KR101960040B1 - Use of human bitter taste receptor TAS2R10 for the diagnosis and treatment of cancer - Google Patents
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Abstract
본 발명은 인간 쓴맛 수용체인 TAS2R10의 암 진단 및 치료를 위한 용도에 관한 것이다. 구체적으로 본 발명은 TAS2R10의 발현을 촉진하는 제제를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, TAS2R10의 발현 수준 측정을 이용한 암 치료제의 스크리닝 방법, TAS2R10의 발현 수준을 측정하는 제제를 유효성분으로 포함하는 암의 진단 또는 예후 분석용 바이오마커 조성물 및 키트, 그리고 TAS2R10의 발현 수준 측정을 이용한 암의 진단 또는 예후 분석에 필요한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 인간 쓴맛 수용체 TAS2R10은 암세포의 암줄기세포성 및 자가 재생 능력을 효과적으로 억제하며, 종양 형성을 억제하고 암세포의 전이 및 침윤을 억제하는 효능이 탁월하여, 이의 발현을 촉진함으로써 암을 예방하고 치료하는 효과가 우수하다. 또한, 본 발명의 TAS2R10은 암세포의 발달 단계, 분화 정도에 따라 발현 수준이 변화되는 특성이 있어 암의 진단과 예후 분석에 효과적으로 이용될 수 있다.The present invention relates to the use of human bitter receptor TAS2R10 for the diagnosis and treatment of cancer. Specifically, the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising an agent that promotes expression of TAS2R10 as an active ingredient, a screening method for cancer treatment using measurement of TAS2R10 expression level, and a method for measuring the expression level of TAS2R10 A biomarker composition and kit for the diagnosis or prognosis analysis of cancer as an active ingredient, and a method for providing information necessary for diagnosis or prognosis analysis of cancer using the expression level of TAS2R10.
The human bitter receptor TAS2R10 of the present invention effectively inhibits the cancer stem cell and self regenerating ability of cancer cells and inhibits tumor formation and inhibits the metastasis and infiltration of cancer cells and promotes the expression thereof, . In addition, the expression level of TAS2R10 of the present invention is changed according to development stage and degree of differentiation of cancer cells, and thus it can be effectively used for diagnosis and prognosis of cancer.
Description
본 발명은 인간 쓴맛 수용체인 TAS2R10의 암 진단 및 치료를 위한 용도에 관한 것이다.The present invention relates to the use of human bitter receptor TAS2R10 for the diagnosis and treatment of cancer.
구체적으로 본 발명은 TAS2R10의 발현을 촉진하는 제제를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, TAS2R10의 발현 수준 측정을 이용한 암 치료제의 스크리닝 방법, TAS2R10의 발현 수준을 측정하는 제제를 유효성분으로 포함하는 암의 진단 또는 예후 분석용 바이오마커 조성물 및 키트, 그리고 TAS2R10의 발현 수준 측정을 이용한 암의 진단 또는 예후 분석에 필요한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.Specifically, the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising an agent that promotes expression of TAS2R10 as an active ingredient, a screening method for cancer treatment using measurement of TAS2R10 expression level, and a method for measuring the expression level of TAS2R10 A biomarker composition and kit for the diagnosis or prognosis analysis of cancer as an active ingredient, and a method for providing information necessary for diagnosis or prognosis analysis of cancer using the expression level of TAS2R10.
암세포의 아형집단(sub-population)은 분화, 자가-재생 잠재력(self-renewal potential) 및 종양 형성을 포함하는 암줄기세포(cancer stem cell; CSC)의 대표적인 특징을 나타내는 것으로 증명되었으며, 이에 CSC는 종양의 성장, 전이 및 화학요법과 방사선 요법에 대한 저항성의 원인이 되는 것으로 나타났다(Clarke MF, et al. Cancer stem cells--perspectives on current status and future directions: AACR Workshop on cancer stem cells. Cancer Res. 2006;66(19):9339-9344). 따라서 CSC를 표적으로 하는 암 치료 전략은 악성 암에 대한 효과적인 치료법이 될 것으로 기대되고 있다.The sub-population of cancer cells has been demonstrated to represent representative features of cancer stem cells (CSC), including differentiation, self-renewal potential and tumorigenesis, (Clarke MF, et al. Cancer stem cells - perspectives on current status and future directions: AACR Workshop on cancer stem cells. Cancer Res. 2006 ; 66 (19): 9339-9344). Thus, a cancer-targeting strategy targeting CSC is expected to be an effective treatment for malignant cancer.
또한, 상당수의 암이 원발성 종양 자체가 아닌, 암세포의 전이에 의해 암환자의 사망률에 영향을 미치는 것으로 알려져 있으며, 이러한 암세포의 전이에 있어서 세포 침윤과 이동은 암세포 전이의 두 가지 기본 과정이 된다. 따라서 암세포의 세포 침윤과 이동을 억제하여 암세포의 전이를 억제하는 치료 전략 역시 악성 암에 대한 효과적인 치료법이 될 것으로 기대되고 있다.In addition, many cancers are known to affect the mortality of cancer patients by metastasis of cancer cells, rather than primary tumors themselves. Cell invasion and migration in these cancer metastases are the two basic processes of cancer cell metastasis. Therefore, it is expected that the therapeutic strategy of inhibiting the cell infiltration and migration of cancer cells and inhibiting the metastasis of cancer cells will be an effective treatment for malignant cancer.
신경모세포종(neuroblastoma; NB)은 배아 또는 태아의 초기 단계에서 발생하며 미성숙한 신경 세포에서 유래된 암의 한 유형이다. NB의 발병의 대부분은 유년기와 10세 미만의 소아에서 발생하며, 실제로 NB는 1세 미만의 영아에서 가장 흔하게 진단되는 암 유형으로 알려져 있다. NB 세포주는 표현형 및 유전자 발현 패턴에 기초하여 신경세포/신경 내분비 전구체(N-type), 기질-부착성/Schwannian (S-type) 및 중간(I-type) 타입과 같은 세 가지의 세포 유형으로 나타나는 것으로 확인되었다. 그 중 I형 세포는 NB 세포 중 가장 미성숙하고 악성인 집단을 나타내며, 이들은 N형 및 S형 세포의 중간적인 특성을 나타낸다. 악성 NB의 유전자 발현 프로파일에서 I형 세포는 NB의 잠재적 치료 표적, 특히 CSC의 연구를 위한 in vitro 모델로서 사용되어왔다.Neuroblastoma (NB) is a type of cancer that occurs in the early stages of an embryo or fetus and is derived from immature neurons. Most cases of NB occur in childhood and in children younger than 10 years of age. In fact, NB is the most commonly diagnosed type of cancer in infants under one year of age. The NB cell line is divided into three cell types based on the phenotype and gene expression pattern, such as nerve cell / neural endocrine precursor (N-type), substrate-adhesion / Schwannian (S-type) Respectively. Among them, type I cells represent the most immature and malignant population of NB cells, and these represent intermediate characteristics of N-type and S-type cells. In the gene expression profile of malignant NB, type I cells have been used as in vitro models for the potential therapeutic targets of NB, particularly for the study of CSC.
미각은 일반적으로 혀의 돌기에 위치한 미뢰의 향미-의존성 화학 감각 시스템으로 알려져 있다. 또한 단맛, 우마미, 신맛, 짠맛 및 쓴맛을 포함하는 5가지 기본 맛은 혀에 국한된 특수 감각 세포에 의해 감지되는 것으로 알려져 있다. 이러한 세포들 중에서 단맛, 우마미 및 쓴맛에 의한 메커니즘은 특정 유형의 G-단백질 결합 수용체(G-protein-coupled receptor; GPCR)와 작은 분자간의 상호 작용을 포함하는 것으로 밝혀졌다. GPCR은 신경 전달 물질, 빛, 맛 및 냄새와 같은 다양한 세포외 자극에 반응하는 트랜스 멤브레인 수용체의 수퍼 패밀리에 속한다. The taste is generally known as a flavor-dependent chemosensory system of taste buds located on the protuberance of the tongue. In addition, five basic flavors including sweet, umami, sour, salty and bitter taste are known to be detected by special sensory cells confined to the tongue. Among these cells, the mechanism of sweetness, umami and bitter taste has been found to involve small intermolecular interactions with certain types of G-protein-coupled receptors (GPCRs). GPCRs belong to the superfamily of transmembrane receptors that respond to a variety of extracellular stimuli such as neurotransmitters, light, taste and odor.
TAS2R로 불리는 인간의 쓴맛 수용체는 쓴 물질에 반응하는 약 25개의 화학 감각 수용체 그룹을 말한다. 최근의 연구에 따르면 TAS2R은 위장관, 심혈관, 폐, 생식기, 면역계 및 중추 신경계 조직을 비롯한 비-미각성 조직에서도 발현된다는 사실이 입증되었다. 이러한 결과는 TAS2R이 맛을 감지하는 역할과 구별되는 기능을 매개함을 시사한다. 지금까지 쓴맛 수용체에 대한 연구는 제한적이었으나, 쓴맛의 감지는 인간이 잠재적으로 해롭고 위험한 독성 물질의 섭취로부터 자신을 보호할 수 있는 자기 방어 시스템과 관련이 있다고 일반적으로 받아들여지고 있다(Singh N, et al. Functional bitter taste receptors are expressed in brain cells. Biochem Biophys Res Commun. 2011;406(1):146-151).Human bitter receptors, referred to as TAS2R, represent about 25 chemosensory receptor groups that respond to bitter substances. Recent studies have demonstrated that TAS2R is also expressed in non-arousal tissues including the gastrointestinal tract, cardiovascular, lung, reproductive, immune and central nervous system tissues. These results suggest that TAS2R mediates the function of taste and the distinctive function. Studies on bitter receptors have hitherto been limited, but the detection of bitter taste is generally accepted to be related to a self-defense system that can protect itself from the ingestion of potentially harmful and dangerous toxins (Singh N, et al . Functional bitter taste receptors are expressed in brain cells. Biochem Biophys Res Commun. 2011; 406 (1): 146-151).
TAS2R이 위장관, 심혈관, 폐, 생식기, 면역계 및 중추 신경계 조직을 비롯한 비-미각성 조직에서도 발현된다는 것에 기초하여, 이와 관련한 천식, 위장관 질병 등의 다양한 질병과 관련이 있을 것으로 추정되고 있으나, 아직까지 TAS2R의 항-암줄기세포성 및 항-전이 효과 등에 대하여는 알려진 바가 없으며 이에 따른 암 치료 가능성에 대하여도 규명된 바가 없다.Although TAS2R is presumed to be related to various diseases such as asthma and gastrointestinal diseases related thereto based on the fact that TAS2R is also expressed in non-arousal tissue including gastrointestinal tract, cardiovascular, lung, genital, immune system and central nervous system tissues, The anti-amyloidogenic and anti-metastatic effects of TAS2R are not known, and the possibility of cancer treatment has not been elucidated.
본 발명은 인간 쓴맛 수용체인 TAS2R10의 암 진단 및 치료를 위한 용도를 제공하는 것을 목적으로 한다.It is an object of the present invention to provide a diagnostic and therapeutic use of TAS2R10, a human bitter receptor, for cancer.
구체적으로 본 발명은 TAS2R10의 발현을 촉진하는 제제를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, TAS2R10의 발현 수준 측정을 이용한 암 치료제의 스크리닝 방법, TAS2R10의 발현 수준을 측정하는 제제를 유효성분으로 포함하는 암의 진단 또는 예후 분석용 바이오마커 조성물 및 키트, 그리고 TAS2R10의 발현 수준 측정을 이용한 암의 진단 또는 예후 분석에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.Specifically, the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising an agent that promotes expression of TAS2R10 as an active ingredient, a screening method for cancer treatment using measurement of TAS2R10 expression level, and a method for measuring the expression level of TAS2R10 A biomarker composition and kit for the diagnosis or prognosis analysis of cancer contained as an active ingredient, and a method for providing information necessary for diagnosis or prognosis analysis of cancer using the expression level of TAS2R10.
본 발명은 인간 쓴맛 수용체 TAS2R10의 발현을 촉진하는 제제를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.The present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising as an active ingredient an agent for promoting the expression of the human bitter receptor TAS2R10.
본 발명의 인간 쓴맛 수용체 TAS2R10은 단맛, 우마미, 신맛, 짠맛 및 쓴맛을 포함하는 인간의 5가지 기본 맛 수용체의 하나로서, 그 중 쓴맛을 나타내는 물질에 대한 수용체로, G-단백질 결합 수용체(G-protein coupled receptor) 군에 속하는 것으로 알려져 있다.The human bitter receptor TAS2R10 of the present invention is one of the five basic taste receptors of humans including sweet taste, umami, sour taste, salty taste and bitter taste. Among them, a receptor for a bitter taste substance, protein coupled receptors.
본 발명자들은 암세포에서 TAS2R10의 발현이 촉진되는 경우, 암세포의 암줄기세포성(cancer stem cell; CSC) 및 자가 재생 능력(self-renewal capacity)이 억제되고, 종양 형성이 억제되며, 암세포의 전이 및 침윤(invasion)이 억제되어 암을 예방하고 치료하는 효과가 있음을 최초로 규명하였다.The present inventors have found that when TAS2R10 expression is promoted in cancer cells, cancer stem cell (CSC) and self-renewal capacity of cancer cells are suppressed, tumor formation is inhibited, and cancer cell metastasis and invasion invasion of the cancer is suppressed and the effect of preventing and curing cancer was first identified.
구체적으로 본 발명의 실시예에서 신경모세포종 세포주인 SK-N-BE(2)C (이하, "BE(2)C")를 재조합 플라스미드인 pcDNA+TAS2R10로 형질 감염시켜 TAS2R10의 과발현을 유도한 결과, 대표적인 암줄기세포 마커인 DLK1, CD133, Notch1 및 Sox2의 발현이 유의하게 감소되었으며, 이로써 TAS2R10의 발현 촉진에 따른 암세포의 암줄기세포성 억제를 확인하였다(도 4a, 4b).Specifically, in the example of the present invention, transfection of SK-N-BE (2) C (hereinafter referred to as "BE (2) C") with the recombinant plasmid pcDNA + TAS2R10 resulted in induction of TAS2R10 overexpression , And the expression of the representative cancer stem cell markers DLK1, CD133, Notch1 and Sox2 was significantly decreased, thereby confirming the inhibition of cancer stem cell by cancer cell promoting expression of TAS2R10 (FIGS. 4A and 4B).
또한, 본 발명의 다른 실시예에서, BE(2)C를 재조합 플라스미드인 pcDNA+TAS2R10로 형질 감염시켜 TAS2R10의 과발현을 유도한 후 집락 형성 분석(clonogenic assay) 및 구 형성 분석(sphere formation assay)을 수행한 결과, BE(2)C의 집락 형성 및 구 형성이 모두 유의하게 억제되었으며, 이로써 TAS2R10의 발현 촉진에 따른 암세포의 자가 재생 잠재력 억제를 확인하였다(도 5, 도 6).In another embodiment of the present invention, BE (2) C is transfected with a recombinant plasmid pcDNA + TAS2R10 to induce overexpression of TAS2R10, followed by clonogenic assay and sphere formation assay As a result, both colony formation and spheroid formation of BE (2) C were significantly inhibited, thereby confirming inhibition of cancer cell self-renewal potential by promoting expression of TAS2R10 (FIGS. 5 and 6).
또한, 본 발명의 다른 실시예에서, BE(2)C를 재조합 플라스미드인 pcDNA+TAS2R10로 형질 감염시켜 TAS2R10의 과발현을 유도한 후, 이를 마우스 모델에 피하 주사하여 종양의 형성여부를 관찰한 결과, 대조군에 비해 약 80%의 수준으로 종양 형성이 억제됨을 확인하였다(표 1).In another embodiment of the present invention, BE (2) C was transfected with a recombinant plasmid pcDNA + TAS2R10 to induce overexpression of TAS2R10 and then injected subcutaneously into a mouse model to observe the formation of tumor. As a result, It was confirmed that the tumor formation was inhibited to the level of about 80% as compared with the control (Table 1).
또한, 본 발명의 다른 실시예에서, pcDNA+TAS2R10로 형질 감염시켜 TAS2R10의 과발현이 유도된 BE(2)C를 이용하여 상처 치유 분석(wound-healing assay)을 수행한 결과, 대조군과 비교하여 약 30% 정도 느린 속도로 세포 이동이 이루어졌으며, 이로써 TAS2R10의 발현 촉진에 따른 암세포의 전이 억제를 확인하였다(도 7).In another embodiment of the present invention, a wound-healing assay was performed using BE (2) C, which was transfected with pcDNA + TAS2R10 and induced overexpression of TAS2R10. As a result, Cell migration was performed at a rate as low as 30%, thereby confirming inhibition of cancer cell metastasis by promoting expression of TAS2R10 (FIG. 7).
또한, 본 발명의 다른 실시예에서, pcDNA+TAS2R10로 형질 감염시켜 TAS2R10의 과발현이 유도된 BE(2)C를 이용하여 트랜스웰 침윤 분석(transwell invasion assay)을 수행한 결과, 대조군과 비교하여 암세포의 침윤성이 유의하게 감소된 것으로 확인되었다(도 8).In another embodiment of the present invention, transwell invasion assay was performed using BE (2) C in which TAS2R10 overexpression was induced by transfection with pcDNA + TAS2R10. As a result, Was significantly reduced (Fig. 8).
또한, 본 발명의 다른 실시예에서, BE(2)C를 재조합 플라스미드인 pcDNA+TAS2R10로 형질 감염시켜 TAS2R10의 과발현을 유도한 후 젤라틴 자이모그라피 분석(gelatin zympgraphy assay)을 수행한 결과, 세포외 기질(ECM)의 거대 분자를 분해하여 암세포의 이동과 침윤을 촉진하는 것으로 알려진 MMP-2 및 MMP-9의 발현이 억제되는 것으로 확인되었다(도 9).In another embodiment of the present invention, BE2C was transfected with recombinant plasmid pcDNA + TAS2R10 to induce overexpression of TAS2R10, followed by gelatin zympgraphy assay. As a result, It was confirmed that the expression of MMP-2 and MMP-9, which are known to decompose macromolecules of substrate (ECM) and promote the migration and invasion of cancer cells, is inhibited (FIG. 9).
또한, 본 발명의 다른 실시예에서, pcDNA+TAS2R10로 형질 감염시켜 TAS2R10의 과발현이 유도된 BE(2)C를 이용하여 qRT-PCR 분석 및 웨스턴 블랏 분석을 수행한 결과, 저산소 상태에서 특히 암세포의 전이를 유도하는 것으로 알려진 HIF-1a의 발현이 유의하게 억제되는 것으로 확인되었다(도 10).In another embodiment of the present invention, qRT-PCR analysis and western blot analysis were performed using BE (2) C, which was transfected with pcDNA + TAS2R10 and induced overexpression of TAS2R10. As a result, It was confirmed that expression of HIF-la, which is known to induce metastasis, was significantly inhibited (FIG. 10).
본 발명에서 사용되는 용어, "TAS2R10의 발현을 촉진하는 제제"는 TAS2R10의 발현을 촉진시키는 모든 제제를 포함하며, 예를 들어 TAS2R10의 유전자 발현 조절 부위에 특이적으로 결합하여 TAS2R10의 발현 촉진을 유도하는 모든 화합물, 탄수화물, 펩티드, 앱타머, 항체 등 일 수 있다.The term " agent that promotes the expression of TAS2R10 " used in the present invention includes all agents that promote expression of TAS2R10, and specifically binds to a gene expression regulatory region of TAS2R10 to induce TAS2R10 expression promotion Carbohydrates, peptides, aptamers, antibodies, and the like.
본 발명의 약학적 조성물은 TAS2R10의 발현을 촉진하는 제제를 유효 성분으로 포함하는 것 이외에 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention may further comprise a pharmaceutically acceptable carrier in addition to an agent which promotes the expression of TAS2R10 as an active ingredient.
본 발명에서 사용될 수 있는 담체의 종류는 특별히 제한되지 아니하며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다. 상기 담체의 비제한적인 예로는, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사 용액, 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 말토 덱스트린, 글리세롤, 에탄올 등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다.The kind of carrier which can be used in the present invention is not particularly limited and any carrier commonly used in the technical field can be used. Examples of the carrier include, but are not limited to, saline, sterilized water, Ringer's solution, buffered saline, albumin injection solution, lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, maltodextrin, glycerol, . These may be used alone or in combination of two or more.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 필요한 경우, 부형제, 희석제, 항산화제, 완충액 또는 정균제 등 기타 약학적으로 허용 가능한 첨가제들을 첨가하여 사용할 수 있으며, 충진제, 증량제, 습윤제, 붕해제, 분산제, 계면 활성제, 결합제 또는 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 사용할 수 있다.In addition, the pharmaceutical composition of the present invention may be supplemented with other pharmaceutically acceptable additives such as excipients, diluents, antioxidants, buffers or bacteriostats, and may be used as fillers, extenders, wetting agents, disintegrants, , A binder, a lubricant, and the like may be additionally used.
본 발명의 약학적 조성물에 있어서, TAS2R10의 발현을 촉진하는 제제는 약학적 조성물의 전체의 중량을 기준으로 0.00001 중량% 내지 99.99 중량%로 포함될 수 있으며, 바람직하게는 0.1 중량% 내지 90 중량%, 보다 바람직하게는 0.1 중량% 내지 70 중량%, 더욱 바람직하게는 0.1 중량% 내지 50중량%로 포함될 수 있으나, 이에 한정되지 않으며 투여 대상의 상태, 구체적인 병증의 종류, 진행 정도 등에 따라 다양하게 변경될 수 있다. 필요한 경우, 약학적 조성물의 전체 함량으로도 포함될 수 있다.In the pharmaceutical composition of the present invention, the agent for promoting the expression of TAS2R10 may be contained in an amount of 0.00001 wt% to 99.99 wt%, preferably 0.1 wt% to 90 wt%, based on the total weight of the pharmaceutical composition, More preferably 0.1% by weight to 70% by weight, and still more preferably 0.1% by weight to 50% by weight, based on the total weight of the pharmaceutical composition of the present invention. . If desired, it may also be included in the total content of the pharmaceutical composition.
본 발명의 약학적 조성물은 경구 투여 또는 비경구 투여를 위한 적합하고 다양한 제형으로 제제화되어 사용될 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention may be formulated into various formulations suitable for oral administration or parenteral administration.
본 발명의 약학적 조성물을 이용한 경구 투여용 제제의 비제한적인 예로는, 트로키제(troches), 로젠지(lozenge), 정제, 수용성 현탁액, 유성 현탁액, 조제 분말, 과립, 에멀젼, 하드 캡슐, 소프트 캡슐, 시럽 또는 엘릭시르제 등을 들 수 있다.Non-limiting examples of oral dosage forms using the pharmaceutical compositions of the present invention include troches, lozenges, tablets, aqueous suspensions, oily suspensions, prepared powders, granules, emulsions, hard capsules, soft Capsules, syrups, and elixirs.
본 발명의 약학적 조성물을 경구 투여용으로 제제화하기 위하여, 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴 등과 같은 결합제; 디칼슘 포스페이트 등과 같은 부형제; 옥수수 전분 또는 고구마 전분 등과 같은 붕해제; 스테아르산 마그네슘, 스테아르산 칼슘, 스테아릴 푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌 글리콜 왁스 등과 같은 윤활유 등을 사용할 수 있으며, 감미제, 방향제, 시럽제 등도 사용할 수 있다. 나아가 캡슐제의 경우에는 상기 언급한 물질 외에도 지방유와 같은 액체 담체 등을 추가로 사용할 수 있다.In order to formulate the pharmaceutical composition of the present invention for oral administration, a binder such as lactose, saccharose, sorbitol, mannitol, starch, amylopectin, cellulose or gelatin; Excipients such as dicalcium phosphate and the like; Disintegrating agents such as corn starch or sweet potato starch; Magnesium stearate, calcium stearate, sodium stearyl fumarate, or polyethylene glycol wax, and the like. Sweetening agents, fragrances, syrups, and the like may also be used. Furthermore, in the case of capsules, in addition to the above-mentioned substances, liquid carriers such as fatty oils can be further used.
본 발명의 약학적 조성물을 이용한 비경구용 제제의 비제한적인 예로는, 주사액, 좌제, 호흡기 흡입용 분말, 스프레이용 에어로졸제, 연고, 도포용 파우더, 오일, 크림 등을 들 수 있다.Non-limiting examples of the parenteral preparation using the pharmaceutical composition of the present invention include injections, suppositories, respiratory inhalation powders, aerosol preparations for spraying, ointments, powder for application, oils and creams.
본 발명의 약학적 조성물을 비경구 투여용으로 제제화하기 위하여, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결 건조 제제, 외용제 등을 사용할 수 있으며, 상기 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.In order to formulate the pharmaceutical composition of the present invention for parenteral administration, sterilized aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, freeze-dried preparations and external preparations may be used. Examples of the non-aqueous solutions and suspensions include propylene glycol, polyethylene Glycerol, vegetable oils such as olive oil, injectable esters such as ethyl oleate, and the like.
본 발명의 약학적 조성물을 주사액으로 제제화하는 경우, 본 발명의 약학적 조성물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고 이를 앰플(ampoule) 또는 바이알(vial)의 단위 투여용으로 제제화할 수 있다.When the pharmaceutical composition of the present invention is formulated into an injection, the pharmaceutical composition of the present invention is mixed with a stabilizer or a buffer in water to prepare a solution or suspension, which is used for unit administration of an ampoule or a vial Can be formulated.
본 발명의 약학적 조성물을 에어로졸제로 제제화하는 경우, 수분산된 농축물 또는 습윤 분말이 분산되도록 추진제 등이 첨가제와 함께 배합할 수 있다.When the pharmaceutical composition of the present invention is formulated into an aerosol formulation, a propellant or the like may be added together with the additive such that the water-dispersed concentrate or the wet powder is dispersed.
본 발명의 약학적 조성물을 연고, 크림, 도포용 파우더, 오일, 피부 외용제 등으로 제제화하는 경우에는, 동물성 유, 식물성 유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화 아연 등을 담체로 사용하여 제제화할 수 있다.When the pharmaceutical composition of the present invention is formulated into an ointment, a cream, a powder for application, an oil, an external preparation for skin or the like, an animal oil, a vegetable oil, a wax, a paraffin, a starch, a tracer, a cellulose derivative, a polyethylene glycol, , Silica, talc, zinc oxide or the like as a carrier.
본 발명의 약학적 조성물의 약학적 유효량, 유효 투여량은 약학적 조성물의 제제화 방법, 투여 방식, 투여 시간 및/또는 투여 경로 등에 의해 다양해질 수 있으며, 약학 조성물의 투여로 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 투여 대상이 되는 개체의 종류, 연령, 체중, 일반적인 건강 상태, 질병의 증세나 정도, 성별, 식이, 배설, 해당 개체에 동시 또는 이시에 함께 사용되는 약물 기타 조성물의 성분 등을 비롯한 여러 인자 및 의약 분야에서 잘 알려진 유사 인자에 따라 다양해질 수 있으며, 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 목적하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정하고 처방할 수 있다.The pharmaceutically effective amount and the effective dose of the pharmaceutical composition of the present invention can be varied depending on the formulation method, administration method, administration time and / or administration route of the pharmaceutical composition, and the kind of reaction to be achieved by administration of the pharmaceutical composition Including the age, weight, general health condition, degree and severity of the disease, sex, diet, excretion, drugs used simultaneously or simultaneously with the subject, and other compositional components, etc. May be varied according to factors well known in the art and in the pharmaceutical arts, and those of ordinary skill in the art can readily determine and prescribe dosages that are effective for the desired treatment.
본 발명의 약학적 조성물의 투여는 하루에 1회 투여될 수 있고, 수회에 나누어 투여될 수도 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양으로 투여할 수 있으며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.The administration of the pharmaceutical composition of the present invention may be administered once a day or divided into several doses. The pharmaceutical composition of the present invention may be administered as an individual therapeutic agent or in combination with other therapeutic agents, and may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents. Taking into consideration all of the above factors, in such an amount as to obtain the maximum effect in a minimal amount without side effects, which can be easily determined by those skilled in the art.
본 발명의 약학적 조성물의 투여 경로 및 투여 방식은 각각 독립적일 수 있으며, 목적하는 해당 부위에 상기 약학적 조성물이 도달할 수 있는 한, 특별한 제한 없이 임의의 투여 경로 및 투여 방식에 따를 수 있다. 상기 약학적 조성물은 경구 투여 또는 비경구 투여 방식으로 투여할 수 있다.The route of administration and the mode of administration of the pharmaceutical composition of the present invention may be independent of each other, and may be arbitrarily selected depending on the route of administration and the mode of administration as long as the pharmaceutical composition can reach the desired site. The pharmaceutical composition may be administered orally or parenterally.
본 발명의 약학적 조성물의 비경구 투여 방법으로는, 정맥 내 투여, 복강 내 투여, 근육 내 투여, 경피 투여 또는 피하 투여 등을 이용할 수 있으며, 상기 조성물을 질환 부위에 도포하거나 분무, 흡입하는 방법 또한 이용할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.Examples of the parenteral administration method of the pharmaceutical composition of the present invention include intravenous administration, intraperitoneal administration, intramuscular administration, transdermal administration or subcutaneous administration, and the method of applying, spraying or inhalation the above composition But are not limited thereto.
본 발명의 약학적 조성물은 단독으로 사용할 수 있으나, 치료 효율을 증가시키기 위하여 추가적으로 방사선 요법, 화학 요법 등의 다양한 암 치료 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention may be used alone, but may be used in combination with various cancer treatment methods such as radiotherapy and chemotherapy in order to increase the therapeutic efficiency.
본 발명은 인간 쓴맛 수용체 TAS2R10을 발현하는 시료에 암 치료용 후보물질을 처리하고 TAS2R10의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 암 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.The present invention provides a screening method for a cancer therapeutic agent comprising treating a sample expressing the human bitter receptor TAS2R10 with a candidate substance for cancer treatment and measuring the expression level of TAS2R10.
본 발명은 암 치료용 후보물질의 존재 및 부재 하에서 TAS2R10의 발현 수준의 변화를 비교하는 방법으로 암 치료제를 스크리닝하는데 유용하게 사용될 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 암 치료제 스크리닝 방법은 암 치료용 후보물질의 부재 하에 시료에서의 TAS2R10의 발현 수준을 측정하고, 또한 암 치료용 후보물질의 존재 하에 TAS2R10의 발현 수준을 측정하여 양자를 비교한 결과, 상기 후보물질이 존재할 때의 TAS2R10의 발현 수준이 상기 후보물질의 부재 하에서의 발현 수준보다 증가된 경우, 그 후보물질을 암의 예방 또는 치료용 제제로 예측할 수 있다.The present invention can be useful for screening cancer therapeutic agents by comparing changes in the expression level of TAS2R10 in the presence and absence of cancer candidate agents. Specifically, the cancer screening method of the present invention comprises measuring the expression level of TAS2R10 in a sample in the absence of a candidate for cancer treatment, measuring the expression level of TAS2R10 in the presence of a candidate for cancer treatment, As a result, when the expression level of TAS2R10 in the presence of the candidate substance is increased above the expression level in the absence of the candidate substance, the candidate substance can be predicted as a prophylactic or therapeutic agent for cancer.
본 발명에서 사용되는 용어, "TAS2R10의 발현 수준"의 측정은 TAS2R10의 단백질의 발현 수준 또는 TAS2R10의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 방식으로 수행될 수 있다.The term " expression level of TAS2R10 " used in the present invention can be measured by measuring the expression level of the protein of TAS2R10 or the expression level of mRNA of TAS2R10.
구체적으로 TAS2R10의 단백질 발현 수준을 측정하는 것은, 예를 들어 TAS2R10 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 앱타머, 안타고니스트 또는 이들의 조합을 이용하여, 웨스턴 블랏팅, ELISA, 방사선면역분석법, 방사선면역확산법, 오우크테를로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트 면역전기영동, 면역조직화학염색, 면역침전분석, 보체고정분석, FACS, 단백질 칩 등의 분석법을 통해 수행될 수 있으나 이에 제한되지 않는다.Specifically, measuring the level of protein expression of TAS2R10 can be accomplished by Western blotting, ELISA, radioimmunoassay, radioimmunoassay, or immunoassay using, for example, antibodies, aptamers, antagonists or combinations thereof specifically binding to the TAS2R10 protein But are not limited to, Ouchterlony immunodiffusion, rocket immunoelectrophoresis, immunohistochemical staining, immunoprecipitation assays, complement fixation, FACS, protein chips, and the like.
또한, TAS2R10의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 것은, 예를 들어 TAS2R10의 mRNA에 특이적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴크레오티드, 프라이머 쌍, 프로브 또는 이들의 조합을 이용하여, 역전사 중합효소 연쇄반응, 경쟁적 역전사 중합효소 연쇄반응, 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응, RNasa 보호 분석법, 노던 블랏팅, DNA 마이크로어레이 칩 등의 분석법을 통해 수행될 수 있으나 이에 제한되지 않는다.In addition, measuring the level of expression of mRNA of TAS2R10 can be accomplished by using, for example, an antisense oligonucleotide that specifically binds to the mRNA of TAS2R10, a primer pair, a probe, or a combination thereof, But are not limited to, reverse transcription polymerase chain reaction, real-time reverse transcription polymerase chain reaction, RNase protection analysis, Northern blotting, DNA microarray chip, and the like.
본 발명은 인간 쓴맛 수용체 TAS2R10의 발현 수준을 측정하는 제제를 유효성분으로 포함하는 암의 진단 또는 예후 분석용 바이오마커 조성물을 제공한다.The present invention provides a biomarker composition for the diagnosis or prognosis analysis of cancer comprising as an active ingredient an agent for measuring the expression level of the human bitter receptor TAS2R10.
또한, 본 발명은 인간 쓴맛 수용체 TAS2R10의 발현 수준을 측정하는 제제를 유효성분으로 포함하는 암의 진단 또는 예후 분석용 키트를 제공한다.The present invention also provides a kit for the diagnosis or prognosis of cancer comprising as an active ingredient an agent for measuring the expression level of the human bitter receptor TAS2R10.
본 발명에서 사용되는 용어, "TAS2R10의 발현 수준을 측정하는 제제"는 TAS2R10의 단백질의 발현 수준 또는 TAS2R10의 mRNA의 발현 수준을 측정하는데 이용될 수 있는 모든 제제를 의미한다. 구체적으로 TAS2R10의 단백질 발현 수준을 측정하기 위한 제제로는 예를 들어 TAS2R10 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 앱타머, 안타고니스트 또는 이들의 조합일 수 있고, TAS2R10의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제로는 예를 들어 TAS2R10의 mRNA에 특이적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴크레오티드, 프라이머 쌍, 프로브 또는 이들의 조합일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.The term " agent for measuring the expression level of TAS2R10 " as used in the present invention means any agent that can be used to measure the expression level of the protein of TAS2R10 or the expression level of mRNA of TAS2R10. Specifically, the agent for measuring the protein expression level of TAS2R10 may be, for example, an antibody, an aptamer, an antagonist or a combination thereof that specifically binds to a TAS2R10 protein, and may be a preparation for measuring the expression level of mRNA of TAS2R10 May be, for example, but are not limited to, an antisense oligonucleotide, a primer pair, a probe, or a combination thereof that specifically binds to the mRNA of TAS2R10.
본 발명에서 사용되는 용어, "진단"은 일반적으로 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미하며, "예후"는 일반적으로 병세의 진행, 회복에 대한 예측을 의미한다.As used herein, the term " diagnosis " generally refers to identifying the presence or characteristic of a pathologic condition, and " prognosis " generally refers to prediction of disease progression and recovery.
본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용설명서를 추가로 포함할 수 있다. 상기 사용설명서는 예를 들어, 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 키트를 포함하는 패키지 표면상의 설명 등의 형태일 수 있으며, 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함할 수 있다.The kit of the present invention may further comprise instructions for describing optimal reaction performance conditions. The instructions may be in the form of, for example, a brochure or flyer-shaped brochure, a label attached to the kit, a description of the package surface including the kit, and may include information disclosed or provided via an electronic medium such as the Internet .
본 발명의 키트는 RT-PCR 키트, DNA 분석용(예를 들어, DNA 칩) 키트 또는 단백질 분석용(예를 들어, 단백질 칩) 키트일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.The kit of the present invention can be, but not limited to, an RT-PCR kit, a kit for DNA analysis (e.g., a DNA chip) or a kit for protein analysis (e.g., a protein chip).
구체적으로, 본 발명의 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. 예를 들어, RT-PCR 키트는 TAS2R10의 유전자에 대한 특이적인 프라이머 쌍, 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제, 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한 정량 대조군으로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다.Specifically, the kit of the present invention may be a kit containing essential elements necessary for performing RT-PCR. For example, RT-PCR kits can be used to screen primer pairs for TAS2R10 genes, test tubes or other appropriate containers, reaction buffers (varying in pH and magnesium concentration), deoxynucleotides (dNTPs), Taq polymerase, Enzymes such as reverse transcriptase, DNase, RNAse inhibitors, DEPC-water, sterile water, and the like. It may also contain a primer pair specific for the gene used as a quantitative control.
또한, 구체적으로 본 발명의 키트는 DNA 분석을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. DNA 분석 키트(DNA 칩 키트)는 일반적으로 편평한 고체 지지판, 전형적으로는 현미경용 슬라이드보다 크지 않은 유리 표면에 핵산 종을 격자형 배열(gridded array)로 부착한 것으로, 칩 표면에 핵산이 일정하게 배열되어, DNA 칩 상의 핵산과 칩 표면에 처리된 용액 내에 포함된 상보적인 핵산 간에 다중 혼성화(hybridization) 반응이 일어나 대량 병렬 분석이 가능하도록 하는 도구를 의미한다.In addition, specifically, the kit of the present invention may be a kit containing essential elements necessary for performing DNA analysis. The DNA assay kit (DNA chip kit) is typically a flat solid support plate, typically with a gridded array of nucleic acid species attached to a glass surface that is no larger than a microscope slide, , Which means a hybridization reaction between a nucleic acid on a DNA chip and a complementary nucleic acid contained in a solution treated on the surface of the chip to enable massive parallel analysis.
또한, 구체적으로 본 발명의 키트는 단백질 분석을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. 단백질 분석 키트(단백질 칩 키트)는 마커에 대한 하나 이상의 항체가 기판 위의 정해진 위치에 배열되어 고밀도로 고정화되어 있는 키트일 수 있다. 단백질 칩을 이용하는 방법은 시료에서 단백질을 분리하고, 분리한 단백질을 단백질 칩과 혼성화시켜서 항원-항체 복합체를 형성하고 이를 판독하는 방식으로 단백질의 존재 또는 발현 수준을 확인할 수 있다.In addition, specifically, the kit of the present invention may be a kit containing essential elements necessary for performing protein analysis. The protein assay kit (protein chip kit) may be a kit in which one or more antibodies against the marker are arranged at predetermined positions on the substrate and immobilized at a high density. The method of using a protein chip can detect the presence or the expression level of the protein by separating the protein from the sample and hybridizing the separated protein with the protein chip to form an antigen-antibody complex and reading the protein.
본 발명의 키트는 마커 성분에 특이적으로 결합하는 항체, 기질과의 반응에 의해서 발색하는 표지체가 접합된 2차 항체 접합체(conjugate), 상기 표지체와 발색 반응할 발색 기질 용액, 세척액 및 효소반응 정지용액 등을 포함할 수 있으며, 사용되는 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.The kit of the present invention comprises an antibody that specifically binds to a marker component, a secondary antibody conjugate conjugated with a marker that develops upon reaction with the substrate, a chromogenic substrate solution that reacts with the label, a wash solution and an enzyme reaction Stop solution, and the like, and may be made from a number of separate packaging or compartments, including the reagent components used.
상기 2차 항체 접합체의 표지체는 발색반응을 하는 통상의 발색제가 바람직하며, HRP(horseradish peroxidase), 염기성 탈인산화효소(alkaline phosphatase), 콜로이드 골드(coloid gold), FITC(poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate), RITC(rhodamine-B-isothiocyanate) 등의 형광물질(fluorescein), 및 색소(dye) 등이 사용될 수 있다.The marker of the secondary antibody conjugate is preferably a conventional coloring agent that undergoes a chromogenic reaction and is preferably selected from the group consisting of HRP (horseradish peroxidase), alkaline phosphatase, colloid gold, poly L-lysine-fluorescein fluorescein such as isothiocyanate and rhodamine-B-isothiocyanate, and dye may be used.
본 발명은 암이 의심되는 개체로부터 분리된 시료에서 인간 쓴맛 수용체 TAS2R10의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 암의 진단 또는 예후 분석에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.The present invention provides a method for providing information necessary for the diagnosis or prognosis analysis of cancer comprising the step of measuring the expression level of the human bitter receptor TAS2R10 in a sample separated from a subject suspected of having cancer.
본 발명은 암이 의심되는 개체로부터 분리된 시료에서 TAS2R10의 발현 수준을 측정하는 방법으로 암의 진단 또는 예후 분석에 필요한 정보를 제공하는데 유용하게 사용될 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 정보제공방법은 암이 의심되는 개체로부터 분리된 시료에서 TAS2R10의 발현 수준을 측정하고, 또한 정상 대조군의 TAS2R10의 발현 수준을 측정하여 양자를 비교한 결과, 암 의심 개체로부터 분리된 시료에서의 TAS2R10의 발현 수준이 정상 대조군에서보다 증가된 경우, 암으로 예측할 수 있다.The present invention can be used to provide information necessary for diagnosis or prognosis analysis of cancer by measuring the expression level of TAS2R10 in a sample isolated from a suspected individual. Specifically, the information providing method of the present invention measures the expression level of TAS2R10 in a sample isolated from a subject suspected of having cancer, and the expression level of TAS2R10 in a normal control group is measured. As a result, If the expression level of TAS2R10 in the sample is increased than in the normal control, it can be predicted as cancer.
본 발명에서 "개체"는 암이 발병되거나 발병될 수 있는 인간을 포함하는 포유동물일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.In the present invention, the term " individual " may be a mammal including, but not limited to, a human being who can develop or develop cancer.
본 발명에서 "암이 의심되는 개체로부터 분리된 시료"는 암이 의심되는 개체로부터 분리된 것으로서, TAS2R10의 단백질 또는 유전자를 포함하여 이의 발현 수분을 측정할 수 있는 모든 시료를 의미하며, 예를 들어 개체로부터 분리한 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수액, 소변 등일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.In the present invention, the term " a sample isolated from a suspected cancer " means all samples capable of measuring the expression moisture thereof, including proteins or genes of TAS2R10, isolated from suspected cancerous individuals, But are not limited to, tissue, cells, whole blood, serum, plasma, saliva, cerebrospinal fluid, urine, etc., separated from an individual.
본 발명의 인간 쓴맛 수용체 TAS2R10은 암세포의 암줄기세포성 및 자가 재생 능력을 효과적으로 억제하며, 종양 형성을 억제하고 암세포의 전이 및 침윤을 억제하는 효능이 탁월하여, 이의 발현을 촉진함으로써 암을 예방하고 치료하는 효과가 우수하다.The human bitter receptor TAS2R10 of the present invention effectively inhibits the cancer stem cell and self regenerating ability of cancer cells and inhibits tumor formation and inhibits the metastasis and infiltration of cancer cells and promotes the expression thereof, .
또한, 본 발명의 TAS2R10은 암세포의 발달 단계, 분화 정도에 따라 발현 수준이 변화되는 특성이 있어 암의 진단과 예후 분석에 효과적으로 이용될 수 있다.In addition, the expression level of TAS2R10 of the present invention is changed according to development stage and degree of differentiation of cancer cells, and thus it can be effectively used for diagnosis and prognosis of cancer.
도 1은 동물의 조직 및 암세포에서의 TAS2R10의 발현 수준을 측정한 그래프로서, (a)는 마우스의 혀 및 간 조직에서의 TAS2R10의 발현 수준을 측정한 그래프, (b)는 신경모세포종 세포주인 BE(2)C 및 SY5Y 세포에서의 TAS2R10의 발현 수준을 측정한 그래프이다.
도 2는 칼슘 이동 분석 그래프로서, (a)는 pcDNA+TAS2R10으로 형질 감염된 HEK293 세포에서의 칼슘 이동 분석 그래프, (b)는 BE(2)C 세포에서의 칼슘 이동 분석 그래프이다. 도면에서 lm1은 Ca2+-결합된 Fura-2 염료의 형광 데이터이고, lm2는 Ca2+-결합되지 않은 염료의 형광 데이터이다.
도 3은 BE(2)C 세포의 신경 돌기 신장 및 신경 분화 관련 표지자의 발현 수준을 측정한 그래프로서, (a)는 BE(2)C 세포에 올-트랜스 레티노산(RA)을 처리한 경우, (b)는 BE(2)C 세포를 pcDNA+TAS2R10으로 형질 감염시킨 경우의 신경 돌기 신장 사진 및 신경 분화 관련 표지자의 발현 수준 측정 그래프이다.
도 4는 BE(2)C 세포에서의 암줄기세포(CSC) 마커의 발현 수준을 측정한 그래프로서, (a)는 BE(2)C 세포에 RA를 처리한 경우의 CSC 마커 발현 수준을 측정한 그래프, (b)는 BE(2)C 세포를 pcDNA+TAS2R10으로 형질 감염시킨 경우의 CSC 마커 발현 수준을 측정한 그래프이며, (c)는 구 형성 분석에서 구를 형성한 BE(2)C 세포에서의 CSC 마커 및 TAS2R10의 발현 수준을 측정한 그래프이다.
도 5는 pcDNA+TAS2R10으로 형질 감염된 BE(2)C 세포의 집락 형성 분석 결과를 나타낸 사진 및 그래프이다.
도 6은 pcDNA+TAS2R10으로 형질 감염된 BE(2)C 세포의 구 형성 분석 결과를 나타낸 사진 및 그래프이다.
도 7은 pcDNA+TAS2R10으로 형질 감염된 BE(2)C 세포의 상처 치유 분석 결과를 나타낸 사진 및 그래프이다.
도 8은 pcDNA+TAS2R10으로 형질 감염된 BE(2)C 세포의 트랜스웰 침윤 분석 결과를 나타낸 사진 및 그래프이다.
도 9는 pcDNA+TAS2R10으로 형질 감염된 BE(2)C 세포의 젤라틴 자이모그라피 분석 결과를 나타낸 사진 및 그래프로서, (a)는 MMP-2의 활성을 측정한 사진, (b)는 MMP-2 및 MMP-9의 유전자 발현 수준을 측정한 그래프이다.
도 10은 pcDNA+TAS2R10으로 형질 감염된 BE(2)C 세포의 HIF-1a의 발현 수준을 확인하기 위한 웨스턴 블랏 분석을 수행한 사진 및 그래프로서, (a)는 HIF-1a의 발현 수준을 측정한 사진 및 그래프이고, (b)는 HIF-1a의 다운스트림 유전자인 VEGF 및 GLUT1의 발현 수준을 측정한 그래프이다.
(본 발명의 그래프의 유의성 표시는 다음을 의미한다: * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001)FIG. 1 is a graph showing the expression levels of TAS2R10 in animal tissues and cancer cells, wherein (a) is a graph showing the expression levels of TAS2R10 in tongue and liver tissues of a mouse, (b) (2) the expression level of TAS2R10 in C and SY5Y cells.
FIG. 2 is a graph of calcium migration analysis. FIG. 2 (a) is a graph of calcium mobilization analysis in HEK293 cells transfected with pcDNA + TAS2R10, and (b) is a graph of calcium migration analysis in BE (2) C cells. In the drawing lm1 is Ca 2+ - and fluorescence data in combination with Fura-2 dye, lm2 is Ca 2+ - a fluorescence data of the unbound dye.
FIG. 3 is a graph showing the expression levels of neurite outgrowth and neural differentiation-related markers of BE (2) C cells, wherein (a) shows the results of treatment of BE (2) C cells with all-trans retinoic acid (b) is a graph showing neurite outgrowth and neural differentiation-associated marker levels when BE (2) C cells were transfected with pcDNA + TAS2R10.
FIG. 4 is a graph showing the expression levels of CSC markers in BE (2) C cells. FIG. 4 (a) shows the levels of CSC marker expression when RA cells were treated with BE (B) is a graph showing CSC marker expression levels when BE (2) C cells were transfected with pcDNA + TAS2R10, (c) is a graph showing BE (2) C cells Lt; RTI ID = 0.0 > CSC < / RTI > marker and TAS2R10.
FIG. 5 is a photograph and a graph showing the results of colony formation analysis of BE (2) C cells transfected with pcDNA + TAS2R10.
6 is a photograph and a graph showing the result of spherical analysis of BE (2) C cells transfected with pcDNA + TAS2R10.
7 is a photograph and a graph showing the results of analysis of wound healing of BE (2) C cells transfected with pcDNA + TAS2R10.
8 is a photograph and a graph showing transwell infiltration analysis results of BE (2) C cells transfected with pcDNA + TAS2R10.
FIG. 9 is a photograph and a graph showing gelatin zymography analysis results of BE (2) C cells transfected with pcDNA + TAS2R10, wherein (a) is a photograph of the activity of MMP-2, And MMP-9 gene expression levels.
FIG. 10 is a photograph and a graph showing Western blot analysis for confirming the expression level of HIF-1a in BE (2) C cells transfected with pcDNA + TAS2R10, wherein (a) shows the expression level of HIF- (B) is a graph showing the expression levels of VEGF and GLUT1, downstream genes of HIF-1a.
(Significance sign of the graph of the present invention means: * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001)
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples. However, these examples are for illustrative purposes only, and the scope of the present invention is not limited to these examples.
통계 분석Statistical analysis
실시예의 모든 실험 결과는 최소 세 번의 독립적인 실험으로부터 평균±평균의 표준 오차(SEM)로 나타내었으며, GraphPad PRISM (GraphPad Software, SanDiego, CA, USA)을 사용하여 통계적 유의성 분석을 수행하였다. 쌍을 이루지 않은 양측 t- 테스트(unpaired two-tailed t-test)를 사용하여 두 군의 데이터를 비교 하였다. 종양 발병률을 비교하기 위해 Pearson의 Chi-suqare 검사를 수행하였다. 0.05 미만의 P 값은 통계적으로 유의하다고 간주하였다.All experimental results of the examples were expressed as mean ± standard error (SEM) from at least three independent experiments and statistical significance analysis was performed using GraphPad PRISM (GraphPad Software, San Diego, Calif., USA). Data were compared between the two groups using the unpaired two-tailed t- test. Pearson's Chi-suqare test was performed to compare tumor incidence. P values less than 0.05 were considered statistically significant.
실시예Example 1: 세포 배양 1: Cell culture
2개의 인간 신경모세포종(Neuroblastoma; NB) 세포주인 SK-N-BE(2)C (BE(2)C) 및 SH-SY5Y (SY5Y)는 American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA)으로부터 구입하였다. 인간 배아 신장 세포주인 HEK293은 서울대학교의 박태현 박사로부터 얻었다.SK-N-BE (2) C (BE (2) C) and SH-SY5Y (SY5Y), two human neuroblastoma (NB) cell lines, were obtained from the American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, Respectively. Human embryonic kidney cell line, HEK293, was obtained from Dr. Park Tae-hyun of Seoul National University.
BE(2)C 세포 및 SY5Y 세포는 MEM (Minimum Essential Medium)과 Ham 's F-12 (Welgene, Daegu, Korea)의 1:1 혼합 배지에서 배양하였다. HEK293 세포는 MEM과 고-포도당 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium; Welgene)의 1:1 혼합 배지에서 배양하였다.BE (2) C cells and SY5Y cells were cultured in a 1: 1 mixed medium of MEM (Minimum Essential Medium) and Ham's F-12 (Welgene, Daegu, Korea). HEK293 cells were cultured in a 1: 1 mixed medium of MEM and high-glucose DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium; Welgene).
모든 배지에 10% 소 태아 혈청(FBS, Hyclone, Logan, UT, USA)과 1% 페니실린(100U/mL) 및 100μg/mL 스트렙토마이신(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 보충하였다. 저산소 조건을 유도하기 위해 pH 7.4의 표준 성장 배지에 1mM sodium pyruvate (Junsei Chemical, Tokyo, Japan)와 25mM HEPES (Biosesang, Seongnam, Korea)를 첨가하였다. 세포 배양은 5% CO2 및 37℃ 조건의 배양기에서 유지하였다.All media were supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS, Hyclone, Logan, UT, USA), 1% penicillin (100 U / mL) and 100 μg / mL streptomycin (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). To induce hypoxic conditions, 1 mM sodium pyruvate (Junsei Chemical, Tokyo, Japan) and 25 mM HEPES (Biosesang, Seongnam, Korea) were added to a pH 7.4 standard growth medium. Cell culture was maintained in a 5% CO 2 and 37 ° C incubator.
올-트랜스 레티노산(all-trans-retinoic acid, RA)과 염화 코발트(II)육수화물(CoCl2·6H2O)은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. RA (1μM)를 사용하여 NB 세포의 신경 분화를 유도하였고, CoCl2 ·6H2O (100μM)를 사용하여 21% O2에서 저산소 상태처럼 만들었다. 상기 시약들은 어두운 조명 아래에서 각 분석을 수행하기 바로 직전에 세포 배양 배지에 첨가하였다. 칼슘 이동 분석(calcium mobilization assay)에서 TAS2R10을 활성화시키기 위해 데나토늄 벤조에이트(denatonium benzoate, Sigma-Aldrich)를 사용하였다.All-trans retinoic acid (all- trans -retinoic acid, RA) and cobalt chloride (II) hexahydrate (CoCl 2 · 6H 2 O) was purchased from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO , USA). RA (1 μM) was used to induce neural differentiation of NB cells and was made to be hypoxic at 21% O 2 using CoCl 2 · 6H 2 O (100 μM). The reagents were added to the cell culture medium immediately before each assay was performed under dark illumination. Denatonium benzoate (Sigma-Aldrich) was used to activate TAS2R10 in a calcium mobilization assay.
실시예Example 2: 2: TAS2R10TAS2R10 플라스미드 벡터의 제조 및 형질 감염 Preparation of plasmid vectors and transfection
pcDNA3+TAS2R10은 서울대학고 박태현 박사로부터 얻었다. 간략하게, TAS2R10에 대한 cDNA PCR 산물을 TAS2R10에 대한 제한효소로서 EcoRI 및 XhoI를 이용하여 분해하였다(Takara Bio, Mountain View, CA, USA). FLAG-표지된 pcDNA3 벡터를 TAS2R10에 대한 제한효소로서 EcoRI 및 XhoI를 이용하여 분해하였다.pcDNA3 + TAS2R10 was obtained from Dr. Park Tae-hyun of Seoul National University. Briefly, cDNA PCR products for TAS2R10 were digested with EcoRI and XhoI as restriction enzymes for TAS2R10 (Takara Bio, Mountain View, CA, USA). The FLAG-tagged pcDNA3 vector was digested with EcoRI and XhoI as restriction enzymes for TAS2R10.
분해된 PCR 산물을 전기영동으로 분리하고 pcDNA3 벡터에 결합시키기 위해 아가로스겔로부터 추출 및 정제하였다. 이들 재조합 플라스미드는 dh5-α 대장균 수용세포(competent cells)를 형질전환시켜 증폭하였다. 앰피실린 (Amresco, Solon, OH, USA)이 보충된 고체 LB 배지(BD Bioscience, San Jose, CA, USA)에서 형질전환된 세포를 선별한 후, 플라스미드 DNA를 시퀀싱을 위해 콜로니의 일부로부터 회수하였다.The digested PCR products were separated by electrophoresis and extracted and purified from agarose gels for binding to pcDNA3 vector. These recombinant plasmids were amplified by transforming dh5-α competent cells. Plasmid DNA was recovered from a portion of the colonies for sequencing after transformed cells were picked in solid LB medium supplemented with ampicillin (Amresco, Solon, OH, USA) (BD Bioscience, San Jose, Calif., USA) .
BE(2)C 세포를 6-웰 플레이트에 분주하고, 세포 밀집도가 70%~80%에 도달할 때까지 48시간 동안 pcDNA3(빈 벡터; EV) 및 pcDNA3+TAS2R10 재조합 플라스미드로 형질 감염시켰다.BE (2) C cells were plated into 6-well plates and transfected with pcDNA3 (empty vector; EV) and pcDNA3 + TAS2R10 recombinant plasmids for 48 hours until cell density reached 70% to 80%.
실시예Example 3: 정량적 실시간 3: Quantitative real time PCRPCR 분석 analysis
본 발명의 실시예들에서 수행되는 PCR 분석은 하기의 방식으로 수행하였다.PCR analysis performed in the examples of the present invention was performed in the following manner.
TRizol 시약(Invitrogen)을 사용하여 RNA를 분리하고 RevertAid 역전사 효소(Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)를 이용한 역전사에 의해 첫 번째 가닥 cDNA를 합성하였다. cDNA 샘플을 2X SYBR Green PCR Master Mix (Qiagen)와 결합시키고, 다음과 같은 조건에서 Rotor-Gene Q (Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 정량적 실시간 PCR을 수행하였다 : 95℃에서 개시(5분), 95℃에서 변성(15초), 60℃에서 어닐링 및 신장 (10초).RNA was isolated using TRizol reagent (Invitrogen) and the first strand cDNA was synthesized by reverse transcription using RevertAid reverse transcriptase (Thermo Scientific, Waltham, Mass., USA). cDNA samples were combined with 2X SYBR Green PCR Master Mix (Qiagen) and quantitative real time PCR was performed using Rotor-Gene Q (Qiagen, Hilden, Germany) under the following conditions: start at 95 ° C (5 min) , Denaturation at 95 캜 (15 sec), annealing at 60 캜 and elongation (10 sec).
PCR에서 사용된 프라이머 서열은 하기 표 1과 같으며, 내부 대조군으로서 GAPDH를 측정하여 모든 qRT-PCR 데이터를 일반화시켰다.The primer sequences used in PCR are shown in Table 1 below, and GAPDH was measured as an internal control to generalize all qRT-PCR data.
실시예Example 4: 4: 웨스턴Western 블랏Blat 분석 analysis
본 발명의 실시예들에서 수행되는 웨스턴 블랏 분석은 하기의 방식으로 수행하였다.Western blot analysis performed in embodiments of the present invention was performed in the following manner.
웨스턴 블랏 분석은 종래 알려진 방식대로 수행하였다(Lim JY 외, Biochem Biophys Res Commun. 2014;450(4):1475-1480). 간략하게, 세포 단백질 추출물을 RIPA 용해 버퍼로 수집하고, 동량의 각 추출물 샘플을 8% 또는 10% 소듐 도데실 설페이트(SDS) 폴리아크릴아마이드 겔에서 분리하였다. 상기 샘플을 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF) 막(Millipore, Billerica, MA, USA)에 옮긴 후, 이를 Tris-buffered saline/Tween 20 (TBS-T)에서 5% 소 혈청 알부민(BSA) 또는 탈지유로 블로킹하였다.Western blot analysis was performed in a manner known per se (Lim JY et al., Biochem Biophys Res Commun. 2014; 450 (4): 1475-1480). Briefly, cell protein extracts were collected in RIPA lysis buffer and an equal volume of each extract sample was separated in 8% or 10% sodium dodecyl sulfate (SDS) polyacrylamide gels. After transferring the sample to a polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane (Millipore, Billerica, MA, USA), it was resuspended in 5% bovine serum albumin (BSA) or skimmed milk in Tris- buffered saline /
상기 블로킹된 막을 Flag(DYKDDDK)tag, 포스포-ERK, 총 ERK (Cell Signaling, Danvers, MA, USA), β-튜불린 III (Sigma-Aldrich), HIF-1α (Novus Biologicals, Littleton, CO, USA) 및 α-튜불린 (Sigma-Aldrich)을 인식하는 1차 항체와 함께 4℃에서 밤새 배양하였다. 막을 여러 번 세척한 다음, 항-마우스 또는 항-토끼 2차 항체(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)를 적절하게 첨가하였다. 1시간 후, 결합된 항체를 시각화하기 위해 ECL 검출 시스템을 이용 하였다.The blocked membrane was labeled with a Flag (DYKDDDK) tag, a phospho-ERK, total ERK (Cell Signaling, Danvers, MA, USA),? -Tubulin III (Sigma-Aldrich), HIF- USA) and α-tubulin (Sigma-Aldrich) at 4 ° C overnight. Membranes were washed several times and then anti-mouse or anti-rabbit secondary antibody (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, Calif., USA) was added as appropriate. One hour later, an ECL detection system was used to visualize the bound antibody.
실시예Example 5: 칼슘 이동 분석을 통한 5: Calcium migration analysis TAS2R10의TAS2R10's 기능적 발현 확인 Functional expression confirmation
실시예Example 5-1: 동물의 혀 및 간 조직 실험 5-1: Experiments on tongue and liver tissue of animals
5주령의 수컷 C57BL/6 마우스(Central Lab Animal Inc, Seoul, Korea)를 이용하여 마우스 조직 실험을 수행하였다. 마우스의 혀와 간 조직을 추출하여 mRNA를 분리하였다. 마우스 TAS2R108(인간 TAS2R10) mRNA의 발현 수준을 혀 및 간 조직 모두에서 분석하였으며, 로딩 대조군으로 GAPDH를 사용하였다. 또한, 실시예 1에서 배양한 두 가지 NB 세포주인 BE(2)C 세포 및 SY5Y 세포에서의 TAS2R10의 mRNA 발현 수준을 분석하였다.Mouse tissue experiments were performed using 5-week-old male C57BL / 6 mice (Central Lab Animal Inc, Seoul, Korea). Mice were isolated by extracting mouse tongue and liver tissue. Expression levels of mouse TAS2R108 (human TAS2R10) mRNA were analyzed in both tongue and liver tissues and GAPDH was used as a loading control. In addition, mRNA expression levels of TAS2R10 in BE (2) C cells and SY5Y cells, which were two NB cell lines cultured in Example 1, were analyzed.
상기 실험 결과, TAS2R10의 발현 수준은 간 조직에서보다 혀 조직에서 훨씬 더 높은 것으로 확인되었다(도 1a). 아울러, TAS2R10은 2개의 NB 세포주인 BE(2)C 및 SY5Y에서 높은 수준으로 발현되었으며, 특히 TAS2R10은 더 분화된 N형 세포주인 SY5Y 세포와 비교하여, 보다 악성이고 덜 분화된 I형 세포주인 BE(2)C 세포에서 유의하게 낮은 수준으로 발현되었다(도 1b). 이러한 결과로부터 TAS2R10의 발현 수준이 세포의 분화 상태에 의존적임을 확인할 수 있었다.As a result of the experiment, it was confirmed that the expression level of TAS2R10 was much higher in tongue tissues than in liver tissues (Fig. 1A). In addition, TAS2R10 was expressed at high levels in two NB cell lines, BE (2) C and SY5Y. Especially, TAS2R10 was shown to be a more malignant and less differentiated type I cell line BE (2) significantly lower levels in C cells (FIG. 1b). From these results, it was confirmed that the expression level of TAS2R10 is dependent on the differentiation state of the cells.
실시예Example 5-2: 칼슘 이동 분석( 5-2: Calcium migration analysis CalciumCalcium mobilizationmobilization assayassay ))
HEK293 세포에서 TAS2R10의 이소성 발현 및 BE(2)C 세포에서의 TAS2R10의 내인성 발현이 기능적인지를 평가하기 위하여, 다음과 같은 방법으로 칼슘 이동 분석을 수행하였다.In order to evaluate the functional expression of TAS2R10 ectopic expression in HEK293 cells and endogenous expression of TAS2R10 in BE (2) C cells, calcium migration assay was performed as follows.
Fura-2 QBTTM칼슘 키트(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 제조사의 지시에 따라 사용하였다. 간략하게, HEK293 세포(8x104) 및 BE(2)C 세포 (5x104)를 96-웰 투명 바닥 블랙 플레이트(Corning Inc., Corning, NY, USA)에 분주하였다. 다음날, 상기 HEK293 세포와 BE(2)C 세포를 pcDNA+TAS2R10으로 형질 감염시키고 48시간 동안 유지하였다. 각 세포주에서 각 수용체의 활성화를 측정하기 위하여 쓴 맛 수용체의 일반적인 작용제인 데나토늄 벤조에이트(denatonium benzoate)를 사용하였으며, 수용체의 활성화는 상기 데나토늄 벤조에이트의 적용 직후, 형광 강도의 비율을 측정하여 검출하였다. 신호는 Ca2+-결합된 Fura-2 염료에 대해서는 340nm, Ca2+-비결합된 염료에 대해서는 380nm의 자극 후에, 510nm에서 Flex Station III 형광 플레이트 판독기(Molecular Devices)를 사용하여 측정하였다.Fura-2 QBT TM calcium kit (Molecular Devices, Sunnyvale, Calif., USA) was used according to the manufacturer's instructions. Briefly, HEK293 cells (8 × 10 4 ) and BE (2) C cells (5 × 10 4 ) were dispensed into 96-well clear bottom black plates (Corning Inc., Corning, NY, USA). The next day, the HEK293 cells and BE (2) C cells were transfected with pcDNA + TAS2R10 and maintained for 48 hours. In order to measure the activation of each receptor in each cell line, denatonium benzoate, a common agent of bitter taste receptors, was used. Activation of the receptor was measured immediately after the application of the denatonium benzoate, Respectively. Signals were measured using a Flex Station III fluorescent plate reader (Molecular Devices) at 510 nm after stimulation at 340 nm for Ca 2+ -bonded Fura-2 dye and 380 nm for Ca 2+ -bonded dye.
상기 실험 결과, BE(2)C세포와 TAS2R10 형질감염된 HEK293 세포에서 칼슘 이동이 검출되었다(도 2a, 2b). 칼슘 이동 정도는 다양하였으나, TAS2R10 활성화가 일어나고 칼슘이 세포내로 방출되는 시점에서 이동 패턴이 유사하였다. 이러한 결과를 바탕으로, 외인성 및 내인성으로 발현된 TAS2R10가 기능적으로 발현되는 것으로 확인되었다.As a result of the experiment, calcium migration was detected in BE (2) C cells and TAS2R10 transfected HEK293 cells (Figs. 2a and 2b). The degree of calcium mobilization varied, but the migration pattern was similar at the time of TAS2R10 activation and release of calcium into the cells. Based on these results, it was confirmed that TAS2R10 expressed exogenously and endogenously was functionally expressed.
실시예Example 6: 신경분화 유도 및 6: induction of neural differentiation and 암줄기세포성Cancer stem cell 억제에 대한 For inhibition TAS2R10의TAS2R10's 효능 efficacy
실시예Example 6-1: 신경세포 분화 6-1: Neuronal differentiation
TAS2R10의 발현이 신경세포 분화에 영향을 받는지 검사하기 위해, BE(2)C 세포를 5일 동안 RA (1μM)로 처리하였다. 처리 결과, 신경 돌기 신장이 관찰되었으며, 신경 분화 관련 표지자인 β-튜불린 III 및 포스포-ERK의 발현이 상향 조절되는 것으로 확인되었다(도 3a). 이와 유사하게, BE(2)C 세포에서 TAS2R10의 과발현 후, 신경 돌기의 신장이 관찰되었고 β-튜불린 III 및 포스포-ERK1/2의 발현 수준이 유의하게 증가되었다(도 3b). 이는 TAS2R10의 과발현이 신경세포 분화를 유도함을 확인할 수 있었다.To test whether expression of TAS2R10 is affected by neuronal differentiation, BE (2) C cells were treated with RA (1 μM) for 5 days. As a result of treatment, neurite outgrowth was observed and it was confirmed that the expression of beta -tubulin III and phospho-ERK, which are neural differentiation-related markers, was upregulated (FIG. Similarly, after overexpression of TAS2R10 in BE (2) C cells, neurite outgrowth was observed and expression levels of p-tubulin III and phospho-ERK1 / 2 were significantly increased (Fig. 3B). It was confirmed that overexpression of TAS2R10 induces neuronal differentiation.
실시예Example 6-2: 6-2: 암줄기세포Cancer stem cell 마커의Marker 발현 Expression
대표적인 암줄기세포(cancer stem cell; CSC) 마커의 발현에 대한 TAS2R10의 영향을 확인하기 위하여, BE(2)C 세포에 RA를 처리한 결과, DLK1, CD133, Notch1 및 Sox2의 발현은 유의하게 하향 조절된 반면, TAS2R10의 발현 수준은 상향 조절된 것으로 확인되었다(도 4a). 또한, 상기 TAS2R10가 BE(2)C 세포에서 과발현되었을 때, 몇 가지 대표적인 암줄기세포 마커 역시 유의하게 하향 조절되었다(도 4b). 이는 TAS2R10의 과발현이 CSC 마커의 발현을 억제함을 입증하는 것이다.In order to examine the effect of TAS2R10 on the expression of representative cancer stem cell (CSC) markers, the expression of DLK1, CD133, Notch1 and Sox2 was significantly downregulated in BE (2) C cells treated with RA While the expression level of TAS2R10 was confirmed to be up-regulated (Fig. 4A). In addition, when the TAS2R10 was overexpressed in BE (2) C cells, several representative stem cell markers were also significantly down regulated (Fig. 4B). This demonstrates that overexpression of TAS2R10 inhibits the expression of CSC markers.
실시예Example 6-3: 구 형성 분석( 6-3: Sphere formation analysis ( SphereSphere formationformation assayassay ))
구 형성을 촉진하기 위해 1.2% poly-HEMA (Sigma-Aldrich)로 미리 코팅한 세포 배양 플레이트에 BE(2)C 세포(3x104/well)를 접종하고, 20ng/mL의 표피 성장 인자(EGF; PepTech, Rocky Hill, NJ, USA), 40ng/mL의 섬유아세포 성장 인자(FGF, PeproTech), 2% B-27 (Invitrogen), 1 % BSA (Rdtech Technology) 및 2% 페니실린-스트렙토 마이신(Invitrogen)을 첨가한 DMEM 및 F-12(Welgene)의 1:1 혼합 배지에 유지하였다. 다음날 세포를 실시예 2에서 제조한 각 플라스미드로 형질 감염시켰다. 48시간 후, 상기 세포를 10일~14일 동안 추가로 배양하고 50개 이상의 세포를 함유하는 구의 수를 세고 사진 촬영을 하였다(Nikon Instruments Co. Ltd, Tokyo, Japan).BE (2) C cells (3x10 4 / well) were inoculated on a cell culture plate previously coated with 1.2% poly-HEMA (Sigma-Aldrich) 2% B-27 (Invitrogen), 1% BSA (Rdtech Technology) and 2% penicillin-streptomycin (Invitrogen) (DMEM) and F-12 (Welgene). The following day, the cells were transfected with each plasmid prepared in Example 2. After 48 hours, the cells were further cultured for 10 days to 14 days, and the number of spheres containing 50 or more cells was counted and photographed (Nikon Instruments Co. Ltd., Tokyo, Japan).
상기 실험 결과, 형성된 구에서 TAS2R10의 유전자 발현이 유의적으로 하향 조절되는 것으로 확인되었다(도 4c). 이는 TAS2R10의 과발현이 CSC 마커의 발현을 억제함을 입증하는 것이다.As a result of the above experiment, it was confirmed that gene expression of TAS2R10 was significantly down-regulated in the formed sperm (Fig. 4C). This demonstrates that overexpression of TAS2R10 inhibits the expression of CSC markers.
실시예Example 7: 암세포의 자가 재생 능력 억제에 대한 7: To inhibit the self-renewal ability of cancer cells TAS2R10의TAS2R10's 효능 efficacy
자가 재생 능력(self-renewal capacity)은 CSC의 특성 중 하나이며, 암줄기세포의 생리학적 효과를 나타내는 것으로 알려져 있다. TAS2R10의 이소성 과발현에 따른 암세포의 자가 재생 능력을 측정하기 위하여 실시예 6-3과 같은 방법으로 구 형성 분석을 수행하였으며, 또한 다음과 같은 방법으로 집락 형성 분석을 수행하였다.Self-renewal capacity is one of the characteristics of CSC and is known to exhibit physiological effects of cancer stem cells. In order to measure the self regenerating ability of cancer cells according to the overexpression of TAS2R10, spherical shape analysis was performed in the same manner as in Example 6-3, and colony formation analysis was performed by the following method.
집락 형성 분석(Clonogenic assay)은 종래 알려진 방식대로 수행하였다(Lee HA 외, Oncol Rep. 2013;30(4):1869-1877). 간략하게, BE(2)C 세포(800 cell/웰)를 6-웰 플레이트에 도말하였다. 다음 날, 상기 세포를 각각 pcDNA(빈 벡터; EV) 및 pcDNA+TAS2R10을 이용하여 제조사의 지시에 따라 형질 감염시켰다. 48시간 후, 형질 감염된 세포를 7일~10일 동안 추가로 유지하였다. 그 다음, 콜로니를 크리스탈 바이올렛(Sigma-Aldrich)으로 염색하였다. 플레이팅 효율(PE, %)은 다음과 같이 계산하였다: 염색된 콜로니의 수/분주된 세포의 수×100%.Clonogenic assays were performed in a manner known per se (Lee HA et al., Oncol Rep. 2013; 30 (4): 1869-1877). Briefly, BE (2) C cells (800 cells / well) were plated on 6-well plates. On the next day, the cells were transfected with pcDNA (empty vector; EV) and pcDNA + TAS2R10 according to the manufacturer's instructions. After 48 hours, transfected cells were maintained for additional 7 days to 10 days. The colonies were then stained with crystal violet (Sigma-Aldrich). Plating efficiency (PE,%) was calculated as follows: number of stained colonies / number of cells divided x 100%.
상기 실험 결과, 집락 형성(도 5) 및 구 형성(도 6) 모두 유의하게 억제된 것으로 확인되었다. 이는 TAS2R10이 암세포의 자가 재생 잠재력을 억제하고 암줄기 유사 세포를 제거하는데 중요한 역할을 한다는 것을 입증하는 것이다.As a result of the above experiment, it was confirmed that colony formation (Fig. 5) and sphere formation (Fig. 6) were significantly inhibited. This demonstrates that TAS2R10 plays an important role in inhibiting the self-renewal potential of cancer cells and eliminating cancer stem-like cells.
실시예Example 8: 이종이식 모델에서의 8: In the xenotransplantation model 종양형성Tumor formation 억제에 대한 For inhibition TAS2R10의TAS2R10's 효능 efficacy
BE(2)C 세포를 pcDNA3(빈 벡터; EV) 및 pcDNA3+TAS2R10 플라스미드로 형질 감염시켰다. 48시간 후, 배지를 G418 (Invitrogen)을 함유하는 성장 배지로 교체하였다. 2주 후, 안정하게 확립된 하나의 세포주를 선택하여 면역 결핍된 5 주령의 수컷 BALB/c 누드 마우스(Central Lab Animal Inc, Seoul, Korea)의 옆구리에 피하 주사하였다(4x105cells/injection).BE (2) C cells were transfected with pcDNA3 (empty vector; EV) and pcDNA3 + TAS2R10 plasmid. After 48 hours, the medium was replaced with growth medium containing G418 (Invitrogen). Two weeks later, one cell line that was stably established was selected and subcutaneously injected (4x10 5 cells / injection) into the side of immunocompetent, 5-week-old male BALB / c nude mice (Central Lab Animal Inc, Seoul, Korea).
종양이 확립된 후, 종양 크기를 디지털 캘리퍼스를 사용하여 일주일에 두 번 모니터 하였다. 종양 부피는 길이(mm)x폭2(mm2)x0.5로 계산하였다. 본 실험을 위한 동물보호 및 실험 프로토콜은 이화여자대학교 동물관리 및 사용위원회의 승인을 받아 수행하였다(IACUC 승인 번호: 16-046).After tumors were established, tumor size was monitored twice a week using a digital caliper. Tumor volume was calculated as length (mm) x width 2 (mm 2 ) x 0.5. Animal protection and experimental protocols for this experiment were carried out with the approval of Ewha Womans University Animal Care and Use Committee (IACUC approval number: 16-046).
상기 실험 결과, 하기 표 1에 나타낸 바와 같이, 마우스의 희생의 시점에서, 10마리의 EV 대조군 마우스 중 10마리에서 종양이 발생된 반면, 10마리의 TAS2R10 마우스 중 7마리에서 종양이 발생되었다. 이로써 TAS2R10의 과발현이 대조군 EV군에 비해 종양 발생을 30% 수준으로 억제한다는 것을 확인할 수 있었다.As a result of the above experiment, tumors were generated in 10 out of 10 EV control mice at the time of sacrifice of mice, while 7 out of 10 TAS2R10 mice developed tumors, as shown in the following Table 1. Thus, it was confirmed that the overexpression of TAS2R10 inhibited the tumor development to 30% as compared with the control EV group.
[표 1][Table 1]
(표 1의 데이터에 있어서, 실험군들 간의 종양 발생 비교는 chi-square test(P<0.05)를 이용해 수행하였다. 최종 종양 부피 및 무게는 평균±SEM으로 나타내었다. 빈 벡터 대조군(EV)과의 비교를 위하여 쌍을 이루지 않은 양측 t- 테스트(unpaired two-tailed t-test)를 수행하였다.)(In the data in Table 1, comparison of tumor incidence among the experimental groups was performed using the chi-square test (P <0.05) .The final tumor volume and weight were expressed as mean ± SEM. Unpaired two-tailed t- test was performed for comparison.
실시예Example 9: 암세포 전이 및 침윤 억제에 대한 9: For cancer cell metastasis and invasion inhibition TAS2R10의TAS2R10's 효능 efficacy
실시예Example 9-1: 상처 치유 분석( 9-1: Wound healing analysis WoundWound -- healinghealing assayassay ))
세포 이동을 조사하기 위해, 종래 알려진 방식대로 상처 치유 분석을 수행하였다(Park S 외, Biosci Biotechnol Biochem. 2013;77(4):722-728). 간략히, BE(2)C 세포를 밀집도가 80%~90%가 될 때까지 단층으로 6-웰 플레이트에 성장시켰다. 그 다음, 멸균 된 200μL 피펫 팁으로 각 단층을 긁어 각각 폭 약 1mm의 줄을 4~6줄 형성하였다. 이탈된 세포를 새로운 배지로 세척하여 제거하고, 나머지 세포를 pcDNA3(빈 벡터; EV) 및 pcDNA3+TAS2R10으로 형질감염시켰다. 24시간 및 48시간 후에 세포 이동을 촬영하여 세포가 이동한 거리를 측정하였다.To investigate cell migration, wound healing assays were performed in a manner known per se (Park S et al., Biosci Biotechnol Biochem. 2013; 77 (4): 722-728). Briefly, BE (2) C cells were grown in 6-well plates as monolayers until the density reached 80% to 90%. Then, each monolayer was scratched with a sterile 200 μL pipette tip to form 4 to 6 lines of about 1 mm wide each. The dislodged cells were washed away with fresh medium, and the remaining cells were transfected with pcDNA3 (empty vector; EV) and pcDNA3 + TAS2R10. After 24 hours and 48 hours, cell migration was photographed and the distance traveled by the cells was measured.
상기 실험 결과, EV 대조군과 비교하여, TAS2R10으로 형질 감염된 BE(2)C 세포 모두 약 30% 정도 느린 속도로 세포 이동이 이루어진 것으로 확인되었다(도 7).As a result of the above experiment, it was confirmed that cell migration was performed at a slow rate of about 30% in all TAS2R10-transfected BE (2) C cells as compared with the EV control (Fig. 7).
실시예Example 9-2: 9-2: 트랜스웰Transwell 침윤 분석( Infiltration analysis TranswellTranswell invasioninvasion assayassay ))
종래 알려진 방식대로 24웰 마트리겔 침윤 챔버(Becton Dickinson, Bedford, MA, USA)를 이용한 트랜스웰 침윤 분석을 통해 세포 침윤 정도를 검사하였다(Park S 외, Biosci Biotechnol Biochem. 2013;77(4):722-728). 간략히, 3x105 BE(2)C 세포를 무혈청 배지를 포함하는 재수화(rehydration)된 상부 웰에 분주하고, 하부 챔버는 5% FBS를 함유하는 성장 배지로 채웠다. 그 다음, 상부 웰에 분주한 세포를 실시예 2에서 제조한 각 플라스미드로 형질 감염시켰다. 48시간 후, 상부 웰의 멤브레인 공극을 통과하지 못한 세포는 면봉으로 조심스럽게 제거하고, 하부 웰에 위치한 세포는 메탄올로 고정시킨 후, 크리스탈 바이올렛(Sigma-Aldrich)으로 염색 하였다. 각 웰에 대해 무작위로 선택한 5개의 필드에서 침윤된 세포의 수를 측정하였다. (Park S et al., Biosci Biotechnol Biochem. 2013; 77 (4): 1977), the extent of cellular invasion was examined by transwell infiltration analysis using a 24 well Matrigel infiltration chamber (Becton Dickinson, Bedford, Mass., USA) 722-728). Dispensing a brief, 3x10 5 BE (2) C cells, the rehydration of the upper well (rehydration) containing serum-free medium, and the lower chamber is filled with a growth medium containing 5% FBS. Cells that were then dispensed into the upper wells were then transfected with each plasmid prepared in Example 2. After 48 hours, the cells that did not pass through the membrane pores of the upper well were carefully removed with a swab and the cells located in the lower well were fixed with methanol and stained with crystal violet (Sigma-Aldrich). The number of infiltrated cells was determined in five fields randomly selected for each well.
상기 실험 결과, TAS2R10의 침윤성 잠재력은 EV 대조군에 비해 유의하게 감소된 것으로 확인되었다(도 8). 이를 통해, TAS2R10의 과발현이 암세포의 이동 및 침윤 능력을 억제함으로써 BE(2)C 세포의 전이 가능성을 억제함을 확인할 수 있었다.As a result of the above experiment, it was confirmed that the invasive potential of TAS2R10 was significantly reduced as compared with the EV control (Fig. 8). Thus, it was confirmed that the overexpression of TAS2R10 suppresses the ability of BE (2) C cells to migrate by inhibiting the migration and invasion ability of cancer cells.
실시예Example 9-3: 젤라틴 9-3: Gelatin 자이모그라피Zymography 분석( analysis( GelatinGelatin zymographyzymography assayassay ))
MMP는 ECM의 거대 분자를 분해하여 암세포의 이동과 침윤을 촉진하는 것으로 알려져 있다. MMP-2의 효소 활성을 분석하기 위하여, 종래 알려진 방식대로 젤라틴 자이모그라피 분석을 수행하였다(Park S 외, Biosci Biotechnol Biochem. 2013;77(4):722-728). 간략하게, BE(2)C 세포를 무혈청 배지에서 성장시키고 실시예 2에서 제조한 각 플라스미드로 형질 감염시켰다. 48시간 후, 각 배지를 수집하고 0.1mg/mL 젤라틴을 함유하는 10% SDS-PAGE 겔에서 분리하였다. 전기영동은 4℃에서 수행되었다.MMP is known to degrade ECM macromolecules to promote the migration and invasion of cancer cells. In order to analyze the enzymatic activity of MMP-2, gelatin zymography analysis was performed according to a conventionally known method (Park S et al., Biosci Biotechnol Biochem. 2013; 77 (4): 722-728). Briefly, BE (2) C cells were grown in serum-free medium and transfected with each plasmid prepared in Example 2. After 48 hours, each medium was collected and separated on a 10% SDS-PAGE gel containing 0.1 mg / mL gelatin. Electrophoresis was performed at 4 캜.
그 다음, 상기 겔을 2.5% Triton X-100 변성 버퍼로 세척하여 SDS를 제거하고, 50mM Tris-Cl (pH 7.5), 10mM CaCl2,15mM NaCl, 및 0.2mM ZnCl2를 함유하는 반응 버퍼에서 37℃에서 밤새 배양하였다. 상기 겔을 실온에서 진탕기로 1시간 동안 0.5% 쿠마시 브릴리언트 블루 R-250 (Amresco, Solon, OH, USA)로 염색한 후, 탈염 용액[MeOH:H2O:아세트산(40:50:10)]을 사용하여 MMP-2의 투명한 밴드가 보일 때까지 씻어내었다.The gel was then washed with 2.5% Triton X-100 denaturing buffer to remove SDS and incubated in a reaction buffer containing 50 mM Tris-Cl (pH 7.5), 10 mM CaCl 2 , 15 mM NaCl, and 0.2 mM ZnCl 2 ≪ / RTI > overnight. The gel was stained with 0.5% Coomassie Brilliant Blue R-250 (Amresco, Solon, OH, USA) for 1 hour at room temperature with a shaker, and then washed with a desalting solution [MeOH: H 2 O: acetic acid (40:50:10) ] Until the transparent band of MMP-2 was visible.
상기 실험 결과, TAS2R10의 과발현에 따라 MMP-2의 활성뿐만 아니라, MMP-2 및 MMP-9의 발현 역시 감소하는 것으로 확인되었다(도 9a, 9b). 이를 통해, TAS2R10 의 과발현은 MMP의 활성 및 발현을 억제함으로써 전이 잠재성을 억제함을 확인할 수 있었다.As a result of the above experiment, it was confirmed that not only the activity of MMP-2 but also the expression of MMP-2 and MMP-9 were decreased according to overexpression of TAS2R10 (FIGS. 9A and 9B). Thus, it was confirmed that overexpression of TAS2R10 inhibits the metastatic potential by inhibiting MMP activity and expression.
실시예Example 10: 저산소 조건하에 10: Under hypoxic conditions HIFHIF -- 1α의1α 발현 조절 대한 Regulation of expression TAS2R10의TAS2R10's 효능 efficacy
저산소 상태에서 종양 세포의 전이 가능성이 증가되는 것으로 알려져 있다. HIF-1α는 VEGF 및 GLUT1과 같은 다운스트림 유전자를 조절함으로써 종양의 전이 과정을 조절하고 중재하는 것으로 알려진 전사 인자이다. TAS2R10이 HIF-1α 및 이와 관련된 유전자의 발현을 조절할 수 있는지를 확인하기 위하여, 실시예 3 및 4와 같은 방법으로 qRT-PCR 분석 및 웨스턴 블랏 분석을 수행하였다.It is known that the possibility of metastasis of tumor cells in hypoxic condition is increased. HIF-1α is a transcription factor known to modulate and mediate tumor metastasis by regulating downstream genes such as VEGF and GLUT1. QRT-PCR analysis and Western blot analysis were performed in the same manner as in Examples 3 and 4 to confirm that TAS2R10 can regulate the expression of HIF-1 alpha and related genes.
상기 실험 결과, HIF-1α 발현은 CoCl2에 의해 저산소 상태가 유도된 후에 강하게 검출되었으나, 정상 산소 상태에서는 검출되지 않았다. 또한, TAS2R10의 과발현은 CoCl2에 의해 유도된 저산소 조건하에서 EV 대조군과 비교하여 HIF-1α 발현을 유의하게 하향 조절하는 것으로 확인되었다(도 10a). 나아가, CoCl2에 의해 유도된 저산소 조건하에서 VEGF 및 GLUT1이 상향 조절되고, TAS2R10의 과발현에 따라 HIF-1α의 다운스트림 유전자가 하향 조절되는 방식으로 HIF-1α의 다운스트림 유전자의 발현이 영향을 받는 것으로 확인되었다(도 10b). 이는, TAS2R10이 저산소 관련 유전자의 발현 조절에 기여하는 바가 있음을 입증하는 것이다.As a result of the above experiment, HIF-1α expression was strongly detected after induction of hypoxic state by CoCl 2 , but was not detected in normal oxygen state. It was also found that overexpression of TAS2R10 significantly downregulated HIF-1α expression compared to EV control under hypoxic conditions induced by CoCl 2 (FIG. 10A). Furthermore, the expression of downstream genes of HIF-1α is affected in such a way that VEGF and GLUT1 are up-regulated under hypoxic conditions induced by CoCl 2 and downstream genes of HIF-1α are down-regulated upon overexpression of TAS2R10 (Fig. 10B). This demonstrates that TAS2R10 contributes to the regulation of the expression of hypoxic-related genes.
본 명세서는 본 발명의 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자이면 충분히 인식하고 유추할 수 있는 내용은 그 상세한 기재를 생략하였으며, 본 명세서에 기재된 구체적인 예시들 이외에 본 발명의 기술적 사상이나 필수적 구성을 변경하지 않는 범위 내에서 보다 다양한 변형이 가능하다. 따라서 본 발명은 본 명세서에서 구체적으로 설명하고 예시한 것과 다른 방식으로도 실시될 수 있으며, 이는 본 발명의 기술 분야에 통상의 지식을 가진 자이면 이해할 수 있는 사항이다.It is to be understood that both the foregoing general description and the following detailed description of the present invention are exemplary and explanatory and are intended to provide further explanation of the invention as claimed. More variations are possible within a range that does not. Accordingly, the present invention may be embodied in other forms without departing from the spirit or scope of the inventive concept as defined by the appended claims and their equivalents.
<110> EWHA UNIVERSITY - INDUSTRY COLLABORATION FOUNDATION <120> Use of human bitter taste receptor TAS2R10 for the diagnosis and treatment of cancer <130> P17-033-EWHA <160> 24 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human DLK1 Forward <400> 1 ctgaaggtgt ccatgaaaga g 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human DLK1 Reverse <400> 2 gctgaaggtg gtcatgtcga t 21 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human CD133 Forward <400> 3 tggatgcaga acggtacaac 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human CD133 Reverse <400> 4 atacctgcta cgacagtcgt 20 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human Notch1 Forward <400> 5 gaggcgtggc agactatgc 19 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human Notch1 Reverse <400> 6 cttgtactcc gtcagcgtga 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human Sox2 Forward <400> 7 caagatgcac aactcggaga 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human Sox2 Reverse <400> 8 gcttagcctc gtcgatgaac 20 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human TAS2R10 Forward <400> 9 tgaaatagct aagccggtga g 21 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human TAS2R10 Reverse <400> 10 acgtgtagtg gaaggcatct 20 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse TAS2R103 Forward <400> 11 tccaagaatc agtacacagg agt 23 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse TAS2R103 Reverse <400> 12 aaaggcttgc aaactgtggt 20 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human MMP-2 Forward <400> 13 cttccaagtc tggagcgatg t 21 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human MMP-2 Reverse <400> 14 taccgtcaaa ggggtatcca t 21 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human MMP-9 Forward <400> 15 cactgtccac ccctcagagc 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human MMP-9 Reverse <400> 16 gccacttgtc ggcgataagg 20 <210> 17 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human VEGF Forward <400> 17 gcacccatgg cagaagg 17 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human VEGF Reverse <400> 18 ctcgattgga tggcagtagc t 21 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human GLUT1 Forward <400> 19 gattggctcc ttctctgtgg 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human GLUT1 Reverse <400> 20 tcaaaggact tgcccagttt 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human GAPDH Forward <400> 21 agaaggctgg ggctcatttg 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human GAPDH Reverse <400> 22 aggggccatc cacagtgttc 20 <210> 23 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse GAPDH Forward <400> 23 gccttccgtg ttcctaccc 19 <210> 24 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse GAPDH Reverse <400> 24 tgcctgcttc accaccttc 19 <110> EWHA UNIVERSITY - 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J Neurosci. 2013 Jan vol. 2;33(1), pages 201-13. |
Sci Rep. 2016 Jun 1, Vol. 6, article number 26904 |
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