KR101946141B1

KR101946141B1 - 발프로산을 유효성분으로 함유하는 수분저류 억제용 시약조성물

Info

Publication number: KR101946141B1
Application number: KR1020170020020A
Authority: KR
Inventors: 김지인; 최재일
Original assignee: 계명대학교 산학협력단
Priority date: 2017-02-14
Filing date: 2017-02-14
Publication date: 2019-02-08
Also published as: KR20180093643A

Abstract

본 발명은 발프로산을 유효성분으로 함유하는 수분저류 억제용 시약조성물에 관한 것으로, 상기 발프로산은 고지질식이에 의해 신장세포에서 유도되는 HDAC1의 발현을 억제시켜 수분저류를 유도하는 안지오텐신 Ⅱ, 수분통로 관련 유전자 및 나트륨 수송체 유전자들의 발현을 효과적으로 억제하는 것이 확인됨에 따라, 상기 발프로산을 유효성분으로 함유하는 조성물을 수분저류 억제용 시약조성물로 제공할 수 있다.

Description

발프로산을 유효성분으로 함유하는 수분저류 억제용 시약조성물{Reagent composition for inhibiting water retention comprising valproic acid}

본 발명은 발프로산을 유효성분으로 함유하는 수분저류 억제용 시약조성물에 관한 것이다.

체액 저류 현상으로 알려진 수분 저류 현상은 신체의 순환계나 조직, 흉강이나 복강 등의 신체의 구멍에 수분이 비정상적으로 축적되어 신체기관이 붓는 현상을 말한다. 수분은 혈액의 구성성분으로 몸속에서 적혈구를 운반하는 것을 돕고 산소와 중요 영양소가 혈액에 잘 녹아 있을 수 있도록 유지하여 뼈와 근육, 각종 샘에서 잘 흡수할 수 있도록 한다. 또한, 각종 생체조직과 근육도 대부분 물로 이루어져 있으며, 인체는 체내에 일정한 체액의 양을 유지하기 위해 호르몬과 프로스타글란딘이라 불리는 호르몬 유사물질을 이용한다.

이러한 물질들을 통하여 과도한 양의 액체가 섭취되더라도 신장에서 초과수분을 소변으로 배출하도록 조절하며, 충분한 양의 액체가 섭취되지 못할 경우에는 수분 배출을 막기 위해 평소보다 소변 배출을 감소시킨다.

산소, 비타민 및 다른 영양소가 풍부한 체액은 가장 작은 혈관인 모세혈관에서 주변부의 조직으로 통과한다. 이러한 체액을 조직액 또는 간질액이라 하며, 상기 체액은 세포에 영양분을 공급하고 다시 모세혈관으로 돌아오는데, 수분저류현상은 모세혈관 내부에서 압력변화나 혈관벽의 내구도 변화로 인해 나타난다.

만약 혈압이 잘못되거나 혈관벽에서 체액이 새게 될 경우, 체액은 세포 사이의 공간으로 많은 양의 체액이 새어 나오고, 새어 나온 체액이 모세혈관으로 돌아가지 못하고 조직에 남게 되면 조직이 부어오르고 물에 잠기게 되는 데, 이러한 경우 수분 저류 현상을 경험하게 되며, 림프계가 정체되거나 울혈이 생길 경우 모세혈관 밖으로 나온 체액이 여전히 조직에 남아 결과적으로 다리, 발목, 발, 복부 등의 신체기관이 붓는 부종의 원인이되며, 고혈압을 유발시킨다.

안지오텐신 II는 혈관을 수축시키고 신장에서 나트륨과 수분 재흡수를 촉진시켜, 나트륨 저류와 수분 저류를 증가시킴으로써 고혈압을 일으킨다고 알려져있다.

실제로 비만으로 인한 고혈압 동물모델에서 안지오텐신 II 억제제와 안지오텐신 변환 효소(angiotensin-converting enzyme, ACE) 억제제의 사용이 나트륨 저류와 혈류량 증가를 억제하여 혈압을 낮춘다고 보고되었으나, 사람을 대상으로 한 소규모 임상실험에서는 비만성 고혈압을 치료하기 위해 안지오텐신 II 수용체 억제제나 레닌 억제제, ACE 억제제를 사용하였을 때, 만성신장질환으로 진행될 위험이 있고, 기침과 가려움 등의 부작용과 함께 비만환자에서는 약물 저항성이 높아 고용량의 약물을 사용해야 하는 문제점이 있다.

따라서 안전하고 효과적인 부종 및 고혈압 치료제의 개발을 위해서는 수분저류 억제 연구 및 수분저류 억제제 개발이 필수적이다.

한국공개특허 제2013-0130562호(2013.12.02 공개)

본 발명은 우수한 수분저류 억제 효과를 나타내는 발프로산을 수분저류 억제용 시약조성물로 제공하여 보다 안전하고 효과적인 부종 또는 고혈압 치료제 개발을 위한 대조군으로 제공하고자 한다.

본 발명은 발프로산(Valproic acid)을 유효성분으로 함유하며, 상기 발프로산은 생체 외(in vitro)에서 신장 세뇨관 세포의 HDAC1 발현을 억제하여 안지오텐신 II, 아쿠아포린(aquaporin) 및 Na⁺/K⁺ ATPase α로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 유전자 발현을 감소시키는 것을 특징으로 하는 수분저류 억제용 시약조성물을 제공한다.

본 발명은 후보물질 및 발프로산을 세포에 각각 처리하는 단계; 상기 후보물질이 처리된 세포 및 발프로산이 처리된 세포에서 안지오텐신 II, 아쿠아포린(aquaporin) 및 Na⁺/K⁺ ATPase α로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자 발현 수준을 확인하는 단계; 및 상기 후보물질이 처리된 세포에서 확인된 유전자 발현 수준을 발프로산이 처리된 세포에서 확인된 유전자 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는 수분저류 억제용 약물 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명에 따르면, 발프로산은 고지질식이에 의해 신장세포에서 유도된 HDAC1의 발현을 억제시키고 수분저류를 유도하는 안지오텐신 II, 아쿠아포린(aquaporin) 및 Na⁺/K⁺ ATPase α 유전자들의 발현을 효과적으로 억제하는 것이 확인됨에 따라, 상기 발프로산을 유효성분으로 함유하는 조성물은 수분저류 억제용 시약조성물로 사용될 수 있다.

도 1은 고지질식이의 영향을 확인하기 위해, 정상식이(ND) 또는 고지질식이(HFD) 생쥐군의 몸무게 및 혈압을 확인한 결과로, 도 1A는 몸무게 측정 결과이며, 도 1B는 심장수축기성 혈압을 확인한 결과로( **p < 0.01 vs. week 0 of its own group. ##p < 0.01 vs. ND of same age.), 상기 결과들은 평균± SE (n = 4-6)으로 나타내었다 (ND: normal diet / HFD: high fat diet).
도 2는 정상식이(ND) 또는 고지질식이(HFD) 생쥐군에서 발프로산(VPA) 및 고지질식이에 의한 혈압 변화 수준을 확인한 결과로, 상기 결과들은 평균± SE (n = 4-6)으로 나타내었다 (*p < 0.05, **p < 0.01 vs. vehicle-treated ND at same age. #p < 0.05, ##p < 0.01 vs. vehicle-treated HFD at same age).
도 3은 정상식이(ND) 또는 고지질식이(HFD) 생쥐군의 신장에서 발프로산(VPA) 및 고지질식이에 의한 안지오텐신 II의 발현 수준을 확인한 결과로, 평균± SE(n = 4-6)으로 나타내었다(*p < 0.05, **p < 0.01 vs. vehicle-treated ND. #p < 0.05, ##p < 0.01 vs. vehicle-treated HFD.).
도 4는 정상식이(ND) 또는 고지질식이(HFD) 생쥐군의 신장에서 발프로산(VPA) 및 고지질식이에 의한 Na⁺/K⁺ ATPase α 단백질 발현 수준을 확인하고 β-액틴으로 표준화하였으며, 평균± SE(n = 4-6)으로 나타내었다(*p < 0.05, **p < 0.01 vs. vehicle-treated ND. ##p < 0.01 vs. vehicle-treated HFD.).
도 5는 정상식이(ND) 또는 고지질식이(HFD) 생쥐군의 신장에서 발프로산(VPA) 및 고지질식이에 의한 AQP1 단백질 발현 수준을 확인한 결과로, 상기 결과들은 평균± SE(n = 4-6)으로 나타내었다(*p < 0.05 vs. vehicle-treated ND. #p < 0.05, ##p < 0.01 vs. vehicle-treated HFD.).
도 6은 정상식이(ND) 또는 고지질식이(HFD) 생쥐군의 신장에서 발프로산(VPA) 및 고지질식이에 의한 HDAC1 단백질 발현 수준을 확인한 결과로, 상기 결과는 평균± SE(n = 4-6)으로 나타내었다(*p < 0.05 vs. vehicle-treated ND. ##p < 0.01 vehicle-treated HFD.).

본 발명은 발프로산(Valproic acid)을 유효성분으로 함유하며, 상기 발프로산은 생체 외(in vitro)에서 신장 세뇨관 세포의 HDAC1 발현을 억제하여 안지오텐신 Ⅱ, 수분통로 관련 유전자 및 나트륨 수송체 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 유전자 발현을 감소시키는 것을 특징으로 하는 수분저류 억제용 시약조성물을 제공할 수 있다.

상기 수분통로 관련 유전자는 아쿠아포린(aquaporin)일 수 있다.

상기 나트륨 수송체 유전자는 Na+/K+ ATPase α, Na+/K+ ATPase β 및 Na-K-2Cl 공동수송체(NKCC2)로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

상기 수분저류는 고지질식이에 의해 유도되는 것일 수 있다.

보다 상세하게는 고지질식이에 의한 체중증가는 안지오텐신 Ⅱ을 활성화시켜 수분저류 및 나트륨 저류를 증가시키는 것으로 알려져있다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 5주간 정상식이 또는 고지질식이한 생쥐의 신장세포에서 수분저류를 유도하는 안지오텐신 II 발현 수준을 확인한 결과, 도 3과 같이 고지질식이한 생쥐의 신장세포에서 상기 유전자들의 발현이 증가가 나타났다. 반면, 발프로산을 투여한 고지질식이 생쥐군에 경우, 정상식이 생쥐군과 유사한 수준으로 안지오텐신 II의 발현이 감소된 것을 확인할 수 있었다.

또한, 고지질식이는 신장세포에서 HDAC 1의 발현을 증가시킴으로써 나트륨 재흡수 증가 및 수분저류 증가를 유도하는 데, 상기 발프로산은 도 6과 같이 고지질식이 생쥐군의 신장세포에서 HDAC 1의 발현을 감소시켰으며, HDAC 1의 발현 감소는 도 4 및 5와 같이 나트륨 수송체 유전자는 Na⁺/K⁺ ATPase α 및 수분통로 관련 유전자는 아쿠아포린(aquaporin) 발현을 감소시켜 수분저류를 억제하는 것이 확인되었다.

상기 결과로부터 발프로산을 유효성분으로 함유하는 조성물은 생체 외(in vitro)에서 고지질식이로 유도된 수분저류를 억제하기 위한 시약조성물로 제공될 수 있으며, 수분저류에 의해 유도되는 질환들의 치료제 연구에 효과적인 대조군으로 사용될 수 있다.

상기 수분저류 억제용 시약조성물은 시약조성물 총 100 중량부에 대하여, 발프로산을 0.001 내지 10 중량부로 포함될 수 있다.

또한, 본 발명은 후보물질 및 발프로산을 세포에 각각 처리하는 단계; 상기 후보물질이 처리된 세포 및 발프로산이 처리된 세포에서 안지오텐신 Ⅱ, 수분통로 관련 유전자 및 나트륨 수송체 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자 발현 수준을 확인하는 단계; 및 상기 후보물질이 처리된 세포에서 확인된 유전자 발현 수준을 발프로산이 처리된 세포에서 확인된 유전자 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는 수분저류 억제용 약물 스크리닝 방법을 제공할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

< 실험예 1> 실험동물 및 식이

동물실험은 계명대학교의 실험동물 윤리위원회의 규정에 따라 진행되었다. 실험동물은 생후 8 주령, 몸무게 20-25 g 정도의 C57BL/6계 숫쥐를 실험동물 공급업체(하나상사, 한국)에서 구입하여 사용하였다.

먼저, 10% kcal 지질이 포함된 일반식이(Envigo사, 미국)와 60% kcal 지질이 포함된 고지질식이(Envigo사, 미국) 두 동물군으로 나누어 제공한 후, 고지질식이군의 수축기 혈압이 130~140 mmHg에 도달하였을 때 총 4개의 실험군[정상식이군(n = 6), 정상식이에 VPA(Sigma-Aldrich사, 미국) 투여군(n = 6), 고지질식이군(n = 6), 고지질식이에 VPA 투여군(n = 6)]으로 나누어 VPA를 300 mg/kg의 농도로 6일간 복강 내에 주사하였다.

발프로산(VPA)은 증류수에 녹여 사용하였으며 대조군은 동량의 증류수를 주사하였다. 희생시 이소퓨란(isoflurane)을 흡입시켜 전신 마취시킨 후 복부를 절개하여 신장을 적출하였다. 상기 적출된 신장은 액체질소를 이용하여 곧바로 동결시킨 후 분석 전까지 - 80℃에 보관하였다.

< 실험예 2> 몸무게 확인

쥐의 몸무게를 KC200(AND사, 한국)를 이용하여 측정한 후 몸무게 편차가 없도록 정상식이군과 고지질식이군으로 그룹을 나누고, 식이 시작 이후 매주 몸무게를 측정하였으며, 발프로산 투여 후 6일간은 매일 몸무게를 측정하였다.

< 실험예 3> 혈압 확인

CODA tail-cuff system(Kent Scientific사, 미국)을 이용하여 혈압을 측정하였다. 쥐용 홀더를 이용하여 움직임을 최소화시키고 안정되기를 기다렸다가 꼬리에 tail-cuff를 감은 뒤 꼬리의 온도가 32~34℃ 사이일 때 혈압을 측정하였다.

< 실험예 4> 웨스턴 블록 분석

얼음에 올려 차갑게 만든 유리 균질기에 단백질 용해 완충액[RIPA buffer (Cell Signaling Technology사, 미국): 20 mM Tris-HCl(pH 7.5), 150 mM NaCl, 1 mM Na2EDTA, 1 mM EGTA, 1% NP-40, 1% sodium deoxycholate, 2.5 mM sodium pyrophosphate, 1 mM β-glycerophosphate, 1 mM Na3VO4, 1 μg/ ml leupeptin]과 1 mM PMSF(Cell Signaling Technology사, 미국)가 첨가된 단백질추출용액 1 ml 및 신장 반쪽을 넣고 균질기를 이용하여 균질화한 후, 조직 균질액을 웨스턴 블록 분석에 사용하였다.

상기 균질액을 4℃에서 12,500 rpm으로 20분 동안 원심 분리하여 상층액을 얻은 후 BCA kit(Scientific 사, 미국)를 사용하여 단백질 농도를 측정하였다. 단백질 샘플을 10% SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동을 수행하여 분리시킨 뒤, PVDF 막(PVDF membrane; Millipore사, 미국)에 이동시켰다.

상기 막을 1% BSA(USB사, 미국)가 함유된 TBST(20 mM Tris, 137 mM NaCl, 0.1% Tween-20) 용액에 1시간 동안 반응시킨 뒤, 1차 항체[안지오텐신 II(Biorbyt사, 미국), Na⁺/K⁺ ATPase α(Genetex사, 미국), HDAC1 (Santa Cruz사, 미국), β-actin(Santa Cruz사, 미국), 아쿠아포린 1(aquaporin; AQP1)]를 0.1% BSA용액에 희석하여 막과 4℃에서 하룻밤 동안 반응시켰다.

그 후, TBST로 5분간 1회 세척한 뒤 호스래디시 퍼옥사이드(horseradish peroxidase)가 결합된 해당 2차 항체[goat anti-rabbit IgG (Santa Cruz사, 미국) 또는 goat anti-mouse IgG(Bethyl사, 미국)]를 실온에서 1시간 동안 반응시키고 TBST로 5분씩 3회 세척한 후 Enhanced Chemi-luminescence(Perkin Elmer사, 미국) 용액에 적셔 1분 동안 반응시키고, 암실에서 x-ray 필름(AGFA사, 벨기에)에 반응시켰다. 블롯을 Image J 프로그램을 이용하여 측정하고 β-actin으로 표준화하여 상대적 발현량을 계산하였다.

< 실시예 1> 고지질식이로 인한 몸무게 증가 및 혈압 증가 확인

C57BL/6 쥐에 5주간 고지질식이한 C57BL/6 쥐 실험군의 몸무게를 확인한 결과, 도 1A와 같이 정상식이군보다 몸무게가 23% 더 증가하였다(p < 0.01).

또한, 실험 시작 전에는 각 실험군 간의 혈압이 유의한 차이를 나타내지 않았으나, 5주간 고지질식이한 실험군에서는 도 1B와 혈압이 모두 증가하였다(p < 0.01).

< 실시예 2> 발프로산(Valproic Acid)의 혈압 상승 억제 효과 및 몸무게 확인

고지질식이군의 수축기 혈압이 130 mmHg에서 140 mmHg 사이인 경계성 고혈압이 되었을 때, vehicle 투여군과 발프로산(VPA) 투여군 2군으로 나눈 후 혈압을 확인하였다.

그 결과, 도 2와 같이 고지질식이 vehicle 투여군의 혈압은 계속 증가하여 140 mmHg 이상으로 고혈압이 발생한 반면, 고지질식이 VPA 투여군은 수축기와 이완기 혈압이 정상식이군 수준으로 유의하게 감소하였다(p < 0.01).

< 실시예 3> 고지질식이에 의한 레닌- 안지오텐신 시스템 구성요소 유전자 발현량 변화 및 발프로산 영향 확인

혈압을 증가시키는 주요 인자인 안지오텐신 II의 발현량의 변화를 확인하기 위해, 신장에서 안지오텐신 II의 단백질 발현량 변화를 확인한 웨스턴 블롯 결과, 도 4와 같이 고지질식이군에서 2.2배 증가한 반면, VPA 투여군에서는 정상식이군 수준으로의 감소가 확인되었다(p < 0.01).

< 실시예 4> 고지질식이에 의한 나트륨 수송체들의 유전자 발현량 변화 및 발 프로산 영향 확인

체중증가와 관련된 고혈압의 경우, 신장의 나트륨 재흡수와 나트륨 저류가 증가하는데, 이러한 과정에 나트륨 수송체들이 관여하는지 확인하기 위해 신장에서 나트륨 수송체들의 발현량을 확인하였다.

그 결과, 도 4와 같이 고지질식이군의 Na⁺/K⁺ ATPase α의 단백질 발현량이 1.3배 증가한 반면, VPA 투여에 의해 정상식이군 수준으로 감소된 것을 확인할 수 있었다(p < 0.05).

< 실시예 5> 고지질식이에 의한 아쿠아포린 ( Aquaporin ) 유전자 발현량 변화 및 발프로산 영향 확인

체중증가와 연관된 고혈압의 경우, 신장의 나트륨 재흡수가 증가함과 동시에 수분도 함께 재흡수되고 혈류량이 늘어나 고혈압이 발생하는데, 이러한 과정에서 수분통로들의 관련성을 확인하기 위해 아쿠아포린(aquaporin; AQP)의 발현량을 확인하였다.

그 결과, 도 5와 같이 AQP1의 단백질 발현량 역시 고지질식이군에서 1.4배 증가한 반면, VPA 투여군에서는 정상식이군 수준으로 감소된 것을 확인할 수 있었다(p < 0.05).

< 실시예 6> 고지질식이에 의한 히스톤 디아세틸라제 1의 단백질 발현량 변화 및 발프로산 영향 확인

고지질식이에 의한 HDAC 단백질 발현량 변화 여부를 확인하기 위해, 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다.

그 결과, 도 7과 같이 HDAC1 단백질 발현량이 고지질식이군에서 2배 증가한 반면, VPA가 투여된 실험군에서는 정상식이군 수준으로 감소된 것을 확인할 수 있었다.(p < 0.05).

상기 결과들로부터 발프로산(VPA)은 신장세포에서 고지방식이에 의해 증가된 HDAC1 발현을 억제함으로써, 수분저류를 유도하는 상기 유전자들의 발현을 감소시켜 수분저류를 억제시키는 것이 확인되었다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

발프로산(Valproic acid)을 유효성분으로 함유하며, 상기 발프로산은 생체 외(in vitro)에서 신장 세뇨관 세포의 안지오텐신 Ⅱ, 아쿠아포린(aquaporin) 및 Na⁺/K⁺ ATPase α 나트륨 수송체 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 유전자 발현을 감소시키는 것을 특징으로 하는 안지오텐신 Ⅱ, 아쿠아포린 및 Na⁺/K⁺ ATPase α 나트륨 수송체 유전자 발현 억제용 시약조성물.
삭제
삭제
청구항 1에 있어서, 상기 안지오텐신 Ⅱ, 아쿠아포린(aquaporin) 및 Na⁺/K⁺ ATPase α 나트륨 수송체 유전자는 고지질식이에 의해 유도되는 것을 특징으로 하는 안지오텐신 Ⅱ, 아쿠아포린 및 Na⁺/K⁺ ATPase α 나트륨 수송체 유전자 발현 억제용 시약조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 시약조성물은 시약조성물 총 100 중량부에 대하여, 발프로산을 0.001 내지 10 중량부로 포함하는 것을 특징으로 하는 안지오텐신 Ⅱ, 아쿠아포린 및 Na⁺/K⁺ ATPase α 나트륨 수송체 유전자 발현 억제용 시약조성물.
후보물질 및 발프로산을 세포에 각각 처리하는 단계;
상기 후보물질이 처리된 세포 및 발프로산이 처리된 세포에서 안지오텐신 Ⅱ, 아쿠아포린(aquaporin) 및 Na⁺/K⁺ ATPase α 나트륨 수송체 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자 발현 수준을 확인하는 단계; 및
상기 후보물질이 처리된 세포에서 확인된 유전자 발현 수준을 발프로산이 처리된 세포에서 확인된 유전자 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는 안지오텐신 Ⅱ, 아쿠아포린 및 Na⁺/K⁺ ATPase α 나트륨 수송체 유전자 발현 억제용 약물 스크리닝 방법.