibility study of poly-L-His / Co-NTA-Atto 488 between pH 4.0 and pH 7.0. This experiment was carried out with a 100 nM probe in 10 mM citrate-sodium citrate buffer (pH 7.0). The pH adjustment was carried out by titration with NaOH and HCl.
Figure 7a shows inhibition assays for penicillinase monitored by the dual-reactive probes of the invention, and Figure 7b shows inhibition assays for ADA monitored by the dual-reactive probes of the present invention. The activity of the enzymes was determined by the presence of inhibitors (-) and the presence of low concentrations of inhibitor (+, 0.01 μM potassium clavulanate and 0.01 mM EHNA) versus the presence of high concentrations of inhibitor (++, 500 μM potassium clavulanate and 2 mM EHNA ). ≪ / RTI >
Figure 8a shows the determination of the IC 50 value (3.25 [mu] M) of potassium clavulanate against penicillinase. Figure 8b shows the determination of the IC 50 value (1.23 mM) of erythro-9- (2-hydroxy-3-nonyl) adenine (EHNA) against ADA.
Figure 9 shows the detection of penicillin resistant isolates using probes. The fluorescence signal is changed by the reaction time of probe and separator from 0 to 90 minutes.
Figure 10 shows that β-lactamase non-producers (negative) (blue bars) and 24 β-lactamase producers (purple bars) isolated from patients are screened using the dual- . Relative fluorescence was determined by subtracting the background signal from the fluorescence intensity at (a) 30 min, (b) 60 min, or (c) 90 min.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. It is to be understood by those skilled in the art that these embodiments are only for describing the present invention in more detail and that the scope of the present invention is not limited by these embodiments in accordance with the gist of the present invention .

실시예Example

실험재료 및 실험방법Materials and Experiments

실험재료 및 장치들:Materials and Devices:

특별히 다르게 기재되지 않는 한, NTA-Atto488을 포함하는 모든 물질들은 시그마 알드리치(USA)로부터 구매되었고 추가적인 정제 없이 사용되었다. UV 흡수 스펙트럼 및 형광 방출 스펙트럼의 프로파일은 각각 Libra S22 UV/Vis 분광 광도계(Biochrom, UK) 및 F-7000 형광 분광기(Hitachi, Japan)에서 측정되었다. pH-의존성 실험들 및 효소 어세이들에서 이용되는 이중-반응성(dual-responsive) 프로브의 형광 강도는 AppliskanTM 멀티모드 마이크로플레이트 판독기(Thermo Scientific, USA)에서 측정되었다. pH 측정치들은 Orion 3 Star pH 미터(Thermo Scientific, USA)로 실시되었다.Unless specifically stated otherwise, all materials including NTA-Atto 488 were purchased from Sigma-Aldrich (USA) and used without further purification. UV absorption spectra and fluorescence emission spectra profiles were measured on a Libra S22 UV / Vis spectrophotometer (Biochrom, UK) and an F-7000 fluorescence spectrometer (Hitachi, Japan), respectively. The fluorescence intensities of the dual-responsive probes used in pH-dependent experiments and enzyme assays were measured in an Appliskan TM multimode microplate reader (Thermo Scientific, USA). pH measurements were performed with an Orion 3 Star pH meter (Thermo Scientific, USA).

이중-반응성 Double-reactive 프로브의Of the probe 제조 및 특징 확인: Manufacturing and Characterization:

Co-NTA-Atto488은 1:1 몰 비율로 CoSO4 및 NTA-Atto488을 상온 암 조건 하에서 10분 동안 혼합하여 제조하였다. 상기 이중-반응성 프로브는 1 당량의 폴리-L-히스티딘(poly-L-His)(Sigma-Aldrich, 미국)을 첨가하여 최종적으로 얻었다. 결과적인 용액을 약하게 교반시키고 상온에서 10분 동안 추가적으로 반응시킨 후, 상기 프로브의 UV-Vis 흡광도(10 mM Tris-HCl(pH 7.0)에 1 μM로 녹여짐) 및 형광 강도(10 mM Tris-HCl(pH 7.0)에 100 nM로 녹여짐; 488 nm에서 여기)가 측정되었다. 또한, 다른 pH 완충액들(pH 4, 5, 6, 7, 8, 9, 및 10)에서 상기 프로브의 형광 강도가 측정되었다. 상기 프로브의 형광 강도는 각각 485/535 nm의 여기/방출 필터 세팅된 AppliskanTM을 이용하여 측정되었다. 각 값은 3개의 독립적인 측정치들의 평균을 의미한다.Co-NTA-Atto 488 was prepared by mixing CoSO 4 and NTA-Atto 488 in a molar ratio of 1: 1 for 10 minutes under room temperature conditions. The double-reactive probes were finally obtained by adding one equivalent of poly-L-His (Sigma-Aldrich, USA). The resulting solution was vigorously stirred and reacted at room temperature for 10 minutes and then the UV-Vis absorbance of the probe (dissolved in 1 μM in 10 mM Tris-HCl, pH 7.0) and fluorescence intensity (10 mM Tris-HCl (pH 7.0) at 100 nM; excitation at 488 nm). In addition, the fluorescence intensity of the probe was measured at different pH buffers (pH 4, 5, 6, 7, 8, 9, and 10). The fluorescence intensities of the probes were measured using Appliskan ™ set at 485/535 nm excitation / emission filters, respectively. Each value represents the average of three independent measures.

베타-beta- 락타마제Lactamase 어세이Assay ::

베타-락타마제 활성 어세이들이 10 mM Tris-HCl(100 μL, pH 7.0)에서 실시되었다. 페니실리나제(0.5 unit)의 부존재 또는 존재 하에서 페니실린 G(1 mM) 및 프로브(100 nM)를 포함하는 반응 혼합물을 상온에서 10분 동안 반응시킨 후, 상기 혼합물의 형광 강도가 측정되었다.Beta-lactamase active assays were performed in 10 mM Tris-HCl (100 [mu] L, pH 7.0). The reaction mixture containing penicillin G (1 mM) and probe (100 nM) in the absence or presence of penicillinase (0.5 unit) was reacted at room temperature for 10 minutes and then the fluorescence intensity of the mixture was measured.

억제 어세이를 위해, 페니실리나제(0.5 unit)가 다양한 농도의 클라불란산칼륨(0-500 μM)과 함께 처리되었다. 15분 동안 반응시킨 후, 페니실린 G(1 mM) 및 프로브(100 nM)가 상기 혼합물에 첨가되었다. 추가적으로 상온에서 30분 동안 반응시킨 후, 상기 혼합물의 형광 강도가 측정되었다. 각 값은 3개의 독립적인 어세이들의 평균을 의미한다.For inhibition assays, penicillinase (0.5 units) was treated with varying concentrations of potassium clavulanate (0-500 [mu] M). After reaction for 15 minutes, penicillin G (1 mM) and probe (100 nM) were added to the mixture. After further reaction at room temperature for 30 minutes, the fluorescence intensity of the mixture was measured. Each value represents the average of three independent assays.

아데노신 Adenosine 디아미나제Diaminazine 어세이Assay ::

아데노신 디아미나제(ADA)에 대한 어세이는 β-락타마제 어세이들에서 이용되는 것과 유사한 방식을 채택하여 실시되었다. 간략하게는, 아데노신 디아미나제(0.001 unit)의 존재 또는 부존재 하에서 아데노신(1 mM), 프로브(100 nM)을 포함하는 반응 혼합물이 30℃에서 30분 동안 반응되었다.Assays for adenosine deaminase (ADA) were performed using a similar approach as that used in the [beta] -lactamase assays. Briefly, the reaction mixture containing adenosine (1 mM), probe (100 nM) in the presence or absence of 0.001 unit of adenosine deaminase was reacted at 30 ° C for 30 minutes.

억제 어세이를 위해, ADA(0.001 unit)가 다양한 농도의 에리트로-9-(2-하이드록시-3-논일)아데닌(EHNA)(0-10 mM)과 함께 나트륨 포스페이트 완충액(10 mM, pH 7.0)에 처리되었다. 30℃에서 15분 동안 반응시킨 후, 아데노신(1 mM) 및 프로브(100 nM)가 상기 혼합물에 첨가되었다. 추가적으로 30℃에서 30분 동안 반응시킨 후, 상기 혼합물의 형광 강도가 측정되었다. 각 값은 3개의 독립적인 어세이들의 평균을 의미한다.For inhibition assays, ADA (0.001 unit) was mixed with various concentrations of erythro-9- (2-hydroxy-3 -nonyl) adenine (EHNA) (0-10 mM) in sodium phosphate buffer ). After 15 min of reaction at 30 캜, adenosine (1 mM) and probe (100 nM) were added to the mixture. After further reaction at 30 DEG C for 30 minutes, the fluorescence intensity of the mixture was measured. Each value represents the average of three independent assays.

스테른Stern -- 볼머Bolmer 플롯(Stern- The plot (Stern- VolmerVolmer plot): plot):

*스테른-볼머 방정식(Fo/F= 1 + Ksv[Q])이 이분자 퀀칭을 계산하는 데 이용되었다. Fo 및 F는 각각 퀀처인 폴리-L-히스티딘(Q)의 부존재 및 존재 하에서 관찰되는 형광 시그널이다. [Q]는 퀀처 농도이고 Ksv는 스테른-볼머 상수이다. Co-NTA-Atto488(100 nM)의 형광 강도는 세 개의 다른 온도(25, 30 및 37℃)에서 다양한 농도의 퀀처(0, 25, 40, 50, 및 80 nM)와 함께 측정되었다.The Stern-Bolmer equation (Fo / F = 1 + K sv [Q]) was used to compute the bimodal quench. Fo and F are fluorescence signals observed in the absence and presence of poly-L-histidine (Q), which is a quencher, respectively. [Q] is the quencher concentration and K sv is the Stern-Bolmer constant. Fluorescence intensities of Co-NTA-Atto488 (100 nM) were measured with various concentrations of quencher (0, 25, 40, 50, and 80 nM) at three different temperatures (25, 30 and 37 ° C).

박테리아 스트레인들:Bacterial strains:

확장된-스펙트럼 β-락타마제(ESBL)을 검출하는 데 상기 이중-반응성 프로브를 이용하는 형광 테스트의 실행을 평가하기 위해 총 44개의 스트레인들이 이용되었다; 상기 스트레인들은 여러 한국 병원들 및 노르만 박사(Swizterland)로부터 제공된 선물들로부터 유래되었다. 상술한 스트레인들은 디스크 강화 방법을 이용하여 ESBL에 대해 이전에 스크리닝되었으며[5], blaCTX-M에 대한 멀티플렉스 PCR 및 시퀀싱을 이용하여 분자 레벨에서 이들의 β-락타마제 함량이 규명되었다. 이러한 스트레인 수집은 24개의 CTX-M 타입 ESBL-양성 스트레인들을 포함하였다(CTX-M 그룹 1의 17개 스트레인들: 1, 3, 12, 15 및 32, 그룹 2의 2개 스트레인: 2, 그룹 9의 다섯 개 스트레인들: 9 및 14, 20개의 ESBL-음성 분리체들)(표 1). 모든 ESBL-생산자들은 CLSI 가이드라인에 따라 세포탁심(MIC ≥ 4 μg/ml)에 대해 저항성을 나타냈다.A total of 44 strains were used to evaluate the performance of fluorescent tests using the double-reactive probes to detect extended-spectrum? -Lactamase (ESBL); The strains were derived from gifts from various Korean hospitals and Dr. Swizterland. The above-described strains were previously screened for ESBL using the disk-enrichment method [5] and their β-lactamase content at the molecular level was determined using multiplex PCR and sequencing for blaCTX-M. This strain collection included 24 CTX-M type ESBL-positive strains (17 strains of CTX-M group 1: 1, 3, 12, 15 and 32, 2 strains of group 2: 2, group 9 Five strains of ESBL-negative isolates: 9 and 14, 20 ESBL-negative isolates (Table 1). All ESBL-producers were resistant to cell susceptibility (MIC ≥ 4 μg / ml) according to CLSI guidelines.

그룹group 이름name 종Bell 세포탁심(Cefotaxime; μg/ml)의Cefotaxime (μg / ml) of
최소억제농도(Minimum inhibitory concentration ( MICMIC )) 그룹 1Group 1 CTX-M-1CTX-M-1 S. 티피무리움S. typhimurium >64> 64 그룹 1Group 1 CTX-M-3CTX-M-3 S. 마르세센스S. Marseens 6464 그룹 1Group 1 CTX-M-3CTX-M-3 S. 마르세센스S. Marseens 6464 그룹 1Group 1 CTX-M-3CTX-M-3 S. 마르세센스S. Marseens 6464 그룹 1Group 1 CTX-M-3CTX-M-3 S. 마르세센스S. Marseens 6464 그룹 1Group 1 CTX-M-3CTX-M-3 대장균(E. coli) E. coli 1616 그룹 1Group 1 CTX-M-3CTX-M-3 E. 클로아카에E. cloacae 6464 그룹 1Group 1 CTX-M-3CTX-M-3 E. 클로아카에E. cloacae 6464 그룹 1Group 1 CTX-M-3CTX-M-3 E. 클로아카에E. cloacae 6464 그룹 1Group 1 CTX-M-3CTX-M-3 K. 뉴모니에K. pneumoniae 3232 그룹 1Group 1 CTX-M-12CTX-M-12 K. 뉴모니에K. pneumoniae 3232 그룹 1Group 1 CTX-M-15CTX-M-15 E. 클로아카에E. cloacae 6464 그룹 1Group 1 CTX-M-15CTX-M-15 대장균Escherichia coli 6464 그룹 1Group 1 CTX-M-15CTX-M-15 K. 뉴모니에K. pneumoniae 6464 그룹 1Group 1 CTX-M-15CTX-M-15 C. 프레운디이C. Freundi 6464 그룹 1Group 1 CTX-M-15CTX-M-15 대장균Escherichia coli 6464 그룹 1Group 1 CTX-M-32CTX-M-32 대장균Escherichia coli 6464 그룹 2Group 2 CTX-M-2CTX-M-2 대장균Escherichia coli 6464 그룹 2Group 2 CTX-M-2CTX-M-2 대장균Escherichia coli 6464 그룹 9Group 9 CTX-M-9CTX-M-9 C. 프레운디이C. Freundi 3232 그룹 9Group 9 CTX-M-14CTX-M-14 S. 마르세센스S. Marseens 6464 그룹 9Group 9 CTX-M-14CTX-M-14 대장균Escherichia coli 3232 그룹 9Group 9 CTX-M-14CTX-M-14 C. 프레운디이C. Freundi 6464 그룹 9Group 9 CTX-M-14CTX-M-14 대장균Escherichia coli 6464

베타-락타마제-양성 박테리아 스트레인들의 특성 및 30분, 60분 및 90분째 이들의 형광의 % 차이.Characterization of beta-lactamase-positive bacterial strains and% difference of their fluorescence at 30 min, 60 min and 90 min.

스트레인들은 뮬러-힌톤 아가(Asan, Korea) 상에서 분리되었고 형광 테스트를 실시하기 전에 37℃에서 16-24시간 동안 배양되었다. 박테리아 단백질의 추출은 이전에 기재된 대로 실시되었다[6]. 간략하게는, 하나의 계산된 접종 루프(1 μl)의 테스트된 스트레인이 150 μl의 200 mM Tris-HCl 용해 완충액(B-PER II, 박테리아 단백질 추출 시약; Thermo Scientific Pierce, Rockford, IL, USA)에 재현탁되어 1분 동안 볼텍싱된 후, 추가적으로 상온에서 30분 동안 반응되었다. 상기 박테리아 현탁액을 상온에서 5분 동안 10,000 x g로 원심분리시켰다. 30 μl의 상층액이 96-웰 트레이에서 100 nM의 이중-반응성 프로브 용액을 포함하는 세포탁심 나트륨 염(Sigma-Aldrich, USA)으로 구성된 100 μl의 용액과 혼합되었다.The strains were isolated on Mueller-Hinton agar (Asan, Korea) and cultured for 16-24 hours at 37 占 폚 before performing the fluorescence test. Extraction of bacterial proteins was performed as previously described [6]. Briefly, the tested strain of one calculated inoculation loop (1 μl) was incubated with 150 μl of 200 mM Tris-HCl lysis buffer (B-PER II, bacterial protein extraction reagent; Thermo Scientific Pierce, Rockford, And reacted for an additional 30 minutes at room temperature after being vortexed for 1 minute. The bacterial suspension was centrifuged at 10,000 x g for 5 minutes at room temperature. 30 μl of supernatant was mixed with 100 μl of a solution of cytotoxic sodium salt (Sigma-Aldrich, USA) containing 100 nM of double-reactive probe solution in a 96-well tray.

형광 측정:Fluorescence measurement:

형광 시그널은 동적 모드를 가지는 Infinite F200pro(TecanGroup Ltd., Mannedorf, Switzerland) 마이크로플레이트 판독기를 이용하여 측정되었다. 여기 파장 및 방출 파장은 각각 485 nm(대역폭 20 nm) 및 535 nm(대역폭 25 nm)로 셋팅되었다. 각 웰에 130 μl의 최대 용량을 가지는 폴리스티렌 블랙 96 편평-바닥 웰 마이크로플레이트(Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany)가 이용되었다. 형광 시그널은 0, 30, 60 및 90분에 측정되었다. 70,000보다 큰 형광 강도는 계산의 용이성을 위해 70,000으로 정의되었다.Fluorescence signals were measured using a Infinite F200pro (TecanGroup Ltd., Mannedorf, Switzerland) microplate reader with dynamic mode. The excitation and emission wavelengths were set to 485 nm (bandwidth 20 nm) and 535 nm (bandwidth 25 nm), respectively. A polystyrene black 96 flat-bottom well microplate (Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany) having a maximum capacity of 130 μl was used in each well. Fluorescence signals were measured at 0, 30, 60 and 90 min. Fluorescence intensity greater than 70,000 was defined as 70,000 for ease of calculation.

실험결과Experiment result

본 발명의 프로브는 폴리히스티딘(폴리-L-His)와 Atto488로 표지된 니트릴로트리아세트산으로 전-킬레이팅된 코발트(II) 이온(Co-NTA-Atto488)과 복합체를 이뤄 제조되었다. 상기 컨쥬게이션(poly-L-His/Co-NTA-Atto488)은 멀티머성 히스티딘 잔기들과 상기 금속 이온 간의 잘-알려진 상호작용으로 인해 형성되었다(도 1b).The probe of the present invention was prepared by complexing polyhistidine (poly-L-His) with cobalt (II) ion (Co-NTA-Atto488) pre-chelated with nitrilotriacetic acid labeled with Atto488. The conjugation (poly-L-His / Co-NTA-Atto 488) was formed due to well-known interactions between the multimeric histidine residues and the metal ion (FIG.

도 2a에서 볼 수 있듯이, Co-NTA-Atto488 용액은 UV-Vis 스펙트럼에서 501 nm에서 최대 흡광도 피크를 보인다. 폴리-L-His의 첨가 하에서, 상기 Atto488 모이어티의 흡광도는 λmax에서 작은 쉬프트를 가지면서 감소하였다. 흡광도 피크에서 그러한 변화는 Co(II)-NTA 공동작용에 의해 매개되는 염료와 His 잔기들 간의 바닥 상태 상호작용에 기인한 것일 수 있으며, 상기 바닥 상태 상호작용은 상기 염료의 형광 방출의 퀀칭을 야기하였다(도 2b).As can be seen in Figure 2a, the Co-NTA-Atto 488 solution exhibits a maximum absorbance peak at 501 nm in the UV-Vis spectrum. Under the addition of poly-L-His, the absorbance of the Atto488 moiety decreased with a small shift at? Max . Such a change in absorbance peak may be due to a bottom state interaction between the dye and the His residues mediated by the Co (II) -NTA synergism, which causes quenching of the fluorescence emission of the dye (Fig. 2B).

이미다졸 고리에 의한 이러한 퀀칭 효과가 이전 문헌[7] 상에 알려져 있었을 지라도, 상기 복합체 내 폴리-L-His에 의한 퀀칭 기작에 대한 추가적인 정보를 얻기 위해 스테른-볼머 플롯이 폴리-L-His에 대해 실시되었다(도 3). 결합이 증가된 온도에서 실시되는 경우 상기 스테른-볼머 플롯의 기울기가 감소하였는데, 이는 상기 복합체의 감소된 형광 강도가 정적 퀀칭(static quenching)에 기반된다는 것을 의미한다. 세 개의 다른 온도에서 스테른-볼머 방정식으로부터 계산되는 관련된 스테른-볼머 상수(Ksv)가 표 2에 요약되었다.Although this quenching effect by the imidazole ring has been known on previous literature [7], the Stern-Volmer plot has been shown to be poly-L-His to obtain additional information on the quenching mechanism by poly- (Fig. 3). When the coupling is carried out at an increased temperature, the slope of the Stern-Bolmer plot is reduced, which means that the reduced fluorescence intensity of the complex is based on static quenching. The associated Stern-Bolmer constant (K sv ), calculated from the Stern-Kolmer equation at three different temperatures, is summarized in Table 2.

T(℃)T (占 폚) KK svsv x 10x 10 -7-7 (L/몰)(L / mol) 2525 9.769.76 3030 7.557.55 3737 5.975.97

다른 온도들에서 스테른-볼머 퀀칭 상수 Ksv.At different temperatures, the Stern-Bolmer quenching constant K sv .

상기 복합체의 pH 민감성에 있어서, His 내 이미다졸의 pKa가 약 6.2이기 때문에, 상기 폴리펩타이드 내 이미다졸의 질소는 상기 pKa 값보다 더 낮은 pH를 가지는 산성 조건 하에서 양성자화되므로 폴리-L-His로부터 Co-NTA-Atto488의 해리를 초래한다. pH의 증가와 함께, 리간드들은 3 x 10-16의 용해도 산물 상수(Ksp)를 가지는 성긴 물-가용성 Co(OH)2의 형성으로 인해 상기 금속 이온으로부터 해리될 것이다. 동시에, His 잔기들은 탈양성자화되며, 염기성 pH 하에서 소수성을 띄어 상기 폴리펩타이드의 응집을 초래하고 이는 또한 상기 복합체로부터 형광단(fluorophore)의 배출을 유도할 것이다. 중성 범위로부터 쉬프트된 pH에 의한 이러한 형광단의 배출은 산성 및 염기성 조건 모두에서 턴-온 시그널로서 이용될 수 있는 형광 강도를 회복시킨다. 따라서, 상기 프로브의 형광 강도가 다양한 pH 조건들 하에서 측정되는 경우, 도 4에서 보여지듯이 pH 7 근처에서 가장 낮은 시그널을 가지는 V-형태 곡선이 얻어졌는데, 이는 상기 Co-NTA-Atto488/폴리-L-His 복합체가 이중 턴-온 프로브로서 이용될 가능성을 가진다는 것을 의미한다. 이와 대조적으로, Co-NTA-Atto488 또는 NTA-Atto488 단독의 형광 방출은 그러한 이중 pH-민감도를 나타내지 않았다(도 5). 상기 pH-의존적 시그널 변화의 가역성은 산성 영역에서 순환하는 두 개의 pH 상태들(pH 4 및 pH 7)에서의 형광 강도를 모니터링하면서 평가되었다. 상기 프로브 복합체의 pH-유발된 결합/해리 과정은 4번의 사이클 동안 합리적인 가역성을 나타냈다(도 6). 하지만, 상기 시그널 가역성은 염기성 영역에서는 관찰되지 않았다. 이것은 금속 이온이 공동작용 산물의 형성에 대해 NTA-Atto488에 의해 접근가능하지 않는 불용성 코발트(II) 하이드록사이드의 형성으로 인한 것으로 추정된다.In the pH sensitivity of the composite, already because it is within His pK a of about 6.2, the imidazole, the nitrogen of the imidazole in the polypeptide, because protonated under acidic conditions with a pH lower than the pK a value poly -L- Resulting in the dissociation of Co-NTA-Ato488 from His. With increasing pH, the ligands will dissociate from the metal ion due to the formation of coarse water-soluble Co (OH) 2 with a solubility product constant (K sp ) of 3 x 10 -16 . At the same time, His residues are deprotonated and become hydrophobic under basic pH, resulting in the aggregation of the polypeptide, which will also lead to the release of fluorophore from the complex. Emission of such fluorophore by pH shifted from the neutral range restores the fluorescence intensity which can be used as a turn-on signal in both acidic and basic conditions. Thus, when the fluorescence intensity of the probe was measured under various pH conditions, a V-shaped curve with the lowest signal near pH 7 was obtained, as shown in Figure 4, indicating that the Co-NTA-Atto488 / -His complex has the potential to be used as a double turn-on probe. In contrast, fluorescence emission of Co-NTA-Atto488 or NTA-Atto488 alone did not exhibit such dual pH-sensitivity (Figure 5). The reversibility of the pH-dependent signal change was evaluated by monitoring the fluorescence intensity at two pH conditions (pH 4 and pH 7) circulating in the acidic region. The pH-induced binding / dissociation process of the probe complex showed reasonable reversibility over four cycles (Figure 6). However, the signal reversibility was not observed in the basic region. This is presumably due to the formation of insoluble cobalt (II) hydroxide, which is not accessible by NTA-Atto 488 for the formation of co-acting products.

상기 프로브의 pH-의존적 턴-온 시그널을 관찰한 후, 본 발명자들은 상기 프로브를 이용한 효소 어세이들을 실시하였다. 페니실리나제가 산성-발생 효소에 대한 모델 효소로서 선택되었다. 항생제-저항성 박테리아에서 관찰되었던 페니실리나제는 β-락탐-기반된 항생제들의 락탐 고리를 절단하는 β-락타마제로 상기 항생제를 무력화시킨다. 베타-락타마제에 의한 페니실린 G의 페니실린 산으로의 가수분해는 용액의 pH를 낮추어 박테리아의 약물 저항성을 검출하기 위한 pH 지시인자들에 의해 모니터링될 수 있다[8]. 상기 효소, 상기 프로브 및 항생제를 포함하는 반응 혼합물의 형광 강도가 상온에서 30분 동안의 반응 후 측정되었다. 효소가 없는 대조군 반응에서 관찰되는 강도와 비교하여, 효소 반응에서의 시그널은 현저하게 증가하였다(도 7a). 억제된 형광 강도는 반응 동안 상기 효소 억제제(글라불란산)의 존재 하에서 기록되었는데, 이는 상기 시그널의 증가가 효소 활성에 대해 특이적이라는 것을 나타냈다. 상기 프로브를 이용하여 결정된 클라불란산칼륨의 IC50 값은 3.25 μM이었는데, 상기 값은 이전에 보고된 값에 필적하였다(도 8a)[9].After observing the pH-dependent turn-on signal of the probe, the present inventors performed enzyme assays using the probe. Penicillinase was selected as a model enzyme for acid-producing enzymes. Penicillinase, which has been observed in antibiotic-resistant bacteria, neutralizes the antibiotic with beta-lactamase, which cleaves the lactam ring of beta-lactam-based antibiotics. Hydrolysis of penicillin G to penicillic acid by beta-lactamase can be monitored by pH indicators to detect the drug resistance of the bacteria by lowering the pH of the solution [8]. The fluorescence intensity of the reaction mixture containing the enzyme, the probe and the antibiotic was measured after 30 minutes of reaction at room temperature. Signals in the enzyme reaction increased significantly compared to the intensity observed in enzyme-free control reactions (Fig. 7A). The inhibited fluorescence intensity was recorded during the reaction in the presence of the enzyme inhibitor (glabulane acid), indicating that the increase in the signal was specific for enzyme activity. The IC 50 value of potassium clavulanate determined using the probe was 3.25 μM, which was comparable to the previously reported value (FIG. 8 a) [9].

상기 프로브를 이용하여 산성-발생 효소의 성공적인 어세이 후, 본 발명자들은 염기성-발생 효소인 아데노신 디아미나제(ADA)의 어세이에 상기 프로브를 이용할 수 있는 지를 조사하였다. ADA는 하이드록시기를 가지는 아데닌 염기의 외향 고리 아민을 대체하여 이노신을 생산하고, 암모니아를 배출하여 용액의 pH를 증가시킨다. ADA의 활성은 결핵성 늑막 유출의 진단을 위해 일반적으로 이용되는 마커이다. ADA, 아데노신 및 상기 프로브를 포함하는 반응 혼합물을 30분 동안 반응시키는 경우, 형광 강도의 두드러진 증가가 관찰되었다(도 7b). 이와 대조적으로, ADA 억제제인 에리트로-9-(2-하이드록시-3-논일)아데노신)(EHNA)의 존재 하에서의 반응 혼합물 또는 효소의 부재 하에서의 반응 혼합물은 방출 시그널의 어떠한 두드러진 증가를 보이지 않았는데, 이는 상기 프로브가 ADA 활성을 모니터링하는 데 이용될 수 있다는 것을 의미한다. 상기 프로브를 이용하여 결정된 억제제의 IC50 값은 1.23 mM이었다(도 8b). 이러한 IC50 값은 ADA1 이소형을 이용하여 결정된 이전에 공개된 IC50 값보다 더 높았으나, EHNA-불감성 ADA2 이소형의 값에 근접하였다[10].After a successful assay of the acid-generating enzyme using the probe, the inventors investigated whether the probe could be used for the assay of the basic-producing enzyme adenosine deaminase (ADA). ADA replaces the outward cyclic amine of the adenine base having a hydroxy group to produce inosine and releases ammonia to increase the pH of the solution. The activity of ADA is a commonly used marker for the diagnosis of tuberculous pleural effusion. When the reaction mixture containing ADA, adenosine and the probe was allowed to react for 30 minutes, a noticeable increase in fluorescence intensity was observed (Figure 7b). In contrast, the reaction mixture in the absence of the reaction mixture or enzyme in the presence of the ADA inhibitor erythro-9- (2-hydroxy-3-nonyl) adenosine) (EHNA) did not show any noticeable increase in the release signal, Quot; means that the probe can be used to monitor ADA activity. The IC 50 value of the inhibitor determined using the probe was 1.23 mM (Fig. 8B). This IC 50 value was higher than the previously published IC 50 value determined using the ADA1 isotype, but close to that of the EHNA-insensitive ADA2 isoform [10].

본 발명자들의 프로브가 완충액 용액에서 효소 활성을 측정하는 데 이용될 수 있다는 것을 보여주는 상술한 결과들에 힘입어, 본 발명자들은 환자 시료로부터 분리된 β-락타마제-함유 박테리아의 검출에 상기 프로브를 사용하고자 시도함으로써 상기 프로브의 실제적 유용성을 추가적으로 테스트하였다. 베타-락타마제-양성 및 -음성 스트레인들의 용해물이 β-락탐-유래된 항생제 및 프로브와 반응된 후, 각 시료의 형광 강도가 측정되었다. 상기 β-락타마제 활성은 상기 프로브의 시그널 증가에 의해 증명되었다(도 9). 모든 20개의 음성 스트레인들은 측정 포인트와 무관하게 음성 결과들을 나타냈다. 24개의 β-락타마제-양성 스트레인들 중에서, 20, 21, 및 21개의 스트레인들이 30분, 60분 및 90분에서 각각 83.3%, 87.5% 및 87.5%의 민감도로 구별된 양성 결과들을 명확하게 산출하였다(도 10). 60분 째에 양성 결과들을 나타내지 않았던 스트레인들은 3개의 K. 뉴모니에 스트레인들이었다. 본 연구에서 상기 테스트된 CTX-M 타입들[11], 예컨대 그룹 1, 그룹 2 및 그룹 9 스트레인들은 60분에 각각 82.4%, 100% 및 100%의 민감도를 나타냈다(표 1). 상술한 결과들은 본 발명자들의 프로브가 β-락타마제-생산 스트레인들을 구별하는 데 이용될 수 있음을 보여준다.Based on the above results showing that our probes can be used to measure enzyme activity in a buffer solution, the present inventors have used the probe to detect beta-lactamase-containing bacteria isolated from patient samples To further test the practical utility of the probe. After the lysis of beta-lactamase-positive and negative strains was reacted with the [beta] -lactam-derived antibiotic and probe, the fluorescence intensity of each sample was measured. The beta -lactamase activity was demonstrated by the signal increase of the probe (Figure 9). All 20 voice strains showed negative results regardless of the measurement point. Of the 24 beta-lactamase-positive strains, 20, 21, and 21 strains clearly yielded positive results distinguished by sensitivities of 83.3%, 87.5% and 87.5% at 30 min, 60 min and 90 min, respectively (Fig. 10). The strains that did not show positive results at 60 min were three K. pneumoniae strains. In the present study, the tested CTX-M types [11], such as Group 1, Group 2 and Group 9 strains, displayed sensitivities of 82.4%, 100% and 100% at 60 minutes, respectively (Table 1). The above results show that our probes can be used to differentiate? -Lactamase-producing strains.

요약하면, 본 발명자들은 산성 및 염기성 용액 모두에서 형광 시그널의 증가를 나타내는 폴리-L-His/Co-NTA-Atto488 복합체를 고안하여 제조하였다. 상기 프로브의 pH-민감성 이중 턴-온 특성을 확인한 후, 본 발명자들은 산도 및 염기도를 발생시키는 모델 효소들의 활성을 모니터링하는 데 상기 프로브를 이용하였고, 상기 프로브가 양 타입의 효소들에서 공통적으로 신규한 시그널 보고 시스템으로서 채택될 수 있다는 것을 증명하였다. 상술한 결과들에 기반하여, 상기 프로브를 포함하는 신규한 어세이 방법의 추가적인 실제 적용가능성이 pH-변화 효소를 포함하는 약물-저항성 박테리아의 검출에서 성공적으로 확인되었다. 따라서, 본 발명자들은 본 연구에서 제시되는 이중 턴-온 프로브가 pH-변화 효소들에 대한 다양한 어세이에 보편적으로 이용될 수 있고 연구 적용 뿐 아니라 임상적 진단학 및 병원체 동정을 포함하는 다양한 분야들에서 유용할 수 있다고 예상한다.To summarize, the present inventors have devised a poly-L-His / Co-NTA-Atto488 complex that represents an increase in fluorescence signal in both acidic and basic solutions. After confirming the pH-sensitive double turn-on characteristics of the probes, the present inventors used the probes to monitor the activity of model enzymes that generate acidity and basicity, and found that the probes were commonly found in both types of enzymes And can be employed as a signal reporting system. Based on the results described above, the further practical applicability of the novel assay method comprising the probe has been successfully confirmed in the detection of drug-resistant bacteria comprising pH-shifting enzymes. Therefore, the present inventors have found that the double turn-on probes proposed in this study can be used universally for various assays for pH-changing enzymes and can be used not only in research applications but also in various fields including clinical diagnosis and pathogen identification I expect it to be useful.

이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 일 구현예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.While the present invention has been particularly shown and described with reference to exemplary embodiments thereof, it will be understood by those skilled in the art that various changes and modifications may be made without departing from the spirit and scope of the invention as defined in the appended claims. It will be obvious. Accordingly, the actual scope of the present invention will be defined by the appended claims and their equivalents.

참고문헌references

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Claims (19)

(a) pH-반응성 모이어티(moiety)인 폴리히스티딘; (b) 형광성 모이어티; 및 (c) 상기 pH-반응성 모이어티와 형광성 모이어티 사이를 연결하는 전이금속 복합체(transition metal complex)를 포함하는 턴-온 프로브 컨쥬게이트(turn-on probe conjugate)를 포함하는, 산성 또는 염기성-유발 효소를 포함하는 약물-저항성 박테리아 감염 질환의 진단에 이용하기 위한 산성 또는 염기성-pH 검출용 조성물로서,
상기 전이금속 복합체는 최소 하나 이상의 전이금속 원자와 최소 하나 이상의 리간드 분자로 이루어져 있으며, 상기 전이금속 원자는 상기 pH-반응성 모이어티 및 상기 리간드 분자와 배위결합으로 연결되고, 상기 리간드 분자는 상기 형광성 모이어티와 공유결합으로 연결된 것이고, 상기 턴-온 프로브 컨쥬게이트는 산성 또는 염기성 pH에서 상기 pH-반응성 모이어티를 해리시켜 형광을 나타내는 것인 조성물.
(a) a polyhistidine which is a pH-reactive moiety; (b) a fluorescent moiety; And (c) a turn-on probe conjugate comprising a transition metal complex connecting the pH-reactive moiety and the fluorescent moiety. A composition for detecting an acidic or basic-pH for use in the diagnosis of a drug-resistant bacterial infectious disease comprising an inducing enzyme,
Wherein the transition metal complex comprises at least one transition metal atom and at least one ligand molecule, wherein the transition metal atom is coordinately bound to the pH-reactive moiety and the ligand molecule, Wherein the turn-on probe conjugate dissociates the pH-reactive moiety at acidic or basic pH to exhibit fluorescence.
삭제delete 삭제delete 제1항에 있어서, 상기 pH-반응성 모이어티는 폴리-L-히스티딘(poly-L-His)인 것인 조성물.
2. The composition of claim 1, wherein the pH-reactive moiety is poly-L-His.
제1항에 있어서, 상기 전이금속 복합체는 금속-함유 아미노폴리카르복실산(aminopolycarboxylic acid)인 것인 조성물.
The composition of claim 1, wherein the transition metal complex is a metal-containing aminopolycarboxylic acid.
제5항에 있어서, 상기 아미노폴리카르복실산(aminopolycarboxylic acid)은 NTA(nitrilotriacetic acid)인 것인 조성물.
6. The composition of claim 5, wherein the aminopolycarboxylic acid is nitrilotriacetic acid (NTA).
제5항에 있어서, 상기 금속은 코발트(II), 구리(II), 니켈(II) 또는 아연(II)인 것인 조성물.
6. The composition of claim 5, wherein the metal is cobalt (II), copper (II), nickel (II), or zinc (II).
제7항에 있어서, 상기 금속은 코발트(II)인 것인 조성물.
8. The composition of claim 7, wherein the metal is cobalt (II).
삭제delete 삭제delete 제1항에 있어서, 상기 산성- 또는 염기성-유발 효소는 베타-락타마제 또는 아데노신 디아미나제인 것인 조성물.
The composition of claim 1, wherein the acidic or basic-inducible enzyme is beta-lactamase or adenosine deaminase.
삭제delete 제1항에 있어서, 상기 약물-저항성 박테리아는 엔테로박터(Enterobacter), 시트로박터(Citrobacter), 세라티아(Serratia), 슈모도마스(Pseudomonas), 에스체리시아(Escherichia), 살모넬라(Salmonella), 해모필러브(Haemophilus), 스트렙토코커스(Streptococcus), 스타필로코커스(Staphylococcus), 쉬겔라(Shigella), 마이코박테리움(Mycobacterium), 클로스트리디움(Clostridium) 또는 리스테리다(Listeria) 속에 속하는 박테리아인 것인 조성물.
The method of claim 1, wherein the drug-resistant bacteria are Enterococcus bakteo (Enterobacter), bakteo (Citrobacter), Serratia marcescens (Serratia), the shoe modo, ongjin Mas (Pseudomonas), S. Cherry cyano (Escherichia), Salmonella (Salmonella) into a sheet, bacteria belonging to the genus by a brush Love (Haemophilus), Streptococcus (Streptococcus), Staphylococcus (Staphylococcus), relax Gela (Shigella), Mycobacterium (Mycobacterium), Clostridium (Clostridium) or less terry is (Listeria) ≪ / RTI >
제13항에 있어서, 상기 약물-저항성 박테리아에 의해 유발되는 감염 질환은 피부 및 연조직 감염, 발열성 호중구감소증, 요로 감염증(UTI), 복강내 감염, 기도관 감염, 상기도관 감염, 폐렴(병원성), 뇌수막염, 수술 중 감염, 전염성 부비동염, 탄저병, 라임병, 브루셀라병(Brucellosis), 급성 장염, 공동체-획득성 호흡 감염, 비특이성요도염(NGU), 성병성 림프 육아종(LGV), 임질, 트라코마, 신생아의 봉입체결막염, 보눌리눔 식중독, 급성식중독, 설사, 출혈성 대장염, 기관지염, 위궤양, 심장 내막염, 살모넬라증, 위장염, 적리, 기회 감염, 중이염, 부비동염, 인두염, 여드름, 모공성각화증(keratosis pilaris), 주사비, 할리퀸 어린선, 색소성 건피증, 각화증, 습진, 뇌사성 근막염 또는 결핵인 것인 조성물.
14. The method of claim 13, wherein the infectious disease caused by the drug-resistant bacteria is selected from the group consisting of skin and soft tissue infections, febrile neutropenia, urinary tract infections (UTI), intraperitoneal infections, airway infections, Acute enteritis, community-acquired respiratory infections, nonspecific urethritis (NGU), sexually transmitted disease (LGV), gonorrhea, trachoma, acute respiratory distress syndrome (SCID), meningitis, intraoperative infection, infectious sinusitis, anthrax, Lyme disease, brucellosis, Keratosis pilaris, pneumoconiosis, acne, pneumoconiosis, acute respiratory distress syndrome, acute food poisoning, diarrhea, hemorrhagic colitis, bronchitis, gastric ulcer, endocarditis, salmonellosis, gastroenteritis, , Harlequin kidney line, pigmented scleroderma, keratosis, eczema, brain fascia fasciitis or tuberculosis.
제1항, 및 제4항 내지 제8항 중 어느 하나의 항의 조성물을 포함하는, 시료 내 박테리아 감염 진단용 키트.
8. A kit for the diagnosis of bacterial infection in a sample, comprising a composition according to any one of claims 1 to 8.
제15항에 있어서, 상기 시료는 박테리아 세포의 용해물로부터 얻어지는 생물학적 시료들 또는 박테리아 세포 배양액의 상층액, 또는 동물 기관 또는 세포의 추출액을 포함하는 것인 키트.
16. The kit of claim 15, wherein the sample comprises biological samples obtained from lysates of bacterial cells or supernatants of bacterial cell culture fluids, or extracts of animal organs or cells.
제15항에 있어서, 상기 박테리아는 산성- 또는 염기성-유발 효소를 포함하는 약물-저항성 박테리아인 것인 키트.
16. The kit of claim 15, wherein the bacterium is a drug-resistant bacterium comprising an acidic or basic-inducible enzyme.
(a) 제1항, 및 제4항 내지 제8항 중 어느 하나의 항의 조성물과 목적 시료(sample of interest)를 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 시료에서 상기 턴-온 프로브 컨쥬게이트로부터 상기 pH-반응성 모이어티가 해리되어 나타나는 형광을 검출하는 단계를 포함하는, 시료 내 산도 또는 염기도를 발생시키는 효소 또는 이를 포함하는 박테리아의 존재를 검출하는 방법.
(a) contacting a sample of interest with a composition according to any one of claims 1 and 8 to 8; And (b) detecting fluorescence in which the pH-reactive moiety is dissociated from the turn-on probe conjugate in the sample to detect the presence of an enzyme producing acidity or basicity or a bacteria comprising the same in the sample. / RTI >
제18항에 있어서, 상기 박테리아는 산성 또는 염기성 유발 효소를 포함하는 약물-저항성 박테리아인 것인 방법.

19. The method of claim 18, wherein the bacterium is a drug-resistant bacterium comprising an acidic or basic inducing enzyme.

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