KR101947647B1 - 전기습윤 디지털 유체칩과 디올 기능기가 코팅된 자성 비드를 이용한 신경가스 모의제 분석방법 - Google Patents

전기습윤 디지털 유체칩과 디올 기능기가 코팅된 자성 비드를 이용한 신경가스 모의제 분석방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 전기습윤원리를 이용한 디지털 유체칩을 활용하여 신경가스 모의제를 분석하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 신경가스 모의제가 용해된 시료 용액, 자성 비드(magnetic bead)를 포함하는 자성 비드 용액, 시료 용액에 사용된 용매 및 용리 용매 각각을 상기 디지털 유체칩에 구비된 서로 다른 저장 전극 표면에 로딩하는 단계, 상기 자성 비드 용액의 액체 방울을 상기 디지털 유체칩에 구비된 복수의 경로 전극 중 특정 경로 전극으로 이동시키고, 상기 특정 경로 전극에 위치하는 액체 방울에 포함된 용매를 상기 시료 용액에 사용된 용매로 바꾸는 단계, 상기 신경가스 모의제가 상기 자성 비드 표면에 흡착되도록, 상기 디지털 유체칩에 로딩된 상기 시료 용액의 액체 방울과 상기 특정 경로 전극에 위치하는 액체 방울을 혼합시키는 단계 및 상기 자성 비드 표면에 흡착된 신경가스 모의제를 상기 용리 용매에 용해시킨 후, 상기 신경가스 모의제가 용해된 상기 용리 용매를 상기 디지털 유체칩에 구비된 농축 전극으로 이동시키는 단계를 포함하는 디지털 유체칩을 이용한 신경가스 모의제의 분석 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 신경가스 모의제 디지털 유체칩을 이용한 분석법은 신경가스 모의제를 디지털 유체칩 위에서 자석을 이용하여 자성 비드를 이용한 고체상 추출법(solid-phase extraction, SPE)을 통해 극미량 분석할 수 있는 장점이 있다.

Description

전기습윤 디지털 유체칩과 디올 기능기가 코팅된 자성 비드를 이용한 신경가스 모의제 분석방법{METHOD FOR ANALYSIS OF NERVE GAS SIMULANTS USING ELECTROWETTING DIGITAL MICROFLUIDICS CHIP AND DIOL-FUNCTIONALIZED MAGNETIC BEADS}
본 발명은 전기습윤원리를 이용한 디지털 유체칩을 활용하여 신경가스 모의제를 분석하는 방법에 관한 것이다.
1990년대 말 친수성(hydrophilic) 액체방울이 소수성(hydrophobic) 표면위에서 표면장력에 의해 동그란 액적모양을 가지며, 소수성 표면 밑에 절연층(insulating layer)을 깔고, 그 밑에 전극을 설치하고 적절한 전압을 걸어줄 때, 동그란 모양의 액체방울이 평편한 액적모양으로 변화한다는 사실이 발견되었다.
이 현상은 전기습윤(electrowetting-on-dielectrics, EWOD) 원리라고 불린다. 이를 이용하여, 두 개의 연속된 EWOD 전극에 서로 비대칭적으로 전압을 걸어주면, 즉 하나의 전극에는 전압을 걸어주지 않고, 또 다른 전극에 전압을 걸어줄 때, 액체방울이 소수성 표면 위에서 전압이 걸린 전극 위로 이동하는 현상을 구현할 수 있었다.
이때, 소수성 표면 위의 작은 액체방울은 작게는 1㎕ 이하로 조절될 수도 있다. 이러한 원리를 이용하여, 다양한 전극 배열을 만들고, 전극 배열위에 매우 얇은 절연층 및 소수성 층을 깔은 후에 전극 배열에 원하는 순서의 전압들을 펄스형태로 가함으로써 액적들의 움직임을 자유롭게 조절할 수 있다.
위에서 언급된 전극 배열 형태를 칩형태로 제작할 수 있다. 또한, 소수성 물질로 얇게 코팅된 ITO(indium tin oxide) 전극 슬라이드를 하나 제작하여, 위에서 언급된 전극 배열을 하층-플레이트로 하고 ITO 전극 슬라이드를 상층-플레이트로 하여 전기습윤 칩(EWOD chip)을 구성할 수 있다.
또한, 전기습윤 칩 위에서 액체 방울이 비연속적으로 움직이므로, 이러한 칩들을 통칭적으로 디지털 유체칩(Digital Microfluidics Chip, DMF chip)이라고 부른다. 디지털 유체칩 위에서 적절한 전압을 여러 전극에 동시에 가함으로써, 큰 액체 방울이 작은 방울로 잘라 질 수도 있고, 두 개 이상의 방울이 하나의 방울로 합쳐질 수도 있는 등 다양한 액체 방울 컨트롤이 가능하다. 또한, 액체 방울을 단독으로 컨트롤 할 수 있지만, 상대적으로 부피 대비 표면적이 큰 작은 액체 방울이 쉽게 증발되는 것을 방지하고, 소수성 표면 위에서의 액체 방울의 움직임을 좀 더 원활하게 조정하고자 실리콘 오일을 추가함으로서, 더 큰 실리콘 오일 방울내에서 액체 방울을 가두어 움직임을 제어할 수도 있다.
디지털 유체칩은 다양한 액체 방울 컨트롤 능력을 활용하여, 액체 방울을 이용한 다양한 화학, 생화학물질의 연구에 활용되고 있다. 그 예로써, 화학물 합성반응, DNA PCR(Polymerase Chain Reaction), 효소 생화학반응(예를 들어, luciferin- luciferase enzyme 반응), 효소반응을 이용한 글루코스 레벨 진단, Jackson- Meisenheimer 색깔반응을 이용한 TNT (2,4,6-trinitrotoluene) 검출, 효소 운동속도 연구 (예를 들어, alkaline phosphates (AP) kinetics and activity), 단백질 소화 반응 및 MALDI-TOF 질량분석기를 이용한 단백질 분석 등을 들 수 있다. 특히, 매우 작은 액체 방울의 부피로 인해 매우 적은 시료를 높은 감도를 갖도록 분석할 수 있음이 여러 실험들을 통해 입증되었다.
디지털 유체칩을 이용한 시료 전처리에 관한 연구결과도 최근에 발표되고 있다. 시료 전처리 중 샘플의 칩 위에서의 분리 및 농축 과정이 매우 중요하다. 이런 목적하에 다양한 기능기가 부착된 하이드로젤(Hydrogel)을 칩 위에 올려놓고, 원하는 시료만을 선택적으로 분리, 분석하는 연구들이 발표되고 있다. 또 다른 한편으로는 하이드로젤에 Trypsin과 같은 기능성 효소를 부착시켜 다양한 분석을 위한 생화학반응을 진행하는 연구들도 보고되고 있다. 분리 및 농축을 위한 방법으로써 자성 나노입자(magnetic nano-particles) 및 자성 비드(magnetic beads)를 이용한 방법들도 활발히 분석분야에 이용되고 있으며, 최근 들어 이러한 자성 비드들을 이용하여 디지털 유체칩에서 특정 분자를 분리, 농축시키는 연구결과들이 보고되고 있다. 자성 비드 표면위에 특정 분자들과 선택적으로 반응할 수 있는 단백질, Aptamer, 항체, 기능기(functional group) 등을 부착시킬 경우, 원하는 분자들은 매우 선택적으로 분리, 농축시킬 수 있는 장점이 있다.
신경가스는 대량 살상무기로써 그 위력이 1차 세계대전에서 확인되었고, 그동안 그 사용이 간헐적으로 보고된 바 있다. 이런 위험한 신경가스의 사용을 막고자 세계적으로 다양한 외교노력들이 진행되고 있어, 1925년 제네바 의정서 (Geneva Protocol), 1997년 화학무기금지협약 (Convention on the Prohibition of the Development, Production, and Stockpiling of Bacteriological(Biological) and Toxin Weapons and on their Destruction (BWC))이 발효되었다. 화학무기금지협약은 현재 화학무기금지기구 (Organization for the Prohibition of Chemical Weapons: OPCW)를 통해 집행되고 있으며, 우리나라 또한 이 협약에 서명을 하였다. 하지만, 이런 국제적인 노력에도 불구하고, 신경가스 등의 화학무기는 제조의 용이성 등의 이유로 테러집단에 의해 이용될 가능성이 크다. 예를 들어, 일본에서는 유사종교 집단이 사린이라는 화학무기를 도쿄 지하철에서 살포함으로써 많은 사상자를 낳기도 하였다.
화학무기를 금지시키려는 외교적 노력 외에도 신경가스와 같은 화학무기를 소량으로, 정밀하게, 정확하게 분석하고자 하는 방법을 개발하고자 하는 과학적인 노력들이 활발히 경주되어 왔다. 본 발명에서는 이러한 노력의 일환으로 다섯종의 신경가스 모의제에 대해 극미량 분석이 가능한 방법을 디지털 유체칩과 연동된 질량분석법을 통해 제시하고자 한다. 본 발명에서 분석하고자 하는 다섯종의 신경가스 모의제는 dimethyl methyl phosphonate (DMMP), di(propylene glycol) methyl phosphonate (DPGME), methyl salicylate (MeSA), triethyl phosphate (TEP), diethyl phosphate (DEP) 이다.
상기 신경가스 모의제의 구조는 도 1에 도시되어 있다. 신경가스가 공기 중에 살포되어 일부가 부근의 연못, 물웅덩이 등해 용해되었을 때, 이곳들에서 물을 체취하게 되면 다양한 물질들이 존재하게 되어 선택적으로 신경가스를 분석하기 위해서는 신경가스 물질에 대해 분리, 농축이 필수적이다. 이런 목적하에 디지털 유체칩에서 물에 용해된 신경가스 물질들을 선택적으로 분리, 농축할 수 있는 자성 비드를 활용하여 시료전처리를 할 수 있는 방법을 제시하고자 한다.
"MALDI-TOF mass spectrometry analysis of chemical warfare nerve gas simulants",Kim, E. H.; Lee, H. J.; Choi, S. K.; Yoon, M. H.;Oh, H. B.?Bull. Kor. Chem. Soc.?2016,?37(3), 316-320. "Application of a paper EWOD (Electrowetting-on-Dielectrics) chip: Protein tryptic digestion and its MALDI-TOF mass spectrometry detection. Jang, I.A.; Ko, H.J.; You, G.R.; Lee, H.J.; Choi, S.K.; Lee, J.H.; Kwon, O.S.; Shin, K.W.; Oh, H. B.Biochip J. (2016) in press.
본 발명은 자성 비드를 이용하여 신경가스 모의제를 디지털 유체칩 위에서 분리 및 농축시킬 수 있는 방법을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 신경가스 모의제를 분리 및 농축 가능한 디지털 유체칩을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.
상술한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 디지털 유체칩을 이용한 신경가스 모의제의 분석 방법을 제공한다. 상기 분석 방법은 신경가스 모의제가 용해된 시료 용액, 시료 용액에 사용된 용매, 자성 비드(magnetic bead)를 포함하는 자성 비드 용액 및 용리 용매 각각을 상기 디지털 유체칩에 구비된 서로 다른 저장 전극 표면에 로딩하는 단계, 상기 자성 비드 용액의 액체 방울을 상기 디지털 유체칩에 구비된 복수의 경로 전극 중 특정 경로 전극으로 이동시키고, 상기 특정 경로 전극에 위치하는 액체 방울에 포함된 용매를 상기 시료 용액에 사용된 용매로 바꾸는 단계, 상기 신경가스 모의제가 상기 자성 비드 표면에 흡착되도록, 상기 디지털 유체칩에 로딩된 상기 시료 용액의 액체 방울과 상기 특정 경로 전극에 위치하는 액체 방울을 혼합시키는 단계 및 상기 자성 비드 표면에 흡착된 신경가스 모의제를 상기 용리 용매에 용해시킨 후, 상기 신경가스 모의제가 용해된 상기 용리 용매를 상기 디지털 유체칩에 구비된 농축 전극으로 이동시키는 단계를 포함하는 디지털 유체칩을 이용한 신경가스 모의제의 분석 방법을 제공한다.
일 실시 예에 있어서, 상기 특정 경로 전극에 위치하는 액체 방울에 포함된 용매를 상기 시료 용액에 사용된 용매로 바꾸는 단계는, 자석을 이용하여 상기 특정 경로 전극에 위치하는 액체 방울에 포함된 상기 자성 비드를 상기 특정 경로 전극의 표면에 고정시키는 단계, 상기 자성 비드가 상기 특정 경로 전극의 표면에 고정된 상태에서, 상기 특정 경로 전극에 위치하는 액체 방울에 포함된 용매를 상기 디지털 유체칩에 구비된 폐기물 전극으로 이동시키는 단계 및 상기 저장 전극에 로딩된, 상기 시료 용액에 사용된 용매의 액체 방울을 상기 특정 경로 전극으로 이동시키는 단계를 포함할 수 있다.
일 실시 예에 있어서, 상기 신경가스 모의제를 상기 자성 비드 표면에 흡착시키는 단계는, 상기 저장 전극에 로딩된 상기 시료 용액의 액체 방울을 상기 특정 경로 전극으로 이동시켜, 상기 시료 용액의 액체 방울과 상기 자성 비드 용액의 액체 방울을 혼합시키는 단계를 포함할 수 있다.
일 실시 예에 있어서, 상기 시료 용액의 액체 방울과 상기 자성 비드 용액의 액체 방울을 혼합시키는 단계는, 상기 자석을 상기 특정 경로 전극으로부터 이격시킨 상태에서, 상기 시료 용액의 액체 방울과 상기 자성 비드 용액의 액체 방울이 혼합된 혼합 액체 방울을 소정 시간 동안 서로 다른 경로 전극으로 이동시키는 단계를 포함할 수 있다.
일 실시 예에 있어서, 상기 자성 비드 표면에 흡착된 신경가스 모의제를 상기 용리 용매에 용해시킨 후, 상기 디지털 유체칩에 구비된 농축 전극으로 이동시키는 단계는, 상기 자석을 이용하여, 상기 혼합 액체 방울이 위치하는 경로 전극에, 상기 혼합 액체 방울에 포함된 상기 자성 비드를 고정시키는 단계, 상기 자성 비드가 고정된 상태에서, 상기 혼합 액체 방울에 포함된 용매를 상기 폐기물 전극으로 이동시키는 단계, 상기 저장 전극에 로딩된 상기 용리 용매의 액체 방울을 상기 자성 비드가 고정된 경로 전극으로 이동시켜, 상기 용리 용매에 상기 자성 비드 표면에 흡착된 신경가스 모의제를 용해 시키는 단계 및 상기 자성 비드가 고정된 상태에서, 신경가스 모의제가 용해된 상기 용리 용매를 상기 농축 전극으로 이동시키는 단계를 포함할 수 있다.
일 실시 예에 있어서, 상기 자성 비드 표면에는 Diol 기능기가 흡착될 수 있다.
일 실시 예에 있어서, 상기 신경가스 모의제는, dimethyl methyl phosphonate(DMMP), di(propylene glycol) methyl phosphonate(DPGME), methyl salicylate(MeSA), triethyl phosphate(TEP) 및 diethyl phosphate(DEP) 중 적어도 하나일 수 있다.
일 실시 예에 있어서, 상기 농축 전극으로 이동시킨 용리 용액을 MALDI-TOF 질량분석기 및 GC-MS 중 적어도 하나를 이용하여 질량분석하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 신경가스 모의제 디지털 유체칩을 이용한 분석법은 신경가스 모의제를 디지털 유체칩 위에서 자석을 이용하여 자성 비드를 이용한 고체상 추출법(solid-phase extraction, SPE)을 통해 극미량 분석할 수 있는 장점이 있다.
또한, 본 발명은 일련의 전압 펄스들을 디지털 유체칩 전극 배열(electrode array)에 가함으로써 액체를 구동하여, 신경가스 모의제 분석을 위한 시료 전처리를 사람의 직접적인 개입 없이 수행할 수 있는 장점이 있다. 신경가스 모의제가 아닌 실제 신경가스 분석시 신경가스 노출로 인해 분석자가 위험에 노출될 가능성이 있는데, 본 발명은 이러한 노출 위험을 최소화 할 수 있는 장점이 있다.
또한, 본 발명은 신경가스의 분리 및 농축을 사람의 직접적인 개입 없이 수행할 수 있기 때문에, 분석인원을 최소화 시킬 수 있다.
도 1은 신경가스 모의제들의 화학식이다.
도 2는 본 발명의 일 실시 예에 따른 디지털 유체칩을 나타내는 개념도이다.
도 3은 본 발명에 따른 디지털 유체칩에 전압을 인가하기 위한 장치들을 나타내는 개념도이다.
도 4는 본 발명에 따른 신경가스 모의제의 분석 방법을 나타내는 순서도이다.
도 5a 내지 5d는 본 발명에 따른 신경가스 모의제의 분석 방법을 나타내는 개념도이다.
도 6은 디지털 유체칩에서 분리 및 농축된 신경가스 모의제를 검출한 MALDI-TOF 스펙트럼이다.
도 7은 디지털 유체칩에서 분리 및 농축된 신경가스 모의제 5종에 대해 얻어진 GC-MS 크로마토그램이다.
도 8은 DPGME의 이성질체를 나타내는 화학식이다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 명세서에 개시된 실시 예를 상세히 설명하되, 도면 부호에 관계없이 동일하거나 유사한 구성요소는 동일한 참조 번호를 부여하고 이에 대한 중복되는 설명은 생략하기로 한다. 본 명세서에 개시된 실시 예를 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 명세서에 개시된 실시 예의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다. 또한, 첨부된 도면은 본 명세서에 개시된 실시 예를 쉽게 이해할 수 있도록 하기 위한 것일 뿐, 첨부된 도면에 의해 본 명세서에 개시된 기술적 사상이 제한되지 않으며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
먼저, 본 발명에 따른 디지털 유체칩에 대하여 설명한다.
도 2는 본 발명의 일 실시 예에 따른 디지털 유체칩을 나타내는 개념도이다.
디지털 유체칩(100)은 상부 플레이트와 하부 플레이트를 포함한다. 하부 플레이트는 유리 슬라이드, 유리 슬라이드 위에 코팅된 흡착층, 상기 흡착층 증착된 Cr 및 Au층, Cr 및 Au층위에 코팅된 절연층을 포함하여 이루어질 수 있다.
일 실시 예에 있어서, 상기 하부 플레이트는 다음과 같은 방법으로 제조될 수 있다. 유리 슬라이드(74 mm × 56 mm, 동성, 광주, 대한민국)을 초음파를 이용하여 증류수, 아세톤, 이소프로판알콜로 씻은 후, 질소를 불어주어 말린다.
헥사메틸디실라잔(hexamethyldisilazane, HMDS, AZ Promoter-K, Microchem, MA, USA)를 일종의 흡착층으로써 깨끗이 씻긴 유리 슬라이드에 스핀 코팅시킨다.
그 후, 양각 포토리시스트(photoresist, GXR601, Microchem, MA, USA)을 다시 유리 슬라이드위에 스핀 코팅시킨 후, 마스크 어라이너(CA-6M, Shinumst, 대전, 대한민국)를 이용하여 자외선 빛에 노출시킨다.
이후, 현상액(MIF 300, Microchem, MA, UISA)에 담근 후, 증류수로 씻고, 질소를 불어서 말린다. 도 2와 같은 전극 디자인 형태로 Cr(3 nm)/Au(100 nm)을 순차적으로 포토리시트 패턴된 슬라이드 위에 열 증발기(Thermal evaporator, GVTE-1000-11T-GV tech, 대전, 대한민국)을 이용하여 열 증착시킨다. 나머지 포토리시스트는 아세톤을 이용하여 제거한다.
이후, 상기 슬라이드를 메탄올을 이용하여 세척한 후, 질소로 불어 말린다. 이후, 상기 슬라이드에 에탄올을 스프레이한 후, 즉시 15 μm 두께의 PVDC(Polyvinylidene chloride, Saran Food wrap) 랩 필름을 씌운다. 상기 랩 필름대신 Parylene-C와 같은 절연층을 코팅하여 사용할 수 있다. 상기 랩 필름은 일종의 전기절연층의 역할을 한다.
이후, 상기 플레이트를 오븐에서 2분간 섭씨 75도의 온도로 어닐링한다. 이후, 상기 플레이트에 50nm 두께의 Teflon-AF (2% w/v)을 스핀 코팅한 후, 섭씨 75도에서 30분간 굽는다. 다만, 이에 한정되지 않고, 하부 플레이트는 인쇄회로기판 (PCB, printed circuit board) 재질에 구리/금 등의 금속 박막으로 전극을 이용하여 제작할 수 있다.
한편, 상기 하부 플레이트는 디지털 유체칩의 전극으로 활용된다. 상기 하부 플레이트는 복수의 전극들로 이루어질 수 있으며, 상기 복수의 전극들은 도 2와 같은 구조를 가질 수 있다. 도 2를 참조하면, 상기 하부 플레이트는 총 6개의 저장 전극(110a 내지 110f)과 총 14개의 경로 전극(120)으로 이루어질 수 있다. 각각의 전극 사이는 액체 방울이 잘 넘어갈 수 있도록 지그-재그 패턴(121)이 형성될 수 있다. 다만, 이에 한정되지 않는다.
여기서, 상기 경로 전극(120)은 액체 방울들의 이동 통로가 되는 전극이다. 상기 경로 전극(120)의 개수에는 제한이 없으나, 6개의 저장 전극(110a 내지 110f) 중 어느 하나의 저장전극에 로딩된 액체가 경로 전극(120)을 통해, 다른 하나의 저장전극으로 자유롭게 이동할 수 있어야 한다.
한편, 상기 저장 전극은 시료 분석에 사용되는 화합물들을 로딩하는 전극으로, 최소 여섯 개 이상 구비되어야 한다. 구체적으로, 네 개의 저장 전극 각각에는 네 종류의 서로 다른 액체가 로딩되며, 상기 네 개의 저장 전극과는 다른 하나의 저장 전극에는 용리 용액에 용해된 신경가스 모의제 용액이 저장되며, 나머지 하나의 저장 전극에는 신경가스 모의제의 분리 및 농축 과정에서 더 이상 필요 없게 된 액체를 저장한다. 각각의 저장전극에 대한 활용은 후술한다.
본 명세서에서는 설명의 편의를 위하여, 서로 다른 액체가 로딩되는 네 개의 저장전극 각각을 "시료 용액 전극"(110a), "시료 용매 전극"(110b), "자성 비드 용액 전극"(110c), "용리 용매 전극"(110d)이라 하며, 용리 용액에 용해된 신경가스 모의제 용액이 저장되는 저장전극을 "시료 농축전극"(110e)이라 하고, 신경가스 모의제의 분리 및 농축 과정에서 더 이상 필요 없게 된 액체를 저장하는 저장전극을 "폐기물 저장전극"(110f)이라 한다.
한편, 전극 간의 거리는 10 내지 100㎛인 것이 바람직하다. 전극 간의 거리가 너무 짧으면, 전 극간의 방전이 발생할 가능성이 커진다. 또한, 전극 간의 거리가 너무 길면, 액체 방울이 인접 전극으로 잘 이동하지 않는다. 더욱 바람직하게는, 전극 간의 거리는 40㎛인 것이 바람직한다.
한편, 상부 플레이트는 ITO(indium-tin oxide) 층, 상기 ITO 층위에 코팅된 Teflon-AF층으로 이루어질 수 있다.
일 실시 예에 있어서, 상부 플레이트는 다음과 같은 방법으로 제조될 수 있다. 패턴이 되어 있지 않는 ITO(indium-tin oxide, 대한과학, 서울, 대한민국)에 대해 50 nm Teflon-AF를 코팅하고, 75℃에서 30분간, 170℃에서 30분간 가열한다.
한편, 상부 및 하부 플레이트는 서로 소정 간격으로 이격될 수 있다. 이때 플레이트간 간격은 180㎛ 정도인 것이 바람직하다. 플레이트 간격은 자성 비드를 포함한 액체 방울의 전극 간 움직임과 관련이 있으므로, 액체 방울의 움직임에 따라 적절히 조절하는 것이 필요하다.
본 발명에 따른 디지털 유체칩은 최소 여섯 개의 저장 전극 및 복수의 경로 전극(120)을 포함하여 이루어질 수 있다. 한편, 상술한 디지털 유체칩은 도 3에 도시된 장치들(200 내지 700)과 연결되어, 상기 전극들 각각에 전압이 인가될 수 있다. 상기 전극들 각각에 비대칭으로 전압이 인가되는 경우, 전극 위의 액체 방울이 소정 방향으로 이동할 수 있다.
이하에서는, 상술한 디지털 유체칩을 이용하여, 도 1에서 설명한 신경가스 모의제를 분석하는 방법에 대하여 설명한다.
도 4는 본 발명에 따른 신경가스 모의제의 분석 방법을 나타내는 순서도이고, 도 5a 내지 5d는 본 발명에 따른 신경가스 모의제의 분석 방법을 나타내는 개념도이다.
도 4, 5a 내지 5d를 참조하면, 본 발명에 따른 신경가스 모의제를 분석하는 방법은 신경가스 모의제가 용해된 시료 용액, 시료 용액에 사용된 용매, 자성 비드(magnetic bead)를 포함하는 자성 비드 용액 및 용리 용매 각각을 상기 디지털 유체칩에 구비된 서로 다른 저장 전극 표면에 로딩하는 단계(S100), 상기 자성 비드 용액의 액체 방울을 상기 디지털 유체칩에 구비된 복수의 경로 전극(120) 중 특정 경로 전극(120)으로 이동시키고, 상기 특정 경로 전극(120)에 위치하는 액체 방울에 포함된 용매를 상기 시료 용액에 사용된 용매로 바꾸는 단계(S200), 상기 신경가스 모의제가 상기 자성 비드 표면에 흡착되도록, 상기 디지털 유체칩에 로딩된 상기 시료 용액의 액체 방울과 상기 특정 경로 전극(120)에 위치하는 액체 방울을 혼합시키는 단계(S300), 상기 자성 비드 표면에 흡착된 신경가스 모의제를 상기 용리 용매에 용해시킨 후, 상기 신경가스 모의제가 용해된 상기 용리 용매를 상기 디지털 유체칩에 구비된 농축 전극으로 이동시키는 단계(S400)를 포함한다.
먼저, S100에 대하여 설명한다.
상기 시료 용액에 사용된 용매는 에틸아세테이트(Ethyl acetate):1-프로판알콜(1-propanol) (1:1 v/v) 용액일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 상기 시료 용액에 용해되는 시료는 도 1에서 설명한 5종의 신경가스 모의제중 적어도 하나일 수 있다.
한편, 자성 비드 용액은 자성 비드 및 상기 시료 용액에 사용된 용매와 다른 용매(예를 들어, 아세트니트릴)를 포함하여 이루어질 수 있다. 자성 비드 표면에는 신경가스 모의제를 흡착시키기 위한 기능기가 부착될 수 있다. 예를 들어 상기 기능기는 Diol기 일 수 있다.
상기 자성 비드 용액의 용매와 상기 시료 용액의 용매가 상이하기 때문에, 두 용액의 용매를 동일하게 하기 위하여, 상기 시료 용액에 사용된 용매를 사용한다. 상기 자성 비드 용액의 용매와 상기 시료 용액의 용매를 동일하게 하는 방법은 후술한다.
한편, 용리 용매는 자성 비드에 흡착된 신경가스 모의제를 용해시키기 위한 용매이다. 예를 들어, 상기 용리 용매는 아세트니트릴 일 수 있다. 다만, 이에 한정되지 않는다.
시료 용액, 시료 용액에 사용된 용매, 자성 비드(magnetic bead) 용액 및 용리 용매 각각은 모세관 주사기 또는 컴퓨터로 제어되는 시린지 펌프를 통해, 서로 다른 저장전극 표면에 로딩될 수 있다.
다음으로, S200에 대하여 설명한다.
S200은 자성 비드의 용매를 시료 용액에 사용된 용매로 바꾸는 단계이다.
신경가스 모의제가 용해된 시료용액의 용매와 자성 비드 용액에 포함된 용매가 다르기 때문에, 시료 용액과 자성 비드 용액을 혼합할 때, 두 용액이 제대로 혼합되지 않을 수 있다. 이를 방지하기 위해, 본 발명은 자석 비드 용액을 교체한다.
여기서, 시료 용액에 사용된 용매는 에틸아세테이트(Ethyl acetate):1-프로판알콜(1-propanol) (1:1 v/v) 용액일 수 있고, 자석 비드 용액의 용매는 아세트니트릴일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
구체적으로, 도 5a를 참조하면, 자성 비드 용액 전극(110c)에 로딩된 자성 비드를 포함하는 아세트니트릴 액체 방울을 경로 전극(120) 표면으로 옮기고(①), 자석(130)을 이용하여 자성 비드를 고정(②) 시킨다. 여기서, 상기 자석은 자성 비드(10)를 전극표면에 고정시키는 역할을 하며, 자성 비드를 더이상 고정 시킬 필요가 없을 때, 전극표면으로부터 이격시킬 수 있다.
자성 비드가 전극표면에 고정된 상태에서, 상청액(아세트니트릴)만을 선택적으로 폐기물 저장전극으로 이동(③)시킨다. 이때, 자성 비드는 자석(130)에 의하여 전극표면에 고정되어 있기 때문에, 자성 비드 용액이 위치한 전극과 폐기물 저장전극 사이에 비대칭적인 전극이 인가되면, 자성 비드 용액의 용매만 폐기물 저장전극으로 이동한다.
이후, 도 5b를 참조하면, 시료 용매 전극(110b)에 로딩된 용매(틸아세테이트(Ethyl acetate):1-프로판알콜(1-propanol) (1:1 v/v) 용액)를 자성 비드가 고정된 경로 전극(120)으로 이동(①) 시킨다. 이에 따라, 자성 비드 용액의 용매가 시료 용액의 용매와 동일하게 된다. 다만, 이에 한정되지 않고, 아세트니트릴 액체 방울에 에틸아세테이트:1-프로판알콜 액체 방울들을 점진적으로 이동시킴으로써 희석하여 용매를 교체할 수도 있다. 하지만, 상청액만을 선택적으로 이동하는 방법이 더 효과적이다.
한편, 액체방울을 특정 전극으로 이동 시기키 위해서는, 액체방울이 현재위치하는 전극과 액체방울을 이동 시키고자 하는 전극 사이에 비대칭적으로 전압이 인가되어야 한다.
일 실시 예에 있어서, 본 발명은 액체방울을 이동 시키고자 하는 전극에 교류 전압 (10kHz, 330-350 Vrms)를 가할 수 있다. 이때, 교류전압 대신 직류전압을 가해도 무방하나, 일반적으로 교류전압이 더 효과적이다.
한편, 전극에 가하는 교류 전압의 세기는 디지털 유체칩의 절연층에 두께에 비례한다. Parylene-C 등의 얇은 절연층일 때는 100볼트 미만의 교류 및 직류 전압도 액체 방울을 떼어 내거나 움직일 때 충분하다. 하지만, PVDC 랩 필름과 같은 두꺼운 절연층이 이용될 경우, 100볼트보다 높은 전압의 교류 또는 직류 전압을 인가해야 할 경우도 있다.
한편, 교류의 주파수는 1kHz 이상인 것이 바람직하다. 전극에 인가되는 높은 교류 전압의 경우, 펄스발생기에서 발생된 5볼트 수준의 교류를 전압 증폭기를 통해 고전압으로 증폭하여 이용할 수 있다. 높은 교류 및 직류 전압을 디지털 유체칩에 인가하기 위해서 멀티채널 스위치 릴레이 보드를 사용할 수 있다.
상기 자성 비드는 표면에 Diol 기능기가 부착된 상용 자성 비드(Micromod, Rostock, Germany)일 수 있다. 한편, Diol 기능기가 아닌 다른 기능기, 예를 들어 C18, HLB (hydrophilic lipophilic balance), 카보그라프(carbograph), 등은 신경가스 모의제에 대한 흡착 효과가 낮았다. 신경가스 모의제가 아닌 신경가스들도 비슷한 성질을 지닐 것으로 예측된다.
한편, 자성 비드의 입경은 100 내지 1000nm일 수 있다. 자성 비드 사이즈가 커지면(특히, 10㎛ 이상) 자성 비드를 포함한 액체 방울의 전극간 이동이 어려워지고, 비드 사이즈가 작으면 액체 방울 이동시 손실이 커질 수 있다. 따라서, 자성 비드의 입경은 250nm인 것이 바람직하다.
다음으로, S300에 대하여 설명한다.
S300은 신경가스 모의제를 자성 비드 표면에 흡착시키는 단계이다. 구체적으로, 도 5c를 참조하면, 경로 전극(120) 표면에 위치하는 자성 비드 용액에, 신경가스 모의제 용액 방울을 혼합한다. 즉, 시료 용액 전극에 로딩된 액체를 자성 비드 용액 방울이 위치하는 경로 전극(120)으로 이동(①) 시킨다.
여기서, 시료 용액의 용매는 에틸아세테이트(Ethyl acetate):1-프로판알콜(1-propanol) (1:1 v/v)일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
자성 비드 용액 및 신경가스 모의제 용액 각각의 액체 방울이 서로 섞인 후, 자성 비드 표면에 신경가스 모의제가 흡착되도록, 혼합 용액 방울을 경로 전극(120)들 상에서 계속해서 움직이도록 할 수 있다. 예를 들어, 혼합 용액 방울이 약 10분간 2분 간격으로 경로 전극(120)들 위에서 움직이도록 할 수 있다. 이후, 자성 비드를 경로 전극(120)에 고정(②) 시킨 상태에서 자성 비드 용액을 이루는 용매만 선택적으로 폐기물 전극으로 이동(③)시킨다. 이에 따라, 상기 특정 경로 전극(120)의 표면에는 신경가스 모의제가 흡착된 자성 비드만 남게 된다.
마지막으로, S400에 대하여 설명한다.
S400은 자성 비드 표면에 흡착된 신경가스 모의제를 농축 전극으로 이동 시키는 단계이다. 이때, 신경가스 모의제를 잘 녹일 수 있는 용리 용매(아세트니트릴)를 이용하여 자성 비드 표면에서 추출하는 방법을 사용한다.
구체적으로, 도 5d를 참조하면, 용리 용액 전극에 로딩된 액체를 자성 비드가 고정된 경로 전극(120)까지 이동(①)시킨다. 이에 따라, 자성 비드 표면에 흡착된 신경가스 모의제가 용리 용매에 용해 된다.
이후, 자성 비드를 경로 전극에 고정(②)시킨 상태에서, 신경가스 모의제가 용해된 용액 방울을 농축 전극으로 이동(③)시킨다. 이러한 과정을 반복하면, 시료 용액에서 신경가스 모의제를 분리 및 농축시킬 수 있게 된다. 상술한 방법은 신경가스 모의제뿐만 아니라 신경가스의 분리 및 농축에도 활용될 수 있다.
이후, 농축 전극에 농축된 용액은 MALDI-TOF 및 GC-MS 중 적어도 하나로 질량분석을 할 수 있다.
MALDI-TOF 질량분석법은 분석하고자 하는 시료분자와 UV를 흡수할 수 있고, 양성자를 쉽게 내어 줄 수 있는 -COOH 기능기를 포함하는 과량의 매트릭스를 혼합한 후, 약 1㎕ 가량의 혼합물을 전기전도성이 있는 MALDI 플레이트에 올려놓고 말리는 방식을 취한다.
이후, 혼합물의 매트릭스와 시료분자는 같이 결정화되는데, 상기 혼합결정에 질소 레이저 또는 355nm Nd:YAG 레이저 3rd harmonics 레이저 빔을 조사함으로써, 매트릭스와 시료분자가 기체화, 양성자화(protonation) 된다. MALDI-TOF 질량분석법은 (M+H)+ 또는 (M+alkali metal)+의 형태로 양성자화된 시료분자를 비행시간차 질량분석기를 이용하여 질량을 검출하는 방법이다.
이때 얻어지는 질량분석스펙트럼의 낮은 m/z 영역에서는 매트릭스의 피크들이 많이 나타나게 되는데, 본 발명에서 분석하고자 하는 신경가스 모의제와 매트릭스가 겹치지 않는 매트릭스를 선택하는 것이 중요하다.
본 발명에서 설명한 신경가스 모의제는 DMMP, DPGME, TEP, MeSA, DEP로써, 상기 모의제들에 대한 MALDI-TOF 질량분석 시에는 α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid(CHCA)를 매트릭스로 사용하는 것이 바람직하다.
한편, 분석 대상 물질의 종류에 따라 매트릭스의 종류가 달라질 수 있다. 한편, 매트릭스와 신경가스 모의제를 혼합할 때, 과량의 매트릭스를 사용하는 것과는 달리, 매트릭스의 비율을 낮추어 MALDI-TOF 질량스펙트럼에서 매트릭스 피크들의 세기를 낮추는 것이 필요하다.
상기 신경가스 모의제들은 MALDI-TOF 질량스펙트럼에서 (M+H)+의 형태로 m/z 125.1 (DMMP), m/z 149.0 (DPGME), m/z 153.1 (MeSA), m/z 183.1 (TEP), m/z 223.1 (DEP)에서 각기 검출된다.
도 6은 디지털 유체칩에서 분리 및 농축된 신경가스 모의제를 검출한 MALDI-TOF 스펙트럼이다. 도 6을 참조하면 상술한 5종의 모의제가 검출된 것을 확인할 수 있다.
한편, GC-MS 분석법은 다음과 같은 방법으로 수행된다. 분석하고자 하는 시료분자를 가스크로마토그래피의 모세관 컬럼에 주입한 후, 시료분자들을 컬럼에 흡착시키고, 온도를 올려가며 헬륨과 같은 캐리어 가스를 흘려주어, 컬럼흡착도가 높을수록 늦게 컬럼에서 용출되어 나오게 하여 분리시킨다. 이후, 용출된 기체상태의 시료분자들을 전자충격이온화법(electron impact ionization)을 통해 시료분자를 이온화와 파편이온화 시키고, 얻어진 전자충격이온화 질량스펙트럼을 라이브러리에 존재하는 수많은 분자들의 전자충격이온화 질량스펙트럼과 비교함으로써 시료분자의 종류를 분석한다.
도 7은 디지털 유체칩에서 분리 및 농축된 신경가스 모의제 5종에 대해 얻어진 GC-MS 크로마토그램이다.
도 7의 GC-MS 크로마토그램에 붙여진 번호에 해당하는 화합물은 하기 표 1에 나타내었다. 하기 표 1의 결과는 GC-MS 스펙트럼을 라이브러리 분자들과 비교하여 검색한 결과이다.
Peak Retention time (min) Compound Mass peaks (a.m.u.)
1 11.0 DPGME 31, 45, 59, 73, 103
2 11.4 DPGME 31, 45, 59, 73, 103
3 11.5 DMMP 47, 63, 79, 94, 109, 124
4 12.7 DPGME 31, 45, 59, 73, 104
5 13.0 DPGME 31, 45, 59, 73, 103, 117
6 13.3 DPGME 31, 41, 59, 73, 117
7 13.4 DPGME 31, 45, 59, 73, 117
8 14.8 TEP 45, 65, 81, 99, 113, 127, 155, 182
9 16.1 MeSA 39, 65, 92, 120, 152
10 21.1 DEP 149, 177
한편, 도 7의 GC-MS 크로마토그램에서 총 10개의 피크가 검출되는데, 이중에 서 1, 2, 4, 5, 6, 7번 피크들은 모두 DPGME에 해당하는 피크들이다. 상기 1, 2, 4, 5, 6, 7번 피크에 해당하는 화합물은 도 8에 도시된 DPGME의 이성질체들 [A: 1-(2-methoxy-1-methyleethoxy)-2-propanol, B: 1-(2-methoxy-2-methyleethoxy) -2-propanol, C: 2-(2-methoxy-1-methyleethoxy)-1-propanol, D: 2-(2-methoxy- 2-methyleethoxy)-1-propanol]과 Diastereomer들로 예상된다.
본 발명은 본 발명의 정신 및 필수적 특징을 벗어나지 않는 범위에서 다른 특정한 형태로 구체화될 수 있음은 당업자에게 자명하다.
또한, 상기의 상세한 설명은 모든 면에서 제한적으로 해석되어서는 아니되고 예시적인 것으로 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 첨부된 청구항의 합리적 해석에 의해 결정되어야 하고, 본 발명의 등가적 범위 내에서의 모든 변경은 본 발명의 범위에 포함된다.

Claims (8)

  1. 디지털 유체칩을 이용한 신경가스 모의제의 분석 방법에 있어서,
    신경가스 모의제가 용해된 시료 용액, 시료 용액에 사용된 용매, 자성 비드(magnetic bead)를 포함하는 자성 비드 용액 및 용리 용매 각각을 상기 디지털 유체칩에 구비된 서로 다른 저장 전극 표면에 로딩하는 단계;
    상기 자성 비드 용액의 액체 방울을 상기 디지털 유체칩에 구비된 복수의 경로 전극 중 특정 경로 전극으로 이동시키고, 상기 특정 경로 전극에 위치하는 액체 방울에 포함된 용매를 상기 시료 용액에 사용된 용매로 바꾸는 단계;
    상기 신경가스 모의제가 상기 자성 비드 표면에 흡착되도록, 상기 디지털 유체칩에 로딩된 상기 시료 용액의 액체 방울과 상기 특정 경로 전극에 위치하는 액체 방울을 혼합시키는 단계; 및
    상기 자성 비드 표면에 흡착된 신경가스 모의제를 상기 용리 용매에 용해시킨 후, 상기 신경가스 모의제가 용해된 상기 용리 용매를 상기 디지털 유체칩에 구비된 농축 전극으로 이동시키는 단계를 포함하고,
    상기 특정 경로 전극에 위치하는 액체 방울에 포함된 용매를 상기 시료 용액에 사용된 용매로 바꾸는 단계는,
    자석을 이용하여 상기 특정 경로 전극에 위치하는 액체 방울에 포함된 상기 자성 비드를 상기 특정 경로 전극의 표면에 고정시키는 단계;
    상기 자성 비드가 상기 특정 경로 전극의 표면에 고정된 상태에서, 상기 특정 경로 전극에 위치하는 액체 방울에 포함된 용매를 상기 디지털 유체칩에 구비된 폐기물 전극으로 이동시키는 단계; 및
    상기 저장 전극에 로딩된, 상기 시료 용액에 사용된 용매의 액체 방울을 상기 특정 경로 전극으로 이동시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 디지털 유체칩을 이용한 신경가스 모의제의 분석 방법.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    상기 신경가스 모의제를 상기 자성 비드 표면에 흡착시키는 단계는,
    상기 저장 전극에 로딩된 상기 시료 용액의 액체 방울을 상기 특정 경로 전극으로 이동시켜, 상기 시료 용액의 액체 방울과 상기 자성 비드 용액의 액체 방울을 혼합시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 디지털 유체칩을 이용한 신경가스 모의제의 분석 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 시료 용액의 액체 방울과 상기 자성 비드 용액의 액체 방울을 혼합시키는 단계는,
    상기 자석을 상기 특정 경로 전극으로부터 이격시킨 상태에서, 상기 시료 용액의 액체 방울과 상기 자성 비드 용액의 액체 방울이 혼합된 혼합 액체 방울을 소정 시간 동안 서로 다른 경로 전극으로 이동시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 디지털 유체칩을 이용한 신경가스 모의제의 분석 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 자성 비드 표면에 흡착된 신경가스 모의제를 상기 용리 용매에 용해시킨 후, 상기 디지털 유체칩에 구비된 농축 전극으로 이동시키는 단계는,
    상기 자석을 이용하여, 상기 혼합 액체 방울이 위치하는 경로 전극에, 상기 혼합 액체 방울에 포함된 상기 자성 비드를 고정시키는 단계;
    상기 자성 비드가 고정된 상태에서, 상기 혼합 액체 방울에 포함된 용매를 상기 폐기물 전극으로 이동시키는 단계;
    상기 저장 전극에 로딩된 상기 용리 용매의 액체 방울을 상기 자성 비드가 고정된 경로 전극으로 이동시켜, 상기 용리 용매에 상기 자성 비드 표면에 흡착된 신경가스 모의제를 용해 시키는 단계; 및
    상기 자성 비드가 고정된 상태에서, 신경가스 모의제가 용해된 상기 용리 용매를 상기 농축 전극으로 이동시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 디지털 유체칩을 이용한 신경가스 모의제의 분석 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 자성 비드 표면에는 Diol 기능기가 흡착되어 있는 것을 특징으로 하는 디지털 유체칩을 이용한 신경가스 모의제의 분석 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 신경가스 모의제는,
    dimethyl methyl phosphonate(DMMP), di(propylene glycol) methyl phosphonate(DPGME), methyl salicylate(MeSA), triethyl phosphate(TEP) 및 diethyl phosphate(DEP) 중 적어도 하나인 것을 특징으로 하는 디지털 유체칩을 이용한 신경가스 모의제의 분석 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 농축 전극으로 이동시킨 용리 용액을 MALDI-TOF 질량분석기 및 GC-MS 중 적어도 하나를 이용하여 질량분석하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 디지털 유체칩을 이용한 신경가스 모의제의 분석 방법.
KR1020170048752A 2017-04-14 2017-04-14 전기습윤 디지털 유체칩과 디올 기능기가 코팅된 자성 비드를 이용한 신경가스 모의제 분석방법 KR101947647B1 (ko)

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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A versatile electrowetting-based digital microfluidic platform for quantitative homogeneous and heterogeneous bio-assays(2011. 12. 31.)*
MALDI-TOF Mass Spectrometric Anlysis of Chmical Warfare Nerve Agent Simulants(2016. 2. 14.)*

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