KR101956381B1

KR101956381B1 - Smad 단백질 활성화제 및 이를 포함하는 약학적 조성물

Info

Publication number: KR101956381B1
Application number: KR1020167029037A
Authority: KR
Inventors: 이인규; 이선주; 고영훈
Original assignee: 경북대학교병원; 경북대학교 산학협력단
Priority date: 2014-03-20
Filing date: 2014-03-20
Publication date: 2019-03-08
Also published as: KR20160131116A; WO2015141875A1

Abstract

본 발명은 PDK4(pyruvate dehydrogenase kinase 4)를 포함하는 SMAD 단백질 활성화제, 세포에 PDK4를 처리하여 SMAD 단백질의 활성화를 유도하는 방법 및 PDK4 또는 PDK4 저해제를 유효성분으로 함유하는 비정상적인 SMAD 단백질 활성화에 기인한 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 글루코오스 산화에 관여하는 PDC(pyruvate dehydrogenase complex)의 활성을 조절하는 단백질로 알려진 PDK4가 기존의 BMP(bone morphogenetic protein) 신호경로의 신호전달 물질로 알려진 SMAD 단백질의 세린 463 및 세린 465의 아미노산을 인산화시킬 수 있으므로, PDK4를 신규한 SMAD 활성화제로서 사용할 수 있는 가능성을 제시할 수 있으며, 나아가, SMAD 단백질의 비정상적인 인산화에 의하여 야기될 수 있는 각종 질환의 치료용도로서 PDK4 또는 PDK4 저해제를 적용할 수 있는 가능성을 제시할 수 있다.

Description

ＳＭＡＤ 단백질 활성화제 및 이를 포함하는 약학적 조성물{SMAD PROTEIN ACTIVATOR AND PHARMACEUTICAL COMPOSITION COMPRISING THE SAME}

본 발명은 PDK4(pyruvate dehydrogenase kinase 4)를 포함하는 SMAD 단백질 활성화제, 세포에 PDK4를 처리하여 SMAD 단백질의 활성화를 유도하는 방법 및 PDK4 또는 PDK4 저해제를 유효성분으로 함유하는 비정상적인 SMAD 단백질 활성화에 기인한 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

SMAD 단백질은 TGF-β(transforming growth factor-β) 신호 전달에서 중요한 역할을 하며, 신호전달을 위해 원형질 막(plasma membrane)에서 핵으로 이동한다. SMAD 단백질은 TGF-β와 상호작용하여 분화 및 세포자살 등을 조절한다. TGF-β수용체 키나제는 리간드가 결합하면 SMAD1과 SMAD5 또는 SMAD2와 SMAD3의 C-말단에 위치한 세린 잔기를 인산화시킨다[Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1997, 64:10669-74; Souchelnytskyi et al., J. Biol. Chem., 1997, 272:2810 7-15; Abdollah et al., J. Biol. Chem., 1997, 272:27678-85]. 상기 인산화된 SMAD들은 SMAD4와 헤테로다이머(heterodimers)를 형성하여 핵으로 이동하게 되고[Lagna et al., Nature, 1996, 383:832-6], 여기서 SMAD는 목적 유전자의 전사(transcription)를 촉진한다[Attisano and Wrana, Curr. Opin. Cell Biol., 2000, 12:235-43; Kijke et al., Trends Biochem Sci., 2000, 25:64-70]. SMAD에 대한 목적 모티프(motif)가 인간 PAI-1(plasminogen activator inhibitor-1)과 같은 TGF-β 반응 유전자의 프로모터에 존재하기 때문에 수용체-특이 SMAD3 및 SMAD4는 DNA에 직접 결합한다[Dennler et al., EMBO J., 1998, 17:3091-100]. TGF-β는 SMAD3 및 SMAD4 전사 인자가 인접한 프로모터에 결합하는 것을 통해 유도 억제자인 SMAD7 유전자의 전사를 유도한다[von Gersdorff et al., J. Biol. Chem., 2000, 275:11320-6]. SMAD 단백질의 메카니즘에 대한 구조적 또는 기능적 연구 결과로부터, 인간 암에서 유전적 돌연변이가 역할을 할 것이라 예상하고 있다[Shi et al., Nature, 1997, 388:87-93].

한편, PDK4는 글루코스 산화(glucose oxidation)에 관여하는 효소인 PDC(pyruvate dehydrogenase complex)의 활성을 조절하는 단백질 중의 하나이다[Linn, T.C., Pettit, F.H. & Reed, L.J. Alpha-keto acid dehydrogenase complexes. X. Regulation of the activity of the pyruvate dehydrogenase complex from beef kidney mitochondria by phosphorylation and dephosphorylation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 62, 234-241 (1969); Yeaman, S.J. The 2-oxo acid dehydrogenase complexes: recent advances. The Biochemical journal 257, 625-632 (1989)]. 단시간(short-term) 동안은 지방산의 산화 동안 생성되는 아세틸-CoA(acetyl-CoA)와 NADH에 의하여 활성이 증가하고, 해당과정 동안 생성되는 피루베이트에 의하여 활성이 저해되지만[Roche, T.E., et al. Distinct regulatory properties of pyruvate dehydrogenase kinase and phosphatase isoforms. Progress in nucleic acid research and molecular biology 70, 33-75 (2001); Behal, R.H., Buxton, D.B., Robertson, J.G. & Olson, M.S. Regulation of the pyruvate dehydrogenase multienzyme complex. Annual review of nutrition 13, 497-520 (1993)], 이런 조절과는 별도로 장시간(long-term) 동안은 기아와 당뇨병 상태에서 활성이 증가하여 PDC의 활성을 억제 시키는 것으로 알려져 있다[Denyer, G.S., Kerbey, A.L. & Randle, P.J. Kinase activator protein mediates longer-term effects of starvation on activity of pyruvate dehydrogenase kinase in rat liver mitochondria. The Biochemical journal 239, 347-354 (1986); Sugden, M.C., et al. Studies of the long-term regulation of hepatic pyruvate dehydrogenase kinase. The Biochemical journal 329, 89-94 (1998)].

그러나, 현재까지 SMAD 단백질의 인산화에 PDK4가 관련되어 있음을 보여주는 선행 연구 결과는 전무하다.

본 발명의 발명자들은 기존의 BMP(bone morphogenetic protein) 신호경로의 신호전달 물질로 알려진 SMAD 단백질이, 글루코오스 산화에 관여하는 PDC의 활성을 조절하는 단백질로 알려진 PDK4에 의하여 인산화될 수 있음을 확인하고, PDK4를 SMAD 단백질의 활성화제로서의 신규 용도를 제안하고자 하며, 아울러, PDK4 또는 PDK4 저해제를 SMAD 단백질의 비정상적인 인산화로 인한 각종 질환의 치료용 약학적 조성물로 적용할 수 있음을 제안하고자 한다.

상기와 같은 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 PDK4를 포함하는 SMAD 단백질 활성화제를 제공한다.

상기 PDK4는 SMAD 단백질을 인산화시키는 것이 바람직하다.

상기 인산화는 SMAD 단백질의 463위치 및 465위치의 세린 아미노산을 인산화시키는 것이 바람직하다.

상기 SMAD는 SMAD1, SMAD5 및 SMAD8로 이루어지는 군으로부터 1종 이상 선택되는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은 세포에 PDK4를 처리하는 것을 특징으로 하는 SMAD 단백질 활성화 방법을 제공한다.

상기 PDK4는 SMAD 단백질을 인산화시키는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은 PDK4를 유효성분으로 함유하는, SMAD 단백질의 비정상적 인산화 수준에 의하여 발생하는 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 비정상적 인산화 수준은 정상보다 낮은 SMAD 단백질의 인산화 수준인 것이 바람직하다.

상기 질환은 폐고혈압, 신장 질환, 암 및 골다공증으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은 PDK4의 저해제를 유효성분으로 함유하는, SMAD 단백질의 비정상적 인산화 수준에 의하여 발생하는 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 비정상적 인산화 수준은 정상보다 높은 SMAD 단백질의 인산화 수준인 것이 바람직하다.

상기 질환은 혈관석회화, 동맥경화증 및 심혈관 질환으로부터 선택되는 것이 바람직하다.

본 발명에 따르면, 글루코오스 산화에 관여하는 PDC의 활성을 조절하는 단백질로 알려진 PDK4가 기존의 BMP 신호경로의 신호전달 물질로 알려진 SMAD 단백질의 세린 463 및 세린 465의 아미노산을 인산화시킬 수 있으므로, PDK4를 신규한 SMAD 활성화제로서 사용할 수 있는 가능성을 제시할 수 있으며, 나아가, SMAD 단백질의 비정상적인 인산화에 의하여 야기될 수 있는 각종 질환의 치료용도로서 PDK4 또는 PDK4 저해제를 적용할 수 있는 가능성을 제시할 수 있다.

도 1은 세포내에서 PDK4와 SMAD1, 4 및 5의 결합가능성을 Co-immunoprecipitation을 이용하여 확인한 것이다.
도 2는 BMP2의 처리 여부에 따른 SMAD5의 인산화 양상 및 PDK4와의 결합능을 확인한 것이다.
도 3은 세포 내에서 PDK4와 SMADs간의 결합이 다른 단백질에 의해 매개되어진 것인지, 혹은 PDK4와 SMADs 간의 직접적인 상호작용인지를 확인한 것이다.
도 4는 기존에 알려진 PDK4와 ADP의 결합모델을 기반으로 하여 PDK4와 SMAD의 결합모델을 유추한 것이다.
도 5는 GST-PDK4와, 인위적으로 전사, 번역시킨 SMAD1, 5, 8, 4의 결합을 확인 한 것이다.
도 6은 도 5의 Synthetic PDK4를 이용하여 GST-SMAD1, 5, 8의 직접인산화를 in vitro kinase assay를 이용하여 확인한 것이다.
도 7은 도 6에서 이용한 물질들의 각각의 protein양을 coomassie blue staining을 이용하여 확인한 것이다.
도 8은 가장 강한 인산화를 보이고 있는 SMAD5가 synthetic PDK4의 농도가 증가함에 따라 인산화가 증가함을 확인한 것이다.
도 9는 PDK family inhibitor로 알려져 있는 DCA가 PDK4의 자가인산화를 감소시키는 것을 확인한 것이다.
도 10은 기존에 BMPR에 의해서 인산화된다고 알려져 있는 SMAD5의 463,465 자리의 Serine을 Alanine으로 치환하여 BMPR에 의해 인산화되는 자리를 불활성화 시키기 위한 SMAD의 염기서열 분석결과를 나타내었다.
도 11은 SMAD5의 463,465 자리의 Serine을 Alanine으로 바꾸었을 때 PDK4에 의하여 인산화가 일어나지 않는 것을 in vitro kinase assay를 이용하여 확인한 결과이다.
도 12는 도 11에서 이용한 물질들의 각각의 protein양을 coomassie blue staining을 이용하여 확인하였다.
도 13은 Adenovirus를 이용하여 PDK4의 과발현시켰을 때 세포내에서 SMAD1, 5, 8의 인산화가 증가되었음을 western blotting assay을 이용하여 확인한 결과를 보여준다.
도 14는 Adenovirus를 이용하여 PDK4의 과발현시켰을 때 세포 내에서 SMAD1, 5, 8의 인산화가 증가되었음을 Immunofluorescence staining assay을 이용하여 확인한 것이다.
도 15는 BMP2의 처치에 의한 BMP response element promoter response가 PDK4가 과발현된 세포에서 훨씬 더 강하게 activation된 것을 확인한 것이다.

발명의 실시를 위한 최선의 형태

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명의 발명자들은 기존의 BMP 신호경로의 신호전달 물질로 알려진 SMAD 단백질이, 글루코오스 산화에 관여하는 PDC의 활성을 조절하는 단백질로 알려진 PDK4에 의하여 인산화될 수 있음을 확인하고, PDK4를 SMAD 단백질의 활성화제로서의 신규 용도를 제안하고자 하며, 아울러, PDK4 또는 PDK4 저해제를 SMAD 단백질의 비정상적인 인산화로 인한 각종 질환의 치료용 약학적 조성물로 적용할 수 있음을 제안하고자 한다.

따라서, 본 발명은 PDK4를 포함하는 SMAD 단백질 활성화제를 제공한다.

상기 PDK4는 인간 PDK4 유전자 또는 단백질의 형태일 수 있으며, 첨부된 서열목록의 서열번호 1 또는 서열번호 2로 각각 표시되는 아미노산 서열 또는 염기 서열일 수 있다. 상기 단백질은 세포 내에서 그대로 작용하며, 상기 유전자는 적절한 발현벡터를 통하여 세포 내에서 PDK4 단백질로 발현되어 작용할 수 있다.

상기 사용된 용어로서 "활성화"는 표적 단백질이 기능성을 가짐을 의미하며, 본 발명에서는 SMAD 단백질의 인산화를 의미한다. 상기 인산화는 SMAD 단백질의 463위치 및 465위치의 세린 아미노산을 인산화시키는 것이 바람직하다. 이와 같은 인산화 부위는 기존에 알려진 활성화된 SMAD의 인산화 부위와 정확히 일치하는 것이다. 본 발명에서 PDK4에 의하여 인산화되는 SMAD는 SMAD1, SMAD5 또는 SMAD8일 수 있다.

상기 사용된 용어 "세포"는 동물 세포, 바람직하게는 포유동물 세포, 보다 바람직하게는 인간 세포일 수 있다. 상기 활성화 방법은 in vitro 또는 in vivo 상에서 수행될 수 있다.

상기 사용된 용어로서 "처리"는 세포에 PDK4를 투입시키는 일련의 과정으로서, 예를 들어 PDK4의 단백질 형태 또는 PDK4의 유전자 형태로 투입될 수 있다.

세포에 PDK4를 처리함으로써, 처리된 PDK4는 세포 내에 존재하는 SMAD 단백질을 인산화시키며, 상기 인산화는 SMAD 단백질의 463위치 및 465위치의 세린 아미노산을 인산화시킬 수 있다. 이와 같은 인산화 부위는 기존에 알려진 활성화된 SMAD의 인산화 부위와 정확히 일치하는 것이다. 상기 인산화되는 SMAD는 SMAD1, SMAD5 또는 SMAD8일 수 있다.

상기 사용된 용어로서 "비정상적 인산화 수준"은 정상보다 낮은 SMAD 단백질의 인산화 수준인 것이다. 따라서, 본 발명의 PDK4는 정상보다 낮은 SMAD 단백질의 인산화 수준과 관련되어 발생될 수 있는 질환의 예방 또는 치료용인 약학적 조성물로서 적용될 수 있다.

예를 들어, 상기 질환은 폐고혈압, 신장 질환, 암 및 골다공증으로부터 선택되는 것이 바람직하다.

상기 PDK4의 저해제는 PDK4의 발현을 억제하는 물질 또는 PDK4의 효소활성을 저해하는 물질이면 어떠한 것이든 가능하다.

본 발명의 바람직한 구체예로서, 상기 PDK4 저해제는 디클로로아세테이트(dechloroacetate, DCA)일 수 있다.

본 발명의 다른 바람직한 구체예로서, 상기 PDK4 저해제는 피루베이트와 유사한 구조를 갖는 화합물로서, 예를 들어 에틸-피루베이트 또는 소듐-피루베이트일 수 있다.

본 발명의 다른 바람직한 구체예로서, 상기 PDK4 저해제는 PDK4 단백질의 모노클로날 항체일 수 있다.

또한, 본 발명의 다른 바람직한 구체예로서, 상기 PDK4 저해제는 하기 화합물들일 수 있다:

(R)-트리플루오로-2-하이드록시-2-메톡시프로피온산((R)-trifluoro-2-hydroxy-2-methylpropionic acid) [Bebernitz GR, Aicher TD, Stanton JL, Gao J, Shetty SS, Knorr DC, Strohschein RJ, Tan J, Brand LJ, Liu C, Wang WH, Vinluan CC, Kaplan EL, Dragland CJ, DelGrande D, Islam A, Lozito RJ, Liu X, Maniara WM, Mann WR. Anilides of (R)-trifluoro-2-hydroxy-2-methylpropionic acid as inhibitors of pyruvate dehydrogenase kinase. J Med Chem 43, 2248-2257 (2000)],

(R)-3,3,3-트리플루오로-2-하이드록시-2-메틸프로피온산((R)-3,3,3-trifluoro-2-hydroxy-2-methylpropionic acid) [Aicher TD, Anderson RC, Gao J, Coppola GM, Stanton JL, Knorr DC, Sperbeck DM, Brand LJ, Vinluan CC, Kaplan EL, Dragland CJ, Tomaselli HC, Islam A, Lozito RJ, Liu X, Maniara WM, Fillers WS, DelGrande D, Walter RE, Mann WR. Secondary amides of (R)-3,3,3-trifluoro-2-methylpropionic acid as inhibitors of pyruvate dehydrogenase kinase. J Med Chem 43, 236-249 (2000)],

렐라민(leelamine) [Aicher, T.D., Damon, R.E., Koletar, J., et al. Triterpene and diterpene inhibitors of pyruvate dehydrogenase kinase (PDK). Biooganic &Medicinal Chemistry Letters 9 2223-2228 (1999)].

Co-A [Sugden MC, Holness MJ.Recent advances in mechanisms regulating glucose oxidation at the level of the pyruvate dehydrogenase complex by PDKs. Am J Physiol Endocrinol Metab. 284, 855-862 (2003)],

NAD [Patel MS, Korotchkina LG. Regulation of mammalian pyruvate dehydrogenase complex by phosphorylation: complexity of multiple phosphorylation sites and kinases. Exp Mol Med. 31, 191-197 (2001)],

인슐린(Insulin) [Lee FN, Zhang L, Zheng D, Choi WS, Youn JH. Insulin suppresses PDK-4 expression in skeletal muscle independently of plasma FFA. Am J Physiol Endocrinol Metab. 287, 69-74. (2004)] 및

피루베이트 및 ADP [Roche TE, Hiromasa Y. Pyruvate dehydrogenase kinase regulatory mechanisms and inhibition in treating diabetes, heart ischemia, and cancer. Cell Mol Life Sci. Apr;64(7-8):830-49. (2007)].

상기 사용된 용어로서 "비정상적 인산화 수준"은 정상보다 높은 SMAD 단백질의 인산화 수준인 것이다. 따라서, 본 발명의 PDK4 저해제는 정상보다 높은 SMAD 단백질의 인산화 수준과 관련되어 발생될 수 있는 질환의 예방 또는 치료용인 약학적 조성물로서 적용될 수 있다.

예를 들어, 상기 질환은 혈관석회화, 동맥경화증 및 심혈관 질환으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다.

본 발명의 약학적 조성물은 각각의 사용 목적에 맞게 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구 제형, 멸균 주사용액의 주사제 등 다양한 형태로 제형화하여 사용할 수 있으며, 경구 투여하거나 정맥 내, 복강 내, 피하, 직장, 국소 투여 등을 포함한 다양한 경로를 통해 투여될 수 있다.

이러한 약학적 조성물에는 추가적으로 담체, 부형제 또는 희석제 등이 더 포함될 수 있으며, 포함될 수 있는 적합한 담체, 부형제 또는 희석제의 예로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리쓰리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 비정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 들 수 있다.

또한, 본 발명의 약학적 조성물은 충전제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 더 포함할 수도 있다.

바람직한 구체예로서, 경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 상기 약학적 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 혼합하여 제형화한다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 등과 같은 윤활제가 사용될 수도 있다.

바람직한 구체예로서, 경구용 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 예시될 수 있으며, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면, 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

바람직한 구체예로서, 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액제, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제, 좌제 등을 예시할 수 있다. 비수성용제, 현탁제에는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 포함될 수 있다. 주사제에는 용해제, 등장화제, 현탁화제, 유화제, 안정화제, 방부제 등과 같은 종래의 첨가제가 포함될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서, "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

바람직한 구체예로서, 본 발명의 약학적 조성물에서 게미글립틴의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 ㎏ 당 1 내지 5,000mg, 바람직하게는 100 내지 3,000mg을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 투여 경로, 질병의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 약학적 조성물은 다양한 경로를 통하여 대상에 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명에서 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 제공하는 것을 의미하며, 본 발명의 약학적 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 일반적인 모든 경로를 통하여 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 유효성분을 표적 세포로 전달할 수 있는 임의의 장치를 이용해 투여될 수도 있다.

본 발명에서 "대상"은, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어, 인간, 원숭이, 소, 말, 양, 돼지, 닭, 칠면조, 메추라기, 고양이, 개, 마우스, 쥐, 토끼 또는 기니아 피그를 포함하고, 바람직하게는 포유류, 보다 바람직하게는 인간을 의미한다.

발명의 실시를 위한 형태

이하에서는 구체적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.

<실시예>

1. 실험 방법

1.1. GST pull-down assay

전장 human Smad1, mouse Smad5 및 rat Smad8을 pGEMX4T-1 벡터의 EcoRⅠ 및 XhoⅠ 부위로 삽입하고, E.coli BL21에서 증폭시켰다. Glutathione-s-transferase (GST), GST-human SMAD1, mouse SMAD5, rat SMAD8, human SMAD4, mouse PDK4 단백질들을 정제하였다. GST 및 GST-융합 단백질들을 Coomassie Blue staining을 통하여 정량하였다. [³⁵S]-Methionine labeled-mouse PDK, human SMAD1, mouse SMAD5, rat SMAD8 단백질들을 TnT Quick Coupled Transcription/Translation System(Promega, WI, USA)을 사용하여 in vitro에서 합성하였다. GST, GST-human SMAD1, mouse SMAD5, rat SMAD8, mouse PDK4 단백질들을 실온에서 20분 동안 Glutathione Sepharose TM4B(GE Healthcare, Sweden)와 함께 인큐베이션시켰다. Sepharose beads를 PBS로 세척하고, binding buffer(25mM HEPES, pH 7.6, 1mM DTT, 100mM NaCl, 0.2mM EDTA, 1.5% BSA, 20% glycerol) 내에서 4℃에서 12h 동안 [³⁵S]-Methionine labeled mouse PDK4, human SMAD1, mouse SMAD5, rat SMAD8와 함께 인큐베이션시켰다. Sepharose beads를 PBS로 세척하고, loading dye와 함께 끓였다. 샘플들을 NuPAGE gel(Invitrogen) 상에서 전개하고 검출하였다.

1.2. In vitro kinase assay

Kinases assays를 기질로서 GST-SMAD 단편들을 사용하여 수행하였다. GST-SMAD 단편을 kinase buffer 및 20μM ATP 내에서 37℃에서 30분 동안 synthetic PDK와 함께 인큐베이션시켰다. Kinase reactions을 NuPAGE loading buffer의 첨가에 의하여 종료시키고, 70℃에서 10분 동안 가열하여 NuPAGE 상에서 전개한 후 DrygelSr.(SLAB GEL DRYER Model SE1160, HOEFER SCIENTIFIC INSTRUMENTS SAN FRANCISCO)를 사용하여 건조시켰다. 건조된 겔을 Image Reader FLA-3000 series(FUJUFILM)를 사용하여 필름에 노출시켰다.

1.3. Co-immunoprecipitation

세포들을 1000rpm에서 10분 동안 원심분리하여 회수하고, PBS로 세척하였다. 세포들을 CoIP Lysis buffer(Triton X-100 1%, phosphatase inhibitor, protease inhibitor)로 처리하였다. ANTI-FLAG^® M2-Agarose를 PBS로 세척하였다. 세포 추출물을 4℃에서 오버나이트로 ANTI-FLAG^® M2-Agarose bead와 함께 인큐베이션시키고, lysis buffer 및 PBS로 순차적으로 세척하였다. 샘플에 β-mercaptoethanol과 함께 SDS loading buffer를 첨가한 후, 5분 동안 끓이고, SDS-PAGE 상에 전개시킨 후, ODYSSEY로 검출하였다.

1.4. Luciferase linked promoter

12XGCGC(BMP response element binding site)는 School of Biological Sciences and Technology, Chonnam National University로부터 분양받았다.

1.5. Western blot analysis

세포들을 adenovirus를 이용하여 PDK4유전자를 과발현시킨 후 lysis buffer(20mmol/L Tris, pH7.4, 10mmol/L Na₄P₂OH, 100mmol LNaF, 2mmol LNa₃VO₄, 5mmol LEDTA, pH 8.0, 0.1mmol LPMSF, 1% NP-40)로 처리하였다. 샘플에 β-mercaptoethanol과 함께 SDS loading buffer를 첨가한 후, 5분 동안 끓이고, SDS-PAGE상에 전개시킨 후, ODYSSEY로 검출하였다.

1.6. Immunofluorescence analysis

세포들을 유리판을 이용하여 6-well plate에 2X10⁵/well로 부착시킨 후 adeno virus를 이용하여 PDK4 유전자를 48시간, 72시간 동안 과발현시켰다. 세포들을 4% PFA로 고정시킨후 0.1% Triton X-100으로 15분 동안 투과성을 높인 후 anti-phospho SMAD1, 5 및 8을 1:100의 비율로 1차 antibody를 4℃에서 오버나이트로 Ab diluent solution을 이용하여 인큐베이션시키고 Alexa-Fluor-568-conjugated anti-rabbit secondary antibody를 사용하여 발현 정도를 확인하였다.

1.7. PDK4와 SMAD의 결합모델

PDK4와 ADP의 구조를 Protein Data Bank(http://www.pdb.org,pdbcode:2E0A)에서 확인하였다. SMAD5의 model building을 위해 Discovery Studio3.5( http://www.accelrys.com)과 MODELLER를 이용하였다. PDK4와 SMAD5의 결합모델을 추측하기 위해 Discovery Studio 3.5안에 ZDOCK과 RDOCK program을 이용한다. PDK4의 자가인산화 자리와 SMAD5 인산화 자리가 두물질의 결합면에 포함될 것으로 기대된다. PDK4와 SMAD5의 결합모델 분자그래픽은 PyMol package(http:// www.pymol.org)를 이용하여 생성하였다.

2. 실험 결과

본 실시예의 상기 항목 1.의 실험방법에 따른 결과들을 첨부된 도면을 참조하여 설명한다.

도 1은 세포내에서 PDK4와 SMAD1, 4 및 5의 결합가능성을 Co-immunoprecipitation을 이용하여 확인한 것이다. Lamin B는 negative control로 이용하였다. 도 1에 나타난 바와 같이, SMAD1 및 5가 강력하게 PDK4와 binding하는 것을 확인하였고, SMAD4는 약하게 결합되어있는 것을 확인하였다.

도 2는 BMP2의 처리 여부에 따른 SMAD5의 인산화 양상 및 PDK4와의 결합능을 확인한 것이다. 세포 내에서 PDK4와 SMAD5의 결합을 확인하고, 이때 SMAD를 인산화시키는 것으로 알려져 있는 BMP2를 같이 처리하였을 때, SMAD5의 인산화가 증가되는 것을 확인하였으며, 이때 PDK4와의 결합이 분리되는 것을 확인하였다.

도 3은 세포 내에서 PDK4와 SMADs간의 결합이 다른 단백질에 의해 매개되어진 것인지, 혹은 PDK4와 SMADs 간의 직접적인 상호작용인지를 확인하기 위하여, GST-pull down assay를 수행하였다. 도 3에 나타난 바와 같이, PDK4와 SMAD5는 직접적으로 단백질간 상호작용이 일어남을 알 수 있다. 또한, PDK4는 SMAD1, 5, 8과는 결합하지만, SMAD4와는 직접적으로는 결합하지 않는 것을 확인하였다. 이를 통하여 세포 내에서의 SMAD4와 PDK4간의 약한 결합은 SMAD 1, 5, 8의 매개에 의한 Co-SMAD(SMAD4)의 결합임을 유추할 수 있었다.

도 4는 기존에 알려진 PDK4와 ADP의 결합모델을 기반으로 하여 PDK4와 SMAD의 결합모델을 유추한 것이다. 유추된 결합은 PDK4의 kinase activation loop에 있는 Asn397, Phe400, Met454가 SMAD5의 serine잔기 주위의 Arg323, Pro315, Val318과 결합하여 SMAD5의 Ser 463, 465를 인산화할수 있는 가능성을 보여준다.

도 5는 GST-PDK4와, 인위적으로 전사, 번역시킨 SMAD1, 5, 8, 4의 결합을 확인 한 것이으로서, 도 3의 GST SMAD1, 5, 8, 4와, 인위적으로 전사,번역시킨 PDK4의 결합을 재확인한 것이다. 도 6은 도 5의 Synthetic PDK4를 이용하여 GST-SMAD1, 5, 8의 직접인산화를 in vitro kinase assay를 이용하여 확인한 것이다. 도 7은 도 6에서 이용한 물질들의 각각의 protein양을 coomassie blue staining을 이용하여 확인한 것이다. 도 6 및 도 7을 통하여 PDK4가 SMAD 1, 5, 8의 인산화를 일으킨다는 것을 확인하였다.

도 8은 가장 강한 인산화를 보이고 있는 SMAD5가 synthetic PDK4의 농도가 증가함에 따라 인산화가 증가함을 확인한 것이다. 도 9는 PDK family inhibitor로 알려져 있는 DCA가 PDK4의 자가인산화를 감소시키는 것을 확인하였으며, 동시에 SMAD5의 인산화도 DCA의 농도가 증가함에 따라 감소되는 것을 확인하였다.

도 10은 기존에 BMPR에 의해서 인산화된다고 알려져 있는 SMAD5의 463,465 자리의 Serine을 Alanine으로 치환하여 BMPR에 의해 인산화되는 자리를 불활성화 시키기 위한 SMAD의 염기서열 분석결과를 나타내었다.

도 11은 SMAD5의 463,465 자리의 Serine을 Alanine으로 바꾸었을 때 PDK4에 의하여 인산화가 일어나지 않는 것을 in vitro kinase assay를 이용하여 확인한 결과이다. 도 12는 도 11에서 이용한 물질들의 각각의 protein양을 coomassie blue staining을 이용하여 확인하였다. 도 11 및 도 12를 이용하여 PDK4가 SMAD5의 463, 463의 Serine을 인산화시킨다는 것을 확인하였다.

도 13은 Adenovirus를 이용하여 PDK4의 과발현시켰을 때 세포내에서 SMAD1, 5, 8의 인산화가 증가되었음을 western blotting assay을 이용하여 확인한 결과를 보여준다. 도 14는 Adenovirus를 이용하여 PDK4의 과발현시켰을 때 세포 내에서 SMAD1, 5, 8의 인산화가 증가되었음을 Immunofluorescence staining assay을 이용하여 확인한 것이다.

도 15는 BMP2의 처치에 의한 BMP response element promoter response가 PDK4가 과발현된 세포에서 훨씬 더 강하게 activation된 것을 확인한 것이다.

서열번호 1: 인간 PDK4의 아미노산 서열
서열번호 2: 인간 PDK4의 염기 서열

<110> Kyungpook National University Hospital Kyungpook National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> SMAD PROTEIN ACTIVATOR AND PHARMACEUTICAL COMPOSITION COMPRISING THE SAME <130> opp14-010-pct <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 411 <212> PRT <213> Homo sapiens PDK4 amino acids sequences <400> 1 Met Lys Ala Ala Arg Phe Val Leu Arg Ser Ala Gly Ser Leu Asn Gly 1 5 10 15 Ala Gly Leu Val Pro Arg Glu Val Glu His Phe Ser Arg Tyr Ser Pro 20 25 30 Ser Pro Leu Ser Met Lys Gln Leu Leu Asp Phe Gly Ser Glu Asn Ala 35 40 45 Cys Glu Arg Thr Ser Phe Ala Phe Leu Arg Gln Glu Leu Pro Val Arg 50 55 60 Leu Ala Asn Ile Leu Lys Glu Ile Asp Ile Leu Pro Thr Gln Leu Val 65 70 75 80 Asn Thr Ser Ser Val Gln Leu Val Lys Ser Trp Tyr Ile Gln Ser Leu 85 90 95 Met Asp Leu Val Glu Phe His Glu Lys Ser Pro Asp Asp Gln Lys Ala 100 105 110 Leu Ser Asp Phe Val Asp Thr Leu Ile Lys Val Arg Asn Arg His His 115 120 125 Asn Val Val Pro Thr Met Ala Gln Gly Ile Ile Glu Tyr Lys Asp Ala 130 135 140 Cys Thr Val Asp Pro Val Thr Asn Gln Asn Leu Gln Tyr Phe Leu Asp 145 150 155 160 Arg Phe Tyr Met Asn Arg Ile Ser Thr Arg Met Leu Met Asn Gln His 165 170 175 Ile Leu Ile Phe Ser Asp Ser Gln Thr Gly Asn Pro Ser His Ile Gly 180 185 190 Ser Ile Asp Pro Asn Cys Asp Val Val Ala Val Val Gln Asp Ala Phe 195 200 205 Glu Cys Ser Arg Met Leu Cys Asp Gln Tyr Tyr Leu Ser Ser Pro Glu 210 215 220 Leu Lys Leu Thr Gln Val Asn Gly Lys Phe Pro Asp Gln Pro Ile His 225 230 235 240 Ile Val Tyr Val Pro Ser His Leu His His Met Leu Phe Glu Leu Phe 245 250 255 Lys Asn Ala Met Arg Ala Thr Val Glu His Gln Glu Asn Gln Pro Ser 260 265 270 Leu Thr Pro Ile Glu Val Ile Val Val Leu Gly Lys Glu Asp Leu Thr 275 280 285 Ile Lys Ile Ser Asp Arg Gly Gly Gly Val Pro Leu Arg Ile Ile Asp 290 295 300 Arg Leu Phe Ser Tyr Thr Tyr Ser Thr Ala Pro Thr Pro Val Met Asp 305 310 315 320 Asn Ser Arg Asn Ala Pro Leu Ala Gly Phe Gly Tyr Gly Leu Pro Ile 325 330 335 Ser Arg Leu Tyr Ala Lys Tyr Phe Gln Gly Asp Leu Asn Leu Tyr Ser 340 345 350 Leu Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Ala Ile Ile Tyr Leu Lys Ala Leu Ser 355 360 365 Ser Glu Ser Ile Glu Lys Leu Pro Val Phe Asn Lys Ser Ala Phe Lys 370 375 380 His Tyr Gln Met Ser Ser Glu Ala Asp Asp Trp Cys Ile Pro Ser Arg 385 390 395 400 Glu Pro Lys Asn Leu Ala Lys Glu Val Ala Met 405 410 <210> 2 <211> 3710 <212> DNA <213> Homo sapiens PDK4 nucleotides sequences <400> 2 aggacgcgtt tccaagttcc agtgactcct cctgtttggg actcgggggg agagtgcggg 60 gagacaaata aaacctcggg cggcggcggc tggtgggaag acttgaactt gaatctcgaa 120 ccactgcatc tccgactctg cccagactct tcactccgcg gcaccctcaa accccagccc 180 aggccggggc gcacaagcca gccagcgcac ctgcagtcct cgcccggacg cgccgcgccc 240 cctcggaacc aggctctgct ccgagcagcc ttcgcccctc aagccagcca cagtccccgc 300 caggccgggt gggcgtcaag atgaaggcgg cccgcttcgt gctgcgcagc gctggctcgc 360 tcaacggcgc cggcctggtg ccccgagagg tggagcattt ctcgcgctac agcccgtccc 420 cgctgtccat gaagcagcta ctggactttg gttcagaaaa tgcatgtgaa agaacttctt 480 ttgcattttt gcgacaagaa ttgcctgtga gactcgccaa cattctgaag gaaattgata 540 tcctcccgac ccaattagta aatacctctt cagtgcaatt ggttaaaagc tggtatatac 600 agagcctgat ggatttggtg gaattccatg agaaaagccc agatgaccag aaagcattat 660 cagactttgt agatacactc atcaaagttc gaaatagaca ccataatgta gtccctacaa 720 tggcacaagg aatcatagag tataaagatg cctgtacagt tgacccagtc accaatcaaa 780 atcttcaata tttcttggat cgattttaca tgaaccgtat ttctactcgg atgctgatga 840 accagcacat tcttatattt agtgactcac agacaggaaa cccaagccac attggaagca 900 ttgatcctaa ctgtgatgtg gtagcagtgg tccaagatgc ctttgagtgt tcaaggatgc 960 tctgtgatca gtattattta tcatctccag aattaaagct tacacaagtg aatggaaaat 1020 ttccagacca accaattcac atcgtgtatg ttccttctca cctccatcat atgctctttg 1080 aactatttaa gaatgcaatg cgggcaacag ttgaacacca ggaaaatcag ccttccctta 1140 caccaataga ggttattgtt gtcttgggaa aagaagacct taccattaag atttcagaca 1200 gaggaggtgg tgttcccctg agaattattg accgcctctt tagttataca tactccactg 1260 caccaacgcc tgtgatggat aattcccgga atgctccttt ggctggtttt ggttacggct 1320 tgccaatttc tcgtctgtat gcaaagtact ttcaaggaga tctgaatctc tactctttat 1380 caggatatgg aacagatgct atcatctact taaaggcttt gtcttctgag tctatagaaa 1440 aacttccagt ttttaacaag tcagccttca aacattatca gatgagctct gaggctgatg 1500 actggtgtat cccaagcagg gaaccaaaga acctggcaaa agaagtggcc atgtgaagag 1560 ggacactcag gacactttac gggatcaaag tgggtctaca ccagtgctgc ttcctgaatg 1620 tttgtgtgtg aacccttgtt tcctccaaaa caaacgacag caacgaaaac tccttaatca 1680 gaacactgat ccaatgagga atggagcttg tttctgtgac ccaggagaac ttagtgcaag 1740 actacaggag ttaacagatg gccagctcct tattttttaa tgtagaataa ctcctgagtt 1800 tatatcaaat cctgaagaaa taagcctcag ttttccatct gtttttgata agaataagaa 1860 agggagtgag tgtgaagatg gtggttagca gtttcactaa gactgatatt ttaggcctct 1920 tgttcacatc aaaagatatt ggtgtcagaa taccagcatt ttcctgccat gcaaaggatt 1980 aaaacttagt ttacactatg tggttacaaa tatatgtcaa tgtacatttt gaacatattt 2040 atgtgctatg gaaggaaatg ctggtgacta aaataaggtt tactctgaaa gaggaggaat 2100 tttattcaaa gcattcaaac attttattca agtgtttcaa aattcaaagc attgtattca 2160 aagttgcagt gaaggcatca acttatgtaa aaactcagaa ggaaggctcc tctgataaaa 2220 acacagctcc 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tttaaactgg catatagaaa aaaaggagga tttttctgca ttgtaaaata 3120 atcagtatgg tttatatgtt gaatttgaca tttgtgtgta atttcatggt ggcctagtgt 3180 tgtggtgctt ctggtaatgg taatagaagc tcaactattt ttttgtggat ttcagttttt 3240 atcatcagaa gtcctagaca gtgacatttc ttaatggtgg gagtccagct catgcatttc 3300 tgattataca aaacagtttg cagtaggtta tttgtcattt cagtttttta ctgaaatttg 3360 agctaaacat ttttacatgt aaatacttgt atttaccaaa gatttaaatc agttgattaa 3420 ttaattaact caaatactgt gaactatctc taaaacacta gaaaaaagaa atgttagtat 3480 ctcaattaca ccaactgtgc aaatgaactt tgataaaata gaaataatct acattggcct 3540 ttgtgaaatc tggggaagag ctttaggatt ctagtagatg gatactgaat actcaggccc 3600 acttaaatta ttaatgtata cattgtgttt ttgtctttat gctatgtaca gagaaatgtg 3660 ataatttttt ataataaata ttttttatga tgataaaaga aaaaaaaaaa 3710

Claims

PDK4(pyruvate dehydrogenase kinase 4)를 포함하는 SMAD 단백질 활성화를 위한 시험관내 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 PDK4는 SMAD 단백질을 인산화시키는 것을 특징으로 하는 시험관내 조성물.
제 2항에 있어서, 상기 인산화는 SMAD 단백질의 463위치 및 465위치의 세린 아미노산을 인산화시키는 것을 특징으로 하는 시험관내 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 SMAD는 SMAD1, SMAD5 및 SMAD8로 이루어지는 군으로부터 1종 이상 선택되는 것을 특징으로 하는 시험관내 조성물.
실험실(in vitro) 상에서, 세포에 PDK4(pyruvate dehydrogenase kinase 4)를 처리하는 것을 특징으로 하는 SMAD 단백질 활성화 방법.
제 5항에 있어서, 상기 PDK4는 SMAD 단백질을 인산화시키는 것을 특징으로 하는 방법.
제 6항에 있어서, 상기 인산화는 SMAD 단백질의 463위치 및 465위치의 세린 아미노산을 인산화시키는 것을 특징으로 하는 방법.
제 5항에 있어서, 상기 SMAD는 SMAD1, SMAD5 및 SMAD8로 이루어지는 군으로부터 1종 이상 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
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