KR101958497B1 - 저함량의 푸코오스 세포주 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

재조합 단백질을 발현시키기 위해 숙주 세포로서 유용한 제로(zero) 푸코오스 수준을 갖는 세포를 선택하는 방법이 개시된다. 방법은 다음 단계를 포함한다: (d) 세포를 메토트렉세이트 (MTX)와 접촉시킴으로써 CHO 세포의 모집단 내로 유전적 돌연변이를 도입하는 단계, (e) 세포의 모집단의 세포막 상의 푸코오스 모이어티(moiety)에 푸코오스 결합제의 결합을 허용하는 시간량 동안 돌연변이된 세포를 포함하는 CHO 세포의 모집단을 비-독성 푸코오스 결합제와 접촉시키는 단계, 여기서 시간량은 세포를 죽이는 것을 허용하지 않음; 및 (f) 돌연변이된 세포를 포함하는 세포의 모집단으로부터 푸코오스 결합제를 결합시키는 세포의 부분모집단을 제거함으로써, 재조합 단백질을 발현시키기 위해 숙주세포로서 유용한 세포를 선택하는 단계, 여기서 선택된 세포는 제로 푸코오스 함량을 가짐. 재조합 단백질을 발현시키기 위해 숙주 세포로서 유용한 세포 및 세포주가 또한 개시된다.

Description

저함량의 푸코오스 세포주 및 이의 용도{LOW FUCOSE CELL LINES AND USES THEREOF}

본 발명의 분야 및 배경기술

본 발명은, 이의 몇 가지 실시양태에서, CHO 세포주, 이 세포주를 발생시키는 방법 및 이의 용도와 관련된다.

재조합 치료 항체는 매우 다양한 질병의 치료에서 중요한 역할을 한다. 약 30%의 새로 도래하는 약물이 다음 10년 안에 항체에 기반할 가능성이 있다는 것으로 추정된다. 30개의 재조합 항체 및 Fc 융합은 2008년에 시판을 위해 승인되었고 $350억에 도달하였다.

항체는 중쇄 및 경쇄 둘 모두의 가변부로 구성되는 표적 항원-특이 영역을 함유한다. 항체의 이러한 부분은 가용성 항원 또는 막 결합 표적을 결합시키고 중화시킬 수 있다.

Fc 부분은 항체 의존 세포성 세포독성 (ADDC) 메커니즘, 보체 의존 복합체 (CDC) 및 신생 수용체 FcRn을 통하여 이펙터(effector) 기능의 원인이 된다. 이들 이펙터 기능은 Fc의 힌지(hinge) 및 CH2 영역과 이펙터 분자의 상호작용을 통하여 매개된다. CH2 도메인은 이펙터 세포에 결합함에 있어 중요한 역할을 하는 것으로 공지된 항체의 위치 297에서의 N 글리코실화 부위 상에 위치한 올리고당을 함유한다. 올리고당은 상당한 이종성, 가령 추가적인 가변적 외부 당 잔기와 함께 중심 헵타사카라이드를 가진 복합체 디안테너리(diantennary) 유형으로 주로 구성된다.

ADCC는 표적 세포의 막 상에 리간드를 결합시키는 항체에 대해 중요한 사멸 메커니즘 중 하나이다. 백혈구 상에서 발현되는 FcyR은 항체의 CH2 도메인을 결합시키고 그리고 표적 세포 상의 항원과의 면역 복합체 결합 및 형성시, 백혈구 활성화가 시작된다. 활성화는 세포 투과화 및 사멸을 유발하는 세포 매개체의 식세포 작용 및 방출을 포함할 수 있다. ADCC 활성도는 한편으로 IgG 이소타입(isotype)에, 그리고 다른 한편으로는, 특이적 FcyR에 의존한다. IgG1 및 IgG3은 이 활성도를 유도할 수 있는 반면에, IgG4는 그렇지 않다. IgG를 결합시키고 ADCC 메커니즘 활성화를 위해 중요한 FcyR은 FcyRIIIa로서 공지되고 NK 세포 및 대식세포 상에서 발현된다. 많은 경우에, 표적 세포와 NK 세포의 결합시 얻은 ADCC 활성도는 표적 세포를 죽이는 것을 수행하는 데에 충분히 효과적이지 않다. 상기 근거는 IgGI에 대한 FcyRIIIa의 친화성이 낮다는 점이다.

FcyRIIIa - 158Phe를 발현하는 환자와 비교하여 10-15%의 모집단에서 발견된 고 친화성 동종이형 FcyRIIIa - 158Val을 발현하는 환자에서 증가된 ADCC 활성도를 밝혀내었다. 또한 IgG Fc에서 이루어진 조작에 의해 상승된 ADCC를 얻었다. 항체를 조작하고 고-처리량 스크리닝에 의한 고 친화성을 선택하기 위하여 컴퓨터 설계 알고리즘이 이용되었다. 이 작업은 비록 돌연변이된 IgG1 (돌연변이 S239D, A330L 및 I332E를 갖는 IgG1)의 열안정도 감소가 탐지되었지만, 시험관내 이펙터 기능의 > 2 차수(2 orders of magnitude) 향상을 나타내는 항체를 산출하였다 (Lazar, Dang et al. 2006). 향상된 ADCC를 갖는 항체를 얻기 위한 또 다른 기법은 위치 297에서 상기 항체의 올리고당 상에서 낮은 푸코오스 수준을 갖는 상기 항체를 생산하는 것이다. 이전에, 올리고당에서의 푸코오스 잔기가 FcyRIIIa와의 Fc 결합을 방해한다는 것으로 밝혀졌다 (Shinkawa, Nakamura et al. 2003). 낮은 푸코오스 수준을 갖는 항체를 얻기 위한 한 가지 방식은 이러한 자연적 능력을 가진 세포, 가령 랫트 하이브리도마 YB2/0 세포를 활용하는 것 (Shinkawa, Nakamura et al. 2003)이지만, 이들 세포에서 생산된 재조합 단백질은 다양한 수준의 푸코오스 함량을 갖는다. 비-포유류 세포의 여러 가지 기타 가능성은 Biolex로부터 수생 식물 렘나(Lemna)가 조작된, Vivalis로부터의 조류 세포 (Cox, Sterling et al. 2006) 및 Igeneon 으로부터 이끼 피스코미트렐라 파텐스(Physcomitrella patens)의 변이체 (Nechansky, Schuster et al. 2007)를 포함한다. 추가적으로, GlycoFi는 향상된 ADCC를 포함한 여러 가지 글리코실화 용액에 대한 능력을 가진 피치아 파스토리스(Pichia Pastoris) 세포의 다양한 계통을 발생시켰다 (Hamilton, Davidson et al. 2006). 또한, 일반적으로는 다양한 글리코실화 용액 및 특정하게는 향상된 ADCC를 갖는 항체의 생산을 위해 여러 가지 포유류 세포가 이용된다. Glycotope는 다양한 인간 글리코조작된(glycoengineered) 세포주를 만들어 생물-치료법 글리코실화를 글리코-최적화시켰다. Roche에 의해 획득된, Glycart는 항체-의존 세포성 세포독성 (ADCC)과 연관되어온 이등분된 올리고당의 형성을 촉매하는 글리코실전달효소인, 베타(1,4)-N-아세틸글루코사미닐전달효소 III (GnTIII)을 도입시킴으로써 환원된 푸코오스 수준을 갖는 재조합 항체를 생산하는 세포주를 조작하였다 (Umana, Jean-Mairet et al. 1999). 푸코오스 수준을 감소시키기 위하여 Biowa는 CHO DG44의 푸코실 전달 8 (Fut8) 유전자에서 넉아웃(knockout)을 발생시켰다 (Yamane-Ohnuki, Kinoshita et al. 2004).

최근 연구는 세포질 내의 원핵 효소 GDP-6-데옥시-D-릭소-4-헥술로오스 환원효소의 비상동 발현이 척추동물 세포에서는 전형적으로 발생하지 않는 데드-엔드(dead-end) 산물로의 중간체 GDP-4-케토-6-데옥시만노오스의 전환을 차단할 수 있다는 것을 입증하였다. 따라서 이 방식으로 변형되었던 CHO 세포는 핵심 푸코오스가 결핍된 항체를 분비하였다 (von Horsten, Ogorek et al.). 또 다른 기법은 독성 푸코오스 특이적 렉틴의 존재에서 생존하는 렉틴 저항 돌연변이를 만드는 것이다. LEC13은 독성 완두 푸코오스 특이적 렉틴의 존재에서 CHO 세포의 인큐베이션에 의해 발달되었던 CHO 기반 세포주이다 (Ripka and Stanley 1986). LEC13은 GDP-만노오스 4,6-탈수효소 활성도가 결핍되며, 이는 푸코오스가 결핍된 인간 IgG1의 발현을 유발한다 (Shields, Lai et al. 2002).

미국 특허 출원 제2010/0081150호는 항체를 발현하기 위해 유용한 세포를 발생시키기 위하여, 화학제를 이용한 처리에 의한 그리고 높은 푸코오스를 가진 세포를 죽임으로써 푸코실화에서의 감소를 포함하는 변이 글리코실화 패턴을 나타내는 세포를 선택하는 것에 의한 CHO 세포의 돌연변이를 교시한다.

미국 특허 출원 제2010/0304436호는 폴리펩티드를 푸코실화하기 위해 세포의 능력을 지시하기 위하여 Fx 단백질내 돌연변이에 의한 그리고 푸코오스의 외부 공급원의 이용가능성을 조절하는 것에 의한 푸코실화 환원된 CHO 세포주를 교시한다.

Kanda et al, (Kanda, Imai-Nishiya et al. 2007)은 GMD 및 FUT8 넉아웃 숙주 세포주를 개시한다. GMD 넉아웃 세포는 GMD 엑손 5, 6 및 7 영역에 상응하는 유전체 결실을 갖는다.

Ripka et al, (Ripka and Stanley 1986)은 4개의 렉틴 저항 CHO 돌연변이 세포를 개시한다. 돌연변이는 N-메틸-N-니트로소구아니딘과의 인큐베이션에 의해 이루어졌다.

Shields et al, (Shields, Lai et al. 2002)은 Lec13 (푸코오스 결핍 CHO) 세포주에 의해 생산된 IgG1이 최대 50배까지 FcyRIIIA와의 결합을 증가시키고 또한 ADCC도 증가시켰다는 것을 개시한다.

Kanda et al., (Kanda, Yamane-Ohnuki et al. 2006)은 Lec13이 50-70% 푸코실화된 항체를 생산하였지만; 이 공지된 세포주는 항체를 안정적으로 생산하지 못하였다는 것을 개시한다. 따라서 Lec13 세포주는 생산 세포주로서 적합하지 않다.

본 발명의 요약

본 발명의 몇 가지 구체예 중 한 측면에 따르면, 재조합 단백질의 발현에 숙주 세포로서 유용한 CHO 세포를 선택하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 다음 단계를 포함한다:

(a) CHO 세포를 메토트렉세이트 (MTX)와 접촉시킴으로써 CHO 세포의 모집단 내로 유전적 돌연변이를 도입하는 단계,

(b) 돌연변이된 세포를 포함하는 CHO 세포의 모집단을 이러한 세포의 모집단의 세포막 상의 푸코오스 모이어티(moiety)에 푸코오스 결합제의 결합을 허용하는 시간량 동안 비-독성 푸코오스 결합제와 접촉시키는 단계, 여기서 시간량은 세포를 죽이는 것을 허용하지 않고; 및

(c) 돌연변이된 세포를 포함하는 세포의 모집단으로부터 푸코오스 결합제를 결합시키는 세포의 부분모집단을 제거함으로써, 재조합 단백질을 발현시키기에 숙주세포로서 유용한 세포를 선택하는 단계, 여기서 선택된 세포는 제로 푸코오스 함량을 가짐.

본 발명의 몇 가지 구체예 중 한 측면에 따르면, 본 발명의 방법에 따라 발생되는 단리된 CHO 세포가 제공된다.

본 발명의 몇 가지 구체예 중 한 측면에 따르면, 유전학적으로 변형되어 서열번호: 23 및/또는 24에서 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 돌연변이된 GDP-만노오스 4,6-탈수효소 (GMD)를 발현하는 단리된 CHO 세포가 제공된다.

본 발명의 몇 가지 구체예 중 한 측면에 따르면, 본 발명의 단리된 세포를 포함하는 CHO 세포주가 제공된다.

본 발명의 몇 가지 구체예 중 한 측면에 따르면, 본 발명의 단리된 CHO 세포를 포함하는 세포 배양 및 제노(xeno) 오염물질이 없는 세포 배양 배지가 제공된다.

본 발명의 몇 가지 구체예 중 한 측면에 따르면, 재조합 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한 폴리뉴클레오티드로 본 발명의 단리된 CHO 세포를 형질감염시키는 단계, 재조합 단백질의 발현을 위해 적합한 조건 하에 형질감염된 CHO 세포를 배양하는 단계, 및 단백질을 단리시키는 단계를 포함하는 재조합 단백질의 생산을 위한 방법이 제공된다.

본 발명의 몇 가지 구체예 중 한 측면에 따르면, 유전학적으로 변형되어 그 안에서 발현되는 단백질의 푸코실화 양이 외부 푸코오스 농도에 연속적으로 의존하도록 하는 단리된 CHO 세포가 제공된다.

본 발명의 몇 가지 구체예에 따르면, 푸코오스 결합제는 돌연변이된 CHO 세포 모집단에 대해 비-독성이다.

본 발명의 몇 가지 구체예에 따르면, 푸코오스 결합제는 탐지가능한 모이어티 또는 친화성 모이어티에 부착된다.

본 발명의 몇 가지 구체예에 따르면, CHO 세포의 모집단 내로 유전적 돌연변이를 도입하는 단계는 GDP-만노오스 4,6-탈수효소에서 돌연변이를 유발하는 돌연변이 유발원인, 푸코오스 합성 경로 유전자와 세포를 접촉시키는 단계에 의해 이루어진다.

본 발명의 몇 가지 구체예에 따르면, 돌연변이된 세포 모집단이 푸코오스 결합제와 접촉되는 동안의 시간 량은 60분 이내이다.

본 발명의 몇 가지 구체예에 따르면, 푸코오스 결합제가 친화성 모이어티에 부착될 때, 상기 방법은 돌연변이된 CHO 세포 모집단을 첨가제와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하며, 이러한 첨가제는 친화성 모이어티에 대해 동족 결합 모이어티를 포함한다.

본 발명의 몇 가지 구체예에 따르면, 친화성 모이어티는 비오틴을 포함한다.

본 발명의 몇 가지 구체예에 따르면, 동족 결합 모이어티는 탐지가능한 모이어티에 부착된다.

본 발명의 몇 가지 구체예에 따르면, 탐지가능한 모이어티는 형광 모이어티 또는 자성 모이어티를 포함한다.

본 발명의 몇 가지 구체예에 따르면, 제거 단계는 FACS 분류에 의해 이루어진다.

본 발명의 몇 가지 구체예에 따르면, 제거 단계는 자성 분리에 의해 이루어진다.

본 발명의 몇 가지 구체예에 따르면, 제거 단계는 적어도 3회의 순차적 제거 단계에 의해 이루어진다.

본 발명의 몇 가지 구체예에 따르면, CHO 세포는 CHO-S, CHO-K1, DUXB11, CHO/DG44 및 Pro-5로부터 선택된다.

본 발명의 몇 가지 구체예에 따르면, 푸코오스 결합제는 알레우리아 아우란티아 렉틴(aleuria aurantia lectin) (AAL) 또는 아스퍼질러스 오리재 1-푸코오스-특이적 렉틴(Aspergillus oryzae 1-fucose-specific lectin) (AOL)이다.

본 발명의 몇 가지 구체예에 따르면, 단리된 CHO 세포는 야생형 푸코실 전달효소-8 (Fut8)을 발현한다.

본 발명의 몇 가지 구체예에 따르면, 단리된 CHO 세포는 야생형 GDP-케오-6-데옥시만노오스 3, 5-에피머화효소, 4-환원효소 (FX)를 발현한다.

본 발명의 몇 가지 구체예에 따르면, 돌연변이된 GMD는 서열번호: 23 및/또는 24에서 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는다.

본 발명의 몇 가지 구체예에 따르면, 단리된 CHO 세포는 돌연변이된 GDP-만노오스 4, 6-탈수효소 (GMD)를 발현한다.

본 발명의 몇 가지 구체예에 따르면, 단리된 CHO 세포는 적어도 370 모집단 배가에 대해 안정한 푸코오스 표현형을 갖는다.

본 발명의 몇 가지 구체예에 따르면, 단리된 CHO 세포는 관심의 재조합 항체를 발현한다.

본 발명의 몇 가지 구체예에 따르면, 세포 배양 배지는 푸코오스를 포함한다.

본 발명의 몇 가지 구체예에 따르면, 세포 배양 배지는 푸코오스가 없다.

본 발명의 몇 가지 구체예에 따르면, 형질감염시키는 단계는 외생 푸코오스의 존재에서 이루어진다.

본 발명의 몇 가지 구체예에 따르면, 방법은 형질감염 단계 후에 푸코오스를 포함한 배양 배지에서 본 발명의 단리된 CHO 세포를 배양하는 단계를 추가로 포함한다.

본 발명의 몇 가지 구체예에 따르면, 재조합 단백질은 항체이다.

본 발명의 몇 가지 구체예에 따르면, 재조합 단백질은 Fc 융합 단백질이다.

본 발명의 몇 가지 구체예에 따르면, 항체는 향상된 ADCC를 갖는다.

본 발명의 몇 가지 구체예에 따르면, 단리된 CHO 세포는 유전학적으로 변형되어 돌연변이된 GDP-만노오스 4,6-탈수효소 (GMD)를 발현한다.

본 발명의 몇 가지 구체예에 따르면, GMD의 적어도 하나의 대립유전자는 적어도 하나의 기능상실(loss of function) 돌연변이를 지닌다.

본 발명의 몇 가지 구체예에 따르면, GMD의 대립유전자 각각은 적어도 하나의 기능상실 돌연변이를 지닌다.

발명의 몇 가지 구체예에 따르면, 외부 푸코오스 농도가 제로일 때, 단백질의 푸코실화의 양은 제로이다.

본 발명의 몇 가지 구체예에 따르면, 단리된 CHO 세포는 비-돌연변이된 CHO 세포보다 20% 더 높은 필수 생존가능 세포 농도 (IVCC)를 갖는다.

달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및/또는 과학적 용어는 본 발명과 관련되는 해당 분야의 통상의 기술자에게 일반적으로 이해되는 바와 같은 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에서 설명된 것들과 유사하거나 동등한 방법 및 재료가 본 발명의 구체예의 실시 또는 검사에서 이용될 수 있음에도 불구하고, 예시적인 방법 및/또는 재료가 하기 설명된다. 상충의 경우, 정의를 포함한 특허 규정을 조절할 것이다. 추가적으로, 재료, 방법 및 예시는 단지 예증이 되고 반드시 제한되는 것으로 의도되지 않는다.

도면의 간단한 설명

본 발명의 몇 가지 구체예는 도면 및 이미지를 수반하는 것에 관련하여, 예시 단독으로써, 본 명세서에서 설명된다. 이제 상세 설명에서의 도면과 특정하게 관련하여, 보여지는 자세한 사항은 예시를 통한 그리고 본 발명의 구체예의 예시적인 논의의 목적을 위한 것이라는 점이 강조된다. 이 점에서, 도면이 수반되는 설명은 본 발명의 구체예가 어떻게 실시될 수 있는 지에 대해 해당 분야의 통상의 기술자에게 명확해진다.

도면에서:

도 1은 제로 또는 낮은 푸코오스 수준을 갖는 폴리펩티드를 발현하는 세포를 얻는 데에 이용된 실험 기법의 순서도이다.

도 2는 완전한 항-EGFR mAb 및 단량체(monomer) 정제 공정의 순서도이다.

도 3은 Octet에 의한 동역학적 분석의 예시적인 프로파일이다.

도 4는 ITL-LF1 낮은 푸코오스 세포 (외부 푸코오스의 부재에서, 제로 푸코오스)의 단리를 위한 예시적인 전략을 설명하는 도식이다. CHO-S 세포는 돌연변이 유발제 메토트렉세이트 (MTX)와 함께 인큐베이션되었고 그 다음 비오틴화 푸코오스 특이적 렉틴 (비오틴화 AAL)으로 세포를 라벨링함으로써 낮은 푸코오스 세포의 선택 및 스트렙타비딘 코팅 자성 구슬에 결합하지 않는 세포의 단리가 2회 되었다. 이 단계 다음에 또 다른 한 회의 선택을 하였고 여기서 세포는 비오틴화 푸코오스 특이적 렉틴 (비오틴화 AAL) 및 형광 스트렙타비딘으로 라벨링되었고 그리고 낮은 형광 세포의 선택이 FACS에 의해 수행되었다.

도　5는　ITL-LF1　낮은 푸코오스 세포의 단리를 위한 예시적인 전략을 설명하는 도식이다. CHO-S　세포는 돌연변이 유발제　MTX와 함께 인큐베이션되었고 그 다음 비오틴화 푸코오스 특이적 렉틴　(비오틴화　AAL)　및 형광 스트렙타비딘으로의 세포 라벨링 및　FACS에 의한 형광 세포 분류가　4회 되었다.

도 6은 자성 구슬 상에서 분리 후 MTX 처리된 그리고 비처리된 CHO-S 세포 상에서의 푸코오스 수준의 FACS 분석을 설명하는 그래프이다. 인큐베이션된 또는 MTX가 없는 CHO-S 세포는 비오틴화 AAL로 라벨링되었고 그리고 스트렙타비딘 코팅 자성 구슬과 혼합되었다. 세포는 자석으로 분리되었고, 자석에 부착되지 않았던 세포는 추가로 증식되었다. 비오틴화 AAL로 세포를 라벨링함으로써 그 다음 형광 스트렙타비딘으로 염색함으로써 FACS 분석이 수행되었다. 라벨링되지 않은, MTX 처리된 CHO-S 세포 (□), MTX와 인큐베이션된 및 AAL로 라벨링된 CHO-S (○). MTX에서 인큐베이션된 및 구슬로 분류된 낮은 푸코오스 CHO-S 세포 (△), 구슬로 분류된 CHO-S (◇).

도 7A는 자성 구슬 및 FACS에 의해 단리된 ITL-LF1 세포 상에서의 푸코오스 수준의 FACS 분석을 설명하는 그래프이다. MTX와 인큐베이션된 CHO-S 세포는 비오틴화 AAL로 라벨링되었고 그리고 스트렙타비딘 코팅 자성 구슬과 혼합되었다. 세포는 자석 상에서 분리되었고, 자석에 부착되지 않았던 세포는 추가로 증식되었다. 이 단계는 2회 반복되었다. 이후 세포는 비오틴화 AAL 및 형광 스트렙타비딘으로 라벨링되었고 낮은 형광 세포는 FACS에 의해 분류되었고 그리고 추가로 증식되었다. 비오틴화 AAL 및 형광 스트렙타비딘으로 세포를 라벨링함으로써 FACS 분석이 수행되었다. 라벨링되지 않은, MTX 처리된 CHO-S 세포 (□), MTX 처리된 CHO-S 세포 (○), 구슬 상에서 단일 분리 후 MTX 처리된 CHO-S 세포 (△), 구슬 상에서 2회 분리 주기(cycle) 후 MTX 처리된 CHO-S 세포 (◇), 구슬 상에서 2회 분리 주기 및 단일 FACS 분류 주기 후 MTX 처리된 CHO-S 세포 (▼).

도 7B는 아스퍼질러스 오리재 1-푸코오스-특이적 렉틴 (AOL)을 이용하여 선택된 세포 상에서의 푸코오스 수준의 FACS 분석을 설명하는 그래프이다. 라벨링되지 않은, CHO-S 세포 (□), CHO-S 세포 (○), 구슬 상에서 단일 분리 후 MTX 처리된 CHO-S 세포 (△), 구슬 상에서 2회 분리 주기 후 MTX 처리된 CHO-S 세포 (◇), 구슬 상에서 2회 분리 주기 및 단일 FACS 분류 주기 후 MTX 처리된 CHO-S 세포 (▼).

도 8A는 다양한 배지내 ITL-LF1 상에서의 푸코오스 수준의 FACS 분석을 설명하는 그래프이다. ITL-LF1 세포는 비오틴화 AAL 및 형광 스트렙타비딘으로 세포의 라벨링 후, ProCHOS 및 C6614에서 증식되었고 FACS 에 의해 분석되었다. 라벨링되지 않은, MTX 처리된 CHO-S (□), ProCHOS내 CHO-S (○), ProCH05내 ITL-LF1 (△), C6614내 ITL-LF1 (◇).

도 8B는 자성 구슬 및 FACS에 의해 단리된 MTX 처리된 CHO-S 세포 상에서의 푸코오스 수준의 FACS 분석을 설명하는 그래프이다. MTX와 인큐베이션된 CHO-S 세포는 비오틴화 AOL로 라벨링되었고 스트렙타비딘 코팅 자성 구슬과 혼합되었다. 세포는 자석 상에서 분리되었고, 자석에 부착되지 않았던 세포는 추가로 증식되었다. 이 단계는 2회 반복되었다. 이후 세포는 비오틴화 AOL 및 형광 스트렙타비딘으로 라벨링되었고 낮은 형광 세포는 FACS에 의해 분류되었고 그리고 추가로 증식되었다. 비오틴화 AOL 및 형광 스트렙타비딘으로 세포를 라벨링함으로써 FACS 분석이 수행되었다. 라벨링되지 않은 CHO-S 세포 (□), CHO-S 세포 (○), 구슬 상에서 단일 분리 후 MTX 처리된 CHO-S 세포 (△), 구슬 상에서 2회 분리 주기 후 MTX 처리된 CHO-S 세포 (◇), 구슬 상에서 2회 분리 주기 및 단일 FACS 분류 주기 후 MTX 처리된 CHO-S 세포 (▼).

도 9는 다양한 배지내 ITL- LF1 세포 상에서의 시알산 수준의 FACS 분석을 설명하는 그래프이다. ITL- LF1세포는 ProCH05 및 C6614 배지내 시알산 수준에 대하여 분석되었다. 세포는 FITC 접합된 시알산 결합 렉틴 특이적 렉틴 (MAA)으로 라벨링되었고 그리고 FACS에 의해 분석되었다. 라벨링되지 않은, CHO-S 세포 (□), MAA-FITC로 라벨링된 CHO-S 세포 (○), MAA-FITC로 라벨링된 ProCH05내 ITL-LF1 세포 (△), MAA-FITC로 라벨링된 C6614내 ITL-LF1 세포 (◇).

도 10은 ITL-LF1 세포의 푸코오스의 안정도의 평가를 설명하는 그래프이다. 낮은 푸코오스 발현의 안정도를 평가하기 위하여, ITL-LF1 세포는 분리 절차의 완성 후 상이한 시점에서 세포 표면 상의 푸코오스 수준에 대하여 FACS에 의해 분석되었다. 분석을 위하여, 세포는 비오틴화 AAL 및 형광 스트렙타비딘으로 라벨링되었다.

도 11은 ITL-LF1 세포의 성장률의 평가를 설명하는 그래프이다. ITL-LF1 세포는 363 모집단 배가 (PDL)를 따라 증식되었고 그리고 성장률이 매 계대 후 측정되었다.

도 12는 연속적인 FACS 분류에 의해 단리된 ITL-LF2 세포의 FACS 분석을 설명하는 그래프이다. MTX와 인큐베이션된 CHO-S 세포는 비오틴화 AAL 및 형광 스트렙타비딘으로 라벨링되었다. 낮은 형광 세포는 FACS에 의해 분류되었고 추가로 증식되었다. 이 절차는 4회 반복되었다. 비오틴화 AAL 및 형광 스트렙타비딘으로 라벨링함으로써 FACS 분석이 수행되었다. 라벨링되지 않은, MTX 처리된 CHO-S 세포 (□), MTX 처리된 CHO-S 세포 (○), 1차 분류 후 MTX 처리된 CHO-S 세포 (△), 2차 분류 후 MTX 처리된 CHO-S 세포 (◇), 3차 분류 후 MTX 처리된 CHO-S 세포 (▼), 4차 분류 후 MTX 처리된 CHO-S 세포 (■).

도 13은 다양한 배지내 ITL-LF2 세포 상에서의 푸코오스 수준의 FACS 분석을 설명하는 그래프이다. 증식된 ITL-LF2 세포는 비오틴화 AAL 및 형광 스트렙타비딘으로 세포의 라벨링 후 ProCHOS 및 C6614에서 증식되었고 그리고 FACS에 의해 분석되었다. 라벨링되지 않은, CHO-S (□), ProCHO5내 CHO-S (○), ProCHO5내 ITL-LF2 (△), C6614내 ITL-LF2 (◇).

도 14는 ITL-LF2 세포 상에서의 시알산 수준의 FACS 분석을 설명하는 그래프이다. ITL-LF2 세포는 ProCHO5 배지내 시알산 수준에 대하여 분석되었다. 세포는 FITC 접합된 시알산 결합 렉틴 특이적 렉틴 (MAA)으로 라벨링되었고 그리고 FACS에 의해 분석되었다. 라벨링되지 않은, CHO-S (□), MAA-FITC로 라벨링된 CHO-S 세포 (○), MAA-FITC로 라벨링된 ProCHO5내 ITL-LF2 세포 (△).

도 15는 낮은 푸코오스 발현의 안정도를 평가하기 위하여, 분리 절차의 완성 후 상이한 시점에서 세포 표면 상에서의 푸코오스 수준을 분석하기 위해 ITL-LF2 상에서의 FACS 분석을 설명하는 그래프이다. 분석을 위하여, 세포는 비오틴화 AAL 및 형광 스트렙타비딘으로 라벨링되었다.

도 16은 ITL-LF2 세포의 성장률을 설명하는 그래프이다. ITL-LF2 세포는 370 PDL을 따라 증식되었고 그리고 성장률이 매 계대 후 측정되었다.

도 17은 ProCHO5내 ILA-LF2 세포의 최대 세포 농도 평가를 설명하는 그래프이다. 배치 공정(batch process)에서 0.2 x10⁶개로 세포가 접종되었고 그리고 이틀에 한 번씩 세포수를 측정하였다. CHO-S 세포 (○) 및 ITL-LF2 세포 (△).

도 18은 ITL-LF2 세포의 푸코실화 수준에서 외생 푸코오스의 효과를 설명하는 그래프이다. ITL-LF2 세포는 0.2x10⁶개 세포/ml의 농도로 상이한 농도의 L-푸코오스와 함께 ProCHO5 배지에 접종되었고 그리고 CO₂와 함께 320rpm의 진탕기의 37℃ 인큐베이터에서 인큐베이션되었다.

도 19A는 배치 공정에서 ITL-LF2 및 CHO-S의 생존력을 설명하는 그래프이다. 배치 공정내 보충물을 가진 ProCHO5에 0.2 x10⁶개 세포/ml의 농도로 세포가 접종되었고 그리고 공정에 따라 세포의 생존력이 분석되었다. CHO-S 세포 (○) 및 ITL-LF2 세포 (△).

도 19B는 배치 공정에서 ITL-LF2 및 CHO-S의 생존가능 세포 농도를 설명하는 그래프이다. 배치 공정내 보충물을 가진 ProCHO5에 0.2 x10⁶개 세포/ml의 농도로 세포가 접종되었고 그리고 공정에 따라 세포수가 분석되었다. CHO-S 세포 (○) 및 ITL-LF2 세포 (△).

도 19C는 배치 공정에서 ITL-LF2 및 CHO-S의 필수 생존가능 세포 농도 (IVCC)를 설명하는 그래프이다. 배치 공정내 보충물을 가진 ProCHO5에 0.2 x10⁶개 세포/ml의 농도로 세포가 접종되었다. 공정에 따라 생존가능 세포 농도가 측정되었다. 세포 농도 측정에 기반하여 IVCC가 계산되었다. CHO-S 세포 (○) 및 ITL-LF2 세포 (△). CHO-S 및 ITL-LF2 계통 둘 모두는 합동(congruent)이지만, CHO-S 세포는 단지 9일만에 도달하는 반면, ITL-LF2 세포는 12일에 도달한다는 점에 주목한다.

도 19D는 설명하는 배치 공정에서 ITL-LF2 및 CHO-S의 젖산 농도를 설명하는 그래프이다.

도 20은 단백질 푸코실화 경로 및 mRNA 분석을 위한 잠재적인 효소 (사각형 안에 표시됨)를 설명하는 도식이다.

도 21은 푸코실화 경로 유전자의 RT-PCR 분석을 설명하는 사진이다. 전체 RNA는 CHO-S (C) 및 ITL-LF2 (LF) 세포로부터 단리되었고 polydT 그 다음 유전자 특이적 프라이머를 활용하여 RT-PCR 처리되었다. 결과적 산물은 아가로오스 겔 상에 러닝(running)되었고 SyberSafe™ 염색에 의해 UV 빛 아래에서 탐지되었다. 예상되는 크기: Fut8 - 1.7 Kb; GMD - 1.1 Kb; FX - 1.2 Kb; GFPP - 1.7 Kb; M - DNA 크기 마커.

도 22A-B는 전장 GMD와 스플라이스 변이체 사이의 단백질 서열 비교이다. CHO-S 및 ITL-LF2 세포로부터 추출된 RNA로부터 RT PCR에 의해 제조된 cDNA는 겔 상에 러닝되었고, 단리 및 서열화되었다. 이후 DNA 서열은 CloneManager™ 소프트웨어에 의해 단백질로 번역되었다. 스플라이스 변이체 1 (SV1; 도 22A; 서열번호: 23) 및 스플라이스 변이체 2 (SV2; 도 22B, 서열번호: 24)의 단백질 서열은 전장 GMD 유전자 (서열번호: 25)와 비교되었다. 파선(Dashed line)은 결실 영역을 나타낸다. 텍스트는 스플라이스 변이체 각각에서 엑손이 결실된다는 점을 나타낸다.

도 23A-B는 두 개의 GMD 스플라이스 변이체의 제한 효소 분석을 설명한다. 도 23A - GMD 스플라이스 변이체 내에서 고유의 제한 효소 부위의 위치; 도 23B - 제한 후 밴드를 나타내는 아가로오스 겔. 크기 및 그들의 설명은 하기 실시예 부문의 표 7에서 상세 설명된다.

도 24는 Q-PCR에 의한 ITL-LF2 세포 대 CHO-S 세포내 푸코실화 경로 유전자 발현 수준의 분석을 설명하는 그래프이다. cDNA는 ITL-LF2 및 CHO-S (대조군) RNA로부터 제조되었고 엑손 5-6 에 위치되는 유전자 특이적 프라이머 및 프로브 (전장 GMD mRNA 및 둘 모두의 스플라이스 변이체에서 존재함)를 활용하여 Q-PCR 분석 처리되었다. 4번의 상이한 일자에 도말된 세포로부터의 4가지 분리 RNA 추출물로부터 유전자 각각에 대한 결과가 얻어졌다. 추출 일자 각각으로부터, cDNA가 제조되었고 Q-PCR에 의한 모든 유전자의 탐지를 위해 이용되었다. 모든 샘플은 삼중(triplicate)으로 러닝되었고 그리고 베타-액틴 내생 대조군에 대하여 정상화되었다. 막대 위의 수는 대응표본 T 검정(paired T test) 통계 분석을 활용하여 계산된 바와 같은 유전자 각각에 대한 P-값을 나타낸다. 유의성은 P 값 < 0.05에 의해 명시된다.

RQ - 대조군으로부터 발현 변화의 배수(fold)

도 25는 벡터 MB-129 (pCMV-P-GMD)의 도식적인 개관이다. CHO-S wt로부터의 전장 GMD cDNA가 벡터 pCMV-P 내로 클로닝되었다. pCMVpr - 인간 CMV 프로모터. IVS - hCMV IE 유전자의 인트론 A. PAC - 퓨로마이신 저항 유전자.

도 26은 ITL-LF2가 야생형 GMD cDNA로 형질감염 시 푸코실화를 회복한다는 점을 설명하는 그래프이다. ITL-LF2 세포는 푸코오스 존재시 C6614 배지에서 GMD cDNA (pCMV-P-GMD)를 함유하는 벡터로 형질감염되었다. 형질감염된 세포는 푸코오스의 부재에서 ProCHO5 배지로 이동되였다. 세포는 비오틴화 AAL 및 형광 스트렙타비딘으로 라벨링 후 FACS에 의해 분석되었다. 라벨링되지 않은 CHO-S 세포 (□), CHO-S 세포 (○), ITL-LF2 (△), GMD 형질감염된 ITL-LF2 세포 (◇).

도 27은 항 EGFR mAb함유 플라스미드- PGL3 항 EGFR mAb-EMCV-PAC1-DHFR 탠덤(Tandem)을 설명하는 도식이다. 항 EGFR mAb의 LC 및 HC 를 함유한 선형 플라스미드는 CHO-S 및 ITL-LF2의 형질감염을 위해 이용되었다. mCMV-쥣과 거대세포바이러스 프로모터, EMCV-뇌심근염 바이러스, IRES-내부 리보솜 진입 부위, PAC-퓨로마이신 N-아세틸전달효소, DHFR- 디하이드로엽산 환원제, HC-중쇄, LC-경쇄, SV40-시미안 바이러스 40, pA-폴리아데닐화.

도 28은 ITL-LF2 및 CHO-S 풀(pool)내 항 EGFR mAb의 안정한 발현을 설명하는 도식이다. ITL-LF2 및 CHO-S는 항 EGFR mAb 함유 벡터 (PGL3 항 EGFR mAb EMCV-PAC1-DHFR 탠덤)로 형질감염되었다. 회복 후, 풀에서 생산성이 평가되었다.

도 29는 항 EGFR mAb 형질감염된 ITL-LF2 세포 상에서의 푸코오스 수준의 FACS 분석을 설명하는 그래프이다. 푸코오스의 제거 전 및 후 C6614 배지에서 증식된 항 EGFR mAb 형질감염된 세포의 막 상에서의 푸코오스 수준의 분석. 라벨링되지 않은, CHO-S (□), ProCHO5내 CHO-S (○), C6614내 ITL-LF2 (◇), 푸코오스의 존재시 C6614에서 항-EGFR mAb 형질감염된 ITL-LF2 (▼), 푸코오스의 부재시 C6614에서 항-EGFR mAb 형질감염된 ITL-LF2 (△).

도 30은 항 EGFR mAb 형질감염된 ITL-LF2 세포 상에서의 시알산 수준의 FACS 분석을 설명하는 그래프이다. ProCHO5 배지에서 증식된 항 EGFR mAb 형질감염된 세포의 막 상에서의 시알산 수준의 분석. 세포는 FITC 접합된 시알산 결합 렉틴 특이적 렉틴 (MAA)으로 라벨링되었고 그리고 FACS에 의해 분석되었다. 라벨링되지 않은 CHO-S 세포 (□), CHO-S 세포 (○), ITL-LF2 (◇), 항-EGFR mAb 형질감염된 CHO-S (▼), 항-EGFR mAb 형질감염된 ITL-LF2 (△).

도 31A-B는 ITL-LF2 세포 내로 일시적인 형질감염을 위해 제작된 벡터의 설명이다. 벡터 MB-127 및 MB-128은 벡터 pTT5의 백본(backbone) 상에서 제작되었다. 항 EGFR mAb-LC - EGFR mAb의 경쇄; 항 EGFR mAbANTI EGFR MAB-HC - EGFR mAb의 중쇄.

도 32는 ITL-LF2 및 CHO-S 세포내 항 EGFR mAb의 일시적인 발현을 설명하는 막대 그래프이다. ITL-LF2 및 CHO-S 세포는 ProCHO5 배지에서 항 EGFR mAb 함유 PTT5 벡터로 일시적으로 형질감염되었다. 형질감염 조건은 세포 유형에 특이적이었다. 형질감염 후 24시간에, ITL-LF2 세포는 VPA로 보충되었고 31℃로 전환되었고 그리고 CHO-S는 VPA 및 셀 부스트(cell boost)로 보충되었다.

도 33은 항체 상에서의 당 잔기 수준의 FACS 분석을 나타내는 설명이다. 미가공 수확물 또는 정제된 항체 샘플은 단백질 G 코팅 자성 구슬과 혼합되었고 그 다음 형광으로 라벨링된 렉틴에 결합하였다. 형광에 따라서 FACS에 의해 푸코오스 수준이 측정되었다.

도 34는 ITL-LF2 및 CHO-S에서 일시적으로 발현된 항 EGFR mAb 상에서의 푸코오스 수준의 FACS 분석을 설명하는 그래프이다. 미가공 수확물 샘플은 단백질 G 코팅 자성 구슬과 혼합되었고 그 다음 비오틴화 AAL 및 형광 스트렙타비딘 혼합물에 결합하였다. 형광 수준에 따라서 FACS에 의해 푸코오스 수준이 측정되었다. 자성 구슬 (□), CHO-S 형질감염 세포로부터의 항 EGFR (○), ITL-LF2 형질감염 세포로부터의 항 EGFR (△).

도 35는 ITL-LF2 및 CHO-S 배양에서 안정하게 발현되는 항 EGFR mAb로부터의 미가공 수확물 상에서의 푸코오스 수준의 FACS 분석을 설명하는 그래프이다. 미가공 수확물 샘플은 단백질 G 자성 구슬과 혼합되었고 그 다음 비오틴화 AAL 및 형광 스트렙타비딘 혼합물에 결합하였다. 형광 수준에 따라서 FACS에 의해 푸코오스 수준이 측정되었다. 자성 구슬 (□), CHO-S 형질감염 세포로부터의 항 EGFR mAb (○), ITL-LF2 형질감염 세포로부터의 항 EGFR mAb (△).

도 36은 분석을 ITL-LF2 및 CHO-S 배양에서 안정하게 발현되는 항 EGFR mAb로부터의 미가공 수확물 상에서의 시알산 수준의 FACS를 설명하는 그래프이다. 미가공 수확물 샘플은 단백질 G 자성 구슬과 혼합되었고 그 다음 FITC 접합된 MAA에 결합하였다. 형광 수준에 따라서 FACS에 의해 시알산 수준이 측정되었다. 자성 구슬 (□), CHO-S 형질감염 세포로부터의 미가공 수확물 (○), ITL-LF2 형질감염 세포로부터의 미가공 수확물 (△).

도 37은 ITL-LF2 및 CHO-S에서 안정하게 발현되는 항 EGFR mAb 상에서의 푸코오스 수준의 FACS 분석을 설명하는 그래프이다. 정제된 항체 샘플은 단백질 G 자성 구슬과 혼합되었고 그 다음 비오틴화 AAL 및 형광 스트렙타비딘 혼합물에 결합하였다. 형광 수준에 따라서 FACS에 의해 푸코오스 수준이 측정되었다. 자성 구슬 (□), CHO-S 형질감염 세포로부터의 항 EGFR mAb (○), ITL-LF2 형질감염 세포로부터의 항 EGFR mAb (△).

도 38은 ITL-LF2 및 CHO-S에서 안정하게 발현되는 항 EGFR mAb 상에서의 시알산 수준의 FACS 분석을 설명하는 그래프이다. 정제된 항체 샘플은 단백질 G 자성 구슬과 혼합되었고 그 다음 FITC 접합된 MAA에 결합하였다. 형광 수준에 따라서 FACS에 의해 시알산 수준이 측정되었다. 자성 구슬 (□), CHO-S 형질감염 세포로부터의 항 EGFR (○), ITL-LF2 형질감염 세포로부터의 항 EGFR (△).

도 39는 정제된 완전 항-EGFR mAb 상에서의 푸코오스 수준의 Octet 분석의 판독이다. O.D 280에 의한 CHO-S 및 ITL-LF2로부터 항-EGFR mAb의 정제된 산물 -225μg/ml은 스트렙타비딘이 미리 코팅된 바이오센서에 이전에 부착되었던 비오틴화 AAL (2μg/ml)에 결합되었다. 그래프는 Octet QK 시스템에 의한 동역학적 분석의 연합 단계를 나타낸다. 곡선 각각은 화살표로 표시된 특이적인 샘플을 나타낸다.

도 40은 정제된 완전 항-EGFR mAb 상에서의 시알산 수준의 Octet 분석의 판독이다. O.D 280에 의한 CHO-S 및 ITL-LF2 세포로부터 항-EGFR mAb의 정제된 산물 - 115μg/ml은 스트렙타비딘이 미리 코팅된 바이오센서에 이전에 부착되었던 비오틴화-MAA (10μg/ml)에 결합되었다. 그래프는 Octet QK 시스템에 의한 동역학적 분석의 연합 단계를 나타낸다. 곡선 각각은 화살표로 표시된 특이적인 샘플을 나타낸다.

도 41은 Octet에 의한 정제된 항-EGFR Fc 단량체 상에서의 푸코오스 수준의 분석의 그래프이다. O.D. 280에 의한 CHO-S 세포로부터 그리고 ITL-LF2 세포로부터 항-EGFR mAb의 Fc 분획 - 40μg/ml은 스트렙타비딘이 미리 코팅된 바이오센서에 이전에 부착되었던 비오틴화 AAL (1μg/ml)에 결합되었다. 그래프는 Octet QK 시스템에 의한 동역학적 분석의 연합 단계를 나타낸다. 곡선 각각은 화살표로 표시된 특이적인 샘플을 나타낸다.

도 42는 Octet에 의한 정제된 항-EGFR Fc 단량체 상에서의 시알산 수준의 분석의 그래프이다. O.D. 280에 의한 CHO-S 세포로부터 그리고 ITL-LF2 세포로부터 항-EGFR mAb의 Fc 분획 - 250μg/ml은 스트렙타비딘이 미리 코팅된 바이오센서에 이전에 부착되었던 비오틴화 MAA (10μg/ml)에 결합되었다. 그래프는 Octet QK 시스템에 의한 동역학적 분석의 연합 단계를 나타낸다. 곡선 각각은 화살표로 표시된 특이적인 샘플을 나타낸다.

도 43은 iCE280에 의한 항-EGFR mAb 정제된 산물의 전하 프로파일 분석의 결과를 보여주는 그래프이다. O.D 280에 의한 CHO-S 세포 (■)로부터 및 ITL-LF2 세포 (▲)로부터 항-EGFR mAb의 정제된 산물 0.4mg/ml이 iCE280에 의해 분석되었다. 점은 iCE280 프로파일에서 이소폼(isoform)의 피크 면적의 %를 나타낸다 (도면에서 선은 연속 함수를 나타내는 것이 아니고 단지 동일한 산물의 이소폼을 따라가는 것을 더 쉽게 하기 위해 추가되었음을 유의한다).

도 44는 항-EGFR Fc 분획에 대한 글리칸 프로파일을 제공하는 표이다.

도 45는 ITL-LF2 EGFR mAb 형질감염 세포의 푸코실화 수준에서 갖는 외생 푸코오스의 효과를 설명하는 그래프이다. ITL-LF2 EGFR mAb 형질감염 세포는 0.2x10⁶개 세포/ml의 농도로 상이한 농도의 L-푸코오스와 함께 ProCHO5 배지에 접종되었고 그리고 CO₂와 함께 320rpm의 진탕기의 37℃ 인큐베이터에서 인큐베이션되었다

도 46은 푸코실화 수준 EGFR mAb에서 갖는 외생 푸코오스의 효과를 설명하는 그래프이다.

도 47은 첨가된 외부 푸코오스에 따른 항 EGFR mAb 상에서의 푸코실화 수준의 캘리브레이션(calibration) 곡선이다.

도 48A-B는 Octet에 의한 정제된 항-EGFR Fc 단량체 상에서의 푸코오스 수준의 캘리브레이션 곡선이다. O.D. 280에 의한 CHO-S 세포로부터 및 ITL-LF2 세포로부터 항-EGFR mAb의 Fc 단량체 분획 40μg/ml으로부터의 산물을 혼합함으로써 샘플을 제조하였다. 샘플은 스트렙타비딘이 미리 코팅된 바이오센서에 이전에 부착되었던 비오틴화 AAL (1μg/ml)에 결합되었다. 그래프는 Octet QK 시스템에 의한 동역학적 분석의 연합 단계를 나타낸다. 곡선 각각은 샘플내 특정 %의 푸코오스와 상응한다 (A). 직선 제시 (B).

도 49는 Octet에 의한 부분적으로 푸코실화된 항-EGFR Fc 단량체 분획의 분석이다. O.D. 280에 의한 CHO-S 세포로부터 및 ITL-LF2 세포로부터 항-EGFR mAb의 Fc 단량체 분획 40μg/ml는 스트렙타비딘이 미리 코팅된 바이오센서에 이전에 부착되었던 비오틴화 AAL (1μg/ml)에 결합되었다. 그래프는 Octet QK 시스템에 의한 동역학적 분석의 연합 단계를 나타낸다. 곡선 각각은 특정 샘플과 상응한다.

본 발명의 특정 구체예의 설명

본 발명은, 이의 몇 가지 구체예에서, 제로 푸코오스 CHO 세포 및 세포주, 상기 세포를 발생시키는 방법 및 이의 용도에 관한 것이다.

본 발명의 적어도 한 가지 구체예를 상세히 설명하기 전에, 본 발명은 다음 설명 또는 실시예의 예시화에서 제시된 상세 설명으로의 이의 적용에 필수로 제한되지 않는다는 점이 이해되어야 한다. 본 발명은 기타 구체예가 가능하거나 또는 다양한 방식으로 실시되거나 또는 수행될 수 있다.

재조합 단백질, 가령 향상된 ADCC를 얻기 위한 항체의 푸코실화 수준을 감소시키기 위하여, 본 발명자는 CHO-S 세포로부터 세포주를 발달시켰으며 상기 세포는 변형되어 이의 세포 표면 상에서 변이 글리코실화 패턴을 발현시켰다. 이것은 MTX의 존재에서 세포의 인큐베이션, 그 다음 세포막 상에서 가장 낮은 푸코오스 수준을 갖는 세포의 효율적 선택에 의해 이루어진다.

항체의 Fc 글리코실화 부위 상에 존재하는 αFuc1-6GlcNA 잔기에 대하여 고 친화성을 갖는 푸코오스 특이적 렉틴 (가령, 알레우리아 아우란티아 렉틴 (AAL) 또는 아스퍼질러스 오리재 1-푸코오스-특이적 렉틴(AOL))을 이용하여 자성 구슬 상에서의 단리 및 FACS 분류 (도 7A-B) 또는 FACS 분류 단독 (도 12)에 의해 선택이 수행되었다.

세포막 상에서의 푸코오스 수준에 따라 제로 푸코오스 발현 세포의 선택이 수행되었음에도 불구하고, 동일한 푸코오스 수준이 다양한 방법 (도 33-41)에 의해 분석된 바와 같이, 이들 세포에서 발현되는 재조합 항체 (항 EGFR mAb)에서 발견되었다.

푸코오스를 포함한 배지에서 세포를 인큐베이션함으로써, 본 발명자는 그 안에서 발현되는 재조합 단백질 상에서의 푸코실화의 수준이 조절가능하다는 점을 보여주었다. 이 결과는 재현가능한 것으로 나타났다 (도 49).

추가적으로, 본 발명의 세포의 표현형은 검사된 370 PDL에 대해 안정하다는 것으로 밝혀졌다 (도 15). 따라서 이러한 세포는 그들 스스로를 100 PDL 이상이 요구되는, 재조합 단백질을 위한 생산 세포로서 부여한다.

제로 푸코오스 발현 세포 (ITL-LF2 세포로 명시됨)의 성장률이 푸코오스 안정도 검사 동안에 측정되었고 ITL-LF2가 유래되었던 CHO-S와 유사한, 약 15-20 시간의 모집단 배가 시간 (PDT)을 유발하는 것 (도 11)으로 밝혀졌다.

푸코실화에 관련되는 것으로 공지된 주요 단백질의 분석은 본 발명의 선택된 세포내 GDP-만노오스 4,6-탈수효소 (GMD)의 mRNA 크기가 그들의 야생형 상대물에서보다 더 짧았다는 것으로 나타났고 (도 20) 그리고 서열은 두 개의 스플라이 변이체를 나타내었다. 3번째 및 4번째, 또는 8번째 및 9번째 엑손이 결핍된 세포로부터 mRNA 분자를 추출하였다 (도 21A-B 및 도 22A-B).

본 발명자는 특정한 속성의 세포 유형을 발생시키고 식별하기 위한 본 명세서에서 개시된 방법이 추가적인 유용한 세포 유형을 선택하기 위해 활용될 수 있다는 것을 제시한다.

따라서, 본 발명의 한 측명에 따라, 재조합 단백질을 발현시키기 위해 숙주세포로서 유용한 CHO 세포를 선택하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 다음 단계를 포함한다:

(a) 세포를 MTX와 접촉시킴으로써 CHO 세포의 모집단 내로 유전적 돌연변이를 도입하는 단계,

(b) 돌연변이된 세포를 포함하는 CHO 세포의 모집단을, 이러한 세포의 모집단의 세포막 상의 푸코오스 모이어티(moiety)에 푸코오스 결합제의 결합을 허용하는 시간량 동안 푸코오스 결합제와 접촉시키는 단계, 여기서 시간량은 세포를 죽이는 것을 허용하지 않고; 및

(c) 세포의 모집단으로부터 푸코오스 결합제를 결합시키는 세포의 부분모집단을 제거함으로써, 재조합 단백질을 발현시키기 위해 숙주세포로서 유용한 세포를 선택하는 단계, 여기서 선택된 세포는 제로 푸코오스 함량을 가짐.

본 발명에 따라 적합한 중국 햄스터 난소 조직-유래 CHO 세포 또는 세포주는 중국 햄스터 (크리세툴루스 그리세우스(Cricetulus griseus))의 난소 조직으로부터 확립된 세포주인 임의의 세포이다. 예시는 Journal of Experimental Medicine, 108, 945 (1958); Proc. Nat Acad. Sci. USA, 60, 1275 (1968); Genetics, 55, 513 (1968); Chromosoma, 41, 129 (1973); Methods in Cell Science, 18, 115 (1996); Radiation Research, 148, 260 (1997); Proc. Nat Acad. Sci. USA, 77, 4216 (1980); Proc. Nat Acad. Sci., 60, 1275 (1968); Cell, 6, 121 (1975); Molecular Cell Genetics, Appendix I, II (pp. 883-900); 등과 같은 문서에서 설명된 CHO 세포를 포함한다. 추가적으로, ATCC (The American Type Culture Collection)에 등록된 CHO-K1 (ATCC CCL-61), DUXB11 (ATCC CCL-9096) 및 Pro-5 (ATCC CCL-1781) 그리고 다양한 배지를 이용하여 세포주를 적응시킴으로써 얻은 CHO-S (Life Technologies, Cat #11619) 또는 아-세포주(sub-cell line)가 본 발명에서 활용될 수 있다.

몇 가지 구체예에서, 숙주 세포는 CHO-1E5, CHO-S, CHO/DG44, CHO-3F, 또는 CHO-2.6 클론이다.

돌연변이 유발원 MTX는 푸코오스 합성 경로에 관련된 유전자 또는 폴리펩티드에서 돌연변이를 유발한다.

언급된 바와 같이, 본 발명의 한 측면의 방법은 돌연변이된 세포의 세포막에 이의 결합을 허용하기 위하여 푸코오스 결합제와 CHO 세포의 돌연변이된 모집단을 접촉시키는 단계에 의해 이루어진다.

본 명세서에서 사용된 바와 같은, 구절 "푸코오스 결합제"는 적어도 1x10^-5의 Kd를 갖는 세포 표면 상에서의 푸코오스 모이어티에 결합할 수 있는 임의의 물질 (가령, 렉틴)을 나타낸다. 한 가지 구체예에서 따라서, 푸코오스 결합제는 적어도 1x10^-3의 Kd (Matsumura, Higashida et al. 2009), 가령 적어도 1x10^-4의 Kd, 적어도 1x10^-5의 Kd, 적어도 1x10^-6의 Kd 또는 적어도 1x10^-7의 Kd는 갖는 αFuc1-6GlcNA 잔기에 결합한다.

한 가지 구체예에 따르면, 푸코오스 결합제는 폴리펩티드, 가령 렉틴이다.

본 발명에 의해 고려되는 예시적인 렉틴은 알레우리아 아우란티아 렉틴 (AAL) 또는 아스퍼질러스 오리재 1-푸코오스-특이적 렉틴 (AOL) 및 울렉스 유로패우스 응집소(Ulex europaeus agglutinin) (UEA) 그리고 (Oda, Senaha et al. 2003; Tateno, Nakamura-Tsuruta et al. 2009)에서 개시된 것들을 포함하지만 이에 제한되지 않으며, 상기 문헌의 내용이 참조로서 본 명세서에 편입된다.

언급된 바와 같이, 접촉은 세포막 상의 푸코오스에 푸코오스 결합제의 결합을 허용하는 조건 하에 이루어진다. 한 가지 구체예에 따르면, 렉틴이 이것이 결합하는 세포에 사멸 (즉, 세포 제거)을 유발하지 못하게 하는 조건 하에, 상기 결합이 발생된다.

특정한 구체예에 따르면, 렉틴이 이것이 결합하는 50% 이상의 세포에 사멸을 유발하지 못하게 하는 조건 하에, 상기 결합이 발생된다.

특정한 구체예에 따르면, 렉틴이 이것이 결합하는 40% 이상의 세포에 사멸을 유발하지 못하게 하는 조건 하에, 상기 결합이 발생된다.

특정한 구체예에 따르면, 렉틴이 이것이 결합하는 30% 이상의 세포에 사멸을 유발하지 못하게 하는 조건 하에, 상기 결합이 발생된다.

특정한 구체예에 따르면, 렉틴이 이것이 결합하는 20% 이상의 세포에 사멸을 유발하지 못하게 하는 조건 하에, 상기 결합이 발생된다.

한 가지 구체예에 따르면, 결합은 3시간 미만 동안, 바람직하게는 2시간 미만 동안 그리고 더 바람직하게는 1시간 미만 동안 이루어진다.

한 가지 구체예에 따르면, 본 발명의 이러한 측면의 푸코오스-결합제는 물질에 결합되는 세포 모집단의 제거 (직접적으로 또는 간접적으로)을 허용하는 기능적 모이어티에 부착된다

따라서, 푸코오스 결합제는 형광 모이어티 또는 자성 모이어티를 포함하지만 이에 제한되지 않는, 탐지가능한 모이어티에 부착될 수 있다.

예시적인 형광 모이어티는 형광 또는 이의 유도체, 가령 형광 이소티오시아네이트 (FITC), 오레곤 그린(Oregon Green), 도쿄 그린(Tokyo Green), SNAFL, 카르복시나프토플루오레세인 (CFSE), 카르복시플루오레세인 디아세테이트 석신이미딜 에스테르 (CFDA-SE), 다이라이트(DyLight) 488, 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 488, 녹색 형광 단백질 (GFP), 피코에리트린 (PE), 페리디닌 엽록소 단백질 (PerCP), PE-알렉사 플루오르 700, PE-Cy5 (TRI-COLOR), PE-Cy5.5, PE-알렉사 플루오르 750, PE-Cy7, 알로피코시아닌 (APC), APC-Cy7, 및 이의 유도체를 포함할 수 있다.

대안적으로, 푸코오스 결합제는 친화성 모이어티에 부착된다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "친화성 모이어티"는 예를 들면 비오틴/아비딘, 리간드/수용체 등과 같은 동족 결합 모이어티와의 선택적인 상호작용을 할 수 있는 분자를 나타낸다.

친화성 또는 탐지가능한 모이어티에 푸코오스 결합제를 부착시키기 위해 상세 설명된 프로토콜을 본 명세서의 하기 실시예 부문에서 찾아볼 수 있다.

푸코오스 결합제가 형광 모이어티에 (직접적으로, 또는 간접적으로 동족 결합 분자를 통하여) 부착된다면, 공지된 세포 분류 절차를 이용하여, 가령 형광-활성 세포 분류기 (FACS)를 이용함으로써 돌연변이된 세포 모집단에서 원하지 않는 세포가 제거될 수 있다는 점이 이해될 것이다.

가령, Becton Dickinson FACScan 및 FACScaliber (BD Biosciences, Mountain View, CA)를 포함하여 다수의 세포 유동 세포계산기(flow cytometer)가 상업적으로 이용가능하다. FACS 분석을 위해 이용될 수 있는 항체가 Schlossman S, Boumell L, et al, [Leucocyte Typing V. New York: Oxford University Press; 1995]에서 교시되고 그리고 널리 상업적으로 이용가능하다.

푸코오스 결합제가 자성 모이어티에 (직접적으로, 또는 간접적으로 동족 결합 분자를 통하여) 부착된다면, 자성 활성화 세포 분리에 의해 돌연변이된 세포 모집단에서 원하지 않는 세포가 제거될 수 있다.

푸코오스 결합제가 친화성 모이어티에 부착된다면, 동족 결합 분자를 이용한 친화성 정제에 의해 돌연변이된 세포 모집단에서 원하지 않는 세포가 제거될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 푸코오스 결합제가 비오틴에 부착된다면, 스트렙타비딘 구슬 또는 칼럼을 이용한 정제에 의해 돌연변이된 세포 모집단에서 원하지 않는 세포가 제거될 수 있다. 예를 들어, 푸코오스 결합제가 항체 또는 항체의 Fc에 부착된다면, 단백질 A 구슬 또는 칼럼을 이용한 정제에 의해 돌연변이된 세포 모집단에서 원하지 않는 세포가 제거될 수 있다.

상기 본 명세서에서 언급된 바와 같이, 동족 결합 분자는 그 자체로, 탐지가능한 모이어티에 부착될 수 있고 그리고 동족 결합 분자의 첨가 후, FACS 또는 MACS를 통하여 제거가 이루어진다.

원하지 않은 세포 모집단의 제거는 다수 회 (가령, 2, 3 또는 그 이상 회)의 순차적 제거 단계로 이루어질 수 있다. 추가적으로, 제거 단계는 동일한 방법 (가령, FACS 기반 분리 단독으로)을 이용하여 다수 회의 순차적 제거 단계를 포함할 수 있거나 또는 다수의 상이한 방법 (가령, 자성 기반 분리, 그 다음 형광 기반 분리)을 결합시킬 수 있다.

한 가지 구체예에 따르면, 제거 횟수 및 특정 방법은 푸코오스-결합제를 결합시키는 세포가 실질적으로 제거되도록 선택된다.

용어 "실질적으로 제거됨"은 적어도 50% 이상의 특정 세포 유형, 가령 적어도 약 75%, 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 97%, 가령 적어도 99%, 99.5%, 99.9% 이상의 특정 세포 유형의 제거를 의미하는 것으로 의도된다.

특정 구체예에 따르면, 푸코오스-결합제를 결합시키는 세포가 실질적으로 제거되며 세포막 상에서 제로 푸코오스를 갖는 세포만이 유지된다.

상기 제거 후, 외부 푸코오스가 세포에 첨가된다면, 특정량의 푸코오스 함량을 가진 다양한 세포가, 첨가된 푸코오스의 양에 의존하여, 얻어질 수 있다.

따라서, 또다른 구체예에 따르면, 야생형 세포 (즉, 메토트렉세이트 처리 전)와 비교하여 이들 세포막 상에서 50% 미만의 푸코오스를 가진 CHO 세포가 얻어진다.

또다른 구체예에 따르면, 야생형 세포 (즉, 메토트렉세이트 처리 전)와 비교하여 이들 세포막 상에서 40% 미만의 푸코오스를 가진 CHO 세포가 얻어진다.

또다른 구체예에 따르면, 야생형 세포 (즉, 메토트렉세이트 처리 전)와 비교하여 이들 세포막 상에서 30% 미만의 푸코오스를 가진 CHO 세포가 얻어진다.

또다른 구체예에 따르면, 야생형 세포 (즉, 메토트렉세이트 처리 전)와 비교하여 이들 세포막 상에서 20% 미만의 푸코오스를 가진 CHO 세포가 얻어진다.

또다른 구체예에 따르면, 야생형 세포 (즉, 메토트렉세이트 처리 전)와 비교하여 이들 세포막 상에서 10% 미만의 푸코오스를 가진 CHO 세포가 얻어진다.

본 발명의 세포 모집단의 단리 후, 그들은 배양에서, 그리고 배양을 증식시키는 데에 이용될 수 있는 임의의 장치에서 증식될 수 있으며, 상기 장치는 발효기 또는 생물반응기를 포함한다. 그들은 단층으로 증식될 수 있거나 또는 표면에 부착될 수 있다. 대안적으로, 단리된 세포 모집단은 현탁액에서 증식될 수 있다.

세포는 무-혈청인 배양 배지에서 증식될 수 있다. 배지는 예를 들어 글루타민, 가령 8mM L-글루타민으로 보충된 ProCHO5 (Lonza, 카탈로그 #BE12-766Q), CHO DHFR^- 배지 파우더(Medium Powder) (SAFC Bioscinces, 카탈로그 #C6614) 또는 Opti-CHO (Invitrogen, 카탈로그 #12681)를 포함하지만 이에 제한되지 않는 상업적으로 이용가능한 배지일 수 있다.

한 가지 구체예에 따르면, 배지는 제노 오염물질이 없다, 즉 동물 유래 성분이 없다.

또 다른 구체예에 따르면, 세포는 무한 증식을 위해 허용하는 조건 (가령, 배지 및 공간) 하에 세포 배양에서 증식된다 - 즉 세포주.

단리된 CHO 세포는 배양에서 다수의 계대를 위해, 그들의 변이 글리코실화 패턴 (즉 낮은 푸코오스 발현)을 유지할 수 있다, 즉 높은 안정도를 갖는다. 변형된 CHO 숙주 세포는 370회 계대 후에도 이의 변이체 글리코실화를 유지할 수 있다는 것이 한 가지 구체예에 따라서 밝혀졌다.

본 발명자는 본 명세서에서 설명된 방법에 따라 선택된 CHO 세포는 특정한 표현형, 가령 이들 세포막의 낮은 푸코실화의 원인이 되는 돌연변이된 GDP-만노오스 4,6-탈수효소 (GMD)의 발현을 갖는다는 것을 밝혀내었다.

돌연변이 유발 후, 세포는 기능상실 돌연변이를 가진 적어도 하나의 GMD 대립유전자를 포함할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "대립유전자"는 대립유전자가 형질 또는 특성과 관련된 모든, 유전자 자리의 하나 이상의 대안적 형태 중 어느 하나를 나타낸다. 이배체 세포 또는 유기체에서, 주어진 유전자의 두 가지 대립유전자는 상동 염색체 쌍의 상응하는 유전자 자리를 차지한다.

"기능상실 돌연변이"는 유전자 서열내 돌연변이이며, 이는 유전자 산물, 주로 단백질의 기능 감소 또는 완전한 부재를 유발한다. 예를 들면, 기능 상실 돌연변이는, 프레임쉬프트(frameshift) 또는 넌센스(nonsense) 돌연변이 로 인한 유전자 산물의 절단에 의해 유발될 수 있다. 기능상실 돌연변이를 가진 대립유전자와 연관된 표현형은 주로 열성이지만, 우성이될 수도 있다.

본 발명은 또한, GMD의 대립유전자 둘 모두가 기능상실 돌연변이를 지니고 있는 세포를 고려한다는 점이 이해될 것이다. 이러한 경우, GMD는 동형접합 형태로 또는 이형접합 형태로 있을 수 있다. 본 구체예에 따르면, 동형접합성은 GDM 유전자 자리에서의 대립유전자 둘 모두가 동일한 뉴클레오티드 서열로 특징되는 조건이다. 이형접합성은 GMD 유전자 자리에서의 유전자의 상이한 조건을 나타낸다.

구체적으로, 본 발명자는 돌연변이 유발 후 CHO 세포 및 본 발명의 선택 절차가 서열번호: 23 및 24에서 제시된 바와 같은 두 가지 GMA 변이체 형태를 발현할 수 있으며, 이는 GMD 유전자의 엑손 3 및 4, 그리고 엑손 8 및 9의 결실과 각각, 상응하다는 것을 밝혀내었다.

따라서, 본 발명의 또 다른 한 측면에 따르면, 유전학적으로 변형되어 서열번호: 23 및/또는 24에서 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 돌연변이된 GDP-만노오스 4,6-탈수효소 (GMD)를 발현하는 단리된 CHO 세포가 제공된다.

본 발명의 이 측면의 세포가 기능적 푸코실 전달효소-8 (Fut8)을 발현한다는 것이 밝혀졌다. 기능적 Fut8은 서열번호: 29에서 제시된 바와 같은 폴리펩티드 서열을 갖는 야생형 Fut8일 수 있다.

추가적으로, 본 발명의 세포는 기능적 GDP-케오-6-데옥시만노오스 3, 5-에피머화효소, 4-환원효소 (FX)를 발현한다. 기능적 FX는 서열번호: 30에서 제시된 바와 같은 폴리펩티드 서열을 갖는 야생형 FX일 수 있다.

본 발명자는 본 명세서에서 설명된 방법에 따라 발생된 CHO 세포가 수확될 수 있거나 또는 수집될 수 있는 글리코단백질, 가령 항체 또는 Fc 융합 단백질을 생산하는 데에 이용될 수 있다는 것을 보여주었다. 본 명세서에서 추가로 설명된 바와 같이, 글리코단백질은 분비될 수 있고, 변이 푸코실화 패턴을 나타낼 수 있고, 및/또는 치료학적 용도를 가질 수 있다. 이러한 글리코단백질은 본 명세서에서 추가로 설명된 바와 같이, 예를 들면 항체, 가령 비변형된 부모 숙주 세포에서 생산된 상응하는 항체와 비교하여 증가된 ADCC 활성도를 갖는 항체일 수 있다.

본 명세서에서 사용된 바와 같은 "항체-의존 세포-매개 세포독성" (ADCC)은 FcRs (가령 자연 살해 (NK) 세포, 중성구, 및 대식세포)를 발현하는 이펙터 세포가 표적 세포 상에서 결합된 항체를 인식하고 그 다음에 표적 세포의 세포용해를 유발하는 세포-매개 반응을 나타낸다. ADCC를 매개하기 위한 일차 세포는 NK 세포, 단핵구, 및 대식세포를 포함한다. NK 세포는 전형적으로 Fc.감마.RIII을 우세하게 발현하는 반면에, 단핵구는 Fc.감마.RI, Fc.감마.RII 및 Fc.감마.RIII을 발현한다. 조혈 세포 상에서 FcR 발현은 Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)에서 요약된다.

"이펙터 세포"는 하나 이상의 FcRs를 발현하는 백혈구이고 이펙터 기능(들)을 수행한다. 바람직하게, 세포는 적어도 Fc.감마.RIII을 발현하고 ADCC 이펙터 기능을 수행한다. ADCC를 매개하는 인간 백혈구의 예시는 말초 혈액 단핵 세포, (PBMC), 자연 살해 (NK) 세포, 단핵구, 세포독성 T 세포 및 중성구를 포함하며; 여기서 PBMC 및 NK 세포가 바람직하다. 이펙터 세포는 이의 원형 공급원으로부터, 즉 상기 설명된 바와 같은 혈액 또는 PBMC로부터 단리될 수 있거나, 또는 해당 분야에서 공지된 방법을 이용하여 시험관 내에서 증식될 수 있다.

한 가지 구체예에서, 본 발명의 CHO 세포주로부터 생산된 항체는 대상 항체가 비교가능한 양으로 적용될 때, 부모 숙주 세포에 의해 생산된 상응 항체보다 더욱 효과적으로, 인간 이펙터 세포의 존재에서 항체-의존 세포-매개 세포독성 (ADCC)을 매개한다. 일반적으로, ADCC 활성도는 본 명세서에서 개시된 어세이(assay)를 이용하여 확인될 수 있지만, 가령 동물 모델에서는, ADCC 활성도를 측정하기 위한 다른 어세이 또는 방법이 고려된다. 본 발명의 CHO 세포주로부터 얻은 항체는 가령, 참조로서 본 명세서에 편입된, 미국 특허 공개공보 제2010/0081150호에서 추가로 설명된 바와 같은 생체내 또는 시험관내 어세이 시스템에서, ADCC를 매개하는 데에 있어서 모체 항체보다 효과적이다.

이에 따라서, 이전에 변형되어 변이 푸코실화 패턴을 산출한 본 개시의 단리된 세포 모집단 또는 세포주는 비상동 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하기 위하여 추가로 변형될 수 있다. 이러한 서열은 유전자 또는 유전자 단편, 전령 RNA (mRNA), 운반 RNA, 리보솜 RNA, 리보자임 등의 코딩 또는 비-코딩 영역을 포함할 수 있다. 비상동 서열은 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 아미노산 서열을 나타내는, 단백질성 모이어티를 인코딩할 수 있으며, 이는 임의의 길이의 아미노산의 중합체를 포함한다.

비상동 폴리뉴클레오티드 서열은 전형적으로 프로모터에 (즉, 발현 벡터 내로) 작동가능하게 연결되어(operatively linked) 재조합 폴리펩티드의 발현을 가능하게 한다.

한 가지 구체예에 따르면, 본 발명의 CHO 세포의 형질감염은 외생 푸코오스의 존재에서 이루어진다. 푸코오스의 고려되는 농도는 1-20μg/ml - 가령 10μg/ml를 포함한다.

도 45 및 48에서 설명된 바와 같이, 재조합 폴리펩티드의 푸코실화의 양은 푸코오스내 형질감염된 세포를 인큐베이팅함으로써 조절될 수 있다. 푸코오스의 고려되는 농도는 1-10μg/ml, 가령 2.5-5μg/ml - 가령 3.5μg/ml를 포함한다.

따라서, 그들의 세포막 상에서 푸코실화되지 않는 그리고 변화하는 정도의 푸코실화의 단백질을 발현할 수 있는 CHO 세포의 모집단이 제공되며, 푸코실화의 양은 형질감염 시간에, 그리고 형질감염 후 배양 배지내 푸코오스 양에 의존한다. 재조합 폴리펩티드의 푸코실화 양은 0 내지 100%의 범위에 있을 수 있다.

삽입된 코딩 서열의 전사 및 번역을 위한 필수 요소를 함유하는 것 이외에, 활용된 발현 구조체는 발현된 펩티드의 안정도, 생산, 정제, 산출량 또는 독성을 향상시키도록 조작된 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 몇 가지 구체예의 단백질 및 비상동 단백질을 포함하는 융합 단백질 또는 절단성 융합 단백질의 발현이 조작될 수 있다. 이러한 융합 단백질은 융합 단백질이 친화성 크로마토그래피에 의해; 가령 비상동 단백질에 특이적인 칼럼 상에 고정시킴으로써 쉽게 단리될 수 있도록 설계될 수 있다. 단백질 및 절단성 융합 단백질 사이에서 절단 부위가 조작되는 경우, 절단 부위를 파괴하는 적절한 효소 또는 물질로의 처리에 의해 크로마토그래피 칼럼으로부터 절단성 융합 단백질이 방출될 수 있다 [가령, Booth et al. (1988) Immunol. Lett. 19:65-70; 및 Gardella et al., (1990) J. Biol. Chem. 265:15854-15859를 참고].

한 가지 구체예에 따르면, 정제는 외생 푸코오스의 부재에서 수행된다.

핵산의 제조는 다양한 정례적 재조합 기술 및 합성 절차에 의해 수행될 수 있다. 표준 재조합 DNA 및 분자 클로닝 기술은 해당 분야에서 잘 공지되고 Sam brook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, (1989) (Maniatis)에 의해 및 T. J. Silhavy, M. L. Bennan, and L. W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1984)에 의해 및 Ausubel, F. M. et al, Current Protocols in Molecular Biology, pub. by Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience (1987)의해 설명된다. 간략하게, 대상 핵산은 유전체 DNA 단편, cDNA 및 RNA로 제조될 수 있으며, 이들 모두는 세포로부터 직접적으로 추출될 수 있거나 또는 PCR 및 rt-PCR을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 다양한 증폭 공정에 의해 재조합적으로 생산될 수 있다.

언급된 바와 같이, 본 발명의 CHO 세포는 항체의 생산을 위해 숙주 세포로서 이용될 수 있다. 항체는 단일클론성 또는 다클론성일 수 있다.

몇 가지 구체예에서, 항체는 저해 항체이다. 저해 항체는 항체가 결합하는 항원의 하나 이상의 생물학적 활성도를 저해할 수 있다. 예를 들어, 저해 항체는 항원의 활성도를 저해함으로써 상응하는 항원의 신호 전달을 하향조절할 수 있거나 또는 항원이 발현을 저해할 수 있다. 몇 가지 구체예에서, 항체는 중화 항체이다. 중화 항체는 용해성 항원 또는 살아 있는 유기체, 가령 감염 물질의 몇몇 생물학적 활성도를 감소시키거나 또는 폐지하였다. 중화 항체는 이의 항원에 대해 중성 리간드 또는 수용체와 경쟁할 수 있다. 몇 가지 구체예에서, 항체는 자극성 또는 활성화 항체이다. 자극성 또는 활성화 항체는 항원의 결합시 상응하는 항원의 신호 전달을 활성화하여 그렇게 함으로써 항원의 활성도를 활성화하거나 상향조절할 수 있거나, 또는 항체가 결합하는 항원의 발현을 상향조절 할 수 있는 작용(agonist) 항체일 수 있다.

본 발명에서 사용된 바와 같은 용어 "항체"는 다음과 같이 정의된 바와 같이, 완전 분자 그리고 이의 기능적 단편, 가령 Fc 융합 단백질을 포함한다: 직접적으로, 또는 적합한 폴리펩티드 연결자를 통하여 또다른 폴리펩티드 또는 단백질에 연결된 중쇄의 불변부를 함유한 유전학적으로 조작된 분자.

비-인간 (가령, 쥣과) 항체의 인간화된 형태는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소한의 서열을 함유한 면역글로불린의 키메라 분자, 면역글로불린 사슬 또는 단편이다. 인간화 항체는 인간 면역글로불린 (수령자 항체)을 포함하며, 여기서 수령자의 상보적 결정 영역 (CDR)을 형성하는 잔기가 비-인간 종 (공여자 항체), 가령 바람직한 특이성, 친화성 및 능력을 갖는 마우스, 랫트 또는 토끼의 CDR로부터의 잔기로 대체된다. 몇몇 경우에는, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 잔기는 상응하는 비-인간 잔기로 대체된다. 인간화 항체는 또한 수여자 항체에서 또는 도입된　CDR이나 프레임워크 서열에서도 찾아볼 수 없는 잔기를 포함할 수 있다.　일반적으로,　인간화 항체는　적어도 하나,　및 전형적으로 두 개의 가변 도메인 모두를　실질적으로 포함할 것이며,　여기서　모든 또는 실질적으로 모든　CDR　영역은 비-인간 면역글로불린의 것에 상응하고 그리고 모든 또는 실질적으로 모든　FR　영역은 인간 면역글로불린 공통 서열의 것이다. 인간화 항체는 면역글로불린 불변 영역 (Fc), 전형적으로 인간 면역글로불린의 불변 영역의 적어도 일부를 최적으로 또한 포함할 것이다. [Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-329 (1988); 및 Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992)].

한 가지 구체예에서, 경쇄 및 중쇄는 동일한 또는 상이한 종 중 하나의 별개의 변형된 숙주세포 배양물로 변형될 수 있다. 대안적인 구체예에서, 경쇄 및 중쇄에 대한 별개의 플라스미드가 단일 변형된 숙주 세포 배양물을 공동-변형시키는 데에 이용될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 둘 모두의 유전자를 함유하고 경쇄 및 중쇄 둘 모두에 대해 유전자를 발현할 수 있는 단일 발현 플라스미드는 단일 변형 숙주 세포 배양물로 변형될 수 있다.

중쇄 및 경쇄가 동일한 숙주 내에서 공동발현될 때, 단리 절차는 재구성된 항체를 수복하기 위하여 설계된다. 이것은 기존의 항체 정제 절차, 가령, 단백질 A-세파로오스, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석, 또는 친화성 크로마토그래피에 의해 수행될 수 있다.

본 발명의 세포에서 생산될 수 있는 재조합 항체는 항체의 이펙터 기능을 증가시키기 위하여 변이 푸코실화 패턴을 갖는다. 바람직하게, 본 발명의 재조합 항체는 ADCC 관련 푸코오스 잔기인 Fc 단량체 상에서 낮은 푸코오스 수준을 가지며, 그렇게 함으로써 항체의 항체-의존 세포성 세포독성 (ADCC)의 활성도를 증가시킨다.

한 가지 구체예를 따르면, 생산된 항체는 IgG1 또는 IgG3 유형 항체이다.

변이 푸코실화 패턴을 갖는 및/또는 본 개시의 변형된 CHO 숙주 세포에 의해 생산된 항체는 항원, 가령 암 항원을 결합시킬 수 있다. 암 항원은 HER2, 면역글로불린 엡실론 Fc 수용체 II, Alk-1, CD20, EGF 수용체, VEGF 수용체, FGF 수용체, NGF 수용체, PDGF 수용체, EpCam, CD3, CD4, CD11a, CD19, CD22, CD30, CD33, CD38, CD40, CD51, CD55, CD80, CD95, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CTLA-4, 뮤신 1, 뮤신 16, 엔도글린, 메소텔린 수용체, Nogo 수용체, 엽산 수용체, CXCR4, 인슐린-유사 성장인자 수용체, 갱글리오사이드 GD3, 및 알파 및 베타 인테그린으로 구성된 그룹으로부터 선택될 수 있다.

본 발명의 세포에서 생산된 예시적인 항체는 아달리무맙(adalimumab) (Humira^RTM), 알렘투주맙(alemtuzumab) (Campath^RTM), 바실릭시맙(basiliximab) (Simulect^RTM), 베바시주맙(bevacizumab) (Avastin^RTM), 세투시맙(cetuximab) (Erbitux^RTM), 다클리주맙(daclizumab) (Zenapax^RTM), 다세투주맙(dacetuzumab), 에팔리주맙(efalizumab) (Raptiva^RTM), 에프라투주맙(epratuzumab), 이브리투모맙(ibritumomab) (Zevalin^RTM), 티욱세탄(tiuxetan), 인플릭시맙(infliximab) (Remicade^RTM), 무로모납(muromonab)-CD3 (OKT3), 오말리주맙(omalizumab) (Xolair^RTM), 팔리비주맙(palivizumab) (Synagis^RTMoregovomab (OvaRex^RTM), 리툭시맙(rituximab) (Rituxan^RTM), 트라스투주맙(trastuzumab) (Herceptin^RTM), 오크렐리주맙(ocrelizumab), 페르투주맙(pertuzumab), hu M195Mab, 항-A베타, 항-CD4, 항-oxLDL, 트라스투주맙(trastuzumab)-DM1, 아포맙(apomab), rhuMAb GA101, 항-OX40L, 이필리무맙(ipilimumab), 우스텍키누맙(ustekinumab), 골리무맙(golimumab), 오파투무맙(ofatumumab), 잘루투무맙(zalutumumab), 모타비주맙(motavizumab), 에크로멕시맙(ecromeximab), MDX010, 4B5, TNX-901, IDEC-114 및 항원에 대해 특이적이고 ADCC를 도입할 수 있는 임의의 Fc 항체 단편을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "약"은 ±10%를 나타낸다.

용어 "함유한다", "함유한", "포함한다", "포함하는", "갖는" 및 그들의 어원이 같은 단어는 "를 포함하지만 이에 제한되지 않는"을 의미한다.

이 출원을 통하여, 본 발명의 여러 가지 구체예는 범위 형식으로 제시될 수 있다. 범위 형식내 설명은 단지 편의 및 간결성을 위한 것으로 이해되어야 하고 그리고 본 발명의 범위에서 불가변 제한으로서 이해되어서는 안된다. 이에 따라, 범위의 설명은 구체적으로 개시된 가능성 있는 모든 범위 그리고 그 범위 내에 있는 개별적인 수치를 갖는 것으로 간주되어야 한다. 예를 들면, 실질적으로 개시된 범위, 가령 1 내지 6의 설명은 구체적으로 개시된 아범위, 가령 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 6, 3 내지 6 등, 그리고 그 범위 내에 있는 개별적인 수를 갖는 것으로 간주되어야 한다.

수치 범위가 본 명세서에서 지정될 때 마다,　이는 지정된 범위 내에서 임의의 인용된 수　(분수 또는 정수)를 포함하는 것으로 여겨진다.　구절,　일차 지정된 수와 이차 지정된 수　"사이의 범위에 이르는/사이의 범위"　및 일차 지정된 수　"내지"　이차 지정된 수　"의 범위에 이르는/의 범위"는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용되며 일차 및 이차 지정된 수 그리고 그들 사이의 모든 분수 및 정수를 포함하는 것으로 여겨진다.

본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "방법"은 공지된 또는 화학적, 약물학적, 생물학적, 생화학적 및 의학적 기술의 시행자에 의해 공지된 방식, 수단, 기술 및 절차로부터 쉽게 개발된 이들 방식, 수단, 기술 및 절차를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 주어진 작업을 수행하기 위한 방식, 수단, 기술 및 절차를 나타낸다.

명확성을 위해, 개별적인 구체예의 맥락에서 설명된, 본 발명의 특정한 특징은 단일 구체예에서 조합으로 또한 제공될 수 있다는 점이 이해된다. 역으로, 간결성을 위해 단일 구체예의 맥락에서 설명된, 본 발명의 다양한 특징이 또한 개별적으로 또는 임의의 적합한 부분조합에서 또는 본 발명의 설명된 임의의 기타 구체예에서 적합한 것으로서 제공될 수 있다. 여러 가지 구체예의 맥락에서 설명된 특정한 특징은 구체예가 이들 요소없이 실행불가능하게 되는 경우가 아닌 한, 이들 구체예의 필수적인 특징으로 간주되지는 않는다.

상기 설명된 바와 같은 및 하기 청구범위 부문에서 청구된 바와 같은 본 발명의 여러 가지 구체예 및 측면은 다음 실시예에서 실험적 지원을 알아낸다.

실시예

이제,　상기 설명과 함께 비제한 방식으로 본 발명의 몇 가지 구체예를 설명하는,　다음 실시예를 참고할 것이다.

일반적으로, 본 명세서에서 사용된 용어 및 본 발명에서 활용된 실험 절차는 분자, 생화학, 미생물학 및 재조합 DNA 기술을 포함한다. 이러한 기술은 문헌에서 완전하게 설명된다. 예를 들어, "Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et al., (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York (1988); Watson et al., "Recombinant DNA", Scientific American Books, New York; Birren et al. (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998); 미국 특허 제4,666,828호; 제4,683,202호; 제4,801,531호; 제5,192,659호 및 제5,272,057호에서 제시된 바와 같은 방법론; "Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumes I-III Cellis, J. E., ed. (1994); "Culture of Animal Cells - A Manual of Basic Technique" by Freshney, Wiley-Liss, N. Y. (1994), Third Edition; "Current Protocols in Immunology" Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites et al. (eds), "Basic and Clinical Immunology" (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell and Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman and Co., New York (1980)을 참고; 이용가능한 면역어세이는 특허 및 과학 문헌에서 광범위하게 설명되며, 예를 들어 미국 특허 제3,791,932호; 제3,839,153호; 제3,850,752호; 제3,850,578호; 제3,853,987호; 제3,867,517호; 제3,879,262호; 제3,901,654호; 제3,935,074호; 제3,984,533호; 제3,996,345호; 제4,034,074호; 제4,098,876호; 제4,879,219호; 제5,011,771호 및 제5,281,521호를 참고; "Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J., ed. (1984); "Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1985); "Transcription and Translation" Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1984); "Animal Cell Culture" Freshney, R. I., ed. (1986); "Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984) 및 "Methods in Enzymology" Vol. 1-317, Academic Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al., "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996)을 참고; 이들 모두 본 명세서에서 완전하게 제시된 바와 같이, 참조로서 편입된다. 일반적인 기타 참고문헌이 이 문헌에서 내내 제공된다. 본 명세서내 절차는 해당 분야에서 잘 공지된 것으로 간주되고 독자의 편의를 위해 제공된다. 본 명세서내 포함된 모든 정보는 참조로서 본 명세서에 편입된다.

일반적인 재료

세포:

배양 배지 Sigma C6614에 적응된 CHO-S (GibcoBRL, Cat. # 11619) 세포가 확립되었다.

200nM MTX에서 배양된 C6614내 CHO-S.

C6614내 CHO-Dukx.

ProCHO-5내 CHO-S1.

플라스미드: PGL3 항 EGFR mAb EMCV-PAC1-DHFR 탠덤-872; pTT5 벡터; pCMV-P.

시약

AccuPrime Pfx Invitrogen DNA 중합효소 Cat No. 12344-024;

인증된 아가로오스 분자 생물학, IBI 아가로오스, Cat # IB70042;

소혈청 알부민 분획 용액 (BSA), 7.5%, Sigma, Cat. # A8412;

알레우리아 아우란티아 렉틴 AAL: 1mg/ml, cat: L-1390, 벡터;

아스퍼질러스 오리재 렉틴 AOL, 5mg/ml Cat. L0169, EY

암피실린 - Sigma Cat. # A9518;

ELISA를 위한 항체: 포획: 염소 항-인간 IgG (H+L), Jackson Immuno Research Cat. #109-005-088 (USA). 탐지: 염소 항-인간 IgG Fc (Fab₂), Jackson Immuno Research Cat. #109-036-098 (USA);

요구시 베타 액틴 어세이 (Q-PCR을 위한 프로브 및 프라이머) - ABI Cat. #RN00667869_m1;

비오틴 (EZ-Link® NHS-PEG4-비오틴, No-Weigh™ Format, cat: 21329, Thermo Cat. # 21329;

비오틴화 AAL 1mg 활성 접합체, 벡터, Cat. # B-1395;

비오틴화 MAL 1mg, EY, Cat. # BA-7801-2;

소 혈청 알부민 (BSA), Bovostar. Bovogen Cat . # BSAS.01;

셀 부스트, HyClone, Cat. # SH30866.01;

CHO CD EfficientFeed™ A, Invitrogen, Cat. # A10234-01

CHO CD EfficientFeed™ B, Invitrogen, Cat. # A10240-01

시트르산, Sigma Cat. # C-1909;

덱스트란 설페이트 나트륨 염, Sigma, Cat. # D4911;

DH5α 컴피턴트(competent) 박테리아 - Life-Technologies Cat. # 18263-012;

DMSO, Merck, Cat. # 1.02931.1000;

DNA 래더(ladder): DNA에 대하여 1 kb 래더- Biolabs Cat No. #3232L;

DNA 래더: DNA에 대하여 100bp 레더 - Biolabs Cat No. #3231L;

DTT, Cat: D9779, Sigma;

EDTA, Sigma, Cat. # E7889;

에탄올 Merck Cat. # 00983.1000;

EZ-Link® NHS-PEG4-비오틴, No-Weigh™ Format, cat: 21329, Thermo Fisher Scientific Inc USA;

FACS Accudrop Beads, Becton Dickinson, Cat. # MAB345249;

푸코오스, Sigma, Cat. # F2252;

글루코오스, Sigma, Cat. # G7021;

글루타민, Biological Industries, Cat. # 03-020-1A;

글루타민, Sigma, Cat. # G5972;

글라이신, Merck, Cat. # 4201;

구아니딘-HCl, cat: G3272, Sigma;

Hepes 1M, Invitrogen, Cat. # 15630-056;

고성능 cDNA 역전사 키트, Applied Biosystems Cat. #4368814;

HTX50, Biological Industries, Cat. # 03-085-1C;

염산, Merck, Cat. # UN-1789 1.00317.2500;

iCE 280 메틸 셀룰로오스 1%, Cat.#102220 및 101876, Convergent Biosciences, (Canada);

iCE 280 파르말리트(pharmalyte) 3-10, Cat.#10-0456-01, GE Healthcare (Germany);

iCE 280 pI 마커 6.14 및 9.5, 각각, Cat.#102220 및 101996, Convergent Biosciences, (Canada);

iCE 280 시스템 적합성 키트, Cat.#102093-j, Convergent Biosciences, (Canada);

iCE280 IEF 키트 Convergent Biosciences;

IMag 완충액, Becton Dickinson, Cat. # 552362;

IMag SA Particles Plus - DM, Becton Dickinson, Cat. # 557812;

요오드아세트아미드, cat: I1149, Sigma;

ITSX100, Invitrogen, Cat. # 51500-056;

LB + 암피실린 플레이트 - Hy-Labs Cat. #PD178;

L-시스테인, Cat: C7352, Sigma;

리포펙타민(LipofectAmine), Invitrogen, Cat　# 50470;

마악키아 아무렌시스(Maackia amurensis) 응집소 1mg/ml, cat: L8025, Lot: 036k4075 Sigma;

MAA-FITC, 2ml 완충액내 2mg, EY, Cat. # F-7801-2;

말레이미드, cat: 129585, Lot: S56783-278 Sigma;

Na₂PO₄. 2H₂O, Merck, Cat. # 6580;

NaH₂PO₄.H₂O, Merck, Cat. # 6346;

Octet QK 시스템, 동역학 완충액 x10 cat # 18-5032 Fortebio. Fortebio Inc, USA;

파파인, Cat: P3125, Sigma. 0.05 M 나트륨 아세테이트에서 제공됨, 0.05% 티몰을 함유한 pH 4.5;

페놀 레드, Sigma, Cat. # P0290;

플루로닉(Pluronic) F-68, Sigma Cat. # P5556;

폴리에틸렌이민 파우더, Linear MW 25000, Polysciences, Cat. # 23966;

프로테아제 저해제 칵테일, Sigma Cat. # P8340;

프로테아제 저해제, Sigma, Cat. # P8340;

단백질 A 세파로오스 - Mab Select Xtra, Cat.#17-5269-07, Lot# 10011545;

단백질 G 자성 구슬, Biolabs, Cat. # S1430;

퓨로마이신, Invivogen, Cat. # Ant-pr 5;

퓨로마이신, Sigma Cat. # P8833;

참고 샘플: MERCK SERONO lot #7820907로부터의 주입을 위한 ERBITUX^® 5mg/ml 용액;

제한 효소는 New England Biolabs로부터 구입되었음;

R-피코에리트린-접합된 스트렙타비딘 (SA-PE) 0.2mg/ml, Biolegend, Cat. # 405203;

R-피코에리트린-접합된 스트렙타비딘 (SA-PE), Jackson, Cat. # 016-110-084;

탈지 우유 파우더, Fluka. Cat. # 70166;

나트륨 바이카보네이트, Merck, Cat. # 6329;

나트륨 카보네이트, Merck, Cat. # 6392;

염화 나트륨, Merck, Cat. # 6404;

수산화나트륨 펠렛(pellet), Merck Cat. #1.06498.5000;

SuperScript® III CellsDirect cDNA 합성 키트, Invitrogen Cat. #18080-051;

SYBR Safe DNA 겔 염색, DMSO내10000x, Invitrogen, Cat # S33102;

TMB 용액, Cat: 1928, Savyon Diagnostics;

TransIT-PRO 시약 키트, Mirus, Cat. # Mir5700;

트리스-HCl, cat: T3038, Lot: 037K8402, Sigma;

트윈20, cat: 8.17072, Merck;

발프론 산 나트륨 염, Sigma, Cat. # P4543.

용액

비오틴화 AAL-SA-PE 혼합물: PBS+0.1 플로론산내 비오틴화 AAL 20μg/ml 및 SA-PE 2μg/ml;

탈색 1% - FACS 클린(Clean), Becton Dickinson, Cat. # 340345;

ELISA 어세이 완충액 -PBS내 1% 탈지 우유 파우더;

ELISA 차단 용액 - PBS내 1% BSA/0.05% 트윈-20;

ELISA 포획 (코팅) 용액 - 염소 항-인간 IgG (H+L)는 0.1 M 카르보네이트 완충액 pH 9.6에서 2 mcg/ml의 최종 농도까지 1:900 희석되었음;

ELISA 표준 곡선 샘플: 참고 샘플 Erbitux (EMD Lot-7820907, 5.0mg/ml)는 100ng/ml까지 어세이 완충액으로 희석되었고, 그 다음 최대 1.56ng/ml까지 2배 연속 희석되었음. 표준점 농도 각각은 적어도 1ml의 최종 부피로 제조되었음;

ELISA 세척 완충액 - PBS내 0.05% 트윈-20;

조제 완충액(Formulation buffer): 염화 나트륨 11.7gr (100mM); 시트르산4.2gr (10mM); 글라이신 15gr (100mM); 수산화나트륨으로　pH 5.8까지 맞추고　WFI로 채워　부피를　2 리터까지 완료시킴;

iCE 280 러닝 스톡(running stock) 용액: 70mcl의 1% 메틸-셀룰로오스, 1mcl의 6.14 및 9.5 pI 마커, 8mcl의 파르말리트 (pH 3-10)에 100ml WFI를 첨가;

파파인 절단 완충액: 0.1M 트리스-HCl, 4mM EDTA, 5mM 시스테인 pH 7.6. 시스테인은 매번 신선하게 제조되어야함. 제조자의 지시에 따라서 완충액으로 파파인을 1mg/ml까지 희석함;

PBS (인산염 완충 식염수) - 10mM 인산 나트륨, 150mM 염화 나트륨, 10X PBS의 1:10 희석으로 제조된 pH 7.2;

0.1% 플루로닉을 함유한 PBS;

PBS, (ITL 제조물, BR R0450V01);

PBS-0.05% 트윈 20: 0.5ml 트윈 20이 1L PBSx1과 혼합됨;

인산염 완충액 20mM: 1L 물내 pH 7.5: 1.8gr Na₂PO₄.2H₂O 및 1.38gr NaH₂PO₄.H2O;

단백질 A- 용리 완충액: 20mM 아세트산 pH=3.2;

단백질 A- 평형/세척 2 완충액: 50mM 아세트산 나트륨, pH=6.8;

단백질 A- 세척 1 완충액: 50mM 아세트산 나트륨 + 1.5 M 염화 나트륨, pH=6.8;

환원 완충액 x2: 8M 구아니딘-HCl, 100mM 트리스-HCl, 10mM DTT, pH 8.8 (매번 신선하게 제조).

배양 배지

3.5% 셀 부스트 6 스톡;

CHO 클로닝 배지, Cat. # C6366, Sigma;

CHO DHFR^- 배지 파우더, SAFC Bioscinces, Cat. # C6614 (ITL 제조물 R0461V01);

DMEM-F/12 1:1 X1, Invitrogen , Cat. # 21331-020;

8ml/L ITS-X (Invitrogen, Cat. # 51500-056)로 보충된 FEME 배지 ((DMEM/F-12 (1:1) (Invitrogen Cat. #32 500_043);

최소 필수 배지 이글(Minimun Essential Medium Eagle), Sigma, Cat. # M2279;

ProCHO5, Lonza, Cat. # BE12-766Q;

Select CD1000, Becton Dickinson, Cat. # 215204;

VPA 나트륨 염 스톡, 100mM.

일회용품

14ml 원심분리 튜브(tube), Greiner, Cat. # 187261;

15ml 원심분리 튜브, Corning, Cat. # 430052;

24 웰 플레이트, Nunc, Cat. # 142475;

5ml 폴리스티렌 둥근 바닥 튜브, Becton Dickinson, Falcon, Cat. # 352054;

5ml 둥근 바닥 튜브 폴리스티렌, Becton Dickinson, Falcon, Cat. # 352054;

96 웰 플레이트, Costar, Cat. # 3595;

96 웰 플레이트, Falcon, Cat. # 353072;

ABI PRISM TM Optical Adhesive Covers 100/Pkg, Applied Biosystems, Cat# 4311971

크라이오(Cryo) 튜브 유리병 2ml, Grenier, cat.# 126-263;

Acrodisc 여과기 0.2μm, Gelman, Cat. # 4192;

Amicon Ultra 15ml 10 kDa, Cat: UFC901024, Millipore;

Amicon Ultra 3kDa, Cat: UFC900324, Millipore;

Amicon ultra, 원심 여과기 유닛(unit), Millipore, Cat. # UFC801024;

크라이오 냉동 (Cryo Freezing) 1℃ 용기, Nalgene, Cat. # 5100-0001;

PBS 또는 물 멸균을 위한 일회용 0.22μ 여과기, Nalgene, Cat. 1270020;

ACFM 멸균 (GP 발현 플러스 막)을 위한 일회용 0.2μ 여과기, Millipore, Cat. # SCGPU05RE 또는 SCGPU11RE;

FACS 클린 멸균을 위한 일회용 0.45μ 여과기, Nalgene, Cat. # 4500045;

일회용 40μ 세포 스트레이너(strainer) 무균, Becton Dickinson, Falcon, Cat. # 352340;

세포 스트레이너 컵(cup) 35μ가 있는 일회용 5ml 폴리스티렌, Becton Dickinson, Falcon, Cat. # 352235;

일회용 70μ (또는 35μ) 무균 여과기 컵 필콘(Filcon), Becton Dickinson, Falcon, Cat. # 340634;

일회용 여과기 10μ 컵 필콘, Becton Dickinson, Cat. # 340732;

일회용 여과기 30μ 컵 필콘, Becton Dickinson, Cat. # 340625;

DynaMag, Dynal, Invitrogen, Cat. #123.01D;

DynaMag, Dynal, Invitrogen, Cat. #123.21D;

ELISA, 마이크로역가 플레이트(microtiter plate) MaxiSorp F96, cat: , NUNC;

에를렌마이어(Erlenmeyer) 1000ml, Triforest, Cat. # TF FPC1000S;

에를렌마이어 플라스크: 125ml, Corning, Cat. # WI-431143, 250ml, Corning, Cat. # WI-431144, 500ml, Corning, Cat. # WI-431145, 2L, Corning, Cat. # WI-431255;

청색 여과기 캡(cap)이 있는 FACS 튜브, Falcon Cat. # 352235;

FACS 튜브, BD Falcon, Cat. # 352235;

여과기 10" 0.1μm, Durapore, Millipore, Cat. # MILLIPAK200;

여과기 튜브 50, TPP, Cat# 87050;

iCE 280 모세관(Capillary) 카트리지(Cartridge), Cat: FC Coating (PN:101700), Convergent Biosciences;

iCE 280 미세주사기 전달 모세관, Cat:PN:102019, Convergent Biosciences;

IMagnet, Becton Dickinson, Cat. # 552311;

격자판(Grid)이 있는 Kova Glasstic Slide 10, Hycor, Cat. 87144;

미세원심분리 튜브 (1.7ml), Costar, Cat. # 3207;

Octet QK 시스템, 마이크로플레이트, 블랙 96 웰 cat:655209, Greiner bio-one, Germany;

바코드 20/Pkg가 있는 Optical 96-웰 급열 사이클링 플레이트(Fast Thermal Cycling Plate), Applied Biosystems, Cat# 4346906 피펫 팁(tip), Sorenson, Cat. # 14200 및 14220;

피펫 팁, Sorenson, Cat. # 14200 및 14220;

피펫 팁 0-200μl, Costar, Cat. # 4864;

Slide-A Lyzer 투석 카세트 G2 2kDa: cat: 87718, Thermo;

SnakeSkin 투석 튜빙(tubing) 10kDa, cat: 68100, Lot: JJ127549, Thermo HiTrap MabSelect Xtra 1ml, Cat: 28-4082-58, GE;

Stericup 1L 여과기 유닛 0.1μm, Millipore, Cat. # SCGPU05RE;

Stericup 1L 여과기 유닛 0.2μm, Millipore, Cat. # SCGPU11RE;

Steriflip 여과기 유닛 50ml, 0.22μm, Millipore, Cat. # SCGP00525;

멸균 24-웰 플레이트, Nunc, Cat. # 143982;

멸균 6-웰 플레이트, Costar, Cat. # 3506;

멸균 원심분리 튜브: 15ml, Becton Dickinson, Falcon, Cat. # 2097 및 Corning, Cat. # 430055, 50ml Corning, Cat. # 430290, 250ml Corning, Cat. # 430776, 500ml Corning, Cat. # 431123;

멸균 FACS 튜브, Becton Dickinson, Falcon, Cat. # 352054;

멸균 피펫: 10ml Sterillin Cat. # 47110, 1ml Sterillin, Cat. # 40105, 2ml Sterilin, Cat. # 40102, 5ml Corning, Cat. # 4011, 50ml Corning, Cat. # 4501, 25ml Falcon, Cat. # 35-7525;

멸균 조직 배양 플라스크: 25 cm2, (T-25), Nunc, Cat. # 163371;

스트렙타비딘 바이오센서 팁, cat: 18-5019, Fortebio Inc, USA;

주사기 2.5ml 멸균, Medi-Plus, Cat.;

TCF 175cm², Nunc, Cat#156502;

TCF 25cm², Nunc, Cat#136196;

TCF 80cm², Nunc, Cat#153732.

장비

AKTA 익스플로러 100, cat: 18-1112-41, GE (Germany);

Cellavista - Innovatis, Roche;

원심분리 - Cat. # 5417R- 에펜도르프(Eppendorf);

원심분리 - Cat. # 5417R- 에펜도르프;

원심분리- Type RC 3C Plus - Sorvall (USA);

순환 수조, 모델 F3/K, Haake (Finland);

컨덕트 미터(Conduct meter) ORION, 모델 150, ORION Research Inc.;

코울터(Coulter) 계수기 - 모델 Z1, Coulter Electronics (England);

크라이오 냉동 1℃ 용기, Nalgene, Cat. # No.5100-0001;

ELISA 플레이트 판독기 선라이즈 베이직(plate reader Sunrise basic), Cat. # 16039400, TECAN;

ELISA 플레이트 세척기 콜럼버스(Plate Washer Columbus) Cat. # 6040834, TECAN;

ELISA 로봇 제네시스(Robot Genesis) RSP 150/8, Cat. # 611408, TECAN;

ELISA, iEMS 인큐베이터, Cat. #5112200, Thermo;

에펜도르프 원심분리, 시리즈 5417R, 에펜도르프 (Germany);

FACSAria 유동 세포계산기, Beckton Dickinson;

핀피펫(Finnpipette), Cat. # 4540000 Labsystems (Finland);

GE Fanuc 시리즈 90-70 프로그램 가능 제어기(programmable controller) - General Electric Ltd. (USA);

GeneAmp® PCR 시스템 9700, PE Applied Biosystems (USA);

호리즌(Horizen) 겔 전기영동 시스템, GIBCO-BRL Horizon 58, Cat. # 41060;

iCE 280 이미지화 모세관 전기영동 분석기, Cat. # 1241, Convergent Biosciences;

iCE 280 PrinCE 미세주사기, Cat. # 5418074067, Convergent Biosciences;

iCE 280 소프트웨어 iCE280 CFR 소프트웨어 v.2.3.6 Convergent Biosciences;

이미지 마스터(Image master) VDS, Cat. # 80-6254-80 Pharmacia (Sweden);

인큐베이터 진탕기 박스, CERTOMAT® BS-T, B. Braun Biotech International (Germany);

인큐베이터 37℃ 5% CO2, 온도 및 CO2 조절됨, Tuttnauer (Israel);

인큐베이터 - 쉐이크(shake) "n" 스택(stack), Hybaid, Cat # HBMOVC5T220 (하이브리드화 오븐);

층류 후드(Laminar Flow Hood) (LFH) 클래스 100 - Israflow (Israel);

광학 현미경 - 모델 TMS No. 301070 - Nikon (Japan);

마이크로플레이트 인큐베이터/진탕기, iEMS, ThermoLabsystem (Finland);

마이크로플레이트 세척기, Cat. # WW015, Applied Quality Services LTD (UK);

전자 레인지 - 크리스탈 17L;

Octet QK 시스템, 데이터 획득 소프트웨어 6.3 버전, Fortebio Inc, USA;

Octet QK 시스템, 데이터 분석 소프트웨어 6.3 버전, Fortebio Inc, USA;

Octet QK 시스템, Fortebio Inc, CA, USA;

25mm New Brunswick Scientific (USA)의 흔들림 진폭 (궤도)이 있는 궤도형 플랫폼 진탕기(Orbital Platform Shaker);

연동 펌프 - Watson Marlow 503S 또는 505U (United Kingdom);

pH 미터, 시리즈 PHM210, Radiometer (Denmark);

플레이트 세척기 (SLT 96PW) TECAN;

플랫폼 락킹(Platform rocking) 진탕기 ― Hoefer "레드-락커(Red-Rocker)" PR50-250V (Pharmacia biotech.);

전원 공급기, Cat. # PS500XT, Hoefer 과학적 기구 (USA);

냉장한 원심분리, Multifuge 3 S-R, Heraeus;

냉장한 인큐베이터 진탕기, Innova 4230, New Brunswick Scientific (USA);

로봇식 샘플 처리기, 모델 RSP 150/8 Genesis, TECAN, (Switzerland);

진탕기, Rotamax, 시리즈 # 120 Heidolph (Germany);

소프트웨어 - WIZCON-PC Soft International Ltd. (Israel);

StepOnePlus™ 실-시간 PCR 시스템, Applied Biosystems, Cat# 4376600;

UV 테이블, BTS 20.MS, Uvitec, Cat. # M023641;

수조 - 온도 제어기, Polyscience, 모델 9106

일반적인 방법

약어

AAL - 알레우리아 아우란티아 렉틴

ACF - 무 동물 성분(Animal component Free)

ACFM - 무 동물 성분 배지

ADCC - 항체-의존 세포-매개 세포독성 항 EGFR mAb

CHO - 중국 햄스터 난소

DHFR - 디하이드로엽산 환원효소

DMEM - 둘베코 변경된 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)

DMSO - 디메틸설폭시드

DTT　- 디티오트레이톨.

EDTA - 에틸렌디아민테트라아세트산.

EGFR - 표피 성장 인자 수용체

ELISA - 효소-결합 면역흡착 어세이

EMCV - 뇌심근염 바이러스

Fab - IgG1의 중쇄 및 경쇄의 CH1 및 V_H 부분.

FACS - 형광 활성화 세포 분류기

Fc - IgG1 중쇄의 CH3 및 CH2 부분.

F-SA - 형광 스트렙타비딘

Fut8 - 푸코실 전달효소 8

FX - GDP-케오-6-데옥시만노오스 3,5-에피머화효소, 4-환원효소

GFT- GDP-푸코오스 수송체

GMD - GDP-만노오스 4,6-탈수효소

GOI - 관심 유전자

HC - 중쇄

hCMV-IE - 인간 거대세포바이러스 즉시 초기 프로모터

HRP - 겨자무과산화수소

ICE - 이미지화 모세관 전기영동

IgG1 - 면역글로불린 유형 G1.

IRES - 내부 리보솜 유입점

LC - 경쇄

MAA - 마악키아 아무렌시스 렉틴

MCB - 마스터 세포 은행

mCMV - 쥣과 거대세포바이러스 프로모터

MFI - 평균 형광 강도

MS - 질량 분석법

MTX - 메토트렉세이트

NK - 자연 살해

pA- 폴리아데닐화

PAC - 퓨로마이신 N-아세틸 전달효소

PBS - 인산염 완충 식염수

PCD - 일 당 세포 당 피코그램(Picogram per Cell per Day)

PCR - 중합효소 연쇄 반응

PDL - 모집단 배가수

PDT - 모집단 배가 시간

POI - 관심 단백질

PreMCB - 전 마스터 세포 은행

RE - 제한 효소(들)

RT - 실온

SA - 스트렙타비딘

SA-PE - R-피코에리트린-접합된 스트렙타비딘

SP - 신호 펩티드

SV40 - 시미안 바이러스 40

TM - 막관통 펩티드

TMB - 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘

VPA- 발프론 산

MTX의 존재에서 CHO-S 세포의 인큐베이션: C6614내 CHO-S 세포를 0.2x10⁶개 세포/ml로 100nM MTX에 접종하였고 생존력이 90%를 초과할 때까지 10일 동안 증식시켰다. 이후 세포를 27일 동안 200nM MTX로 이동시켰고 그 다음에 세포를 200nM MTX의 존재에서 냉동시켰다. 제로 푸코오스 발현 세포의 단리를 위하여, MTX를 함유하지 않았던 배지에서 세포를 해동시켰다.

스트렙타비딘 자성 구슬을 이용한 낮은 푸코오스의 선택: MTX 처리된 CHO-S 세포를 비오틴화 AAL 또는 AOL로 라벨링하였고 그리고 자성 구슬이 결합된 스트렙타비딘과 혼합하였다. 세포를 자석으로 분리시켰고 그리고 자석에 부착되지 않았던 현탁액내 세포 (즉, 그들의 표면 상에서 낮은 푸코오스 수준을 가졌음)를 추가로 증식시켰다. 이 절차를 두번 수행하였고 이후 세포를 FACS로 분류하였다.

50x10⁶ MTX 처리된 CHO-S 세포를 수집하였고 그리고 PBS + 0.1% 플로론산 (플루로닉 F-68, Sigma Cat. # P5556)으로 세척하였다. 이후 실온에서 30분 동안 세포를 20μg/ml의 농도로 5ml의 비오틴화 AAL (벡터, cat. B-1395, Lot# U0922)에 재현탁시키거나 또는 AOL (Cat. L0169, EY)을 이용하여 5μg/ml의 농도로 PBS + 0.1% 플로론산에 재현탁시켰다. 250μl BD IMag SA Particles Plus - DM (BD, Cat. # 557812)의 첨가 및 RT에서 또 다른 30분의 인큐베이션 전에 염색된 세포를 PBS + 0.1% 플로론산으로 세척하였다. 이후, 2.25ml의 PBS + 0.1% 플로론산 + 0.5% BSA를 첨가하였다. 구슬을 3개의 5ml 튜브에 나누었다. 튜브를 BD IMagmet (BD, Cat. # 552311) 상에 배치시켰고 그리고 8분 동안 그대로 두었다. 상청액을 흡인시켰고 그리고 새로운 15ml 튜브에 옮겼다. 이 단계를 2회 수행하였고 흡인된 상청액을 결합시켰다. 상청액을 5ml 튜브로 다시 나누었고 8분 동안 BD IMagmet (BD, Cat. # 552311) 상에 두었다. 상청액을 수집하고, 원심분리하고 그리고 C6614 배지 (CHO DHFR^- 배지 파우더, SAFC Bioscinces Cat. # C6614) (ITL 제조물 R0461V01)에 접종하였다. 세포를 증식시켰고 그리고 이후 구슬을 이용하여 또 다른 횟수의 분리를 수행하였다.

렉틴과 인큐베이션 후, 세포의 생존력은 AAL과 인큐베이션하였을 때 83%였고, AOL과 인큐베이션하였을 때 89%였다. PBS와 인큐베이션 후 전형적인 세포의 생존력은 85-95%이다.

FACS에 의한 낮은 푸코오스 세포의 분류

A. 자성 구슬을 이용한 분리 후 분류: 자성 구슬을 이용하여 2회 분리 후, 세포를 그들의 세포 표면 상에서 낮은 푸코오스 수준을 갖는 세포를 분류하기 위하여 FACS 처리를 하였다. 40x10⁶개 세포를 차가운 PBS+0.1% 플로론산으로 세척하고, 원심분리하고, 10ml 비오틴화 AAL 또는 AOL + SA-PE 혼합물 20μg/ml에 재현탁시키고 그리고 37℃에서 45rpm으로 진탕과 함께 30분의 인큐베이션을 위해 T80 플라스크에 옮겼다. 세포를 원심분리하고 차가운 PBS + 0.1% 플로론산으로 세척하고 2회 원심분리하고 그리고 10x10⁶개 세포/ml의 최종 농도까지 PBS + 0.1% 플로론산에 재현탁시켰다. 모집단의 가장 낮은 형광 분획 (1.5%)을 2ml의 Sigma C6614 SFM +HT (Biological Industries Cat. # 03-085-1C)/튜브에 FACS로 분류하고, 원심분리하고, 1.5ml의 Sigma C6614 SFM +HT/튜브에 재현탁시키고 그리고 6 웰 플레이트의 웰에 접종하였고 그리고 증식시켰다.

B. 낮은 푸코오스 세포의 분류 - 4회: 100x10⁶개 세포를 차가운 PBS+ 0.1% 플로론산으로 세척하고, 원심분리하고, PBS + 0.1% 플로론산내 10ml 비오틴화 AAL (20μg/ml) + SA-PE (1:100) 혼합물에 재현탁시키고 그리고 37℃에서 45rpm으로 진탕과 함께 30분의 인큐베이션을 위해 T80 플라스크에 옮겼다. 세포를 원심분리하고, 차가운 PBS+0.1% 플로론산으로 세척하고, 2회 원심분리하고 그리고 PBS + 0.1% 플로론산에 재현탁시켜 10x10⁶/ml의 세포 농도를 얻었고 그리고 FACS 튜브 내로 여과시켰다. AAL과 인큐베이션 후, 세포의 생존력은 81%였다. PBS와 인큐베이션 후 세포의 전형적인 생존력은 85-95%였다. 모집단의 가장 낮은 형광 분획 (1차 분류에서 0.2%, 2차 분류에서 0.07%, 3차 분류에서 1% 그리고 4차 분류에서 2%)을 2ml의Sigma ProCHO5 SFM +HT/튜브에 FACS로 분류하고, 원심분리하고, 1ml (1차 및 2차 분류에서), 3ml (3차 및 4차 분류에서)의 ProCHO5+HT/튜브에 재현탁시키고, 24웰 플레이트의 웰 (1차 및 2차 분류에서), T25 플라스크 (3차 및 4차 분류에서)에 접종하고 그리고 증식시켰다.

FACS에 의한 세포의 막 상에서의 푸코오스 수준 분석: 2x10⁶개 세포를 PBS+0.1% 플로론산으로 세척하고, 원심분리하고 PBS + 0.1% 플로론산내 500μl 비오틴화 AAL (Cat. B1395, 벡터) (20μg/ml까지 희석함) 또는 AOL (Cat. L0169, EY) (5μg/ml까지 희석함) + SA-PE (Cat. 40250, Biolegend) (2μg/ml까지 희석함) 혼합물에 재현탁시키고 그리고 37℃에서 진탕과 함께 30분의 인큐베이션을 위해 24 웰 플레이트에 옮겼다. 세포를 완전하게 재현탁시켰고 그리고 15ml 튜브에 옮겼다. 10ml PBS + 0.1% 플로론산을 첨가하였고 그리고 세포를 혼합하고, 원심분리하고 그리고 다시 세척하였다. 펠렛을 0.5ml의 PBS + 0.1% 플로론산/튜브에 재현탁시켰고 그리고 세포의 형광에 따라서 분석을 위해 FACS 튜브 내로 여과시켰다.

FACS에 의한 세포의 막 상에서 시알산 함량의 분석: 2x10⁶개 세포를 PBS+0.1% 플로론산으로 2회 세척하고, 원심분리하고, PBS + 0.1% 플로론산내 500μl MAA-FITC (50μg/ml까지 희석함)에 재현탁시키고 그리고 25℃에서 진탕과 함께 30분의 인큐베이션을 위해 24 웰 플레이트에 옮겼다. 세포를 완전하게 재현탁시켰고 그리고 15ml 튜브에 옮겼다. 10ml PBS + 0.1% 플로론산을 첨가하였고 그리고 세포를 혼합하고, 원심분리하고 그리고 다시 세척하였다. 펠렛을 0.5ml의 PBS + 0.1% 플로론산/튜브에 재현탁시켰고 그리고 세포의 형광에 따라서 분석을 위해 FACS 튜브 내로 여과시켰다.

ITL-lf2 세포 배양에 외생 푸코오스의 첨가 : 항 EGFR mAb로 형질감염 전 또는 후에, ITL-LF2 세포를 0.2x10⁶개 세포/ml의 농도로 상이한 농도의 L-푸코오스 (Sigma Cat. #F2252)와 함께 ProCHO5 배지에 접종하였고 그리고 CO₂와 함께 320rpm의 진탕기에서 37℃로 인큐베이션하였다. 4일 후, 세포의 형광 (하기 설명된 바와 같이)에 따라서 FACS 분석을 위해 세포 샘플을 채취하였다. 추가적으로, 항 EGFR mAb 형질감염된 세포로부터의 미가공 수확물 샘플을 FACS로 분석하였다.

전-마스터 세포 은행(Pre-Master Cell Bank)의 제조 : 세포 냉동을 위하여 세포 배양을 에를렌마이어에서 확장시켰다. 세포의 필요량을 원심분리하였고 그리고 신선한 ProCHO5 배지 + HT 및 조건화된 배지 (ITL-LF2 숙주 세포가 기하급수적으로 성장하는 것으로부터)의 1:1 혼합물 92.5% 그리고 DMSO 7.5% 로 구성된 동결보존 배지에 재현탁시켰다. 전-마스터 세포 은행 (pre-MCB) 각각에서의 클론 각각으로부터 유리병 당 1.5ml에서 유리병 당 10 x 10⁶개 세포로, 60개의 유리병을 냉동시켰다. 세포를 크라이오 냉동 1℃ 용기 (NALGENE, Cat. # No.5100-0001)에서 -80℃로 냉동시켰고, 그리고 24시간 후에 액체 질소 증기내 저장소에 옮겼다.

세포 은행 검사: ITL-LF2 세포의 pre-MCB내 냉동된 앰플(ampoule)에서 세포의 생존력을 pre-MCB 제조 후 11일에 검사하였다. 하나의 앰플을 해동시켰고 그리고 생존력을 해동 후 즉시 측정하였다. 세포를 3회의 성장 주기에 따라 증식시켰고 그리고 3번째 주기 후에 생존력을 측정하였다.

직접적인 이동 또는 수침범(immersion technique)으로 무균 검사(Sterility testing)을 수행하였다. 또한 마이코플라즈마에 대해서도 세포를 검사하였다.

FACS ACDU에 의한 클로닝 : ProCHO5+HT에서 성장하는 세포의, FACSAria 세포 분류기의 자동화된 세포 침전 유닛(Automated Cell Deposition Unit) (ACDU) 장치에 의한 클로닝을 200μl/웰의 80% C6366 + 20% ProCHO5 ACFM 혼합물을 함유한 96 웰 플레이트 내로, "단세포" 정밀 모드에서, ACDU로 수행하였다. 세포의 농도는 0.4x10⁶세포/ml였다. 클로닝하는 날 (0일)에 그리고 8일 이후에 Cellavista로 플레이트의 사진을 찍었다. 여러 가지 클론을 고르고, 증식시키고 그리고 이후 4ml의 50% Sigma C6366 및 50% ProCHO5 혼합물을 함유한 T25 플라스크에 옮겼다. 세포 증식 동안에 ProCHO5를 점진적으로 첨가하였다. mRNA 특성화를 위하여 이들 세포를 분석하였다.

세포로부터 RNA 추출: 전체 RNA를 제조자의 지시에 따라서 Rneasy 키트 (Qiagen Cat. #74104)를 이용하여 세포를 단리시켰다.

푸코오스-경로 유전자의 탐지를 위한 RT-PCR: Invitrogen SuperScript III 키트 (Cat. #18080-051) 및 상기 키트에서 제공되는 올리고(Oligo) dT 프라이머를 활용하여 CHO-S 또는 ITL-LF2 세포로부터 추출된 전체 RNA로부터 cDNA를 제조하였다. 이후 유전자 특이적 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. Sigma Aldrich에서 프라이머를 합성하였다. 프라이머의 서열은 하기 본 명세서의 표 1에서 상세 설명된다. 결과적 밴드를 아가로오스 겔 상에서 분석하였고 그리고 DNA 크기 마커와 비교하였다.

벡터의 제작	사용된 주형	얻은 단편	5' 프라이머		3' 프라이머
			번호	서열*	번호	서열*
MB-127 (pTT5-항 EGFR mAb항 EGFR mAb-HC)	PGL3 항 EGFR mAb EMCV-PAC1-DHFR 탠덤 - 872	HindIII -항 EGFR mAbHC- NotI	690-36	서열번호: 1	691-38	서열번호: 2
MB-128 (pTT5-항 EGFR mAb-LC)	PGL3 항 EGFR mAb EMCV-PAC1-DHFR 탠덤 - 872	H indIII -항 EGFR mAbLC- NotI	692-36	서열번호: 3	693-32	서열번호: 4

푸코오스-경로 mRNA 발현 수준의 평가를 위한 Q-PCR (실시간 PCR): 고성능cDNA 역전사 키트 (Applied Biosystems Cat. #4368814) 및 상기 키트에서 제공되는 랜덤 프라이머(random primer)를 활용하여 cDNA를 제조하였다.

유전자 특이적 프라이머 및 TaqMan® MGB 프로브를 Applied Biosystems에서 합성하였다. 프라이머 및 프로브의 서열은 하기 본 명세서의 표 2에서 상세 설명된다.

유전자	프로브	5' 프라이머	3' 프라이머
알파 1,6 푸코실전달효소 (Fut8)	서열번호: 5	서열번호: 6	서열번호: 7
GDP-4-케토-6-데옥시-D-만노오스 에피머화효소-환원효소 (Fx)	서열번호: 8	서열번호: 9	서열번호: 10
GDP-만노오스 4,6-탈수효소 (GMD) - 5-6 엑손 프라이머	서열번호: 11	서열번호: 12	서열번호: 13
GDP 베타 L 푸코오스 피로인산분해효소 (GFPP)	서열번호: 14	서열번호: 15	서열번호: 16
GDP-푸코오스 운반체 (GFT)	서열번호: 17	서열번호: 18	서열번호: 19
VEZT	서열번호: 20	서열번호: 21	서열번호: 22

Q-PCR은 다음 방식으로 수행되었다:

각각의 반응을 위하여 5μl의 제조된 cDNA를 다음을 함유한 혼합물에 첨가하였다: 13μl의 최종 부피내 TaqMan™ 유전자 발현 마스터 혼합물, 정방향 및 역방향 프라이머 & TaqMan™ MGB 프로브.

StepOnePlus™ 실시간 PCR 기기 상에서 "빠른" 모드로 Q-PCR을 작동시켰고 그리고 StepOnePlus™ 및 DataAssist v2.0 소프트웨어를 활용하여 결과를 분석하였다.

cDNA 단편 및 플라스미드의 DNA 서열화: 완전히 자동화된 16 모세관 ABI 프리즘 3100 유전적 분석기(16 Capillary ABI Prism 3100 Genetic Analyzer)로 DNA 서열화를 수행하였다. Sci-Ed 제너럴(General) 소프트웨어 (클론 매니저 소프트웨어(Clone manager software), 버전 7.01 및 Align plus 5, 버전 5.01)를 활용하여 내부에서(in-house) 서열을 분석하였다.

DNA 발현 벡터의 제작: 모든 벡터는 표준 분자 생물학 기술을 활용하여 제작하였다.

플라스미드 DNA의 제조 : 제조자에 의해 설명된 절차에 따라서 QIAGEN 하이스피드 플라스미드 맥시 키트(QIAGEN Hispeed plasmid Maxi Kit)를 이용하여 플라스미드 DNA를 단리시켰다. 안정한 형질감염을 위하여, DNA를 특이적 제한 효소로 선형화하였고 그리고 에탄올내 DNA 침전으로 멸균시켰다. 환형 DNA로 일시적인 형질감염을 수행하였다.

ITL-LF2 및 CHO-S 세포의 안정한 형질감염: ITL-LF2 세포를 C6614 무혈청 배지 (CHO DHFR^- 배지 파우더, SAFC Bioscinces Cat. # C6614)에 적응시켰다. 세포를 37℃, 50ml 튜브 (여과기 튜브 50, TPP, Cat# 87050)내 현탁액에서 성장시키고, 가습처리하고 그리고 320RPM으로 진탕시켰다. 형질감염 2일 전에, 100ml의 세포를 0.5 x 10⁶개 세포/ml의 농도로 500ml 에를렌마이어 (Corning, Cat. WI-431145)에 접종하였다. 리포펙타민 (GibcoBRL Cat. # 18324-020)에 의한 항 EGFR mAb 코딩 서열을 함유한 PGL3 항 EGFR mAb EMCV-PAC1 DHFR 탠덤-872 벡터로 세포를 형질감염시켰다. 형질감염 날에, 복제물내 세포를 세척하고; 재현탁시키고 그리고 10x10⁶개 세포를 T-25 플라스크 (Nunc Cat. # 163371) 당 4ml MEM (Sigma, Cat. # M2279)에 접종하였다. 단일 플라스미드를 이용한 각각의 형질감염을 위하여, 20μg 선형화된 PGL3 항 EGFR mAb EMCV-PAC1 DHFR 탠덤-872 벡터를 이용하였다. 최종 DNA 부피를 MEM에서 100μl까지 조정하였다. 그 다음에, 100μl 리포펙타민을 첨가하였고 그리고 실온에서 45분 동안 인큐베이션하였다. 이후 DNA-리포펙타민 혼합물을 세포에 첨가하였고 50RPM의 진탕 인큐베이터에서 37℃, 5% CO₂로 4시간 동안 인큐베이션하였다. 이 인큐베이션 기간의 종료에서, 세포를 회전 감소시켰고(spun down) 그리고 배지를 13.6mg/L 하이포잔틴/3.9mg/L 티미딘 (HT, Biological Industries Cat. # 03-085-1C) 그리고 10μg/ml 푸코오스 (Sigma, Cat. #F2252)로 보충된 8ml의 신선한 50% C6614 (Sigma) 및 50% C6366 (Sigma)로 대체시켰다.

72시간 동안 50RPM의 진탕 인큐베이터에서 37℃로 플라스크를 인큐베이션하였다. 이후 세포를 수집하고, 원심분리하고 그리고 10mg/ml 푸코오스 및 5-10μg/ml 퓨로마이신 (상이한 복제물을 위해)으로 보충된 10ml 50% C6614 + 50% C6366 배지에 재현탁시켰고 그리고 원래의 T-25 플라스크로 돌려보냈다. 이들의 선택적인 조건 하에, PAC 유전자를 발현하는 세포만이 생존할 수 있었다. 복제 풀(replicate pool) 수복 후, C6614 배지 + 10μg/ml 푸코오스를 점진적으로 첨가하였다. 풀이 완전하게 수복되었을 때, 세포를 푸코오스가 없는 신선한 C6614 배지에 접종하였다. 이후 세포를 ProCHO5 배지에 옮겼고 그리고 하기 본 명세서에서 설명된 바와 같이 세포막 상에서의 푸코실화 수준을 탐지하였다.

하이포잔틴 13.61mg/L 및 티미딘 3.88mg/L (HTx1, Biological Industries Cat. #03-085-1B)로 보충된 ProCHO5 무혈청 배지 (Lonza, Cat. #BE12-766Q)에서 CHO-S 세포를 배양하였다. 세포를 37℃, 여과기 튜브 50ml 생물반응기 (TPP, Cat# 87050)내 현탁액에서 성장시키고, 가습처리하고 그리고 320RPM으로 진탕시켰다. 형질감염 2일 전에, 세포를 0.2 x 10⁶개 세포/ml의 농도로, 여과기 캡이 있는 500ml 진탕 플라스크 에를렌마이어 (Corning, Cat. #431145)에 접종하였다. 형질감염 당일에, 세포를 원심분리하였고 그리고 10 x 10⁶개 세포를 T25 플라스크 (Nunc, Cat. # 163371)내 4ml MEM (Sigma, Cat. # M2279)에 접종하였다. 단일 플라스미드를 이용한 각각의 형질감염을 위하여, 20μg 선형화된 벡터 (PGL3 항 EGFR mAb EMCV-PAC1 DHFR 탠덤-872)를 이용하였다. 최종 DNA 부피를 MEM에서 100μl까지 조정하였다. 그 다음에, 100μl 리포펙타민 (GibcoBRL Cat. # 18324-020)을 첨가하였고 그리고 실온에서 45분 동안 인큐베이션하였다. 이후 DNA-리포펙타민 혼합물을 세포에 첨가하였고 50RPM의 진탕 인큐베이터에서 37℃, 5% CO₂로 4시간 동안 인큐베이션하였다. 이 인큐베이션 기간의 종료에서, 세포를 회전 감소시켰고 배지를 여과기 캡이 있는 에를렌마이어 125ml (Corning, Cat. # 431143)내 덱스트란 설페이트 0.1mg/ml, 하이포잔틴 27.22mg/L 및 티미딘 7.76mg/L (HTx2, Biological Industries Cat. # 03-085-1B)로 보충된 8ml 신선한 ProCHO5 (Lonza, Cat #BE12-766Q)로 대체시켰다. 72시간 동안 125RPM의 진탕 인큐베이터에서 37℃로 플라스크를 인큐베이션하였다. 이후 세포를 수집하고, 원심분리하고 그리고 25μg/ml 퓨로마이신 (Invivogen, Cat. # ant-pr-1)으로 보충된 20ml ProCHO5 배지에 재현탁시켰다. 이들의 선택적인 조건 하에, PAC 유전자를 발현하는 세포만이 생존할 수 있었다.

ITL-LF2 세포의 일시적인 형질 감염: 형질감염 2일 전에, 2일 후 2.5-3.0 x 10⁶개 세포/ml의 대략적인 밀도에 도달시키기 위하여, ProCHO5내 증식된 세포를 0.5x10⁶ 세포/ml의 농도로 1000ml 에를렌마이어 (TRIFOREST, Cat. # TF FPC1000S)의 250ml에 접종하였다.

두 가지 형질감염 프로토콜이 사용되었다:

1. ProCHO5 (Lonza)를 함유한 배지에서의 형질감염

형질감염 날에, 37.5μg DNA (각각 18.75μg의 HC+LC 플라스미드)를 15ml 튜브 (Corning, Cat. # 430052)내 2.5ml FEME 배지 (DMEM/F-12 (1:1) (Invitrogen Cat. #32 500_043), 29mM NaHCO3, 10mM HEPES, 5 g/l D-글루코오스 및 7.5mM L-글루타민)에서 희석하였다. 8ml/L ITS-X (Invitrogen, Cat. # 51500-056)로 보충된 10ml 초기 부피의 FEME 배지 DMEM/F-12 (1:1) (Invitrogen Cat. #32 500_043)로 Er125 플라스크를 채웠고; 187.5μg PEI 스톡 (Polysciences inc., Cat. #23966)을 DNA+FEME 배지 (DNA:PEI 1:5)에 첨가하였고, 시약을 10초 동안 와동(vortex) 상에서 혼합하였고 그리고 실온에서 10초 동안 인큐베이션하였다. 60x10⁶개의 살아 있는 세포를 50ml 튜브에서 원심분리하였다. 펠렛을 형질감염 혼합물과 부드럽게 재-현탁시켰고 125ml 에를렌마이어 내에 옮겼고 그 다음 160 pm으로 37℃의 CO₂ 진탕 인큐베이터에서 180분 동안 인큐베이션하였다. 12.5ml의 ProCHO5 배지를 첨가하여 25ml 배양에서 2.4x10⁶개 세포/ml의 최종 농도에 도달시켰다.

형질감염 후 24시간에, CHO-S 형질감염 세포를 100μl (최종 농도 0.5 MM)의 발프론 산 (VPA) 나트륨 염 스톡 100nM (Sigma, Cat. #P4543) 및 2ml의 3.5% 셀 부스트 (HyClone Cat# SH30866.01)로 보충하였다. ITL-LF2 세포를 100μl (최종 농도 0.5 MM)의 발프론 산 (VPA) 나트륨 염 스톡 100nM (Sigma, Cat. # P4543)로 보충하였고 그리고 인큐베이션 온도를 31℃까지 감소시켰다.

인큐베이션 6일 후, 세포수 및 생존력을 위해 세포 현탁액의 샘플을 채취하였다. 원심분리 후 ELISA 검사에서 일시적인 발현의 평가를 위해 상청액을 채취하였다.

2. 이차 배지에서의 형질감염

ITL-LF2 및 CHO-S 세포에 의한 항-EGFR mAb의 생산: 0.5-2x10⁶의 농도의 세포를 1 또는 2 L 에를렌마이어 플라스크내 덱스트란 설페이트를 함유한 200-600ml ProCHO5에 접종하였고 그리고 320rpm의 진탕 인큐베이터 상에서 37℃로 4일 동안 배양하였다. 수확물을 원심분리하였고 그리고 0.22μm 여과기를 통하여 여과시켰다. 그 다음에 프로테아제 저해제 칵테일 (Sigma, Cat. # P8340)을 첨가하였다 (1L의 배양물에 대해 1ml). 정제 공정의 시작 때까지 수확물을 -80℃에서 냉동 유지하였다.

FACS에 의한 미가공 수확물 샘플 또는 정제된 재조합 단백질의 푸코오스 수준 분석: 단백질 G 자성 구슬 (Cat. S1430S, Biolabs)을 완전하게 재-현탁시켰고 그리고 25μl를 실온에서 2ml 튜브 내에 옮겼다. 튜브를 자석 상에 1분 동안 두었고 그리고 상청액을 흡인시켰다. 단백질 G 구슬을 재-현탁시키기 위하여 0.5ml의 20mM 인산염 완충액을 첨가하였다. 이 세척 단계를 한 번 더 반복하였다.

100μl의 샘플 항체 (25-37μg/ml의 미가공 수확물 또는 정제된 단백질)를 자성 구슬 함유 튜브에 첨가하였다. 혼합물을 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였고 상청액을 폐기하기 위하여 자석 상에 두었다. 구슬을 0.5ml의 20mM 인산염 완충액으로 2회 세척하였고 그리고 완충액을 자석 상에서 흡인시켰다. 샘플 항체에 결합된 구슬을 0.5ml의 비오틴화 AAL-SA-PE 혼합물 (PBS+0.1% 플로론산에서 2μg/ml까지 희석된 비오틴화 AAL 백터, Cat. B1395, 20μg/ml 및 SA-PE, BioLegend, Cat. 40520, 2μg/ml)에 재현탁시켰고 그리고 알루미늄 호일(aluminum foil)로 커버되는 24 웰 플레이트 (Nunc, Cat. 142475) 내에 옮기고 그리고 37℃에서 80rpm으로 진탕하면서 30분 동안 인큐베이션하였다. 혼합물을 완전하게 재현탁시켰고 그리고 10ml PBS+0.1% 플로론산이 있는 15ml 튜브 (Corning, Cat. 430052)에 옮겼다. 이후 10ml PBS+0.1% 플로론산 원심분리의 첨가 및 상청액의 제거로써 2회의 세척을 수행하였다. 펠렛을 0.5ml PBS+0.1% 플로론산에 재현탁시키고, FACS 튜브 (Falcon, Cat. 352235)를 통하여 여과시키고 그리고 FACS로 분석하였다.

FACS에 의한 미가공 수확물 샘플 또는 정제된 재조합 단백질의 시알산 수준 분석: 단백질 G 자성 구슬 (Cat. S1430S, Biolabs)을 완전하게 재-현탁시켰고 그리고 25μl를 실온에서 2ml 튜브 내에 옮겼다. 튜브를 자석 상에 1분 동안 두었고 그리고 상청액을 흡인시켰다. 단백질 G 구슬을 재-현탁시키기 위하여 0.5ml의 20mM 인산염 완충액을 첨가하였다. 이 세척 단계를 한 번 더 반복하였다.

100μl의 샘플 항체 (25μg/ml의 미가공 수확물 또는 정제된 단백질)를 자성 구슬 함유 튜브에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였고 상청액을 폐기하기 위하여 자석 상에 두었다. 구슬을 0.5ml의 20mM 인산염 완충액으로 2회 세척하였고 그리고 완충액을 자석 상에서 흡인시켰다. 샘플 항체에 결합된 구슬을 0.5ml의 MAA-FITC (PBS+0.1 플로론산에서 25μg/ml까지 희석된 2ml, EY, Cat. F-7801-1에서의 2mg)에 재현탁시켰고 그리고 알루미늄 호일로 커버되는 24 웰 플레이트 (Nunc, Cat. 142475) 내에 옮기고 그리고 실온에서 80rpm으로 진탕하면서 30분 동안 인큐베이션하였다. 혼합물을 완전하게 재현탁시켰고 그리고 10ml PBS+0.1% 플로론산이 있는 15ml 튜브 (Corning, Cat. 430052)에 옮겼다. 이후 10ml PBS+0.1% 플로론산 원심분리의 첨가 및 상청액의 제거로써 2회의 세척을 수행하였다. 펠렛을 0.5ml PBS+0.1% 플로론산에 재현탁시키고, FACS 튜브 (Falcon, Cat. 352235)를 통하여 여과시키고 그리고 FACS로 분석하였다.

항-EGFR 항체의 ELISA: 검사 샘플내 인간 항체의 농도를 측정하는 데에 ELISA 어세이를 이용하였다. 하기 설명된 바와 같이 어세이를 수행하였다.

마이크로역가 플레이트를 0.1 M 카보네이트 완충액 pH 9.6에서 2μg/ml의 염소 항-인간 IgG (H+L)로 코팅하였고 그리고 4℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척 완충액 (PBS내 0.05% 트윈-20)으로 4회 세척하였다. 이후 플레이트를 실온에서 1시간 동안 차단 완충액 (PBS-T 0.05%내 1% BSA), 200μl/웰로 차단하였다. 차단 후, 플레이트를 세척 완충액 (PBS내 0.05% 트윈-20)으로 4회 세척하였다. 코팅된 플레이트를 제조 후 바로 사용하거나, 또는 사용할 때까지 (6주 내에) -20℃에서 저장하였다. 샘플, 표준 곡선 및 체크 샘플(check sample)을 플레이트 (100μl/웰)에 첨가하였고 그리고 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 다시 세척 완충액으로 4회 세척하였고 그리고 100μl 분취량의 HRP-접합된 염소 항 인간 IgG Fab을 어세이 완충액 (PBS내 1% 탈지 우유 파우더)에서 8ng/ml까지 희석하고 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 다시 세척 완충액으로 4회 세척하였고 그리고 100μl의 기질 용액 (TMB)를 첨가하고 실온에서 대략 10분 동안 인큐베이션하였다. 웰 각각에 100μl 1N HCl을 첨가함으로써 반응을 중시시켰다. ELISA 판독기에서 A₄₅₀nm으로 흡광도를 측정하였다. 표준 용액을 참고 샘플 항-EGFR (MerckSerono로부터의 ERBITUX)의 연속 희석으로 표준 용액을 제조하여 어세이 완충액에서 100 내지 1.56ng/ml 범위의 표준 곡선을 제공하였다. 풀 2390 (ITL에서 생산됨)으로부터의 미가공 산물 샘플을 체크 샘플로서 사용하였다. Magelan 5 소프트웨어는 광학 데이터 결과를 계산하였다. 네 개의 파라미터 로지스틱 방정식(logistic equation)을 이용하였고 비공지된 샘플의 결과는 ng/ml로 표현되는 표준 곡선으로부터 자동적으로 보간되었다. 샘플의 희석, 표준곡선의 제조, 플레이트 상에 샘플의 분배를 로봇식 샘플 처리기로 수행하였다.

완전한 항-EGFR 및 FC 단량체의 정제: 풀 (2390 및 2622UN)로부터 생산된 항-EGFR 산물을 단백질 A 칼럼에서 정제하였다. 정제된 산물을 완전 IgG 또는 Fc 단량체 (하기 설명된 바와 같이 생산됨)중 하나로서 분석하였다. 정제 공정은 도 2에서 나타난 바와 같이 이루어졌고 AKTA 익스플로러 시스템을 이용하여 수행되었다.

단백질 A상에서 항-EGFR 정제: 단백질 A 세파로오스-MAb Select Xtra 미리-팩킹(packing)된 칼럼 (5ml 부피)을 2.0ml/분의 유속에서 5-6 CV의 50mM 아세트산 나트륨 pH 6.8로 평형시켰다. 풀로부터의 산물을 함유한 정화된 미가공 수확물 (~500ml)을 2.0ml/분의 유속으로 칼럼 상에 로딩하였다. 칼럼을 두 단계 (7-9 CV)로 세척하였다: 50mM 아세트산 나트륨 pH 6.8내 1.5 M NaCl로 일차 세척, 그 다음 기선을 얻을 때까지 2.0ml/분의 유속에서, 50mM 아세트산 나트륨 pH 6.8로 이차 세척. 산물을　2.0 ml/분의 유속으로　20mM　아세트산　pH 3.2를 이용하여 한 분획으로 용리시켰다. 칼럼 런(run)을 실온에서 수행하였고 그리고 280 및 215nm에서 UV로 모니터링하였다. pH를 트리스 1M을 이용하여 6.0으로 조정하였다. 칼럼을 0.1M 아세트산, pH 2.9로 세척하였고, 그리고 이후 8 CV 4M 구아니딘 HCl로 원 위치(in-place)에서 정화하였다. 칼럼을 50mM 아세트산 나트륨 pH 6.8로 재-평형시켰고 그리고 20% 에탄올에 저장하였다.

완전 항-EGFR mAb 투석 및 농축: 단백질 A 세파로오스- MAb Select Xtra 칼럼으로부터 용리된 분획을 약 1:100 부피 비로 하룻밤 동안 "조제 완충액" (100mM NaCl, 100mM 글라이신, 10mM 시트레이트, pH 5.8)에 대항하여 SnakeSkin 투석 튜빙 (10 kDa MW 컷-오프(cut-off) 기공 크기)에서 두 번 투석하였다. 투석 후 샘플을 Amicon 농축기내 한외여과 (10 kDa MW 컷-오프 막)로 농축시켰다. 2-8℃에서 이들 단계를 수행하였다. 농축된 산물의 산물 농도를 ELISA로 또는 O.D. 280nm으로 측정하였다.

항체의 파파인 절단: 단백질 A 칼럼으로부터 용리된 분획을 약 1:100 (단백질: 완충액) 부피 비로 4℃에서 하룻밤 동안 완충액 (0.1 M 트리스-HCl, 4mM EDTA, pH 7.6)에 대항하여 SnakeSkin 투석 튜빙 (10 kDa MW 컷-오프 기공 크기)에서 두 번 투석하였다. 투석 후 샘플을 Amicon 농축기내 한외여과 (10 kDa MW 컷-오프 막)로 1mg/ml까지 농축시켰다. 파파인으로 항-EGFR을 Fab 및 Fc 분획으로 절단하였다. 0.1 M 트리스-HCl pH 7.6, 4mM EDTA, 5mM 시스테인내 1mg/ml의 최종 농도에서 항체를 인큐베이션함으로써 절단을 수행하였다. 파파인 (물로 1mg/ml까지 희석함)의 첨가로 분해가 시작되어 100:1 (w/w)의 최종 단백질:효소 비를 제공하였다. 37℃에서 2시간 동안 분해를 수행하였고, 말레이미드 (33mM)의 첨가로 절단을 중지시켰고 그리고 얼음에서 식혔다. 상기 본 명세서에서 설명된 바와 같이 단백질 A 친화성 크로마토그래피로 절단 혼합물로부터 Fc 이량체 분획을 정제하였다. 정제된 Fc 이량체를 PBSx1, pH 7.2에 대항하여 SnakeSkin 투석 튜빙 (10 kDa MW 컷-오프 기공 크기)에서 두 번 투석하였고, 그리고 Amicon 농축기내 한외여과 (10 kDa MW 컷-오프 막)로 2mg/ml까지 농축시켰다.

환원 및 알킬화: 변성 조건 하에 Fc 이량체 분획을 이용하여 환원 및 알킬화를 수행하여 중쇄의 CH2 도메인에 위치한 위치 297에서의 N 글리코실화 부위 상에서 푸코오스 수준의 특성화를 위한 Fc 단량체를 생산한다 (배경기술 참고). Fc 이량체 분획을 완충액 (4 M 구아니딘-HCl, 50mM 트리스-HCl, pH 8.8)으로 1mg/ml까지 희석하였고, 이후 디티오트레이톨 (DTT, 5mM)을 첨가하였고 그리고 반응 혼합물을 5분 동안 75℃에 두었다. 이후 단백질 용액을 실온까지 식혔고 그리고 0.5 M 요오드아세트아미드 스톡 용액을 첨가하여 15mM의 최종 농도에 도달시켰다. 어두운 곳에서 40분 동안 실온에서 알킬화를 수행하였다. 이후 0.5 M DTT 스톡 용액을 첨가하여 알킬화를 퀀칭(quenching)하기 위한 15mM 농도를 얻었다.

항-EGFR Fc 단량체 투석 및 농축: 단백질 A 세파로오스- MAb Select Xtra 칼럼으로부터 용리된 분획을 약 1:100 (단백질:완충액) 부피 비로 하룻밤 동안 "조제 완충액" (100mM NaCl, 100mM 글라이신, 10mM 시트레이트, pH 5.8)에 대항하여 SnakeSkin 투석 튜빙 (10 kDa MW 컷-오프 기공 크기)에서 두 번 투석하였다. 투석 후 샘플을 Amicon 농축기내 한외여과 (10 kDa MW 컷-오프 막)로 농축시켰다. 2-8℃에서 이들 단계를 수행하였다. 농축된 산물의 산물 농도를 ELISA로 또는 O.D. 280nm으로 측정하였다.

Octet에 의한 정제된 단백질 상에서의 푸코오스 및 시알산 수준 분석: Octet에 의한 동역학적 분석으로 정제된 산물 (완전 IgG1 또는 Fc 단량체) 상에서의 푸코오스 또는 시알산 수준을 측정하는 데에 이 어세이를 이용하였다. 하기 설명된 바와 같이 어세이를 수행하였다.

제조자의 지시에 따라서 AAL 또는 MAA의 비오틴화를 위해 NHS-PEG4-비오틴 시약을 이용하였다. 비오틴 시약 용액 (PBS x1내 1mM, pH 7.2)을 1ml의 렉틴 (1mg/ml)에 첨가하였다 (1:5의 렉틴: 비오틴 비). 반응 혼합물을 얼음에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. Slide-A-Lyzer 카세트 (10 kDa MW 컷-오프 기공 크기)내 PBS pH 7.2에 대항하여 샘플의 투석을 수행하였다.

실험을 시작하기 전에 스트렙타비딘 바이오센서 (SA)를 진탕 없이 30℃에서 20분 동안 동역학 완충액에서 미리-인큐베이션하였다. 완충액, 비오틴화 렉틴 및 정제된 산물을 요구되는 농도에 따라서 제조하였고 그리고 96-웰 플레이트 (250μl/웰)에 옮겼고, 모든 단계는 30℃에서 진탕 속도 (1000rpm)로 수행하였다. 런은 모두 컴퓨터 조절 하에, 적절한 웰에 바이오센서를 배치시킴으로써 그리고 시간이 흐름에 따라 층 두께 (나노미터, nm에서)에서의 변화를 측정함으로써 시작하였다. 먼저, 1μg/ml의 비오틴화 AAL (AAL-B) 또는 10μg/ml 비오틴화 MAA (MAA-B)를 40분 동안 스트렙타비딘 바이오센서 팁 표면 상에 고정시켰다 (로딩 단계). 이후, 팁을 희석된 동역학 완충액 (KB x1)으로 10분 동안 세척하였다 (기선 단계). 연합 단계에서, 정제된 단백질을 비오틴화 렉틴에 40분 동안 결합시켰고 그 다음 분리 단계를 위하여 KBx1 완충액으로 세척하였다. 도 3은 Octet에 의한 동역학적 분석의 전형적인 프로파일을 나타낸다. Octet 유저 소프트웨어(User Software)를 이용하여 자동적으로 데이터를 처리하였다.

ICE 280에 의한 정제된 항체의 전하 프로파일 분석: iCE280 분석기 (Convergent Biosciences)를 이용하여 이미지화 모세관 등전점 전기영동을 수행하였다. 플루오로탄소 화합물로 미리-코팅된 이의 안쪽 표면을 갖는 분리 모세관인, 모세관 카트리지 (50mM 길이, 100μm I.D. 칼럼) 상에서 이소폼 분리를 성취하였다.

정제된 및 투석된 항-EGFR 샘플을 Amicon Ultra 원심 여과기내 한외여과 (10 kDa MW 컷-오프 셀룰로오스 막)으로 4mg/ml까지 농축시켰다. 20μl의 4mg/ml 항-EGFR, 80μl의 러닝 스톡 용액을 혼합함으로써 분석을 위한 샘플을 제조하였다. 음극액으로서 100mM NaOH 및 양극액으로서 80mM H3PO4를 이용하여 분리를 수행하였다. 280nm에서 UV 흡광도에 의해 전기 영동도(electropherogram)를 획득하였다. 최종 조건 및 농도의 요약은 하기 본 명세서의 표 3에서 제공된다.

최종 샘플 농도	약 0.4mg/ml (최종 양쪽성 전해질 샘플 용액의 최종 부피 200μl내 80μg의 단백질은 3개 보다 더 많은 복제물을 작동시키는 데에 충분함).
모세관	50mM 길이, 100μm ID 칼럼, 플루오로 탄소 코팅
전해질	양극액-80mM H3PO4; 음극액-0.1% 메틸-셀룰로오스내100mM NaOH.
담체 양쪽성 전해질	파르말리트 3-10 (4% 최종 농도)
첨가제	0.35% 메틸 셀룰로오스
내부 pI 마커	6.14 및 9.5 (0.5% 최종 농도)
집속 시간	1+8 분
집속 전압	1500V (300V/cm)에서 1분 3000V (600V/cm)에서 8분

MS에 의한 Fc 단량체 상에서 글리코실화 프로파일의 분석: EGFR에 대한 항체의 Fc 단량체를 상기 설명된 바와 같이 단리시켰고 추가로, MS로 글리칸 분석에 대해 평가하였다.

ACFM에서의 세포 증식 및 생산성

세포 배양 유지 및 PDT 계산

다음과 같이 ACFM에서 세포 배양을 유지하였다: 세포를 0.2 x 10⁶개/ml의 농도로 50ml 튜브 내에 접종하였고 320rpm의 궤도 진탕기에서 37℃로 인큐베이션하였다. 한 주에 두 번, 세포수 및 생존력을 측정하였다. 4℃에서 5분 동안 100 g에서 원심분리로 배양을 계대하였고 이후 세포 펠렛을 신선한 미리-데워둔 ACFM에 재현탁시켰다.

모집단 배가수 (PDL) 및 모집단 배가 시간 (PDT) 계산을 다음 방정식에 따라 측정하였다:

Ti- 접종시 살아 있는 총 세포

Te- 마지막에 살아 있는 총 세포

최대 세포 농도의 측정: 세포를 0.2 x 10⁶개 세포/ml의 농도로 50ml 튜브 (TPP, Cat# 87050) 내에 접종하였고 320rpm의 궤도 진탕기에서 37℃로 인큐베이션하였다. 상이한 시점에서 세포수 및 생존력을 측정하였다.

ACFM에서의 비 생산성(Specific productivity): ACFM에서의 비 생산성 (PCD)을 위하여, 세포를 0.5 x 10⁶개 세포/ml의 농도로 50ml 튜브내, 명시된 ACFM에 접종하였고 그리고 24시간 동안 진탕 인큐베이터 (320rpm)에서 37℃로 인큐베이션하였다. 이후 배지를 제거하였고 생산물 농도를 ELISA로 측정하였다. 24시간 역가를 접종 시 그리고 실험 24시간 후 세포의 평균 농도로 나눔으로써 계산을 수행하였다.

PCD- pg/세포/일

T- 역가 (pg/ml)

Ci- 접종시 세포 농도 (세포/ml)

Ce- 24시간 후 세포 농도 (세포/ml)

배치 공정에서의 성장 및 생산성: 생존력 수준이 70% 아래로 감소될 때까지 5% CO₂와 함께 37℃에서, 125RPM으로 진탕하여 125ml 에를렌마이어 플라스크: 125ml (Corning, Cat. # WI-431143)내 40ml ProCHO5 배지 및 12ml CHO CD EfficientFeed™ A (Invitrogen, Cat. # A10234-01) + CHO CD EfficientFeed™ B (Invitrogen, Cat. # A10240-01) (1:1)에서 0.2x10⁶개 세포/웰의 접종 농도로 세포 현탁액 배치 공정에서의 성장 및 생산성을 수행하였다. 3일자로부터 계속하여 매 1-2일에 생산물 역가 분석 (ELISA로), 대사산물 농도, 세포 농도 & 생존력을 위해 샘플을 회수하였다.

실시예 1

낮은 푸코오스 함유 세포의 단리를 위한 전략

낮은 푸코오스 발현 세포의 단리를 위해 활용되는 전략은 랜덤 돌연변이의 형성 및 요구되는 낮은 푸코오스 표현형을 갖는 세포의 선택에 기반하였다.

공정은 여러 가지 단계 (도 4 및 도 5에서 도시된 바와 같음)를 포함하고 돌연변이를 발생시키기 위하여 돌연변이 유발제 MTX와 CHO-S 세포의 인큐베이션을 시작하였다. 이후 MTX를 제거하였고 세포를 다음 단계 중 하나에 따라 단리시켰다.

1. 2회의 비오틴화 푸코오스 특이적 렉틴(비오틴화 AAL 또는 AOL)으로의 세포 라벨링 및 스트렙타비딘 코팅 자성 구슬에 결합하지 않은 세포의 단리. 이 단계 다음에 비오틴화 푸코오스 특이적 렉틴 (비오틴화 AAL 또는 AOL) 및 형광 스트렙타비딘으로 세포를 라벨링하고 그리고 FACS에 의한 낮은 형광 세포의 단일 분류를 하였다 (도 4).

2. 4회의 비오틴화 푸코오스 특이적 렉틴 (비오틴화 AAL) 및 형광 스트렙타비딘으로의 세포 라벨링 및 FACS로 낮은 형광 세포의 분류 (도 5).

MTX내 CHO-S 세포의 인큐베이션: C6614내 CHO-S 세포를 0.2x10⁶개 세포/ml로 100 nM MTX에 접종하였고 그리고 생존력이 90%를 초과할 때까지 10일 동안 증식시켰다. 이후 생존력이 90%를 초과할 때까지 200 nM MTX가 있는 C6614에 동일한 초기 농도로 세포를 옮겼다. 세포를 냉동시켰고 그리고 낮은 푸코오스 함유 세포의 단리를 위해 제공하였다.

실시예 2

스트렙타비딘 자성 구슬로 2회 단리에 의한 낮은 푸코오스 세포의 선택 및 1회 FACS 분류 주기 (ITL-LF1 세포)

200 nM MTX에서 인큐베이션된 5 천만개의 CHO-S 세포, 야생형 CHO-S 및 CHO DUKX 세포를 자성 구슬 상에서 1회 분리하고 96 웰 플레이트에 접종하고 증식시키고 그리고 T80 플라스크에 옮겼다. 분리된 비결합 세포의 수와 생존력은 MTX 처리된 CHO-S 세포의 경우에서 더 높았고 비 MTX 처리된 세포에서 훨씬 더 낮았다. 추가로, MTX에서 인큐베이션된 CHO-S 세포는 14일 내에 T80 플라스크에 도달하였지만, 반면에 CHO-S 및 CHO-DUKK는 22일 후에야 T80 플라스크에 도달하였다. 추가적인 낮은 푸코오스 세포 단리를 MTX 처리된 CHO-S 세포에만 시행하였다. 이차 스트렙타비딘 코팅 자성 구슬 단리를 5x10⁷개 세포로 시작하였고 선택된 비-결합 세포를 96 웰 플레이트에 접종하였다. 1.5% 가장 낮은 푸코오스 모집단의 FACS 분류를 수복 및 세포 증식 후 4x10⁷개 세포로 수행하였다.

세포막 상에서의 푸코오스 수준 분석 : 세포 표면 상에서의 푸코오스 수준의 분석은 비오틴화 AAL 및 SA-PE로 세포의 라벨링 후, CHO-S MTX 분류된 세포만이 세포막 상에서 낮은 푸코오스 수준을 갖는 부분 모집단을 나타내었다는 것을 보여주었다. CHO-S (도 6) 및 CHO DUKX (데이터는 나타나지 않음) 분리된 세포는 세포막 상에서 정상적인 푸코오스 수준을 나타내었다. 2회의 스트렙타비딘 코팅 자성 구슬 선택 및 단일 FACS 분류 선택 후 CHO-S MTX 처리된 세포의 추가적인 분석은 도 7A에서 도시되고 분류된 세포의 낮은 푸코오스 프로파일을 나타낸다. 낮은 푸코오스 프로파일은 ProCHO5 및 C6614 배지 둘 모두에서 유사한 것으로 밝혀졌다 (도 8A).

유사한 기법을 비오틴화 AOL로 수행하였다. 2회의 스트렙타비딘 코팅 자성 구슬 선택 및 단일 FACS 분류 선택 후 비오틴화 AOL로 라벨링된 CHO-S MTX 처리된 세포의 분석은 도 8B에서 도시되고 분류된 세포의 낮은 푸코오스 프로파일을 나타낸다.

낮은 푸코오스 세포에 대해 선택하기 위한 아스퍼질러스 오리재 1-푸코오스-특이적 렉틴 (AOL)의 용도: MTX와 인큐베이션된 CHO-S 세포를 비오틴화 AOL로 라벨링하였고 그리고 스트렙타비딘 코팅 자성 구슬과 혼합하였다. 세포를 자석 상에서 분리시켰고, 자석에 부착되지 않았던 세포는 추가로 증식시켰다. 이 단계를 2회 반복하였다. 이후 세포를 비오틴화 AOL 및 형광 스트렙타비딘으로 라벨링하였고 그리고 낮은 형광 세포를 FACS로 분류하였고 그리고 추가로 증식시켰다. 비오틴화 AOL 및 형광 스트렙타비딘으로 세포를 라벨링함으로써 FACS 분석을 수행하였다. 도 7B에서 나타난 결과는 AOL이 낮은 푸코오스 발현 세포에 대해 선택하는 데에 또한 이용될 수 있다는 점을 보여준다.

세포막 상에서의 시알산 수준 분석: 시알산 수준의 분석은 올리고당에서 시알산의 존재를 명시할 뿐 만 아니라, 또한 낮은 푸코오스 세포 선택 동안에 전체 올리고당이 손실되지 않는다는 점을 보장할 수 있다. FITC에 접합된 시알산 특이적 렉틴 (MAA)과 세포의 인큐베이션, 그 다음 FACS 분석으로 세포막 상에서의 시알산 수준 분석을 수행하였다. 분석은 비오틴화 AAL 및 SA-PE로 세포의 라벨링 후, CHO-S 및 ITL-LF1 세포 둘 모두는 ProCHO5 및 C6614 배지내 세포막 상에서 유사한 시알산 수준을 제시한다는 점을 보여주었다 (도 9).

낮은 푸코오스 표현형의 안정도: 358 모집단 배가 (PDL)에 대한 ITL-LF1 세포의 선택 후 상이한 시점에서 세포 표면 상에서의 푸코오스 수준 분석을 측정하였고 그리고 상기 분석은 비오틴화 AAL 및 SA-PE로 세포의 라벨링 후, 낮은 푸코오스 표현형은 낮고 안정하게 남아있었다는 점을 보여주었다 (도 10).

성장률: ITL-LF1 세포의 성장률을 푸코오스 안정도 검사 동안에 측정하였고 그리고 CHO-S와 유사한 15-20 시간의 PDT를 유발한다는 것 (도 11)을 밝혀내었다.

실시예 3

FACS를 이용한 분류에 의한 제로 푸코오스 세포의 선택 (ITL-LF2 세포)

200 nM MTX에서 인큐베이션된 CHO-S 세포를 FACS로 분류하여 낮은 푸코오스 모집단에 대해 선택하였다. 분류를 위해 이용된 초기 세포수, 낮은 푸코오스 게이팅(gating)된 세포의 분획 그리고 매 분류 주기에서의 분류된 세포수는 하기 본 명세서의 표 4에 명시된다.

FACS 분류 주기	초기 세포수	게이팅된 세포의 %	분류된 세포수
1	6.5x 107	0.2	1.2 x 104*
2	6.5x 107	0.07	5.8 x 103*
3	8 x 107	1.0	8 x 105#
4	6 x 107	2.0	1 x 106#

* 분류 후 Cellavista에 의해 계산된 세포

# FACS 게이트(gate)에 따라서 추정된 세포수.

세포막 상에서의 푸코오스 수준 분석: 세포 표면 상에서의 푸코오스 수준 분석은 비오틴화 AAL 및 SA-PE로 세포의 라벨링 후, 제로 푸코오스 분류된 CHO-S MTX 분획은 수행되는 분류 횟수에 따라 증가되었다는 점을 보여주었다. 3회의 분류는 낮은 푸코실화 수준을 갖는 상동 모집단을 유발하였다. 낮은 푸코오스 수준을 갖는 상동 모집단의 선택을 추가로 실증하기 위하여 4차 분류를 적용하였다 (도 12). 또 다른 분석은 ITL-LF2 세포의 푸코실화 수준이 ProCHO5 및 C6614 배지 둘 모두에서 제로였다는 점을 보여주었다 (도 13).

세포막 상에서의 시알산 수준 분석: 시알산 수준의 분석은 올리고당에서 시알산의 존재를 명시할 뿐 말 아니라, 또한 낮은 푸코오스 세포 선택 동안에 전체 올리고당이 손실되지 않는다는 점을 보장할 수 있다. 분석은 시알산 특이적 렉틴 FITC 접합된 MAA로 세포의 라벨링 후, CHO-S 및 ITL-LF2 세포 둘 모두가 세포막 상에서 유사한 시알산의 수준을 나타낸다는 점을 보여주었다 (도 14).

낮은 푸코오스 표현형의 안정도: 370 PDL에 대한 ITL-LF2 낮은 푸코오스 세포의 선택 후 상이한 시점에서 세포 표면 상에서의 푸코오스 수준 분석을 측정하였고 그리고 상기 분석은 비오틴화 AAL 및 SA-PE로 세포의 라벨링 후, 낮은 푸코오스 표현형은 낮고 안정하게 남아있었다는 점을 보여주었다 (도 15).

성장률: ITL-LF2 세포의 성장률을 푸코오스 안정도 검사 동안에 측정하였고 그리고 CHO-S와 유사한 15-20 시간의 PDT를 유발한다는 것 (도 16)을 밝혀내었다.

최대 세포 농도: 순수한 배치 배양 조건 (영양분 공급 없음) 하에 최대 세포 농도를 측정하기 위해, ITL-LF2 세포를 0.2x10⁶개 세포/ml의 농도로 50ml 튜브에 접종하였고 7일 동안 배양하였다. 도달한 최대 생존가능 농도는 최대 7.5x10⁶개 생존가능 세포/ml에 도달한 부모 CHO-S보다 약간 더 높은 8.4x10⁶개 세포/ml였다 (도 17).

ITL-LF2 세포의 푸코실화 수준에서 외생 푸코오스의 효과: ITL-LF2 세포를 배양 배지내 L-푸코오스의 농도 증가의 존재에서 ProCHO5 배지에 접종하였다. FACS 분석 결과는 외생으로 첨가된 푸코오스 농도 및 세포막 상에서의 푸코실화 수준 사이의 상관관계를 보여준다 (도 18).

배치 공정에서 ITL-LF2 세포의 성장: 배치 공정에서 ITL-LF2 세포의 수행을 평가하고 그들을 CHO-S 세포와 비교하기 위하여, 세포를 ProCHO5 + CHO CD EfficientFeed™에 접종하였고 그리고 생존력이 60%보다 더 높게 남아있는 동안 증식시켰다. 세포 농도, 세포 생존력, 대사산물 농도 및 산물 역가를 측정하기 위하여 배양물로부터 세포를 채취하였다. 결과는 ITL-LF2가 CHO-S 세포와 비교하여 더 높은 생존력 (도 19B 및 19C) 및 ~20%보다 더 높은 필수 생존가능 세포 농도 (IVCC) (도 19D)를 가지고 더 긴 시간 동안 성장하였다는 것을 보여준다. 또한 ITL-LF2 세포는 공정 동안 상당히 더 낮은 젖산 농도를 보여주며, 이는 이들 세포가 부모 CHO-S 세포 보다 더 효율적으로 탄소 공급원으로서 젖산을 활용한다는 것을 명시한다.

FACS ACDU에 의한 클로닝: FACSAria 세포 분류기의 자동화된 세포 침전 유닛 (ACDU) 장치로 ITL-LF2 세포의 클로닝을 수행하였다. 클로닝 후 8일에 두 번의 실험에서 80% C6366+20% ProCHO5에 접종된 192 웰로부터 103 및 124개 클론이 나타났다 (54 및 65% 수복을 나타냄). 유사한 수복 범위는 CHO-S 세포의 클로닝 후 주로 얻어진다 (데이터는 나타나지 않음). 여러 가지 클론을 ProCHO5 배지에서 증식시켰고 그리고 mRNA 특성화를 위해 제공하였다.

ITL-LF2 세포의 유전적 분석 : 푸코실화 경로는 개별적으로 시작하고 수렴되는 2개의 경로로 구성된다. 두 개의 경로는 D-글루코오스로부터의 드 노보 경로(de novo pathway) 및 L-푸코오스로부터의 살비지 경로(salvage pathway)로 구성된다. ITL-LF2 세포에서 낮은 푸코오스 표현형의 원인을 조사하기 위하여, 경로에 관련된 유전자의 발현 상에서 분석을 수행하였다. 이것은 이들 유전자 중 임의의 유전자가 서열에서 또는 발현 수준에서 방해될 수 있는 지를 알아보기 위함이다. 발현 패턴에 대해 (RT-PCR 및 서열화에 의해) 분석된 유전자 및 발현 수준 (Q-PCR에 의함)은 도 20에서 강조된다.

프라이머의 서열은 하기 본 명세서의 표 5에서 상세 설명된다.

유전자	5' 프라이머 #	서열	3' 프라이머 #	서열
알파 1,6 푸코실전달효소 (Fut8)	580-23	ATAATGCGGG CATGGACTGGTTC 서열번호: 33	581-26	ATACTATTTT TCAGCTTCAGGATATG 서열번호: 34
GDP-4-케토-6-데옥시-D-만노오스 에피머화효소-환원효소 (Fx)	582-23	ATAATGGGT GAGCCCCAGGGATC 서열번호: 35	583-23	ATATCTAGACAA GGGACAGCAGG 서열번호: 36
GDP-만노오스 4,6-탈수효소 (GMD)-5-6 엑손 프라이머	586-26	ATAATGGCTC ACGCTCCCGCTAGCTG 서열번호: 37	587-22	ATATCAGGCGTT GGGGTTGGTT 서열번호: 38
GDP 베타 L 푸코오스 피로인산분해효소 (GFPP)	584-23	ATAATGGCGTC TCTGCGCGAAGC 서열번호: 39	585-23	ATATTAAGATT TCTCCGAATCAG 서열번호: 40

CHO-S 부모 세포와 비교하여 ITL-LF2에서 발현되는 푸코실화 경로 유전자를 분석하기 위해, 전체 RNA를 둘 모두의 세포주로부터 추출하였고 그리고 역전사 (RT) 처리 다음 전체 코딩 영역을 포획하는 유전자-특이적 프라이머를 이용한 PCR을 하였다. 이후 결과적 cDNA를 아가로오스 겔 상에서 러닝시켜 부모 CHO-S 및 ITL-LF2 세포로부터 얻은 크기에서 상이함이 있는지를 분석하였다. 얻은 밴드를 서열화함으로써 추가로 분석하였다. 도 21은 검사된 모든 네 가지 유전자에 대해 RT-PCR 후 결과를 얻었음을 보여준다.

GDP-4-케토-6-데옥시-D-만노오스 에피머화효소-환원효소 (Fx) 및 알파 1,6 푸코실전달효소 (Fut8) 유전자에 대해 유사한 크기의 cDNA를 얻었다. 서열화 분석은 유전자 둘 모두의 cDNA가 두 세포주에서 동일하다는 점을 확인하였다. GDP 베타 L 푸코오스 피로인산분해효소 (GFPP)는 CHO-세포에서 탐지되지 않았지만 (여러 가지 RT-PCR 분석에서 확임됨) 하지만 예상된 크기에서의 매우 희미한 밴드가 ITL-LF2 세포에서 탐지될 수 있었다 (도 21의 화살표). 이 경우에서는 서열화를 수행하지 않았다.

GMD 유전자에 대하여, 예상되는 크기의 밴드가 CHO-S 세포에서 탐지되었고, 그리고 서열화는 이를 예상되는 전장 GMD mRNA가 되도록 나타내었다. 하지만 ITL-LF2 세포에서 두 개의 밴드가 탐지되었고 (이들 두 개의 밴드는 때때로 겔 상에서 하나의 "두꺼운" 밴드로 보이며 이는 이중선(doublet)을 명시함), 둘 모두는 전장 ORF보다 더 작았다. 서열화는 두 개의 스플라이스 변이체의 존재를 나타내었다: 첫 번째 (스플라이스 변이체 1 - SV1을 나타냄)는 엑손 8 및 9의 결실을 함유 (도 22A)하고, 두 번째(스플라이스 변이체 2 - SV2)는 엑손 3 및 4에서 결실을 가짐 (도 22B). 전장 GMD의 단백질 서열 및 스플라이 변이체 둘 모두는 서열번호: 23-25에서 제시된다. 전장 GMD의 DNA 서열 및 스플라이스 변이체 둘 모두는 서열번호: 26-28에서 제시된다. 추가적으로, ~250 bp의 작은 밴드는 CHO-S 및 ITL-LF2 세포 둘 모두에서 발견되었다. 이 작은 밴드가 둘 모두의 세포 유형에서 탐지되었다는 사실에 기인하여, 이 밴드가 이들 세포 유형 둘 모두에서의 글리코실화에서 보여지는 상이함에 대한 근거로 보이지 않는다. 따라서 이 밴드를 "작은" 밴드로서 언급하였지만 하지만 추가로 분석하지는 않았다.

GMD 스플라이스 변이체 (SV) 서열의 분석은 스플라이스 변이체 각각에 대한 특유한 제한 효소 부위의 존재를 나타내었다 (엑손 4에서의 BglII 및 엑손 8에서의 XmnI) (도 23A를 참고). CHO-S 및 ITL-LF2 세포내 mRNA 패턴의 추가적인 입증을 위하여, 각각의 세포 유형으로부터 추가적인 RT-PCR을 수행하였다. 이후 cDNA를 3개의 동일한 부분으로 나누었고, 하나는 처리하지 않고 두번째 것은 BglII로 분해하고 그리고 세 번째 것은 XmnI로 분해하였다. 이후 모든 반응을 아가로오스 겔 상에서 작용시켰고 그리고 밴드를 탐지하고 DNA 사이즈 마커와 비교하였다 (도 23B). 이 실험을 뒷받침하는 근거는 ITL-LF2 세포가 두 가지 SV의 혼합물을 함유한다면, 하나의 제한 효소를 이용한 분해는 특이적 제한 부위를 함유하지 않는 SV의 더 높은 밴드를 남길 것이고 그리고 추가적인 새로운 밴드가 특이적 제한 부위를 함유한 기타 SV에 대해 예상되는 크기로 나타날 것이라는 점이었다. 밴드의 예상되는 크기를 모든 분해에서 얻었으며, 이는 ITL-LF2에서 두 개의 스플라이스 변이체가 혼합물로서 존재한다는 사실을 명시한다. 추가로, 제한 후 가장 큰 (더 높은) 밴드 (분해되지 않았던 SV)를 겔로부터 잘라내었고 서열화하였다. 결과는 각각의 경우에서 예상되는 SV의 존재를 보여주었다: BglII 분해된 분획에서 더 높은 밴드로서 남아있는 SV2 및 XmnI 분해된 단편에서 남아있는 SV1 (얻은 단편 크기의 설명을 위하여, 하기 본 명세서의 표 6을 참고).

레인 #	세포 유형	비절단(Uncut)	BglII를 이용한 분해의 결과 *	XmnI를 이용한 분해의 결과
1	CHO-S	1.1 (전장) 0.25 ("작은" 밴드)
2	ITL-LF2	0.9-0.92 (SV1 & SV2) 0.25 ("작은" 밴드)
3	CHO-S		1.1 (비-분해된 전장 단편) 0.8 (분해된 단편) 0.3 (분해된 단편) 0.25 ("작은" 밴드)
4	ITL-LF2		0.92 (SV2 비-분해) 0.59 (분해된 단편) 0.31 (분해된 단편) 0.25 ("작은" 밴드)
5	CHO-S			0.86 (분해된 단편) 0.26 (분해된 단편 + "작은" 밴드)
6	ITL-LF2			0.91 (SV1 비-분해) 0.67 (분해된 단편) 0.26 (분해된 단편 + "작은" 밴드)

* CHO-S 세포로부터 cDNA의 BglII 분해는 불완전함

푸코오스 합성에 관련된 유전자의 발현 수준: 푸코실화 경로에 관련된 유전자의 발현 수준을 유전자-특이적 프라이머 및 프로브를 이용하여 Q-PCR로 측정하였다. 검사된 유전자 중 어느 하나의 발현 수준에서도 현저한 변화가 탐지되지 않았다 (도 24). 결과는 ITL-LF2 세포의 푸코실화 수준내 변화가 GMD mRNA 발현 수준에 기인하는 것이 아니라는 점을 명시한다.

Pre-MCB의 제조 (제조, 해동, 무균 및 마이코플라즈마 검사): FACS에 의한 4회 주기의 낮은 푸코오스 선택 후 발생된 ITL-LF2 세포를 증식시키고 냉동시켰다. 그들을 증식시키고 PreMCB를 제조하기 위하여 이들 세포를 해동시켰다. 유리병 당 10x10⁶개 세포를 가진 60 앰플을 함유한 전-마스터 세포 은행 (pre-MCB)을 제조하였다.

전-마스터 세포 은행의 생존력, 무균 및 마이코플라즈마 검사: ITL-LF2 세포의 pre-MCB로부터 하나의 앰플을 냉동 후 11일에 해동시켰다. 해동 후 즉시 측정된 생존력은 98.3%였다. 세포를 3회 성장 주기 동안 증식시켰고 그리고 각각, 99.0% 생존가능한 것으로 밝혀졌다.

무균 및 마이코플라즈마 오염에 대하여 pre-MCB를 검사하였다. 상기 은행은 무균 및 무 마이코플라즈마인 것으로 밝혀졌다.

실시예 4

wt GMD 유전자로 형질감염시 ITL-LF2 세포는 푸코실화를 회복한다

ITL-LF2 세포에서, GMD 유전자 (푸코오스의 데-노보 합성 경로에 관련됨)는 두 가지 스플라이스 변이체를 나타내고 전장 mRNA는 나타내지 않으며, 이는 CHO-S 야생형 세포에서 나타나는 패턴과는 상이하다는 점을 밝혀내었다. 전장 GMD 단백질의 결핍이 ITL-LF2 세포에서 나타나는 낮은 푸코오스 표현형에 대한 원인인지를 평가하기 위하여, 세포를 전장 GMD cDNA로 형질감염시키고 그 다음 푸코실화 수준의 FACS 분석을 하였다.

플라스미드 MB-129 (PCMV-P-GMD)의 제작: 상기 본 명세서의 표 5에서 도시된 프라이머 586-26 및 587-22를 활용하여 CHO-S wt 세포로부터 추출된 전체 RNA 상에서 RT-PCR로 전장 GMD cDNA를 만들었다. 이 유전자를 요구되는 벡터 내로 클로닝하기 위하여, 클로닝 단계를 위해 요구되는 제한 효소 (RE) 부위 (5' SwaI 및 3' XhoI)의 첨가가 가능한 프라이머 700-45 및 701-30 (상세 설명을 위하여 하기 본 명세서의 표 7을 참고)을 이용하여 PCR의 추가적인 단계를 수행하였다.

벡터의 제작	사용된 주형	얻은 단편	5' 프라이머		3' 프라이머
			번호	서열*	번호	서열*
MB-127 (pTT5-APERA-HC)	PGL3 APERA EMCV-PAC1-DHFR 탠덤 - 872	HindIII -APERAHC- NotI	690-36	GTCTGAAT TCAAGCTT GTAGCGAT CGCCGCCA CCAT 서열번호: 41	691-38	GGATCCGC GGCCGCTA CGCCGCCC TCAGATCT TTATCA 서열번호: 42
MB-128 (pTT5-APERA-LC)	PGL3 APERA EMCV-PAC1-DHFR 탠덤 - 872	HindIII -APERALC- NotI	692-36	GCTTGAAT TCAAGCTT CTAGTACG CGTGTTTA AACC 서열번호: 43	693-32	GCGGCCGC TGTCCGCG CCTTACTA ACACTCTC 서열번호: 44
MB-129 (pCMV-P-GMD)	CHOwt 세포로부터의 GMD의 cDNA	SwaI-GMD-XhoI	700-45	GTCCGATA TCATTTAA ATCGCCAC CATGGCTC ACGCTCCC GCTAG 서열번호: 45	701-30	ATCCCTCG AGTTATCA GGCGTTGG GGTTGGTTC 서열번호: 46

PCR 단편을 SwaI 및 XhoI로 분해하였고 동일한 제한 효소로 분해되었던 벡터 pCMV-P에 결찰하였다.

결과적 벡터 (MB-129)는 도 25에서 설명되는 바와 같은 분리된 카세트 상에서의 선택 마커로서 퓨로마이신 저항 유전자를 가진 hCMV 프로모터 하에 GMD 유전자를 함유한다.

형질감염된 세포의 푸코오스 발현: 리포펙타민 시약을 이용하여 삼중으로 GMD 코딩 서열을 함유한 선형 플라스미드 (pCMV-P-GMD)로 ITL-LF2 및 CHO-S 세포를 형질감염시켰다. 13.6mg/L 하이포잔틴/3.9mg/L 티미딘 (HT) 및 10μg/ml 푸코오스로 보충된 50% C6614 (Sigma) 및 50% C6366 (Sigma)에서 3일 동안 ITL-LF2 세포를 수복하였다. 이후 10μg/ml 푸코오스 및 10μg/ml 퓨로마이신으로 보충된 50% C6614 (Sigma) 및 50% C6366 (Sigma)에서 형질감염된 세포를 선택하였다. 완전한 수복 후 ITL-LF2 형질감염 풀을 푸코오스가 없는 10μg/ml 퓨로마이신을 함유한 ProCHO5 배지에 옮겼다.

푸코실화 수준을 ITL-LF2 GMD 형질감염된 세포 상에서 FACS로 분석하였고 그리고 CHO-S (양성 대조군) 및 ITL-LF2 (음성 대조군) 세포의 푸코실화 수준과 비교하였다 (도 26). 결과는 대략적으로 45%의 모집단이 CHO-S 세포의 푸코실화 수준과 유사한 푸코실화 수준을 갖는 단백질을 발현한다는 점을 입증한다. 나머지 모집단 (~55%)은 더 낮은 푸코실화 수준을 나타내었다. 그럼에도 불구하고, 낮은 푸코실화 수준을 갖는 모집단은 ITL-LF2 비-형질감염된 세포의 푸코실화 수준보다 더 높은 푸코실화 수준을 가졌다. 상기 결과는 푸코실화가 GMD 함유 플라스미드로 형질감염 후 ITL-LF2 세포에서 재구성되었다는 점을 명시하고 GMD mRNA내 결함은 ITL-LF2 세포 상에서의 낮은 푸코실화 수준에 대한 근거였다는 점을 확인하였다. 상이한 푸코실화를 수준을 갖는 ITL-LF2 GMD 형질감염된 세포의 두 가지 부분-모집단의 존재에 대한 근거는 퓨로마이신 선택의 전략으로부터 파생될 수 있다. 낮은 및 높은 푸코실화 모집단 둘 모두는 퓨로마이신 선택에서 생존하기 위해 충분한 양으로 퓨로마이신 N 아세틸 전달효소 (PAC)을 발현하지만, PAC와 GMD 발현 사이에 직접적인 상관관계가 없을 수도 있다는 점이 추정된다. 따라서, 두 가지 부분모집단은 GMD 단백질의 상이한 수준을 발현하며 이는 상이한 푸코실화 수준을 유발한다.

실시예 5

안정한 및 일시적인 형질감염 후 ITL-LF2 세포의 분석

ITL-LF 및 CHO-S 세포의 안정한 형질감염: 리포펙타민 시약을 이용하여 삼중으로 (도 27) 항 EGFR mAb 코딩 서열을 함유한 선형 플라스미드 (PGL3 항 EGFR mAb EMCV-PAC1-DHFR 탠덤)로 ITL-LF2 및 CHO-S 세포를 형질감염시켰다.

13.6mg/L 하이포잔틴/3.9mg/L 티미딘 (HT) 및 10μg/ml 푸코오스로 보충된50% C6614 (Sigma) 및 50% C6366 (Sigma)에서 3일 동안 ITL-LF2 세포를 수복하였다. 이후 10μg/ml 푸코오스 및 5-10μg/ml 퓨로마이신으로 보충된 50% C6614 (Sigma) 및 50% C6366 (Sigma)에서 형질감염된 세포를 선택하였다. 8일 후 세포를 10μg/ml 푸코오스 및 25μg/ml 퓨로마이신이 있는 C6614 배지에 옮겼다. 낮은 푸코오스 형질감염된 세포의 결합된 풀을 형성하기 위하여 완전한 수복 후 ITL-LF2 형질감염 풀을 결합시켰다. 배지로부터 푸코오스를 제거하였고 나중에 세포를 10μg/ml 퓨로마이신을 함유한 ProCHO5 배지에 옮겼다.

27.2mg/L 하이포잔틴/7.8mg/L 티미딘 (HT) 및 10μg/ml 푸코오스로 보충된 ProCHO5 배지 (Sigma)에서 3일 동안 CHO-S 세포를 수복하였다. 이후 10μg/ml 푸코오스 및 25μg/ml 퓨로마이신으로 보충된 ProCHO5 배지에서 형질감염된 세포를 선택하였다. 12일 후 CHO-S 세포를 완전히 수복하였다.

재조합 항체 발현을 ELISA로 분석하였고 상기 발현이 CHO-S 형질감염된 세포와 비교하여 ITL-LF2 세포에서 불과 약간 더 낮은 것으로 밝혀졌다 (도 28).

항 EGFR mAb 형질감염된 세포막 상에서의 푸코오스 수준의 FACS 분석: 푸코오스의 제거 전 및 후 C6614 배지에서 증식된 항 EGFR mAb 형질감염된 세포의 세포막 상에서의 푸코오스 수준 분석은 푸코오스 제거시 푸코실화가 푸코오스의 부재에서 얻은 초기의 낮은 수준까지 감소된다는 것을 보여준다 (도 29).

항 EGFR mAb 형질감염된 세포막 상에서의 시알산 수준의 FACS 분석: 분석은 형질감염 후 그리고 시알산 특이적 렉틴: FITC 접합된 MAA로 세포의 라벨링 후, CHO-S 및 ITL-LF2 항 EGFR 형질감염된 세포 둘 모두가 그들의 세포막 상에서 시알산의 유사한 수준을 나타낸다는 점을 보여주었다. 이들 수준은 또한 CHO-S 및 ITL-LF2 비형질감염된 세포의 수준과 유사하다 (도 30).

일시적인 형질감염을 위한 pTT5-항 EGFR mAb 벡터의 제작: ITL-LF2 세포 내로 항 EFGR mAb의 일시적인 형질감염을 위하여, pTT5 벡터의 백본 상에서 두 가지 벡터를 제작하였다. 한 가지 벡터는 EFGR mAb 항체의 경쇄 (LC)를 함유하였고 다른 벡터는 중쇄를 함유하였다.

벡터 MB-127을 만들기 위하여, 벡터 PGL3 항 EGFR mAb EMCV-PAC1-DHFR 탠덤 - 872 상에서 프라이머 690-36 & 691-38을 활용하여 EFGR mAb HC를 함유한 1476 bp의 PCR 단편을 만들었다. 단편을 HindIII 및 NotI로 분해시켰고 그리고 동일한 RE로 분해되었된 벡터 pTT5 내에 결찰하였다. 결과적 벡터는 도 31A에서 볼 수 있다.

벡터 MB-128을 만들기 위하여, 벡터 PGL3 항 EGFR mAb EMCV-PAC1-DHFR 탠덤 - 872 상에서 프라이머 692-36 & 693-32를 활용하여 EFGR mAb LC를 함유한 762 bp의 PCR 단편을 만들었다. 단편을 HindIII 및 NotI로 분해시켰고 그리고 동일한 RE로 분해되었던 벡터 pTT5 내에 결찰하였다. 결과적 벡터는 도 31B에서 볼 수 있다.

ITL-LF 및 CHO-S 세포의 일시적인 형질감염: 삼중으로 PEI 시약을 이용하여 항 EGFR mAb 함유 PTT5 벡터 (도 30B)로 ITL-LF2 및 CHO-S 세포를 형질감염시켰다. 이후 두 가지 형질감염 프로토콜이 수행되었다:

ProCHO5내 형질감염: ProCHO5를 함유한 배지에서 37℃로 CHO-S 및 ITL-LF2 세포를 형질감염시켰고 형질감염 24시간 후 CHO-S 세포를 발프론 산으로 보충하고 31℃에서 인큐베이션하였다. 상기 명시된 조건 하에 ITL-LF2 및 CHO-S 세포내 단백질 농도는 각각, 12.5μg/ml 및 25μg/ml였다 (도 32).

실시예 6

재조합 항체의 분석

FACS에 의한 미가공 물질 또는 정제된 항체 상에서의 푸코오스 및 시알산 수준 분석: 미가공 또는 정제된 물질 함유 항체를 단백질 G 자성 구슬 상에 결합시켰고 그 다음 형광으로 라벨링된 특이적 렉틴으로 염색하였다 (도 33에서 설명된 바와 같음). 당 잔기 수준을 탐지하기 위하여 FACS로 항체 샘플을 분석하였다.

일시적으로 형질감염된 세포로부터의 미가공 수확 물질 상에서의 푸코오스 수준의 FACS 분석: 25μg/ml 이상 농도에 도달시키기 위하여 일시적인 형질감염으로부터의 미가공 수확물 샘플을 회전 여과기(spin filter) (Amicon ultra cat# UFC801024)로 농축시켰다. 32-37μg/ml의 단백질 산물 농도로 방법 부문에서 명시된 바와 같이 분석을 수행하였다. 결과는 ITL-LF2 형질감염된 세포가 안전하게 형질감염된 세포로부터의 물질의 푸코오스 수준과 유사한 (도 37) 그리고 세포막상에서 탐지된 수준과 관련이 있는 (도 29) 낮은 푸코오스 수준 (도 33)을 갖는 항 EGFR mAb 단백질을 발현한다는 점을 명백하게 보여준다.

안정한 풀로부터의 미가공 수확물 상에서의 푸코오스 수준의 FACS 분석: 세포 배양 배치로부터 제조된 미가공 수확물 샘플을 수집하였다. 25μg/ml의 단백질 농도로 방법의 부문에서 설명된 바와 같이 FACS에 의한 분석을 수행하였다. 결과는 ITL-LF2 형질감염된 세포가 일시적으로 형질감염된 세포로부터의 물질의 푸코오스 수준과 유사한 (도 34) 그리고 세포막상에서 탐지된 수준과 관련이 있는 (도 29) 낮은 푸코오스 수준 (도 35)을 갖는 항 EGFR mAb 단백질을 발현한다는 점을 명백하게 보여준다.

안정한 풀의 미가공 수확물 상에서의 시알산 수준의 FACS 분석: 세포 배양 배치로부터 제조된 미가공 수확물 샘플을 수집하였다. 25μg/ml의 단백질 농도로 방법의 부문에서 설명된 바와 같이 FACS에 의한 분석을 수행하였다. 결과는 ITL-LF2 및 CHO-S 형질감염된 세포가 시알산 수준과 유사한 (도 36) 그리고 세포막상에서 탐지된 수준과 관련이 있는 (도 30) 항 EGFR mAb 단백질을 발현한다는 점을 명백하게 보여준다.

정제된 산물 상에서의 푸코오스 수준의 FACS 분석: 안정하게 형질감염된 ITL-LF2 세포로부터의 항 EGFR mAb 정제된 산물의 FACS 분석은 낮은 푸코오스 수준을 나타낸 반면에, 부모 CHO-S 세포로부터의 정제된 산물은 정상적인 푸코오스 수준을 함유하였다 (도 37). 푸코오스 수준은 세포막 (도 29) 상에서 그리고 미가공 물질 (도 34)에서 탐지된 수준과 관련이 있다.

정제된 물질 상에서의 시알산 수준의 FACS 분석: 안정하게 형질감염된 세포로부터의 항 EGFR mAb 정제된 물질의 FACS 분석은 ITL-LF2 및 CHO-S 세포 둘 모두로부터의 물질 상에서 유사한 시알산 수준을 나타내었다 (도 38). 시알산 수준은 세포막 (도 30) 상에서 그리고 미가공 물질 (도 36)에서 탐지된 수준과 관련이 있다.

Octet에 의한 완전 항-EGFR mAb 상에서의 푸코오스 수준 측정: 단백질 A 칼럼으로부터 용리된 완전 항-EGFR mAb 정제된 분획을 조제 완충액에 대하여 투석하였고 그리고 농축시켰다. 비오틴화 알레우리아 아우란티아 렉틴 (AAL)에 항-EGFR mAb를 결합시킴으로써 야생형 CHO-S 세포 또는 ITL-LF2 중 하나에 의해 생산된 완전 정제 항-EGFR mAb 상에서의 푸코오스 수준을 측정하였다. 동역학적 분석 모듈을 이용하여 Octet QK 시스템 상에서 어세이를 수행하였다. 첫 번째로, 비오틴화-AAL를 스트렙타비딘 코팅 바이오센서에 결합시켰고, 이후 항 EGFR 항체 상에서의 푸코오스를 AAL 렉틴에 결합시켰다. Fc 영역 상에 위치한 푸코실화 부위 (ASN 297)가 AAL에 접근가능하지 않기 때문에 (데이터는 나타나지 않음), 완전 항-EGFR mAb의 분석은 Fab 푸코실화 잔기의 탐지만 가능하게 한다. Fc 영역 상에서 푸코실화 부위를 탐지하기 위해서는, Fc 단량체를 제조해야 한다.

결과는 CHO-S 형질감염된 세포에 의해 생산된 산물에 비하여, ITL-LF2 세포에 의해 생산된 완전 항 EGFR mAb 상에서의 낮은 푸코오스 수준을 입증한다 (도 39).

Octet에 의한 완전 항-EGFR mAb 상에서의 시알산 수준 측정: 야생형 CHO-S 세포 (WT) 또는 ITL-LF2 세포 중 하나에 의해 생산된 항-EGFR mAb를 시알릴화(sialylation) 수준에 대해 평가하였다. 단백질 A 칼럼으로부터 용리된 완전 항-EGFR mAb 정제된 분획을 조제 완충액에 대항하여 투석하였고 그리고 농축시켰다. 비오틴화 마악키아 아무렌시스 렉틴 (MAA)에 산물을 결합시킴으로써 완전 정제 항-EGFR mAb 상에서의 시알산 수준을 측정하였다. 동역학적 분석 모듈을 이용하여 Octet QK 시스템 상에서 어세이를 수행하였다. 첫 번째로, 비오틴화-MAA를 스트렙타비딘-코팅 바이오센서에 결합시켰고, 이후 항 EGFR mAb 상에서의 시알산을 MAA 렉틴에 결합시켰다. 결과 (도 40)는 시알산 수준이 ITL-LF2 및 CHO-S 세포에 의해 생산된 산물 둘 모두에서 유사하였다는 것을 보여준다. 결과는 ITL-LF2 및 CHO-S 세포에 의해 생산된 산물내 유일한 차이가 푸코오스의 수준인 반면에, 전체 글리코실화 프로파일은 아마도 변하지 않을 것이라는 점을 암시한다.

Octet에 의한 항-EGFR Fc 단량체 상에서의 푸코오스 수준 측정: 항-EGFR의 Fc 분획을 완전 항체의 파파인 절단으로 제조하였고, 이후 환원 및 알킬화 그 다음에 투석 및 농축 단계를 하였다. 야생형 CHO-S 세포, ITL-LF2 세포에 의해 생산된 산물로부터 Fc 단량체 분획을 제조하였다. Octet QK의 스트렙타비딘-코팅 바이오센서에 미리 부착되었던 비오틴화-AAL에 분획을 결합시킴으로써 Fc 단량체 상에서의 푸코오스 수준을 측정하였다. 결과는 CHO-S 세포에 의해 생산된 산물에 비하여, ITL-LF2 세포로부터의 항 EGFR Fc 단량체 상에서의 낮은 푸코오스 수준을 입증한다 (도 41).

Octet에 의한 항-EGFR Fc 단량체 상에서의 시알산 수준 측정:

항-EGFR mAb의 Fc 분획을 완전 항체의 파파인 절단으로 제조하였고, 이후 환원 및 알킬화 그 다음에 투석 및 농축시켰다. 야생형 CHO-S, ITL-LF2 세포에 의해 생산된 산물로부터 Fc 투석된 및 농축된 단량체 분획을 제조하였다. Octet QK 시스템의 스트렙타비딘-코팅 바이오센서에 미리 부착되었던 비오틴화-MAA에 분획을 결합시킴으로써 Fc 단량체 상에서의 푸코오스 수준을 측정하였다. 결과는 CHO-S 및 ITL-LF2 세포 둘 모두로부터 정제된 Fc 분획 상에서 유사한 시알산화 수준을 나타낸다 (도 42).

항-EGFR 풀로부터 정제된 산물의 모세관 등전점 전기영동: 야생형 CHO-S 또는 ITL-LF2 세포에 의해 생산된 항-EGFR mAb 산물을 단백질 A 칼럼 상에서 정제하고, 조제 완충액에 대항하여 투석하고 그리고 농축시켰다. 완전 산물의 전하 프로파일을 iCE 280의 모세관 전기영동으로 분석하였다. 도 43은 CHO-S 세포, ITL-LF2 세포로부터 정제된 산물의 pI 값 사이의 비교를 보여준다. 결과는 CHO-S 및 ITL-LF2 세포에 의해 생산된 산물의 전하 프로파일은 유사하지만, 반면에 아마도 세포주 및 배양 조건에서의 차이 때문에, 참고 샘플은 그들과 비교하여 약간 더 염기성인 것으로 보여진다는 것을 입증한다.

항-EGFR Fc 분획의 질량 분석법: 정제된 항-EGFR 완전 mAb를 파파인으로 절단하여 Fc 및 Fab 분획을 생산하였고, 이후 Fc 분획을 정제하고 그 다음 투석 및 농축시켰다. 보존된 Fc 영역 글리코실화 부위에서 푸코실화 수준의 평가를 위해 야생형 CHO-S 및 ITL-LF2 세포로부터의 항-EGFR Fc 샘플을 EMD Serono Research Center (Billerica, USA)에서 질량 분석법으로 분석하였다. 관찰된 글리칸 구조는 주로, 도 44에서 설명된 바와 같이 각각 0, 1 및 2 갈락토오스 G0-F, G1-F 및 G2-F를 가진 바이안테너리(biantennary)였다. 갈락토오스 수준은 하나 및 주로 두 개의 갈락코오스 잔기를 가진 더 높은 분획으로 명시된 바와 같이 CHO-S 유래된 물질에서 더 높다. 결과는 야생형 CHO-S 세포에 의해 생산된 산물의 IgG Fc 영역은 완전히 푸코실화된 반면에, ITL-LF2 세포에 의해 생산된 산물의 Fc 영역은 푸코실화되지 않았다(afucosylated)는 것을 보여준다.

실시예 7

ITL-LF2 항 EGFR mAb 형질감염된 세포의 푸코실화 수준에서 외생 푸코오스 첨가의 효과

배양 배지내 L-푸코오스의 증가하는 농도의 존재에서 ITL-LF2 항 EGFR mAb 형질감염된 세포를 ProCHO5 배지에 접종하였다. 세포 그리고 미가공 물질을 세포 접종 후 4일에 분석하였다. FACS 분석 결과는 외생으로 첨가된 푸코오스 농도 및 세포막 (도 45) 상에서의 그리고 재조합 항 EGFR mAb (도 46) 상에서의 푸코실화 수준 사이의 상관관계를 보여준다. 세포 및 재조합 항 EGFR mAb 둘 모두에서의 10μg/ml 푸코오스에서 최대 푸코실화를 얻었다. 세포에서 1μg/ml 외부 푸코오스의 가장 낮은 푸코실화 수준을 탐지하였지만, 반면에 재조합 항 EGFR mAb에서는 2.5μg/ml의 외부 푸코오스의 더 높은 농도의 가장 낮은 푸코실화 수준을 탐지하였다.

상기 결과에 기반하여, 칼리브레이션 곡선을 형성하였으며, 여기서 최대 형광은 100% 푸코실화로서 해석하고, 그리고 푸코오스 없이 얻은 샘플은 0% 푸코실화로서 측정하였다. 0% 외부 푸코오스에서의 형광 수준을 외부 푸코오스 농도 각각에서 얻은 형광 수준으로부터 공제하였고 이후 100% 푸코실화 (푸코오스 포화)에서의 형광 수준으로 나눈 푸코오스 농도 각각에서의 형광 수준으로서 푸코실화 퍼센트를 계산하였다. 이들 도면으로부터 곡선을 그렸다 (도 47).

Octet QK 결과에 기반한 푸코실화된 및 푸코실화되지 않은 항 EGFR mAb Fc 분획의 칼리브레이션 곡선: 항-EGFR의 Fc 분획을 완전 항체의 파파인 절단으로 제조하였고, 그 다음 환원, 알킬화, 투석 및 농축시켰다. 야생형 CHO-S 세포 및 ITL-LF2 세포에 의해 생산된 산물로부터 Fc 단량체 분획을 제조하였다. CHO-S 세포 (풀 100% 푸코오스)로부터의 산물 및 ITL-LF2 세포 (0% 푸코오스)로부터의 산물의 상이한 비율을 혼합함으로써 칼리브레이션 곡선을 위한 샘플을 제조하였다. Octet QK 시스템의 스트렙타비딘-코팅 바이오센서에 미리 부착되었던 비오틴화-AAL에 혼합된 샘플을 부착시킴으로써 샘플 각각에서의 푸코오스 수준을 측정하였다. Octet QK 시스템으로 동역학적 분석의 연합 단계를 수행하였다. 곡선 각각은 샘플내 푸코오스의 특정 %에 상응한다 (도 48A). 칼리브레이션 곡선내 푸코실화된 물질의 결합 수준 및 % 사이의 선형 상관 (도 48B)은 요구되는 샘플의 푸코실화 수준 측정을 위해 제공될 수 있다. 결과는 어세이가 민감하고 그리고 푸코오스의 비슷한 수준 사이에서 높은 해상도로 구별할 수 있다는 것을 보여준다. 푸코실화 물질의 결합 수준 및 % 사이에서 선형 상관은 특정한 외생 푸코오스 농도의 첨가로 푸코실화의 요구되는 퍼센트의 푸코실화를 얻을 수 있다는 점을 암시한다.

Octet에 의한 부분적으로 푸코실화된 항-EGFR Fc 단량체 분획의 분석: 외생으로 첨가된 푸코오스 농도 및 세포막 상에서의 푸코실화 수준 사이의 상관관계를 보여주는 FACS 분석의 결과에 따라서, 정제된 항-EGFR mAb 상에서의 푸코오스 수준을 Octet으로 측정하였다. 항 EGFR mAb를 발현하는 ITL-LF2 세포를 3.5μg/ml 푸코오스의 존재에서 4일 동안 병행하여 5개의 배치에서 배양하였고 그리고 배지를 수확하였다. 항-EGFR mAb를 정제하고 파파인으로 절단하고 그 다음 Fc 단량체 분획의 단리를 위해 환원 및 알킬화하였다. 상기 설명된 바와 같이 푸코오스 수준을 분석하였다. 결과는 배지에 3.5μg/ml 푸코오스의 첨가가 5개의 상이한 배치로부터 정제된 단백질에서 +/- 0.5% 변산도(variability)를 갖는 ~15%의 푸코실화 수준을 발생시킨다는 점을 입증한다 (도 49). 이것은 바람직한 푸코오스 수준이 재현가능하다는 점을 명시한다.

질량 분석법에 의한 부분적으로 푸코실화된 항-EGFR Fc 단량체 분획의 분석: 항-EGFR mAb 단량체 분획 상에서의 푸코실화 수준을 질량 분석법으로 분석하였다. 항 EGFR mAb를 발현하는 ITL-LF2 세포를 3.5μg/ml 푸코오스의 존재에서 4일 동안 병행하여 5개의 배치에서 배양하였고 그리고 배지를 수확하였다. 항-EGFR mAb를 정제하고 파파인으로 절단하고 그 다음 상기 설명된 바와 같이 Fc 단량체의 분획의 단리를 위해 환원 및 알킬화하였다.

관찰된 글리칸 구조는 주로, 하기 본 명세서의 표 8에서 설명된 바와 같이 각각 0, 1 및 2 갈락토오스 잔기 G0-F, G1-F 및 G2-F를 가진 바이안테너리였다. 갈락토오스 수준은 하나 및 주로 두 개의 갈락코오스 잔기의 더 높은 분획으로 명시된 바와 같이 CHO-S 유래된 물질에서 더 높다. 결과는 배지에 3.5μg/ml 푸코오스의 첨가가 5개의 상이한 배치로부터의 단백질에서 +/- 1.7%의 변산도를 갖는 15.6%의 푸코실화 수준을 유도한다는 점을 입증한다. 이들 결과는 Octet에 의해 얻은 결과와 관련이 있다 (도 49). 결과는 야생형 CHO-S 세포에 의해 생산된 산물의 IgG Fc 영역이 완전히 푸코실화되는 반면, ITL-LF2 세포에 의해 생산된 산물의 Fc 영역은 푸코실화되지 않았다는 것을 보여준다. 푸코실화 수준에 관하여 Octet 및 질량 분석법 결과 사이에서 매우 상당한 상관관계가 밝혀졌다.

가능한 글리칸 질량	1298	1444	1460	1606	1623	1769	1509
제안된 구조							비공지	푸코실화
샘플 ID	G0	G0f	G1	G1f	G2	G2f
CHO-S (WT)		30.10%		60.70%		9.20%		100%
ITL-LF2	49.80%		40.80%		5.10%		4.30%	0%
ITL-LF2 (3.5F/1)	41.70%	6.50%	37.60%	7.70%	6.40%			14.20%
ITL-LF2 (3.5F/2)	37.50%	7.10%	38.80%	9.60%	7.00%			16.70%
ITL-LF2 (3.5F/3)	37.20%	7.10%	38.70%	10.70%	6.30%			17.80%
ITL-LF2 (3.5F/4)	36.70%	5.50%	37.90%	8.10%	6.20%		5.50%	13.60%
ITL-LF2 (3.5F/5)	38.20%	6.50%	39.70%	9.00%	6.50%			15.50%
GluNac- ; 만노오스- ● ; 푸코오스- ▲ ; 갈락토오스-○

결론 및 논의

향상된 ADCC를 얻기 위한 재조합 항체의 푸코실화 수준을 감소시키기 위하여 여러 가지 기법이 최근에 개발되었다. 멕토트렉세이트의 존재에서 세포의 인큐베이션 그 다음 세포막 상에서 가장 낮은 푸코오스 수준, 즉 제로 푸코오스를 가진 세포의 효과적인 선택에 의해 CHO-S 세포로부터의 ITL-LF2 세포주의 발달이 이 작업에서 성공적으로 이루어졌다. 메토트렉세이트 (MTX)의 존재에서 세포의 인큐베이션에 의해 형성된 돌연변이 및 유전자 증폭이 문헌 (Schimke 1988; Coquelle, Pipiras et al. 1997; Singer, Mesner et al. 2000)에서 이전에 설명되었다.

MTX 처리 후, 다음 선택 단계를 위해 돌연변이 유발 시약을 제거하였다. Fc 글리코실화 부위 상에 존재하는 αFuc1-6GlcNA 잔기에 대하여 고 친화성을 갖는 푸코오스 특이적 렉틴 알레우리아 아우란티아 렉틴 (AAL)을 이용하여 자성 구슬 상에서의 단리 (도 7)에 의해 및/또는 FACS 분류 (도 12)에 의해 선택을 수행하였다. 제로 푸코오스 발현 세포의 선택이 세포막 상에서의 푸코오스 수준에 따라서 이루어졌음에도 불구하고, 제로 푸코오스 수준은 다양한 분석 방법에 의해, 이들 세포에서 발현되는 재조합 항체 (항 EGFR mAb) 상에서 발견되었다 (도 34-43). 모델 항체로서 역할하는 항 EGFR mAb는 두 개의 N 글리코실화 부위, Fab 단편 상에서 하나 그리고 Fc CH2 상의 ADCC 활성도에 중요한 다른 하나를 제시한다. 완전 mAb 상에서뿐만 아니라 ADCC 관련 푸오코스 잔기를 가진 Fc 단량체 상에서도 또한 Octet 및 MS 분석을 수행하였다. 결과는 ITL-LF2 세포에 의해 생산된 물질로부터의 ADCC 관련 푸코오스 잔기 상에서 제로 푸코오스 수준을 보여준다. ITL-LF2 세포의 제로 푸코오스 표현형은 검사되는 370 PDL에 대해 안정한 것으로 밝혀졌다 (도 15). 재조합 단백질을 발현하는 세포의 발달 및 생물반응기내 생산은 세포의 ~200 PDL 내에서 주로 완성된다. 제로 푸코오스 안정도 실험의 길이 (370 PDL)는 그것보다 길고, 따라서 ITL-LF2가 전체적인 클론 개발 및 생산 공정에 대해 안정하게 남아있을 것이라는 점이 예상된다. 대부분의 ITL-LF2 세포주 특징은 하기 본 명세서의 표 8로부터 결론지어질 수 있는 바와 같이 CHO-S와 유사한 것으로 밝혀졌다. 성장률, 최대 세포 농도, 세포 단백질의 그리고 이들 세포에서 발현되는 재조합 항체의 시알산 수준, 및 항 EGFR mAb의 발현 수준은 매우 유사하였다. 추가적으로, ITL-LF2　세포는 생존력에 있어서 CHO-S 세포보다 우세하였고, 그 결과로서 배치 공정에서 측정된 필수 생존가능 세포 농도　(IVCC)에서　CHO-S　세포보다　우세하였다. 이 현상은 세포막 상에서의 낮은 푸코오스 함량에 대한 분류 주기에 따라 세포가 겪은 엄격한 선택 공정의 결과일 수 있다.

외생 푸코오스의 존재에서 ITL-LF2 세포에 대한 높은 효능으로 안정한 형질감염을 수행하였다. 추가적으로, 외생 푸코오스의 부재에서, 형질감염된 세포는 거의 수복될 수 없지만 (데이터는 나타나지 않음), 형질감염으로부터의 ITL-LF2 세포의 수복은 CHO-S 세포에서의 수복보다 더 빨랐다. 이러한 발견은 푸코오스가 형질감염 및 선택 단계로부터의 수복에서 중요한 역할을 한다는 점을 암시한다. 항 EGFR mAb를 이용한 일시적인 형질감염은 CHO-S에서 얻은 생산성의 약 65-75%로 또한 성공적이었다.

하기 명세서의 표 9는 ITL-LF2의 특징의 요약을 제공한다.

특징	결과
푸코오스의 부재에서 푸코오스 수준	제로
푸코오스의 존재에서 푸코오스 수준	조정가능
형질감염 능력	CHO-S와 유사
제로 푸코오스 표현형의 안정도	적어도 370 PDL에 대하여
성장률 (PDT)	CHO-S와 유사한, 15-20 시간
최대 세포 농도	CHO-S와 유사한 8.4x106
시알릴화 수준	CHO-S와 유사
일시적인 발현	CHO-S내 ~50%의 발현
유전적 변형	GMD의 mRNA 프로파일의 변형
안정한 발현	CHO-S와 유사
배치 공정내 생존력	CHO-S보다 더 긴 시간 동안 높은 생존력
배치 공정내 IVCC	풀 스테이지(pool stage)내 CHO-S 세포보다 더 높은 IVCC

ITL-LF2 세포내 푸코오스 수준이 제로 및 안정한 것으로 밝혀졌던 사실을 제외하고는, 세포 (도 18 및 도 45) 및 재조합 단백질 (도 46-47 및 49) 상에서 푸코실화의 수준은 용량 의존 방식으로 외생 푸코오스 첨가에 의존하는 것으로 밝혀졌다. 추가적으로, 특정 농도의 푸코오스의 외생 첨가시, 상이한 샘플내 재조합 항체의 결과적 푸코실화 수준은 재현가능하였다 (도 49 및 표 8). 푸코실화 경로 (도 20)는 드 노보 및 살비지 경로 유형 둘 모두가 GDP-푸코오스의 발생을 유발할 수 있다는 점을 보여준다. 제로 푸코오스 표현형에 따라서 ITL-LF2를 선택하였기 때문에, 그 특징에 대한 유전적 근원을 발견하는 것은 흥미로웠다. 외생 푸코오스의 첨가는 세포막 상에서 단백질의 푸코실화 수준 회복을 유발하였다 (도 18). 이러한 발견은 살비지 경로가 활성이라는 점을 암시한다 (도 20). 드 노보 및 살비지 경로를 위한 여러 가지 주요 효소의 RT-PCR 및 서열화 분석은 ITL-LF2 및 CHO-S 세포내 푸코실 전달효소 8 (Fut8)이 크기 (도 21) 및 서열 (데이터는 나타나지 않음) 둘 모두에서 동일했다는 점을 보여주었다. 이러한 발견은 순차적 상동 재조합으로 중국 햄스터 난소 CHO DG44 세포주내 양쪽 FUT8 대립유전자를 파괴시킨 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd의 ITL-LF2 세포를 차별화시킨다 (Yamane-Ohnuki, Kinoshita et al. 2004; Kanda, Satoh et al. 2005).

Fut8과 유사하게도, 드 노보 경로와 관련된 GDP-케오-6-데옥시만노오스 3,5-에피머화효소, 4-환원효소 (FX) (도 21)의 mRNA 크기 및 서열은 ITL-LF2 세포에서 변화하지 않았다. 다른 한편으로, ITL-LF2 세포내 GDP-만노오스 4,6-탈수효소 (GMD)의 mRNA 크기는 CHO-S에서 더 짧았고 (도 20) 그리고 서열은 두 개의 스플라이스 변이체를 나타내었다. 3번째 및 4번째, 또는 8번째 및 9번째 엑손이 결핍된 세포로부터 mRNA 분자를 추출하였다 (도 21A-B 및 도 22A-B). 결실의 크기가 유사하기 때문에, 결실 사이에서의 차이를 겔로부터 탐지할 수 없었다 (도 21 및 도 23B). 하지만, 짧은 GMD 버전 (그리고 전장이 아님)만 겔 상에서 탐지할 수 있었다 (도 21). 돌연변이 유발원과 인큐베이션하였던 부분 모집합이 전장 mRNA가 아닌 상이한 스플라이스 변이체를 발현시키는 메커니즘은 명확하지는 않지만, 낮은 푸코오스 세포가 MTX 없이 선택되지 않았기 때문에 변경이 원래의 CHO-S 모집단에서는 존재하지 않는다는 점이 가능하다. 선택이 표현형적으로 이루어졌다는 것을 고려하면 이들 결과는 매우 흥미롭다.

QPCR 분석은 푸코실화 경로와 관련되는 검사된 모든 유전자가 유사한 mRNA 수준을 발현한다는 점을 보여주었다 (도 24). 결과는 ITL-LF2 세포에서 얻은 제로 푸코오스 수준이 상이한 스플라이스 변이체로부터, 또는 낮은 수준으로부터 발현되는 GMD 단백질의 불활성도, 또는 GMD 단백질의 완전한 부재 중 하나로부터 유래된다는 점을 제시한다.

CHO 세포 (Lec 13)내 렉틴 저항 돌연변이의 발생을 위하여 또 다른 연구 그룹에 의해 상이한 표현형 선택 기법이 사용되었다 (Ripka and Stanley 1986). 이 기법에서, 세포를 독성 완두 푸코오스 특이적 렉틴과 인큐베이션하였고 그리고 저항 세포가 Asn(297)-연결된 탄수화물에 부착된 푸코오스에서 결핍되었던 인간 IgG1을 발현하는 것으로 밝혀졌다 (Shields, Lai et al. 2002). 추가 연구 작업은 이들 세포내 푸코오스 수준이 상대적으로 짧은 시간 후 증가되었고 이는 낮은 푸코오스 표현형은 안정하지 않고 몇 가지 활성 GDP-푸코오스 단백질을 드 노보 경로로 합성하였다는 점을 명시한다는 것을 밝혀내었다 (Kanda, Yamane-Ohnuki et al. 2006). 또 다른 최근 논문에서, Kanda 및 동료들 (Kanda, Imai-Nishiya et al. 2007)은 Lec13이 CHO DG44에서 발현되는 mRNA와 동일한 크기로 mRNA를 발현한다는 점을 RT-PCR 분석으로 보여주었다. 앞서 명시된 바와 같이, ITL-LF2 세포는 아마도 활성 GMD 형태의 완전한 결핍 때문에 안정한 제로 푸코오스 표현형을 나타낸다 (도 21). RT PCR 서열화 및 서던 블롯에 의한, 또 다른 렉틴 (렌스 쿨리나리스(Lens culinaris) 응집소-LCA) 저항 세포주인 CHO-SM의 유전형 분석 (Kanda, Imai-Nishiya et al. 2007)은 이 세포주가 중요한 활성도 도메인을 인코딩하는 엑손 5, 6 및 7이 결핍된 돌연변이 GMD mRNA를 발현한다는 점을 밝혀내었다 (Somoza, Menon et al. 2000; Webb, Mulichak et al. 2004). 엑손 3 및 4 그리고 엑손 8 및 9도 ITL-LF2 세포에서 입증된 바와 같이 GMD 활성도에 대해 또한 중요하다. 따라서, ITL-LF2 세포의 GMD 프로파일은 Lec13 및 CHO SM 둘 모두와 상이하다는 것으로 결론 짓는다.

각각의 분류에서 가장 낮은 푸코오스 (또는 푸코오스의 부재) 함유 세포 분획을 FACS 선택함으로써 4회의 연속 분류 주기 후 ITL-LF2 세포를 발생시켰다 (표 4). 1차 분류는 결과적으로 낮은 푸코오스 표현형을 가진 세포조차도 산출하지 못하였다. 그럼에도 불구하고, 2차 분류 후, 대부분의 세포는 세포막 상에서 낮은 푸코오스 수준을 발현하였다. 추가적인 (3차) 분류는 제로 푸코오스 수준에서만 존재하는 상동 모집단으로 끝났다. 4차 분류를 수행하여 제로 푸코오스 발현 세포만 존재한다는 점을 확실하게 하였다 (도 12).

ITL-LF2 세포주는 2011년 2월 28일에 기탁물 CNCM I-4449로서 파리(Paris)에 있는 Pasteur Institute의 Collection Nationale de Cultures de Microoganisms에 기탁되었다.

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Collection Nationale de Cultures de Microoganisms CNCMI-4449 20110228

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HELMAN, DANIEL BAR-SHIMON, MEIRAV TOISTER-ACHITUV, MIRA <120> LOW FUCOSE CELL LINES AND USES THEREOF <130> P 11/028PCT <150> 211583 <151> 2011-03-06 <150> 217216 <151> 2011-12-27 <160> 46 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Single strand DNA oligonucleotide <400> 1 gtctgaattc aagcttgtag cgatcgccgc caccat 36 <210> 2 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Single strand DNA oligonucleotide <400> 2 ggatccgcgg ccgctacgcc gccctcagat ctttatca 38 <210> 3 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Single strand DNA oligonucleotide <400> 3 gcttgaattc aagcttctag tacgcgtgtt taaacc 36 <210> 4 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Single strand DNA oligonucleotide <400> 4 gcggccgctg tccgcgcctt actaacactc tc 32 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Single strand DNA oligonucleotide <220> <221> misc_feature <223> 5' FAM conjugated oligonucleotide <220> <221> 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misc_feature <223> 5' FAM conjugated oligonucleotide <220> <221> misc_feature <223> 3' BQ conjugated oligonucleotide <400> 11 ctttgactta gcagagtaca 20 <210> 12 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Single strand DNA oligonucleotide <400> 12 gccctatgga gcagccaaa 19 <210> 13 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Single strand DNA oligonucleotide <400> 13 aatgccgttc accgcaaa 18 <210> 14 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Single strand DNA oligonucleotide <220> <221> misc_feature <223> 5' FAM conjugated oligonucleotide <220> <221> misc_feature <223> 3' BQ conjugated oligonucleotide <400> 14 cctgaatgtt gttgtcctt 19 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Single strand DNA oligonucleotide <400> 15 tccacctcct caagggaaca c 21 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Single strand DNA oligonucleotide <400> 16 ctcctccgtt gttccaatgt g 21 <210> 17 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Single strand DNA oligonucleotide <220> <221> misc_feature <223> 5' FAM conjugated oligonucleotide <220> <221> misc_feature <223> 3' BQ conjugated oligonucleotide <400> 17 ttctatgccc tgctcaca 18 <210> 18 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Single strand DNA oligonucleotide <400> 18 ctgctgctca aacagaccac tt 22 <210> 19 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Single strand DNA oligonucleotide <400> 19 gtgccctcag ctccctctt 19 <210> 20 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Single strand DNA oligonucleotide <220> <221> misc_feature <223> 5' FAM conjugated oligonucleotide <220> <221> misc_feature <223> 3' BQ conjugated oligonucleotide <400> 20 ttgggacgtc tcactgc 17 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Single strand DNA oligonucleotide <400> 21 ctgctccctg gcaactccta 20 <210> 22 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Single strand DNA oligonucleotide <400> 22 aagtgggaag cataatgagc aaa 23 <210> 23 <211> 300 <212> PRT <213> Cricetulus griseus <220> <221> misc_feature <223> GDP-mannose 4,6-dehydratase (GMD) - Splice variant 1 <400> 23 Met Ala His Ala Pro Ala Ser Cys Pro Ser Ser Arg Asn Ser Gly Asp 1 5 10 15 Gly Asp Lys Gly Lys Pro Arg Lys Val Ala Leu Ile Thr Gly Ile Thr 20 25 30 Gly Gln Asp Gly Ser Tyr Leu Ala Glu Phe Leu Leu Glu Lys Gly Tyr 35 40 45 Glu Val His Gly Ile Val Arg Arg Ser Ser Ser Phe Asn Thr Gly Arg 50 55 60 Ile Glu His Leu Tyr Lys Asn Pro Gln Ala His Ile Glu Gly Asn Met 65 70 75 80 Lys Leu His Tyr Gly Asp Leu Thr Asp Ser Thr Cys Leu Val Lys Ile 85 90 95 Ile Asn Glu Val Lys Pro Thr Glu Ile Tyr Asn Leu Gly Ala Gln Ser 100 105 110 His Val Lys Ile Ser Phe Asp Leu Ala Glu Tyr Thr Ala Asp Val Asp 115 120 125 Gly Val Gly Thr Leu Arg Leu Leu Asp Ala Ile Lys Thr Cys Gly Leu 130 135 140 Ile Asn Ser Val Lys Phe Tyr Gln Ala Ser Thr Ser Glu Leu Tyr Gly 145 150 155 160 Lys Val Gln Glu Ile Pro Gln Lys Glu Thr Thr Pro Phe Tyr Pro Arg 165 170 175 Ser Pro 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Ile Asn Ser Val Lys Phe Tyr Gln Ala Ser Thr Ser Glu Leu Tyr Gly 145 150 155 160 Lys Val Gln Glu Ile Pro Gln Lys Glu Thr Thr Pro Phe Tyr Pro Arg 165 170 175 Ser Pro Tyr Gly Ala Ala Lys Leu Tyr Ala Tyr Trp Ile Val Val Asn 180 185 190 Phe Arg Glu Ala Tyr Asn Leu Phe Ala Val Asn Gly Ile Leu Phe Asn 195 200 205 His Glu Ser Pro Arg Arg Gly Ala Asn Phe Val Thr Arg Lys Ile Ser 210 215 220 Arg Ser Val Ala Lys Ile Tyr Leu Gly Gln Leu Glu Cys Phe Ser Leu 225 230 235 240 Gly Asn Leu Asp Ala Lys Arg Asp Trp Gly His Ala Lys Asp Tyr Val 245 250 255 Glu Ala Met Trp Leu Met Leu Gln Asn Asp Glu Pro Glu Asp Phe Val 260 265 270 Ile Ala Thr Gly Glu Val His Ser Val Arg Glu Phe Val Glu Lys Ser 275 280 285 Phe Met His Ile Gly Lys Thr Ile Val Trp Glu Gly Lys Asn Glu Asn 290 295 300 Glu Val Gly Arg Cys Lys Glu Thr Gly Lys Ile His Val Thr Val Asp 305 310 315 320 Leu Lys Tyr Tyr Arg Pro Thr Glu Val Asp Phe Leu Gln Gly Asp Cys 325 330 335 Ser Lys Ala Gln Gln Lys Leu Asn Trp Lys Pro Arg Val Ala Phe Asp 340 345 350 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ttttgttact 660 cgaaaaatta gccggtcagt agctaagatt taccttggac aactggaatg tttcagtttg 720 ggaaatctgg acgccaaacg agactggggc catgccaagg actatgtcga ggacttcctg 780 cagggagact gctccaaggc gcagcagaaa ctgaactgga agccccgcgt tgcctttgac 840 gagctggtga gggagatggt gcaagccgat gtggagctca tgagaaccaa ccccaacgcc 900 tga 903 <210> 27 <211> 921 <212> DNA <213> Cricetulus griseus <220> <221> misc_feature <223> GDP-mannose 4,6-dehydratase (GMD) - Splice variant 2 <400> 27 atggctcacg ctcccgctag ctgcccgagc tccaggaact ctggggacgg cgataagggc 60 aagcccagga aggtggcgct catcacgggc atcaccggcc aggatggctc atacttggca 120 gaattcctgc tggagaaagg atacgagatt tcctttgact tagcagagta cactgcagat 180 gttgatggag ttggcacctt gcggcttctg gatgcaatta agacttgtgg ccttataaat 240 tctgtgaagt tctaccaggc ctcaactagt gaactgtatg gaaaagtgca agaaataccc 300 cagaaagaga ccaccccttt ctatccaagg tcgccctatg gagcagccaa actttatgcc 360 tattggattg tagtgaactt tcgagaggct tataatctct ttgcggtgaa cggcattctc 420 ttcaatcatg agagtcctag aagaggagct aattttgtta ctcgaaaaat tagccggtca 480 gtagctaaga tttaccttgg acaactggaa tgtttcagtt tgggaaatct ggacgccaaa 540 cgagactggg gccatgccaa ggactatgtc gaggctatgt ggctgatgtt acaaaatgat 600 gaaccagagg actttgtcat agctactggg gaagttcata gtgtccgtga atttgttgag 660 aaatcattca tgcacattgg aaagaccatt gtgtgggaag gaaagaatga aaatgaagtg 720 ggcagatgta aagagaccgg caaaattcat gtgactgtgg atctgaaata ctaccgacca 780 actgaagtgg acttcctgca gggagactgc tccaaggcgc agcagaaact gaactggaag 840 ccccgcgttg cctttgacga gctggtgagg gagatggtgc aagccgatgt ggagctcatg 900 agaaccaacc ccaacgcctg a 921 <210> 28 <211> 1120 <212> DNA <213> Cricetulus griseus <220> <221> misc_feature <223> GDP-mannose 4,6-dehydratase (GMD Full length) <400> 28 atggctcacg ctcccgctag ctgcccgagc tccaggaact ctggggacgg cgataagggc 60 aagcccagga aggtggcgct catcacgggc atcaccggcc aggatggctc atacttggca 120 gaattcctgc tggagaaagg atacgaggtt catggaattg tacggcgatc cagttcattt 180 aatacaggtc gaattgaaca tttatataag aatccacagg ctcatattga aggaaacatg 240 aagttgcact atggtgacct caccgacagc acctgcctag taaaaatcat caatgaagtc 300 aaacctacag agatctacaa tcttggtgcc cagagccatg tcaagatttc ctttgactta 360 gcagagtaca ctgcagatgt tgatggagtt ggcaccttgc ggcttctgga tgcaattaag 420 acttgtggcc ttataaattc tgtgaagttc taccaggcct caactagtga actgtatgga 480 aaagtgcaag aaatacccca gaaagagacc acccctttct atccaaggtc gccctatgga 540 gcagccaaac tttatgccta ttggattgta gtgaactttc gagaggctta taatctcttt 600 gcggtgaacg gcattctctt caatcatgag agtcctagaa gaggagctaa ttttgttact 660 cgaaaaatta gccggtcagt agctaagatt taccttggac aactggaatg tttcagtttg 720 ggaaatctgg acgccaaacg agactggggc catgccaagg actatgtcga ggctatgtgg 780 ctgatgttac aaaatgatga accagaggac tttgtcatag ctactgggga agttcatagt 840 gtccgtgaat ttgttgagaa atcattcatg cacattggaa agaccattgt gtgggaagga 900 aagaatgaaa atgaagtggg cagatgtaaa gagaccggca aaattcatgt gactgtggat 960 ctgaaatact accgaccaac tgaagtggac ttcctgcagg gagactgctc caaggcgcag 1020 cagaaactga actggaagcc ccgcgttgcc tttgacgagc tggtgaggga gatggtgcaa 1080 gccgatgtgg agctcatgag aaccaacccc aacgcctgag 1120 <210> 29 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Ser Val Gly Glu Glu Asp Glu Val Ser Ile Lys Glu Ala Ala 245 250 255 Glu Ala Val Val Glu Ala Met Asp Phe Cys Gly Glu Val Thr Phe Asp 260 265 270 Ser Thr Lys Ser Asp Gly Gln Tyr Lys Lys Thr Ala Ser Asn Gly Lys 275 280 285 Leu Arg Ala Tyr Leu Pro Asp Phe Arg Phe Thr Pro Phe Lys Gln Ala 290 295 300 Val Lys Glu Thr Cys Ala Trp Phe Thr Asp Asn Tyr Glu Gln Ala Arg 305 310 315 320 Lys <210> 31 <211> 1728 <212> DNA <213> Cricetulus griseus <400> 31 atgcgggcat ggactggttc ctggcgttgg attatgctca ttctttttgc ctgggggacc 60 ttattgtttt atataggtgg tcatttggtt cgagataatg accaccctga ccattctagc 120 agagaactct ccaagattct tgcaaagctg gagcgcttaa aacaacaaaa tgaagacttg 180 aggagaatgg ctgagtctct ccgaatacca gaaggcccta ttgatcaggg gacagctaca 240 ggaagagtcc gtgttttaga agaacagctt gttaaggcca aagaacagat tgaaaattac 300 aagaaacaag ctaggaatga tctgggaaag gatcatgaaa tcttaaggag gaggattgaa 360 aatggagcta aagagctctg gttttttcta caaagtgaat tgaagaaatt aaagaaatta 420 gaaggaaacg aactccaaag acatgcagat gaaattcttt tggatttagg acatcatgaa 480 aggtctatca tgacagatct atactacctc agtcaaacag atggagcagg tgagtggcgg 540 gaaaaagaag ccaaagatct gacagagctg gtccagcgga gaataacata tctgcagaat 600 cccaaggact gcagcaaagc cagaaagctg gtatgtaata tcaacaaagg ctgtggctat 660 ggatgtcaac tccatcatgt ggtttactgc ttcatgattg cttatggcac ccagcgaaca 720 ctcatcttgg aatctcagaa ttggcgctat gctactggag gatgggagac tgtgtttaga 780 cctgtaagtg agacatgcac agacaggtct ggcctctcca ctggacactg gtcaggtgaa 840 gtgaaggaca aaaatgttca agtggtcgag ctccccattg tagacagcct ccatcctcgt 900 cctccttact tacccttggc tgtaccagaa gaccttgcag atcgactcct gagagtccat 960 ggtgatcctg cagtgtggtg ggtatcccag tttgtcaaat acttgatccg tccacaacct 1020 tggctggaaa gggaaataga agaaaccacc aagaagcttg gcttcaaaca tccagttatt 1080 ggagtccatg tcagacgcac tgacaaagtg ggaacagaag cagccttcca tcccattgag 1140 gaatacatgg tacacgttga agaacatttt cagcttctcg aacgcagaat gaaagtggat 1200 aaaaaaagag tgtatctggc cactgatgac ccttctttgt taaaggaggc aaagacaaag 1260 tactccaatt atgaatttat tagtgataac tctatttctt ggtcagctgg actacacaac 1320 cgatacacag 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gtccacccca cagcagcaat 420 tttgggtact cgtatgccaa gaggatgatt gacgtgcaga acagggccta cttccagcag 480 catggctgca ccttcactgc tgtcatccct accaatgtct ttggacctca tgacaacttc 540 aacattgaag atggccatgt gctgcctggc ctcatccata aggtgcatct ggccaagagt 600 aatggttcag ccttgactgt ttggggtaca gggaaaccac ggaggcagtt catctactca 660 ctggacctag cccggctctt catctgggtc ctgcgggagt acaatgaagt tgagcccatc 720 atcctctcag tgggcgagga agatgaagtc tccattaagg aggcagctga ggctgtagtg 780 gaggccatgg acttctgtgg ggaagtcact tttgattcaa caaagtcaga tgggcagtat 840 aagaagacag ccagcaatgg caagcttcgg gcctacttgc ctgatttccg tttcacaccc 900 ttcaagcagg ctgtgaagga gacctgtgcc tggttcaccg acaactatga gcaggcccgg 960 aagtga 966 <210> 33 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Single strand DNA oligonucleotide <400> 33 ataatgcggg catggactgg ttc 23 <210> 34 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Single strand DNA oligonucleotide <400> 34 atactatttt tcagcttcag gatatg 26 <210> 35 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Single strand DNA oligonucleotide <400> 35 ataatgggtg agccccaggg atc 23 <210> 36 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Single strand DNA oligonucleotide <400> 36 atatctagac aagggacagc agg 23 <210> 37 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Single strand DNA oligonucleotide <400> 37 ataatggctc acgctcccgc tagctg 26 <210> 38 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Single strand DNA oligonucleotide <400> 38 atatcaggcg ttggggttgg tt 22 <210> 39 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Single strand DNA oligonucleotide <400> 39 ataatggcgt ctctgcgcga agc 23 <210> 40 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Single strand DNA oligonucleotide <400> 40 atattaagat ttctccgaat cag 23 <210> 41 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Single strand DNA oligonucleotide <400> 41 gtctgaattc aagcttgtag cgatcgccgc caccat 36 <210> 42 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Single strand DNA oligonucleotide <400> 42 ggatccgcgg ccgctacgcc gccctcagat ctttatca 38 <210> 43 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Single strand DNA oligonucleotide <400> 43 gcttgaattc aagcttctag tacgcgtgtt taaacc 36 <210> 44 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Single strand DNA oligonucleotide <400> 44 gcggccgctg tccgcgcctt actaacactc tc 32 <210> 45 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Single strand DNA oligonucleotide <400> 45 gtccgatatc atttaaatcg ccaccatggc tcacgctccc gctag 45 <210> 46 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Single strand DNA oligonucleotide <400> 46 atccctcgag ttatcaggcg ttggggttgg ttc

Claims (40)

1. 다음 단계를 포함하는, 재조합 단백질을 발현시키는 숙주 세포로서 유용한 제로(zero) 푸코오스 수준을 갖는 중국 햄스터 난소(Chinese hamster ovary) (CHO) 세포를 선택하는 방법:
   (a) CHO 세포를 메토트렉세이트 (MTX)와 접촉시킴으로써 CHO 세포의 모집단 내 CHO 세포의 GDP-만노오스 4,6-탈수효소 (GMD)의 코딩 영역으로 유전적 돌연변이를 도입함으로써 돌연변이 GMD 단백질을 가지는 CHO 세포를 생산하는 단계,
   (b) 돌연변이된 GMD 단백질을 가지는 적어도 하나의 CHO 세포를 포함하는 CHO 세포의 모집단을, 이러한 세포의 모집단의 하나 이상의 세포막 상의 푸코오스 모이어티(moiety)에, 상기 돌연변이된 GMD를 포함하는 세포 모집단에 비-독성인 푸코오스 결합제의 결합을 허용하는 시간량 동안 비-독성 푸코오스 결합제와 접촉시키는 단계, 여기서 시간량은 세포를 죽이는 것을 허용하지 않고; 및
   (c) 돌연변이된 세포를 포함하는 세포의 모집단으로부터 비-독성 푸코오스 결합제를 결합시키는 하나 이상의 세포의 부분모집단을 제거함으로써, 재조합 단백질을 발현시키는 숙주세포로서 유용한 세포를 선택하는 단계, 여기서 선택된 세포는 외부 푸코오스의 부재시 제로 푸코오스 함량을 가지고, 상기 발현된 돌연변이 GMD는 엑손 3 및 4에 의해 인코딩되는 아미노산 결실이거나 또는 엑손 8 및 9에 의해 인코딩되는 아미노산 결실이고, 그리고 상기 세포들은 적어도 100 모집단 배가에 대해 안정한 푸코오스 표현형을 나타냄.
2. 제1항에 있어서, CHO 세포는 CHO-Kl, CHO-S, DUXB11, CHO-1E5, CH03F, CHO/DG44 및 CHO-2.6으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 중국 햄스터 난소 세포를 선택하는 방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 재조합 단백질은 항체 또는 Fc 단백질인 것을 특징으로 하는, 중국 햄스터 난소 세포를 선택하는 방법.
4. 삭제
5. 제1항에 있어서, 상기 비-독성 푸코오스 결합제는 탐지가능한 모이어티 또는 친화성 모이어티에 부착되는 것을 특징으로 하는, 중국 햄스터 난소 세포를 선택하는 방법.
6. 제1항에 있어서, 돌연변이 세포를 포함하는 상기 CHO 세포의 모집단이 비-독성 푸코오스 결합제와 접촉하는 시간량은 60분 이내인 것을 특징으로 하는, 중국 햄스터 난소 세포를 선택하는 방법.
7. 제5항에 있어서, 상기 비-독성 푸코오스 결합제가 친화성 모이어티에 부착될 때, 상기 방법은 상기 돌연변이된 세포 모집단을 첨가제와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하며, 이러한 첨가제는 상기 친화성 모이어티에 대한 동족 결합 모이어티를 포함하는 것을 특징으로 하는, 중국 햄스터 난소 세포를 선택하는 방법.
8. 제5항에 있어서, 상기 친화성 모이어티는 비오틴을 포함하는 것을 특징으로 하는, 중국 햄스터 난소 세포를 선택하는 방법.
9. 제7항에 있어서, 상기 동족 결합 모이어티는 탐지가능한 모이어티에 부착되는 것을 특징으로 하는, 중국 햄스터 난소 세포를 선택하는 방법.
10. 제9항에 있어서, 상기 탐지가능한 모이어티는 형광 모이어티 또는 자성 모이어티를 포함하는 것을 특징으로 하는, 중국 햄스터 난소 세포를 선택하는 방법.
11. 제1항에 있어서, 상기 (C) 단계의 제거는 FACS 분류에 의해 이루어짐을 특징으로 하는, 중국 햄스터 난소 세포를 선택하는 방법.
12. 제1항에 있어서, 상기 (C) 단계의 제거는 자성 분리에 의해 이루어짐을 특징으로 하는, 중국 햄스터 난소 세포를 선택하는 방법.
13. 제1항에 있어서, 상기 (C) 단계의 제거는 적어도 3회의 순차적 제거 단계에 의해 이루어짐을 특징으로 하는, 중국 햄스터 난소 세포를 선택하는 방법.
14. 제1항에 있어서, 상기 푸코오스 결합제는 알레우리아 아우란티아 렉틴(aleuria aurantia lectin) (AAL) 또는 아스퍼질러스 오리재 1-푸코오스-특이적 렉틴(Aspergillus oryzae 1-fucose-specific lectin) (AOL)인 것을 특징으로 하는, 중국 햄스터 난소 세포를 선택하는 방법.
15. 발현된 돌연변이 GDP-만노오스 4,6-탈수효소(GMD)를 포함하는 단리된 CHO 세포로, 상기 세포는 외부 푸코오스의 부재시 제로 푸코오스 함량을 가지고, 상기 발현된 돌연변이 GMD는 엑손 3 및 4에 의해 인코딩되는 아미노산 결실이거나 또는 엑손 8 및 9에 의해 인코딩되는 아미노산 결실이고, 그리고 상기 세포들은 적어도 100 모집단 배가에 대해 안정한 푸코오스 표현형을 나타내는 것인, 단리된 CHO 세포.
16. 제15항에 있어서, 상기 CHO 세포는 서열번호: 23 또는 24에서 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 돌연변이된 GDP-만노오스 4,6-탈수효소 (GMD)를 발현하도록 유전학적으로 변형된, 단리된 CHO 세포.
17. 제15항에 있어서, 상기 CHO 세포는 세포내에서 발현되는 단백질의 푸코실화 양이 외부 푸코오스 농도에 선형적으로 종속되도록(linearly dependent) 유전학적으로 변형된, 단리된 CHO 세포.
18. 삭제
19. 삭제
20. 삭제
21. 삭제
22. 제15항에 있어서, 상기 CHO 세포는 비-돌연변이된 CHO 세포보다 20% 더 높은 통합 생세포 농도 (IVCC)를 갖는 것을 특징으로 하는, 단리된 CHO 세포.
23. 제15항에 있어서, 야생형 푸코실 전달효소-8 (Fut8)을 발현하는 것을 특징으로 하는, 단리된 CHO 세포.
24. 제15항에 있어서, 야생형 GDP-케오-6-데옥시만노오스 3, 5-에피머화효소, 4-환원효소 (FX)를 발현하는 것을 특징으로 하는, 단리된 CHO 세포.
25. 삭제
26. 삭제
27. 제15항에 있어서, 단리된 CHO 세포가 20 시간 이상의 모집단 배가(doubling) 시간을 갖는 것을 특징으로 하는, 단리된 CHO 세포.
28. 삭제
29. 제15항에 있어서, 관심의 재조합 항체 또는 Fc 융합 단백질을 발현하는 것을 특징으로 하는, 단리된 CHO 세포.
30. 제15항의 단리된 세포를 포함하는 CHO 세포주.
31. 제30항에 있어서, CNCM 수탁번호 제I-4449호로 기탁된 것을 특징으로 하는, CHO 세포주.
32. 제15항의 단리된 CHO 세포 및 제노(xeno) 오염물질이 없는 세포 배양 배지를 포함하는 세포 배양물.
33. 제32항에 있어서, 상기 세포 배양 배지는 푸코오스를 포함하는 것을 특징으로 하는, 세포 배양물.
34. 제32항에 있어서, 상기 세포 배양 배지는 푸코오스가 없는 것을 특징으로 하는, 세포 배양물.
35. 재조합 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한 폴리뉴클레오티드로 제1항의 선택된 CHO 세포를 형질감염시키는 단계,
    형질감염된 CHO 세포를 재조합 단백질의 발현에 적합한 조건하에 배양하는 단계, 및
    단백질을 단리시키는 단계
    를 포함하는 재조합 단백질의 생산 방법.
36. 제35항에 있어서, 재조합 단백질은 항체 또는 Fc 융합 단백질인 것을 특징으로 하는, 재조합 단백질의 생산 방법.
37. 제35항에 있어서, 상기 형질감염 단계는 외생 푸코오스의 존재하에 이루어짐을 특징으로 하는, 재조합 단백질의 생산 방법.
38. 제35항에 있어서, 상기 형질감염 단계 후, 상기 선택된 CHO 세포를 푸코오스를 포함한 배양 배지에서 배양하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 재조합 단백질의 생산 방법.
39. 제15항에 있어서, 상기 돌연변이 GDP-만노오스 4,6-탈수효소 (GMD)는 엑손 3, 4, 8 및 9에 의해 인코딩되는 아미노산 결실인 것을 특징으로 하는 단리된 CHO 세포.
40. 제15항에 있어서, 상기 돌연변이 GDP-만노오스 4,6-탈수효소(GMD)는 1-49, 151-257, 및 330-372 위치에서 서열번호: 25로 제시되는 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 단리된 CHO 세포.

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