KR101952297B1 - 항암제의 탑재율을 조절하여 조영 성능의 제어가 가능한 항암조영제를 이용한 암 진단 효율 향상 방법 - Google Patents

Abstract

에피루비신(EPI), 양친매성 폴리(아스파트산) 그래프트 공중합체 P 및 산화철 나노 입자(IONP)를 포함하는 항암조영제의 에피루비신의 탑재율을 조절하여 암 진단 효율 조절하는 방법이 개시된다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 에피루비신(EPI) 의 탑재율을 조절함으로써, 조영 성능의 제어가 가능하고 우수한 조영 증강 능력을 나타내며, 생체적합성 고분자 매트릭스에 EPI 의 봉입은 P-IONP의 표면에 코팅된 EPI에서 얻을 수 있는 형태 이상으로 EPI의 방출을 연장할 수 있어, 높은 안정성 등을 나타내고, 이외에도 우수한 세포독성 및 세포 흡수를 나타내는바, 치료, 진단 및 테라노스틱스와 같은 다양한 생의학적 분야에 활용 가능하다는 효과가 있다.

Description

항암제의 탑재율을 조절하여 조영 성능의 제어가 가능한 항암조영제를 이용한 암 진단 효율 향상 방법{A METHOD TO IMPROVE THE CANCER DIAGNOSTIC EFFICIENCY BY USING THE ANTICANCER CONTRAST AGENT THAT CAN CONTROL THE CONTRAST ABILITY BY ADJUSTING THE LOADING EFFICIENCY OF ANTICANCER AGENT}

테라노스틱제로서의 다기능 초미세 초상자성 산화철 나노입자를 이용한 진단 효율 향상 방법 및 약물 전달 방법에 관한 것이다.

MRI (Magnetic Resonance Imaging) 는 강력한 자기장을 이용하여 신체 내부를 나타내는 진단 기술로서, 다른 영상화 기술 X-레이나 CT에 비해 방사능에 노출되지 않아 무해하며, 진단상의 민감도와 특이도를 향상시킬 수 있고, 근래에는 MR 하드웨어와 소프트웨어의 빠른 발전으로 병변의 검출 및 진단에 충분한 병변-잡음 대조도(CNR)를 가진 허상이 적은 훌룡한 영상의 획득이 단시간에 가능해짐에 따라, MRI는 병변의 발견과 감별진단에 매우 유용한 진단의 수단으로 자리잡고 있으며 치료 후 평가에 있어서 상당부분 CT를 대치하여 사용되고 있다.

생리 기관들에 특정된 MRI 조영제들은 정상 조직과 병리 조직 사이의 영상 대조를 향상시키는데 사용되어 왔다. 따라서 이러한 MRI 조영제는 조영 증강 능력, 높은 콜로이드 안정성 및 유리한 약물 동태학적 특성들을 가져야한다. MRI를 위한 다양한 조영제들 중에서, 잠재력이 높은 간 특유의 조영제로서 초상자성 산화철 (superparamagnetic iron oxide, SPIO) 나노입자 (NP)가 개발되어왔다. 원리적으로 망상내피계 (reticuloendothelial system, RES)의 대식세포 (macrophage)에 의한 SPIONP의 흡수는 T₂ 이완 시간을 단축시켜서 결과적으로 흔히 사용되는 모든 펄스 시퀀스의 신호를 잃을 수 있다. 정상 조직과 종양 사이의 T₂ 이완 시간의 차이 때문에 RES 장기의 병변을 발견할 수 있다. 초상자성 MRI 조영제로 사용되는 산화철 나노입자 (IONP) 의 효과적인 안정화를 위해 NP 의 코팅이 일반적으로 바람직하다. NP의 코팅에 사용되는 재료는 무기 및 고분자 재료를 포함한 여러 재료를 포함할 수 있다. 고분자 또는 계면 활성제와 같은 안정제는 일반적으로 NP 가 분산된 매체에서 응집되는 것을 방지하기 위해 나노 크기 입자 준비 시에 투입되며 대부분의 고분자는 기질-특유의 방식으로 표면에 부착한다. 고분자 코팅재는 합성 및 천연 고분자로 분류할 수 있다. 폴리(에틸렌-co-비닐아세테이트), 폴리(비닐피롤리돈), 폴리(락트산-co-글리콜산), 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리(비닐 알코올) 등의 고분자 및 그 유도체가 전형적인 합성 고분자의 예이다. 젤라틴 (gelatin), 덱스트란 (dextran), 키토산 (chitosan), 풀루란 (pullulan)과 같은 천연 고분자들이 천연 고분자 코팅 시스템으로 이용되고 있다.

또한, 저분자 및 고분자 계면 활성제, 예를 들면, 나트륨 올레에이트 (sodium oleate), 도데실 아민 (dodecylamine) 및 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스 (sodium carboxymethylcellulose)는 수성 매질에서의 분산성을 향상시키기 위해 통상적으로 사용된다.

한편, SPIONP 의 가능한 가장 유망한 응용은 위치-특이적 전달을 위한 약물 전달 수송체이다. 또한, 약물 운반 담체를 위한 미립자 시스템으로서 몇 가지 폴리(아미노산) 유도체들이 연구되었다. 그러한 고분자들 가운데 폴리숙신이미드 (PSI)는 PSI가 비-독성 (non-toxicity), 생분해성 및 고분자 프로드럭의 개발을 위한 상대적으로 쉬운 합성 및 기능화와 같은 적합한 물리화학적 특성들을 가지고 있음이 입증되었기 때문에 미립자 담체에 대한 가장 유망한 고분자들 중 하나이다. 한편, 진보된 바이오컨쥬게이션 (bioconjugation) 기술을 통해 제조된 생리 활성 물질의 미셀화 (micellization)는 친지성 (lipophillic) 약물의 용해도, 안정성 및 생체이용률을 증가시킬 수 있는 유용한 방법이다. 고분자의 바이오컨쥬게이트 (bioconjugate)의 합리적인 설계는 바람직한 물리화학적 및 생물약제학적 특성을 갖는 유도체를 얻기 위한 핵심 사항이다. 그러므로 고분자 백본 (backbone)에 특정한 펜던트 그룹(pendant group)의 도입이 담체 특성을 조절하기 위해 종종 수행된다. 특히, 고분자 미셀 시스템은 다양한 약물에 대한 적용성 및 다른 시스템에 비해 비교적 작은 크기와 같은 몇가지 장점을 가질 수 있다. 블록 공중합체로부터 자기-조립된 (self-assembled) 미셀과 폴리머솜 (polymersome) 과 같은 고분자 나노구조들은 고분자 나노구조들에 ex situ 로 도입시켜 SPIONP 를 안정화시키는데 사용되었다.

최근, in situ 화학적 침전을 통해 고분자 소포체 (vesicle)의 코로나 (corona) 사이에서 성장한 초미세 SPIONP 가 가능성 있는 약물 전달용 운반체로서 보고되었다. SPIONP 로 수식된 그러한 소포체는 정상 간 세포에 대해 낮은 세포독성을 보였다.

이에, 본 발명자들은 테라노스틱제 (theranostic agent)의 플랫폼으로서 생체적합성 고분자로 코팅된 초소형 IONP (P-IONP 라 약칭함) 의 잠재력을 연구하기 위해 양친매성 폴리(아스파트산) 그래프트 공중합체를 합성하였고 P-IONP의 제조에 사용하였다. 모델 항신생물제인 에피루비신 (epirubicin)을 탑재시킨 P-IONP (EPI-P-IONP)을 합성하였으며, EPI-P-IONP의 물리화학적 특성, 시험관 내 (in vitro) 자기 공명 (MR) 특성, 시험관 내 (in vitro) 세포독성, HeLa 세포에 대한 세포 내 흡수 등과 같은 성질들이 특성화되었다. 이러한 P-IONP의 약물 운반 능력 외에도, EPI-P-IONP는 시험관 내 (in vitro)에서 그것의 분포가 가시화될 수 있는 EPI-P-IONP의 초상자성 특성으로 인해 MR 영상 조영제로서 유용할 것으로 예상되었다. 테라노스틱제 (theranostic agent)로서, P-IONP는 생분해성 조영제가 될 것이고 생체적합성 고분자 매트릭스에 EPI의 봉입은 P-IONP의 표면에 코팅된 EPI에서 얻을 수 있는 형태 이상으로 EPI의 방출을 연장할 수 있을 것으로 기대되었다. 또한, EPI-P-IONP의 세포독성 및 세포 흡수가 조사되었으며, 결과는 테라노스틱 (theranostic) 플랫폼으로서 P-IONP의 높은 가능성을 시사했다.

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대한민국 공개특허 10-2010-0102345

본 발명의 일 목적은 EPI-P-IONP 가 약물 전달 시스템뿐만 아니라 MR 조영제로서 기능하는 테라노스틱제 (theranostic agent) 로서 높은 가능성을 가지는 점을 이용하여, 항암 약물의 전달체로서 활용할 뿐만 아니라, 진단제로서 동시에 활용하여, 다양한 생의학적 분야에서, 진단 효율을 조절하기 위한 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여,

본 발명의 일 측면에 따라, 알킬화제인 항암제, 양친매성 폴리(아스파트산) 그래프트 공중합체 및 산화철 나노 입자를 포함하는 항암조영제의 항암제 탑재율을 조절하여 암 진단 효율을 조절하는 방법이 제공된다.

구체적으로, 상기 항암제는 에피루비신인 것이 바람직하고, 상기 에피루비신의 탑재율은 2% 이상, 보다 바람직하게는 4% 이상, 가장 바람직하게는 8% 이상인 것이 가장 바람직하다.

본 발명의 일 측면에 따른 방법은 알킬화제인 항암제의 탑재율을 조절함으로써, 조영 성능의 제어가 가능하고 우수한 조영 증강 능력을 나타내며, 생체적합성 고분자 매트릭스에 EPI 의 봉입은 P-IONP의 표면에 코팅된 EPI에서 얻을 수 있는 형태 이상으로 EPI의 방출을 연장할 수 있어, 높은 안정성 등을 나타내고, 이외에도 우수한 세포독성 및 세포 흡수를 나타내는바, 치료, 진단 및 테라노스틱스와 같은 다양한 생의학적 분야에 활용 가능하다는 효과가 있다.

즉, EPI 탑재율을 조절함으로써 조영 특성과 함께 세포 독성 등을 조절할 수 있으며, 이로써 테라노스틱제로서 개발할 수 있을 것으로 기대된다.

도 1 은 폴리(2-히드록시에틸 아스파트아미드) mPEG-C₁₆ (PHEA-mPEG-C₁₆) 공중합체의 합성 도식 (A) 및 ¹H-핵 자기 공명(NMR) 스펙트럼 (B) 을 나타낸 것이다.
도 2 는 투과 전자 현미경 (TEM) 에서의 산화철 나노입자 (IONPs) 의 morphology (A) 및 동적 빛 산란 (DLS) 분석에서의 PHEA-mPEG-C₁₆ 이 코팅된 IONP (P-IONP) 의 수역학적 직경 (B) 를 나타낸 것이다.
도 3 은 37 ℃ 의 온도에서, 5 일동안, PBS 용액(pH 7.4) 하에서 에피루비신-탑재 PHEA-mPEG-C₁₆-코팅된 IONP (EPI-P-IONP) 의 콜로이드 안정성을 나타낸 것이다.
도 4 는 PBS 용액(pH 7.4) 하에서 37 ℃ 의 온도에서의 EPI-P-IONP 로부터 방출된 EPI 를 나타낸 것이다.
도 5 는 P-IONP, Resovist^® 및 EPI-P-IONP 의 T₂-echo-spin weighted 자기 공명으로부터 얻은 팬텀 이미지 (A), 및 철 (Fe) 농도에 따른 relaxivity rate (R₂=1/T₂) (B) 를 나타낸 것이다.
도 6 는 다양한 농도의 P-IONP 또는 EPI-P-IONP 의 존재 하에서 Hela 세포의 세포 생존을 나타낸 것이다.
도 7 은 유세포 분석기로 분석된 EPI-P-IONP 의 세포 흡수를 나타낸 것이다; control (A), 유리 EPI (B) 및 EPI-P-IONP (C).
도 8 은 유리 EPI (A) 및 EPI-P-IONP (B), 및 4,6-디아미노-2-페닐인돌 디히드로클로라이드 (DAPI)- 및 EPI-P-IONP-처리 세포 (B) 의 이미지의 화살표와 대응되는 형광성 강도 프로파일 (C) 로 인큐베이트된 HeLa 세포의 공초점형 레이저 스캐닝 현미경 이미지를 나타낸 것이다.
도 9 는 EPI 의 탑재율이 0, 3, 6 및 9% 인 EPI-P-IONP 의 Fe 농도에 따른 relaxation rate (1/T₂) 를 나타낸다.
도 10 은 EPI 의 탑재율과 T₂ 이완율 (r₂) 의 관계를 나타낸다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 일 측면은, 알킬화제인 항암제, 양친매성 폴리(아스파트산) 그래프트 공중합체 및 산화철 나노 입자를 포함하는 항암조영제의 항암제 탑재율을 조절하여 항암 조영제의 T₂ 이완율을 조절하거나 암 진단 효율 향상시키는 방법을 제공한다.

상기 항암조영제는 산화철 나노 입자에 상기 공중합체가 코팅되고, 알킬화제인 항암제가 탑재된 것일 수 있으며, 양친매성 폴리(아스파트산) 그래프트 공중합체는 폴리숙신이미드의 개환 반응을 통해 합성되는 것일 수 있다.

또한, 상기 공중합체 는 중량평균분자량이 1,000 ~ 100,000 범위인 폴리숙신이미드,

중량평균분자량이 100 ~ 20,000 범위인 폴리에틸렌글리콜, 폴리비닐피롤리돈, 덱스트란, 폴리에틸렌옥사이드, 폴리라이신 또는 폴리비닐알콜로부터 유래된 친수성기 및

탄소수 10 이상의 장쇄 알킬 아민 또는 인지질로부터 유래된 소수성기로부터 합성된 것일 수 있다.

한편, 이 중에서 상기 공중합체는 중량평균분자량이 1,000 ~ 100,000 범위인 폴리숙신이미드,

중량평균분자량이 100 ~ 20,000 범위인 폴리에틸렌글리콜로부터 유래된 친수성기 및

탄소수 10 이상의 장쇄 알킬 아민으로부터 유래된 소수성기로부터 합성된 것이 더욱 바람직하며,

보다 구체적으로는, 상기 공중합체 가 폴리(2-히드록시에틸아스파트아미드)-mPEG-C₁₆ (poly(2-hydroxyethylaspartamide)-mPEG-C₁₆) 인 것이 더욱 바람직하다.

또한, 상기 항암제는 에피루비신인 것이 바람직하며, 에피루비신의 탑재율은 2% 이상, 바람직하게는 4% 이상, 가장 바람직하게는 8% 이상이다.

아울러, 에피루비신의 탑재율이 2% 미만인 경우에는, 기존의 Resovist^® 및 P-IONP 의 r₂ 값(각각 221.2 s^{- 1}mM^-1 및 165.5 s^{- 1}mM^{- 1})과의 차이가 크지 않으므로(도 10), 탑재율이 2% 이상인 것이 바람직하고, 보다 구체적으로는, 4% 이상인 것이 더욱 바람직하며, 8% 이상인 것이 가장 바람직하다.

본 발명에서 합성된, 탑재율이 9.1% 및 봉입율이 81% 인 EPI-P-IONP 는 605.5 s^{- 1}mM^{- 1} 의 r₂ 값을 가지며, 이는 기존의 Resovist^® 및 P-IONP 의 r₂ 값보다 약 2.7 배 및 3.7 배 더 높은 대조 증강 효과에 해당한다.

EPI-P-IONP 의 매우 높은 r₂ 이완율은 진단 용도로 매우 흥미로우며, 암 테라노스틱스(theranostics) 분야에서 MRI 조영제의 이완율 향상은 중요하다. 이러한 이완율에 영향을 미치는 요소는 (U)SPIONP 의 성질과 크기, 여러 개의 SPIONP 에 의해 형성되는 클러스터, 비자성 (non-magnetic) 쉘, 소수성 멤브레인 및 수분 투과성 등으로 알려져 있으며, 본 발명의 EPI-P-IONP 의 매우 높은 r₂ 이완율은 나노입자에 단백질을 코팅함으로써, 물 확산 상관 시간 (water diffusion correlation time, τD) 가 증가했기 때문인 것으로 생각되며, P-IONP 의 중합체 매트릭스 상에 탑재된 저분자 약물 EPI 가 빠른 물의 확산을 제한할 수 있어, 명백한 r₂ 의 증가로 이어진다.

한편, 또한, 본 발명에 따른 항암조영제는, 산화철 나노 입자(IONP) 코어 직경이 6~9 nm 이고, 수역학적(hydrodynamic) 직경이 50 nm 미만인 산화철 나노 입자(IONP) 를 포함하는 것이 바람직하다.

이하, 본 발명에 대하여 실시예에 의거하여 더욱 자세하게 설명하겠는바 본 발명이 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 제조 예 >

1. 재료의 준비

Polysuccinimide (PSI, 분자량 3,077 g/mol, Baypure®)는 Lanxess (Leverkusen, Germany)에서 구입했다. 메톡시 폴리(에틸렌 글리콜) 아민 (methoxy pol(ethylene glycol)amine, mPEG-NH2, 분자량 5,000 g/mol)은 Sunbio Inc. (Anyang, South Korea)로부터 구입했다. 헥사데실아민 (hexadecylamine, C₁₆), 에탄올아민 (ethanolamine, EA), 수산화암모늄 용액 (ammonium hydroxide solution, NH3 기준 28-30%), 염화 제1철 4수화물 (ferrous chloride tetrahydrate, FeCl2·4H2O) 및 염화 제2철 6수화물 (ferric chloride hexahydrate, FeCl3·6H2O)을 Sigma-Aldrich Corp. (St. Louis, MO, USA)에서 구입했다. N, N-디메틸 포름아미드 (N, N'-dimethylformamide, DMF)는 Junsei Chemical Co. Ltd.(Tokyo, Japan)로부터 구입했다. 항신생물제인 epirubicin hydrochloride (EPI 염산염)는 Boryung Pharmaceutical Company (Seoul, South Korea)에서 구입했다. 초고순도 등급(Extra pure grade) 에틸 에테르 (ethyl ether)는 SK Chemicals (Ulsan, South Korea)에서 구입하여 추가 정제없이 사용하였다. 다른 모든 시약은 ACS 시약 등급이었고 Sigma-Aldrich Corp. (St. Louis, MO, USA)에서 공급했다.

2. PSI-mPEG-C ₁₆ (P) 의 합성

PSI 4 g (1.30 mmol) 및 mPEG-NH2 3.5 g (0.70 mmol)을 DMF 20 mL에 용해시켰다. 산소 분자를 제거하기 위해, 2구 둥근 바닥 플라스크 내의 용액을 질소 가스 기류로 퍼징(purging)하였다. 제조된 혼합물을 70 ℃로 가열하고, 24 시간 동안 교반하고, DMF에 용해된 C₁₆ 1.71 g (7.08mmol)을 반응 용액에 점적했다. 반응 24 시간 후, 2.04 mL (34.0 mmol) 의 EA를 반응 용액에 점적하고 실온 (room temperature, RT)하에 24 시간 동안 교반하였다. 반응 생성물인 폴리 (2-하이드록시에틸 아스파트아미드)-mPEG-C₁₆ (poly(2-hydroxyethylaspartamide)-mPEG-C₁₆, PHEA-mPEG-C₁₆)을 에틸 에테르에 침전시키고 에틸 에테르로 여과시켰다. 여과된 PHEA-mPEG-C₁₆을 에틸 에테르로 세척하고 진공 건조시켰다.

3. PHEA -mPEG-C ₁₆ 코팅된 IONP (P- IONP )

합성된 고분자 P 를 P-IONP 의 합성에 사용하였다. P-IONP 는 전반적으로 열분해법보다 일반적인 방법으로 알려진 공침법을 이용하여 합성되었고, 고분자 P 는 형성된 IONP, 즉 Fe₃O₄ 나노입자의 표면에 코팅된 것으로 간주되었다. 보다 구체적인 방법은 하기와 같다:

PHEA-mPEG-C₁₆ 166 mg (0.14 mmol), FeCl₂·4H₂O 79.4 mg (0.40 mmol) 및 FeCl₃·6H₂O 151.4 mg (0.56 mmol)을 80 mL의 탈이온수에 용해시키고, 산소 분자를 제거하기 위해 3구 둥근 바닥 플라스크 내의 용액을 질소 가스 기류로 퍼징(purging)하였다. 제조된 혼합물의 온도를 격렬히 기계적으로 교반하면서 80 ℃로 1 시간 동안 상승시키고, 수산화 암모늄 용액 3 mL를 반응 용액에 점적하였다. 반응하는 동안, 초기의 오렌지색 용액은 점차 갈색을 띠는 검은 색 콜로이드 용액으로 변했다. 콜로이드 용액을 RT로 냉각시키고 연동 펌프 (peristaltic pump)를 사용하여 중공사 필터 막 (차단 분자량 (molecular weight cut off, MWCO), 50 KDa; KrosFlo®, Spectrum Lab. Inc., CA, USA)으로 투석했다. 반응 생성물인 PHEA-mPEG-C₁₆ 코팅된 IONP (P-IONP)는 동결건조기 (Bondiro®, Ilsin Lab Co., Ltd., Daejeon, South Korea)를 사용하여 동결건조시켰다.

도 2 의 (A) 및 (B) 는 각각 탈이온된 증류수에서 제조된 샘플의 P-IONP 의 TEM 영상 및 동적 광산란 (DLS) 데이터를 각각 나타낸다. TEM 영상은 산화철 코어가 구형이고 코어의 평균 직경이 6 내지 9 nm 임을 나타냈다. 또한, 수용액에서의 P-IONP 의 DLS 데이터는 동결건조된 형태로부터 재형성된 콜로이드성 나노입자의 수역학적 평균 직경이 41 nm 이고, 직경의 분포가 좁다는 것을 보여주었다.

제조된 P-IONP 의 표면 전하 및 Fe 함량을 조사하기 위해 P-IONP 의 제타 전위 및 철 (Fe) 원소 비율을 측정하였다. 표 1 에 나타낸 바와 같이, 삼회 측정으로부터 얻은 P-IONP 의 평균 제타 전위는 -7.84±5.2 mV 였으며 이는 PEG 분자가 수용액에서 부분적인 전기음성 분극능 (partial electronegative polarizability) 을 가지므로 고분자 P 의 그래프트된 PEG 분자에 기인한 것일 수 있다. 이중 유도 결합 플라스마-원자 방출 분광계 (duo inductively coupled plasma-atomic emission spectrometer, ICP-AES) 를 사용하여 측정한 P-IONP 내의 Fe 원자의 중량 백분율은 2.31% 였다.

특성	평균 수역학적 직경(nm)	제타 포텐셜(Zeta potential) (mV)	Fe (wt%)
P-IONP	41.0	-7.8±5.2	11.8

4. PHEA -mPEG-C ₁₆ 및 P- IONP 특성

PHEA-mPEG-C₁₆ 고분자의 분자 구조는 1H-NMR (500 MHz, Bruker, Billerica, MA, USA)을 사용하여 분석하였고, 용매는 디메틸 설폭사이드-d₆ (dimethyl sulfoxide-d₆, DMSO-d₆)을 사용했다. 투과 전자 현미경 (transmission electron microscopy, TEM; JEM-2010, JEOL, Tokyo, Japan)을 사용하여 P-IONP의 평균 입자 크기 및 형태를 조사하였다. 샘플을 탈이온된 증류수에 분산시키고, 탄소 코팅된 구리 그리드위에 드롭-캐스팅하고 (drop-casted), 그리드를 현미경으로 보기 전에 실온에서 공기 건조시켰다. 동적 광산란 및 제타 전위 분석기 (ELS-Z-1000, Otuska Electronics Co., Ltd., Osaka, Japan)를 사용하여 콜로이드 용액 내의 P-IONP의 수역학적 (hydrodynamic) 직경 분포 및 제타 전위를 측정하였다. P-IONP의 철 (Fe) 양은 듀오 유도 결합 플라스마-원자 방출 분광기 (duo inductively coupled plasma-atomic emission spectrometer, ICP-AES; iCAP 7400, ThermoScientific, Waltham, MA, USA)를 사용하여 측정하였다.

자기 공명 영상 조영제뿐만 아니라 항싱생물제의 전달 운반체로서도 유용한 생체적합성 고분자 코팅 IONP (P-IONP) 를 제조하기 위해 도 1 의 (a) 에 합성 도식에 나타낸 바와 같이 3,077 g/mol 의 분자량을 갖는 PSI 를 mPEG-아민, C₁₆-아민, 및 에탄올 아민(ethanolamine, EA) 으로 순차적으로 아미노분해반응 (즉, 숙신이미드 개환 반응)시켜 PHEA-mPEG-C₁₆ (P) 를 합성하였다. 합성된 고분자 P 의 1H-NMR 스펙트럼을 도 1 의 (B) 에 나타내었다.

5. EPI 탑재된 P- IONP 의 제조

P-IONP의 콜로이드 용액은 P-IONP 300 mg을 DMSO 9 mL에 분산시켜 제조하였고, 약물 용액은 EPI 염산염 45 mg을 DMSO 3 mL에 녹여 제조한 후 트리에틸아민 400 μL를 약물 용액에 첨가하여 제조하였다. P-IONP 콜로이드 용액을 약물 용액에 점적한 후, 그 반응물들을 10 ℃ 에서 15 분간 초음파 처리 (Sonic Dismembrator, Model 500, Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA)하에 40 mL의 탈이온수에 점적하였다. 반응하지 않은 과량의 EPI를 제거하기 위해 반응 생성물의 혼합물을 투석 (Disposable dialyzers, MWCO, 8 KDa; Sigma-Aldrich Corp. St. Louis, MO, USA)하고, 투석된 생성물을 48 시간 동안 동결건조시켰다. 그 후, 제조된 EPI-P-IONP의 평균 수역학적 직경을 상기한 ELS-Z-1000을 사용하여 측정하였다.

( EPI 탑재율 및 EPI 봉입율 )

EPI 탑재율 및 EPI 봉입율은 각각 다음과 같이 정의되었다.

EPI 탑재율 (%, w/w)

= (EPI-P-IONP 내의 EPI의 질량 / EPI-P-IONP의 질량) × 100 ----- 식 (1)

EPI 봉입율 (%, w/w)

= (EPI-P-IONP 내의 EPI의 질량 / 공급된 EPI의 질량) × 100 ----- 식 (2)

항신생물제 EPI 탑재 P-IONP (EPI-P-IONP)의 물리적 특성은 EPI-P-IONP 의 평균 수역학적 직경과 EPI 탑재율 및 봉입율을 측정함으로써 조사되었다. 결과는 표 2 에 정리되어 있다.

특성	평균 수역학적 직경(nm)	Fe (wt%)	약물 탑재율(%)	약불 봉입율(%)
EPI-P-IONP	53.0±4.2	2.10	9.1±1.4	81.0±1.5

6. EPI -P- IONP 의 시험관 내 (in vitro) 안정성 평가

EPI-P-IONP의 평균 수역학적 직경은 상기 ELS-Z-1000을 사용하여 pH 7.4에서 EPI-P-IONP의 10.0 μg/mL 콜로이드 용액의 광산란 측정을 통해 결정하였다. EPI-P-IONP 의 시간에 대한 시험관 내 약물 안정성은 PBS (pH 7.4) 용액 중 EPI-P-IONP 농도가 10.0 μg/mL인 시료의 안정성을 측정하였고, 수역학적 직경의 변화를 37 ℃에서 5일 동안 평가했다.

도 3 은 EPI-P-IONP 가 최소 연속 5일 동안 37 ℃ 의 생리적 온도에서 직경의 현저한 변화없이 생리적 조건에서 안정하다는 것을 보여준다.

7. EPI-P-IONP 로부터 시험관 내 (in vitro) EPI 방출 평가

EPI-P-IONP로부터의 EPI의 시험관 내 방출은 약물 방출 시험 매질로서 PBS (pH 7.4) 용액을 사용하여 조사하였다. 18.8 μg/mL의 EPI 농도를 갖는 3 mL의 EPI-P-IONP 콜로이드 용액을 셀룰로오스 투석 튜브 (cellulose dialysiss tube, VISKASE®, MWCO12 KDa ~ 14 KDa; Viskase Corporation, Chicago, IL, USA)에 밀봉한 후, 그 튜브를 37 ℃의 등온조 (isothermal bath)에서 12 시간 동안 1.0 L의 PBS 용액에 100 rpm의 속도로 연속 교반하면서 인큐베이션시켰다. 미리 결정된 시점에서, 일정액을 추출하고 EPI 농도를 형광 분광계 (fluorescence spectrometer, Model F-4500, Hitachi, Ltd., Tokyo, Japan)를 사용하여 측정하였다.

도 4 에 나타낸 바와 같이, EPI-P-IONP 로부터 시험관 내 EPI 방출은 12 시간까지 약 31±7.5 % 의 EPI 가 방출되면서 지속 방출 패턴을 나타내었다.

< 실시예 >

1. 시험관 내 (in vitro) MR 영상 연구

MR 팬텀 (phantom) 영상 실험은 4.7 테슬라 (Tesla, T) MRI 시스템 (Bruker BioSpec 47/40, Ettlingen, Germany)을 사용하여 수행되었다. MR 이미지와 T₂ 값을 얻기 위한 파라미터들은 다음과 같다: 에코 시간 (echo times, TE) = 30.0 ms (4 에코), 반복 시간 (repetition times, TR) = 10000 ms, 시야 (field of view, FOV) = 55 mm × 30 mm, 획득 매트릭스 (acquisition matrix) = 128 × 128, 슬라이스 두께 (slice thickness) = 2mm.

T₂-weighted MRI 를 이용하여 0.01 ~ 0.156 mM 의 범위에서 다양한 Fe 농도를 갖는 P-IONP 와 EPI-P-IONP 를 조사하였으며, 상업용 MRI 조영제인 Resovist^® 를 같은 농도에서 대조군으로 사용하였다.

도 5 의 (A) 에 나타낸 바와 같이, 모든 시료에서, T₂ 강조 MR 영상의 이완 시간은 철 농도의 증가에 따라 감소하여 음성 (즉, 저강도, hypointense) 조영 증강을 나타낸다.

이완율 r₂ 는 인접한 물의 양성자의 완화율을 향상시키는 효율로 정의되며, s^-1mM^-1 로 표시된다. R₂ 완화율 (1/T₂) 을 측정하여 도 5 의 (b) 와 같이 철 농도의 함수로 나타내었다. 각 조영제의 r₂ 값은 철 농도의 함수로서 R₂ 값의 선형 피팅(fitting) 의 기울기에 의해 주어졌다. 본 연구에서 합성된 P-IONP 는 165.5 s^-1mM^-1 의 r₂ 가 얻어졌고, Resovist^® 는 221.2 s^-1mM^-1 가 얻어졌다.

한편, 본 연구에서 합성된 EPI-P-IONP 는 605.5 s^{- 1}mM^{- 1} 의 r₂ 를 나타내었으며, 이는 시험한 자기장 강도에서 Resovist^® 및 P-IONP 보다 각각 약 2.7 배 및 3.7 배 더 높은 대조 증강 효과에 해당하였다.

2. 시험관 내 (in vitro) 세포독성

P-IONP 및 EPI-P-IONP의 세포독성을 측정하기 위해, MTS [3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-5-(3-카르복시메톡시페닐)-2-(4-설포페닐)-2H-테트라; 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolim] 분석을 수행하였다. HeLa 세포 (ATCC, CCL-2TM)는 10% 태아 우 혈청 (fetal bovine serum, FBS) 및 1% 항생제가 첨가된 Dulbecco's modified Eagle 배지 (DMEM, Gibco BRL, Grand Island, NY, USA)에서 105 세포/well로 5% CO₂ 의 가습된 분위기에서 37 ℃에서 24 well 플레이트에 배양하였다. 24 시간 후, P-IONP 또는 EPI-P-IONP의 연속 배수 희석액을 배양된 세포에 가하는 것을 3회 반복하여 P-IONP의 최종 농도를 50.0 내지 250 ㎍/mL 범위로 하고 4 시간 동안 배양하였다. 세포 생존 (viability)은 MTS 분석법을 사용하여 결정하였다.

도 6 은 HeLa 세포에 대한 P-IONP 및 EPI-P-IONP 의 세포독성을 MTS 분석법을 이용하여 측정한 결과이며, 세포 생존력은 상기 처리 조건 하에서 배양한 후 살아있는 세포 수의 비처리(untreated) 대조군 세포 수에 대한 비율로서 나타내었다.

EPI-P-IONP 의 농도가 EPI 의 농도로 4.5 에서 22.5 ㎍/ml 범위에 해당하는 50 에서 250 ㎍/ml 로 점차 증가함에 따라 EPI-P-IONP 의 세포독성능 (cytotoxic potency) 도 증가하였다.

EPI-P-IONP 의 IC50 (half maximal inhibitory concentration) 는 산화철 농도로서 90.0 ㎍/ml 이었으며, EPI-P-IONP 의 EPI 탑재율 9.1% (표 2 에 나타낸 데이터) 과 EPI-P-IONP 의 PBS 용액 (도 4 에 나타낸 데이터) 에서의 4 시간 배양 후 9.0 % 의 EPI 방출을 고려할 때, 방출된 EPI 농도는 0.74 ㎍/ml 이었다. 방출된 EPI 의 몰 농도에 기반하여, HeLa 세포주에 대한 EPI-P-IONP 의 IC50 값은 4 시간 처리 후 1.36 ㎍/mM 이었다.

3. EPI-P-IONP 의 세포 내 흡수

EPI-P-IONP의 세포 내 흡수는 유세포 측정법 (flow cytometry)을 사용하여 평가하였다.

HeLa 세포를 well 당 105 세포로 24 well 조직 배양 플레이트 (24 well tissue culture plate)로 옮기고 37 ℃에서 24 시간 동안 배양하였다. 배양 배지를 4.5 μg/mL의 유리(free) EPI 또는 50.0 μg/mL의 EPI-P-IONP (즉, 4.5 μg/mL의 EPI, EPI-P-IONP의 평균 EPI 탑재율은 9.1 %)로 교체하고, 세포를 DMEM 배지에서 4 시간 동안 배양하였다. 그 후 배양 배지를 제거하고 각각의 well을 PBS (pH 7.4) 용액으로 세척하였다. 파라포름알데히드(paraformaldehyde, PFA, 5 %, v/v) 300 μL를 각 well에 첨가하여 세포를 고정시켰다. 유세포 계측기 (flow cytometer, FACScanTM System, BD Biosciencs, San Jose, CA, USA) 를 사용하여 시료의 세포 흡수를 분석하였다. 세포-관련 EPI (cell-associated EPI)는 474 nm 파장을 갖는 아르곤 (argon, Ar) 레이저 광으로 여기되고, 551 nm의 파장에서 방출된 형광이 검출되었다.

그 결과를 도 7 에 나타내었으며, 유리 (free) EPI 와 EPI-P-USPIONP 의 세포 트랜스펙션 효율은 각각 86.4% 와 83.2% 였다. 이러한 결과로부터, EPI-P-IONP 의 세포 트랜스펙션 효율은 유리 EPI 의 세포 트랜스펙션 효율만큼 높다는 것을 알 수 있다.

4. EPI -P- IONP 의 세포 내 흡수에 대한 공초점 현미경 (confocal microscopy) 분석

EPI 또는 EPI-P-IONP의 세포 내 흡수는 공초점 형광 현미경을 사용하여 각각 474 nm 및 557 nm의 여기 파장 및 방출 파장에서 관찰되었다. HeLa 세포는 10% FBS와 1% 페니실린이 함유된 500 μL DMEM에 well 당 3 x 104 세포의 밀도로 4-웰 챔버 슬라이드 (4-well chamber slide, Nunc® Lab-Tek®, Roskide, Denmark)에 37 ℃ 에서 24 시간 동안 배양하여 부착시켰다. 배양 배지를 4.5 μg/mL의 fee EPI 또는 50.0 ㎍/mL의 EPI-P-IONP로 대체하고 세포를 DMEM 배지에서 1 시간 동안 배양하였다. 세포를 PBS (pH 7.4) 용액으로 3 회 세척하였다. 그 후 세포를 실온에서 8 분 동안 4% PFA로 고정시키고 PBS (pH 7.4) 용액에 녹인 0.1 % Triton X-100으로 10 분 동안 투과도를 높였다. 세척 후, 세포를 DAPI (4,6-디아미노-2-페닐인돌 디하이드로클로라이드, 4,6-diamino-2-phenylindole dihydrochloride)로 10 분 동안 처리하여 세포의 핵을 염색하였다. 커버 슬립을 유리 슬라이드 위에 장착하고 공초점 레이저 주사 현미경 (confocal laser scanning microscope, Model LSM 510, Carl Zeiss, Jena, Germany)으로 세포를 관찰하였다.

도 8 의 (A) 및 (B) 는 각각 유리 EPI 및 EPI-P-IONP 의 TPHVSO 분포를 각각 나타내며, 유리 EPI 또는 P-IONP-결합 EPI 에 관계없이, 모델 항종양 약물인 EPI 및 형광 염료인 DAPI 로부터 방출된 형관은 세포를 1시간 동안만 배양했음에도 불구하고 세포핵에서 주로 관찰되었다. 그 HeLa 세포에서 적색 및 청색 형광은 각각 EPI 및 DAPI 로부터 유래되었으며 현미경 영상에서 관찰되었다. EPI-P-IONP 또는 유리 EPI- 로 트랜스펙션된 세포의 형광이 주로 세포질보다는 세포핵에서 관찰되었고, 이는 EPI-P-IONP 가 세포질로 트랜스펙션된 후 EPI-P-IONP 로부터 방출된 EPI 가 세포핵으로 흡수되었다는 것을 나타낸다.

5. EPI-P-IONP 의 이완율 변화 평가

상기 '1. 시험관 내 (in vitro) MR 영상 연구' 에서와 동일한 T₂-weighted MRI 를 이용하여 EPI 의 탑재율을 달리하여(0%, 3%, 6%, 9%), 0.01 ~ 0.156 mM 의 범위에서 다양한 Fe 농도를 갖는 EPI-P-IONP 를 조사하였다.

이에 따라, R₂ 완화율 (1/T₂) 을 측정하여 도 9 와 같이 철 농도의 함수로 나타내었다. 각 조영제의 r₂ 값은 철 농도의 함수로서 R₂ 값의 선형 피팅(fitting) 의 기울기에 의해 주어졌다. 본 연구의 방법에 따라 합성된 EPI-P-IONP 탑재율 0%, 3%, 6%, 9% 의 이완율 r₂ 값은 165.5 s^{- 1}mM^-1, 341.6 s^{- 1}mM^-1, 509.6 s^{- 1}mM^-1, 672.7 s^{- 1}mM^{- 1} 가 얻어졌다. 이를 도 10 에서와 같이 그래프로 나타내었다.

Claims (12)

1. 알킬화제인 항암제, 양친매성 폴리(아스파트산) 그래프트 공중합체 및 산화철 나노 입자를 포함하는 항암조영제의 항암제 탑재율을 조절하여 항암조영제의 T₂ 이완율을 조절하는 방법이되,
   상기 공중합체는, 중량평균분자량이 1,000 ~ 100,000 범위인 폴리숙신이미드; 중량평균분자량이 100 ~ 20,000 범위인 폴리에틸렌글리콜로부터 유래된 친수성기; 및 탄소수 10 이상의 장쇄 알킬 아민으로부터 유래된 소수성기;로부터 합성된 공중합체임을 특징으로 하는, 항암조영제의 항암제 탑재율을 조절하여 항암조영제의 T₂ 이완율을 조절하는 방법.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 항암조영제는 산화철 나노 입자에 상기 공중합체가 코팅되고, 알킬화제 항암제가 탑재된 것을 특징으로 하는 방법.
   
3. 제1항에 있어서,
   상기 양친매성 폴리(아스파트산) 그래프트 공중합체가 폴리숙신이미드의 개환 반응을 통해 합성되는 것인 방법.
   
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6. 제1항에 있어서,
   상기 공중합체가 폴리(2-히드록시에틸아스파트아미드)-mPEG-C₁₆ (poly(2-hydroxyethylaspartamide)-mPEG-C₁₆) 인 방법.
   
7. 제1항에 있어서,
   상기 항암제가 에피루비신인 방법.
   
8. 제7항에 있어서,
   상기 에피루비신의 탑재율이 2% 이상인 방법.
   
9. 제7항에 있어서,
   상기 에피루비신의 탑재율이 4% 이상인 방법.
   
10. 제7항에 있어서,
    상기 에피루비신의 탑재율이 8% 이상인 방법.
    
11. 제1항에 있어서,
    산화철 나노 입자(IONP) 코어 직경이 6~9 nm 이고, 수역학적(hydrodynamic) 직경이 50 nm 미만인 방법.
    
12. 삭제

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