KR101963968B1 - 재순환 루프를 포함하는 회분식 또는 연속식 배양기 및 이를 이용한 배양 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 재순환 루프를 포함하는 회분식 또는 연속식 배양기 및 이를 이용한 배양 방법에 관한 것으로 액상의 배지를 사용하는 연속식 또는 회분식 배양기에 있어서, 상기 배양기의 상층액에서 가스를 포집하여 배양기의 하부 액상 배지로 가스를 재순환시키는 루프; 상기 배양기의 하부 액상 배지로 가스를 재순환시킬 때 분사되는 가스의 표면적을 크게 하기 위한 노즐; 상기 배양기의 내부에 위치하고 액체 배지의 혼합을 위한 교반기; 상기 배양기 내부로 배지 물질을 보충하기 하기 위한 가스공급관; 상기 가스공급관에 연결된 배지 저장부; 및 상기 배양기의 외부로 연결되어 배양기의 압력을 조정하기 위한 배기관을 포함하는 연속시 또는 회분식 배양기를 제공한다. 또한 액상의 배지를 사용하는 연속식 또는 회분식 배양 방법에 있어서, 상기 배양기의 상층액에서 가스를 포집하여 배양기의 하부 액상 배지로 가스를 재순환시키는 단계; 상기 배양기의 하부 액상 배지로 가스를 재순환시킬 때 노즐을 통하여 분사되는 가스의 표면적을 넓히는 단계; 상기 배양기의 내부에서 액체 배지의 혼합을 위하여 교반하는 단계; 상기 배양기에 소모된 기체 물질을 보충하기 하기 위한 배지 공급단계; 및 상기 배양기의 외부로 연결되어 배양기의 압력을 조정하는 단계를 포함하는 연속시 또는 회분식 배양 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 가스 순환 배양을 이용하여 원료 가스의 소모량을 줄이고 바이오케미컬로의 전환 효율을 높일 수 있다. 본 발명에 따른 배양기는 가스 재순환 방식을 통해 배지로의 가스 공급을 증가시킬 수 있다. 이에 따른 발효 생산량이 증가된다.

Description

재순환 루프를 포함하는 회분식 또는 연속식 배양기 및 이를 이용한 배양 방법{Batch or continuous culture device comprising recycling loop and the culture method using thereof}
본 발명은 일산화탄소, 이산화탄소, 메탄과 같은 C1 가스를 이용하여 혐기상태에서 가스 재순환 배양을 통해 아세트산, 에탄올, 2,3-부탄디올(butanediol)과 같은 유용 바이오케미컬 생산 방법에 관한 것이다.
일산화탄소와 이산화탄소 같은 C1가스는 제철소, 석탄을 이용하는 발전소, 쓰레기 소각로 등의 부생가스 등에서 다량으로 발생하여 쉽게 확보할 수 있는 중요한 원료이다. Clostridium 속과 같은 혐기성 균주들은 이러한 C1 가스를 이용하여 유용한 바이오케미컬을 생산할 수 있다.
이러한 유용한 바이오케미컬 중에서 2,3-부탄디올(butanediol)은 프린터 잉크, 향수, 보습제, 연화제, 가소제, 식의약소재 등으로 다양하게 이용되는 화학원료로서 사용되며, 화학전환을 통해 합성고무의 원료로 이용될 수 있기 때문에 석유화학원료를 대체할 수 있는 대표적인 바이오화학원료로 많은 연구가 진행되고 있다. 또한 에탄올의 경우 전통적으로 주정을 생산하기 위해 발효를 통해서 대량으로 생산되고 있으며, 2000년대에 들어서면서 부터는 화석연료의 사용으로 인한 지구온난화를 줄이기 위해 브라질 미국 등의 국가에서 옥수수와 사탕수수를 이용해 가솔린을 대체하기 위한 내연기관의 연료로 많이 생산되고 있다.
생물학적 반응을 이용한 바이오케미컬의 생산은 주로 위에서 언급한 옥수수와 같은 곡물 및 사탕수수 등을 이용하여 생산하며, 목질계, 해조류 바이오매스 등에 존재하는 탄수화물 성분들을 탄소원으로 이용하여 생산하는 방법들이 많이 연구가 되고 있다. 그러나 이러한 원료들의 사용은 식량자원과의 경쟁, 산림 자원을 이용해야 하는 문제를 가지고 있다.
헤테로트로프(heterotroph)는 포도당, 녹말 및 셀룰로오스와 같은 당을 사용하는 반면에, 오토트로프(autotroph)는 CO, CO2 및 합성가스를 탄소원으로 이용한다. 전형적인 헤테로트로프 미생물로는 Klebsiella , Serratia , Bacillus, 및 Enterobacter가 있고, 몇 종류의 C . ljungdahlii , C. ragsdalei , 및 C. autoethanogenum 같은 Clostridium 이 오토트로프의 대표적인 예이다.
Clostridium 속 균주는 탄수화물이 아닌 C1 가스인 일산화탄소와 이산화탄소를 탄소원으로 이용하여 유용한 바이오케미컬을 생산할 수 있다. 그러나 배양에 있어서 시럼 바틀(serum bottle)과 같이 외부에서 가스가 없는 상태에서의 배양은 세포성장과 바이오케미컬과 같은 대사산물 생산에 있어 제한적일 수밖에 없다. 배양기를 이용하여 연속적으로 가스를 공급하며 배양할 수 있으나 기-액 반응에서 기체에서 액체로 전달되는 속도에 한계가 있고 또한 균주가 CO를 바이오케미컬로 전환하는 속도도 낮아 반응하기 못한 CO가 높은 농도로 남아 그대로 배양기 외부로 배출되게 된다.
Clostridium 속 균주를 이용하여 CO와 같은 C1 가스에서의 바이오케미컬 생산에 대해서는 이미 잘 알려져 있다. 그러나 앞서 언급한 바와 같이 Clostridium 속 균주의 세포 성장과 가스 이용 속도가 매우 느리기 때문에 일반적인 배양방법에서는 버려지는 CO의 양이 매우 많았다.
한국특허출원 10-2010-7028446호에서는 세포를 보호유지하고 재순환시키는 방법 및 장치에 대해 개시하고 있다. 상기 특허에서는 연속 흐름 또는 회분식 흐름 용기에서 세포를 보호 유지하고 재순환시키는 장치 및 방법에 대해 제시하고 있다.
본 발명자들은 용해도가 낮아 쉽게 기체 상태되는 배지성분을 이용하여 발효를 진행하는 경우에 있어, 배양기 내부의 상층에서 가스를 채취하여 다시 액상의 배양액 내부로 순환시켜 기체 상태의 배지 성분(예를 들어 일산화탄소(CO))를 배지의 액상에 다시 용해시켜 액상 배지내에서 기체화되지 용이한 성분(예를 들어 일산화탄소(CO))의 농도를 높여주게 되면 발효의 효율이 증가되는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 용해도가 낮고 용이하게 기체화하는 배지 성분을 이용하여 바이오케미컬을 생산할 때, 배지 성분에서 바이오케미컬로의 전환 효율을 높이기 위하여 배양액 상층으로부터 가스를 포집하여 액상으로 재용해시키는 단계를 포함하는 발효 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 목적은 기체 상태의 가스를 액체 내부로 재순환시키는 루프를 포함하는 발효기를 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기한 목적을 위해서 본 발명의 제 1 의 형태는 배양기의 상층액에서 가스를 포집하여 배양기의 하부 액상 배지로 가스를 재순환시키는 루프를 포함하는 연속식 또는 회분식 배양기를 제공한다.
상기 배양기의 하부 액상 배지로 가스를 재순환시킬 때 분사되는 가스의 표면적을 크게 하기 위하여 노즐을 사용할 수 있다. 상기 노즐은 금속 및 세라믹 재료로 이루어진 특수 소결체, 필터 판 또는 레이저 천공판을 사용해 제조되어질 수 있으며, 상기 천공판의 소공 또는 구멍은 일반적으로 15 ㎛보다 작다. 0.5 m/h 미만의 낮은 표면 기체 속도하에서, 매우 미세한 기포들이 발생시킨다.
상기 배양기에서는 액체 배지의 혼합을 위하여 교반기를 포함할 수 있다.
상기 배양기에서는 액상배지내의 용이하게 기체화될 수 있는 물질의 농도를 측정하기 위한 센서를 포함할 수 있다. 이 센서를 통하여 높은 농도의 배지 농도에 따른 기질저해를 막고, 낮은 배지 농도에 따른 생장 저하를 방지할 수 있다.
상기 배양기에는 용이하게 기체화될 수 있는 물질을 보충하기 하기 위한 별도의 가스공급관을 포함할 수 있다. 상기 가스공급관은 별도의 배지 성분의 저장부에 연결되어 배양기 내부로 배지 성분을 공급할 수 있도록 연결된다.
상기 배양기에는 압력을 조정하기 위하여 별도의 배기관을 포함할 수 있다. 배기관은 배양기의 상부에 연결되어서 기체를 외부를 배출시키며, 보충되어진 기체 성분의 배지에 의한 압력 상승을 감압하는 역할을 한다. 배출된 가스는 압력이 높아졌을 때 배양기가 압력으로 인해 부서지는 것을 보호하기 위해서 설정값 이상으로 압력이 높아지면서 배출된 가스이다. 상기 배기관에는 배양기 측으로의 가스 역류를 방지하기 위한 역류방지밸브를 포함할 수 있다.
본 발명의 제 2 의 형태는 연속시 또는 회분식 배양기에서 배양기의 상층액에서 가스를 포집하여 배양기의 하부 액상 배지로 가스를 재순환시키는 것을 특징으로 하는 배양 방법을 제공한다. 상기 액상 배지로 가스를 재순환은 분사되는 가스의 표면적을 크게 하기 위하여 노즐을 사용할 수 있다. 상기 노즐은 금속 및 세라믹 재료로 이루어진 특수 소결체, 필터 판 또는 레이저 천공판을 사용해 제조되어질 수 있으며, 상기 천공판의 소공 또는 구멍은 일반적으로 15 ㎛보다 작을 수 있으며, 적어도 미세한 기포들이 발생시킬 수 있어야 한다. 상기 배양 방법은 배지 성분의 혼합을 위하여 교반기를 포함할 수 있다. 상기 배양 방법에 있어서 소모된 배지성분의 보충을 위한 별도의 배지 투입관을 통하여 배지를 공급할 수 있다. 여기에서는 상기 소모된 배지성분의 보충에 따른 압력의 증가를 상쇄하기 위하여 별도의 배기관을 이용하여 압력을 유지해준다. 보다 구체적으로는 기-액 반응의 효율을 높이기 위해 압력이 가해진 배양기에서 배양기 상단의 가스를 순환펌프를 이용하여 배양기 하단의 노즐을 통해 가스를 지속적으로 배지에 공급하고 바이오케미컬로의 전환으로 감소한 가스를 가스봄베에서 연속적으로 공급하는 배양 방법을 제공한다.
이때의 공급 압력에 의하여 배양기 내부의 압력이 조절된다. 배양기로의 가스 공급은 가스조절기에서 조절된 압력과 배양기 내부의 압력이 같아지면 자동적으로 중단되게 된다. 가스조절기의 압력은 반드시 배양기 제조상에 설계된 압력 한계치 이하로 조절하여 사용되어야 한다.
배양기 내부의 가스를 정량펌프를 이용하여 노즐을 통해 순환하게 되면 공급된 C1 가스는 Clostridium 속과 같은 미생물에 의해 바이오케미컬로 전환된다.
이 과정에서 배양기 내부의 압력이 감소하게 되면 가스조절기를 통해 원료물질로 사용되는 C1 가스가 소모된 가스의 양 만큼 배양기 내부로 공급되어 일정하게 압력을 유지하게 된다.
콘덴서 후단의 역류방지밸브는 외부의 산소가 배양기 내부로 들어오는 것을 방지하는 목적과 설계 압력 이상의 압력으로 가스가 공급되었을 때 가스를 배출하기 위한 목적으로 설치한다.
본 발명에 따른 가스 순환 배양을 이용하여 원료 가스의 소모량을 줄이고 바이오케미컬로의 전환 효율을 높일 수 있다. 본 발명에 따른 배양기는 가스 재순환 방식을 통해 시럼 바틀(serum bottle)에서의 환경과 유사한 환경을 만들어주면서 동시 배지로의 가스 공급을 증가시킬 수 있다.
종래의 배양기에서 소모된 원료가스에 소량의 산소가 포함되었을 경우 일반적인 가스 공급 방식에서는 산소가 배지에 누적되어 녹아들어가기 때문에 혐기성균주의 성장을 방해한다. 그러나 본 발명에 따른 가스 재순환 방식은 바이오케미컬로 전환되면서 소모되는 만큼만 원료가스를 연속적으로 채워주기 때문에 원료가스에 들어있는 산소의 영향을 줄일 수 있다. 이에 따른 발효 생산량이 증가된다.
도 1은 원료물질로 사용하는 C1가스를 미생물을 배양하는 배지로 재순환하여 공급하는 모식도를 나타낸 것이다.
도 2는 기존방식과 본 발명에 따른 배양 방법을 비교한 것이다. 본 발명에 따른 배양 방법의 세포 성장이 약 2 배 증가한 것을 보인다.
도 3은 기존방식과 본 발명에 따른 배지의 소모비를 보인 것이다. 기존의 방식에 비해 배지의 소모량이 약 10배 이상 감소되었다.
이하에서는 본 발명을 상세하게 설명한다. 그러나 이와 같은 상세한 설명이 본 발명의 권리범위를 한정하기 위한 것은 아니다. 본 발명의 권리범위는 특허청구범위에 기재된 청구항에 의해 정해진다.
( 실시예 1) 가스 재순환을 통한 배양
1) 균주 및 배지
본 연구는 C1 가스를 이용하는 세포성장 및 바이오케미컬을 생산할 수 있는 모든 균주에 활용이 가능한 배양 방법이며, 그에 따라 다양한 배지를 활용하여 배양에 이용할 수 있다. 보다 구체적으로 사용된 균주는 C. ljungdahlii , C. ragsdalei, 또는 C. autoethanogenum 같은 Clostridium 속 균주이다.
2) 장비의 구성
본 장비는 도 1를 통해 구체적으로 설명한다. 본 실시예에서 사용하는 것은 일반적으로 미생물 배양에 주로 이용되는 회분 배양기(100)를 사용하였다. 장비의 구성에 필요한 주요 장치는 배양기 상부의 가스를 순환시킬 수 있는 정량펌프(150)와, 밀폐 구조로 이루어져 외부와 격리되는 배양기 내부에 압력을 유지시켜 주는 배기관(180)을 구비하였다. 상기 배기관(180)에는 가스의 압력을 유지하기 위한 가스조절기(220)가 구비되어져 있다. 가스의 공급은 가스공급관(230)을 통하여 가스배지를 공급해주며, 상기 가스공급관은 가스를 보관하고 있는 가스 저장소(160)가 연결되어져 있다. 가스공급은 가스공급관에 연결된 가스조절기(210)에 의해 조절되어진다. 정량펌프에 연결된 가스순환루프(190)의 일말단에는 가스를 배출하기 위한 노즐(170)이 연결되어져 있다. 가스순환루프는 배양기의 상부에서 가스를 포집하여 펌프(150)를 통하여 재순환하여 노즐(170)을 통하여 가스를 미세하게 토출시킨다. 배양기의 외부에 위치한 모터(140)에 의해 전달된 회전에너지를 이용하여 배양기 내부에서 위치하여 회전하며, 액체 배지 성분을 교반하기 위한 교반기(130)가 있고, 배양기의 내부측면에 위치하며 교반기(130)에 의해 만들어진 액체의 흐름을 분산시키는 배플(110)이 내장되어 있다.
3) 원료물질의 순환
원료물질로 사용되는 C1 가스의 공급은 원료가 공급되는 가스라인을 통하여 들어오게 되며 들어가는 가스는 가스조절기를 통해서 일정한 압력으로 유지되어 공급된다.
도 2는 기존의 방식과 배지 재순환 방식을 이용하여 가스를 원료물질로 사용이 가능한 Clostridium 속의 균주를 배양한 결과이다. 기존의 방식에 비해서 세포의 성장이 약 2배 증가된 것을 알 수 있다.
도 3은 총 가스배출량을 보인다. 총 가스배출량을 비교해 보면 일반적인 방식에 비해 10% 정도로 매우 낮은 양의 가스를 배출하는 것으로 나타났다. 따라서 본 발명은 가스 사용량을 줄이면서 세포성장을 보다 더 안정적으로 높일 수 있는 방식이다.
100: 회분 배양기 110: 배플(baffle)
130: 교반기 140: 회전모터
150: 펌프 160: 가스저장소
170: 노즐 180: 배기관
190: 가스순환루프 200: 역류방지밸브
210, 220: 가스조절기 230: 가스공급관

Claims (7)

  1. 액상의 배지를 사용하는 연속식 또는 회분식 배양기에 있어서,
    상기 배양기의 상층액에서 가스를 포집하여 배양기의 하부 액상 배지로 가스를 재순환시키는 루프;
    상기 배양기의 하부 액상 배지로 가스를 재순환시킬 때 분사되는 가스의 표면적을 크게 하기 위한 노즐;
    상기 배양기의 내부에 위치하고 액체 배지의 혼합을 위한 교반기;
    상기 배양기 내부로 배지 물질을 보충하기 하기 위한 가스공급관;
    상기 가스공급관에 연결된 배지 저장부; 및
    상기 배양기의 외부로 연결되어 배양기의 압력을 조정하기 위한 배기관을 포함하고,
    상기 배양기는, 밀폐 구조로 이루어짐으로써, 내부가 외부로부터 격리되도록 하고,
    상기 배기관은, 상기 배양기 측으로의 가스 역류를 방지하여 외부의 산소가 상기 배양기의 내부로 들어오는 것을 방지함과 아울러, 설계 압력 이상의 압력으로 가스가 공급되었을 때 가스를 배출하도록 하는 역류방지밸브를 포함하고,
    상기 가스공급관은, 상기 배양기 내부로의 가스 공급을 조절하도록 마련되는 가스조절기를 포함하고,
    상기 배기관은, 상기 배양기 내부의 가스 압력을 유지하도록 마련되는 가스조절기를 포함하는, 연속식 또는 회분식 배양기.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 배양기의 내부의 배지의 농도를 측정하기 위한 센서를 구비한 것을 특징으로 하는 연속식 또는 회분식 배양기.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 노즐은 금속 및 세라믹 재료로 이루어진 특수 소결체, 필터 판 또는 레이저 천공판을 사용해 제조되고, 상기 천공판의 소공 또는 구멍은 일반적으로 15 ㎛보다 작지만 기포를 생시킬 수 있는 노즐인 것을 특징으로 하는 연속식 또는 회분식 배양기.
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