KR101944326B1 - Sub micropore chip and impedance measurement using the same - Google Patents
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Abstract
본 발명은 미세기공 칩에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 미세기공 칩을 이용한 세포의 임피던스 측정 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 본 발명에 따르면, 미세기공 칩을 이용하여 임피던스를 측정함으로써, 미세기공에 위치한 세포의 특성을 비표지, 실시간으로 검출할 수 있다. 미세기공 칩과 임피던스 분광법을 결합시킴으로써 세포독성시험 또는 암세포의 표현형 연구에서의 세포막 또는 세포의 형태학적 변화의 모니터링이 가능하다.The present invention relates to a micro pore chip, and more particularly, to a method of measuring impedance of a cell using a micro pore chip.
According to the present invention, by measuring the impedance using the microporous chip, the characteristics of the cells located in the micropores can be detected in an unlabeled and real time manner. By combining the microporous chip with impedance spectroscopy, it is possible to monitor morphological changes of cell membranes or cells in cytotoxicity tests or phenotypic studies of cancer cells.
Description
본 발명은 미세기공 칩에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 미세기공 칩을 이용한 세포의 임피던스 측정 방법을 제공하는 것이다. The present invention relates to a micro pore chip, and more particularly, to a method of measuring impedance of a cell using a micro pore chip.
나노기공 구조는 다양한 용도로 단일분자, DNA, 효소, 단백질, 세포의 바이오센싱(biosensing)에 적용할 수 있어 주목받고 있다. 고체상 나노기공은 기공직경의 범위가 넓고, 장기적인 실험에서 생물학적 나노기공보다 화학안정성 및 내구성이 높다는 것이 입증되었다. 또한 기공 구조는 이온의 혼합되지 않는 두 전해질의 계면에서 발생하는 이온의 이동을 돕고, 이온의 동역학을 연구하기 위한 전기화학적 분석을 실시하고 있다. The nanopore structure can be applied to biosensing of single molecules, DNA, enzymes, proteins, and cells for various applications. Solid-state nanopores have a wide range of pore diameters and have proven to be more stable and durable than biological nanopores in long-term experiments. In addition, the pore structure facilitates the migration of ions generated at the interface between the two non-mixed electrolytes, and performs electrochemical analysis to study ion dynamics.
나노기공 기반의 생물학적 분석장치는 생체분자 또는 단일세포의 형질주입의 고감도 탐지를 위해 사용될 수 있다. 또한, 생물학적으로 기능화 된 고체상 나노기공은 나노기공의 표면에 고정 된 프로브 분자와 표적분자사이의 상호작용을 검출할 수 있다. Nanopore based biological analysis devices can be used for high sensitivity detection of transduction of biomolecules or single cells. In addition, the biologically functionalized solid phase nanopore can detect the interaction between the probe molecule immobilized on the surface of the nanopore and the target molecule.
이온집속빔(Focused Ion Beam, FIB)은 컴퓨터를 이용하여 디자인이 가능하며, 도체 및 부도체의 국부적인 영역에 높은 정밀도로 직접 나노패터닝을 할 수 있다. 또한 이온집속빔은 유전적 분석이 필요한 DNA, 유전자 돌연변이 및 단일염기 다형성(single nucleotide polymorphism) 검출을 위한 고체상 나노기공의 제조에 사용 된다. Focused ion beams (FIB) can be designed using a computer and can be directly patterned with high precision in localized areas of conductors and nonconductors. The ion focusing beam is also used for the production of solid phase nanopores for DNA, gene mutation and single nucleotide polymorphism detection requiring genetic analysis.
이러한 이온집속빔의 사용은 저비용으로 기공구조의 빠른 제작이 가능하다. 또한 세포막을 통해 이온의 흐름을 모니터링, 세포막의 이온채널 활성도 측정 및 세포막의 전기적·동적 물성을 측정하기 위한 평면 패치클램프(planar patch clamping)에 이용될 수 있다.The use of such an ion focusing beam enables a rapid pore structure to be fabricated at a low cost. It can also be used for planar patch clamping to monitor the flow of ions through the cell membrane, measure ion channel activity of the cell membrane, and measure the electrical and dynamic properties of the cell membrane.
본 발명의 목적은, 미세기공이 형성되어 있는 미세기공 멤브레인을 제공함에 있다. 또한 상기 미세기공 멤브레인을 포함하는 미세기공 칩의 제조방법을 제공함에 있다.An object of the present invention is to provide a microporous membrane in which micropores are formed. And a method of manufacturing a microporous chip including the microporous membrane.
또한, 미세기공 칩을 제공함으로써, 단일세포의 전기적 임피던스 특성화를 가능하게 함에 있다.In addition, by providing a microporous chip, it is possible to characterize the electrical impedance of a single cell.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 미세기공이 형성되어 있는 미세기공 멤브레인을 포함하는 미세기공 칩을 제공한다. 상기 미세기공 멤브레인은 질화규소 멤브레인일 수 있다. 또한 상기 미세기공은 직경 500nm인 것을 특징으로 한다. 또한 상기 미세기공 칩은 미세기공의 하부에 형성되어 있으며, 미세기공방향으로 수렴하는 형태인 흡인조절구를 더 포함할 수 있다.In order to accomplish the above object, the present invention provides a microporous chip comprising a microporous membrane having micropores formed therein. The microporous membrane may be a silicon nitride membrane. The fine pores have a diameter of 500 nm. The microporous chip may further include a suction control port formed at a lower portion of the micropore and configured to converge in the micropore direction.
또한 본 발명은 미세기공 칩의 제조방법을 제공한다. 상기 미세기공 칩제조방법은 기판에 박막을 증착시키는 단계, 상기 박막이 증착된 기판의 일 면에 패터닝하여 기판을 노출시키는 단계, 상기 노출된 기판을 에칭하는 단계, 상기 에칭된 면에 박막을 증착시키는 단계 및 상기 증착된 박막에 미세기공을 형성시키는 단계를 포함한다.The present invention also provides a method of manufacturing a microporous chip. The microporous chip manufacturing method includes depositing a thin film on a substrate, exposing the substrate by patterning on one side of the thin film deposited substrate, etching the exposed substrate, depositing a thin film on the etched side And forming micropores in the deposited thin film.
상기 박막은 질화규소(Si3N4)이며 기판에 200 내지 300nm의 두께로 증착시킨다. 또한 에칭된 면에 박막을 증착시키는 단계에서는 200 내지 300nm의 두께로 증착시킨다. 상기 미세기공을 형성시키는 단계는 증착된 박막에 직경 500nm 내지 2μm인 기공을 형성시킨다.The thin film is silicon nitride (Si 3 N 4 ) and is deposited on the substrate to a thickness of 200 to 300 nm. In the step of depositing the thin film on the etched surface, the deposited film is deposited to a thickness of 200 to 300 nm. The step of forming the micropores may include forming pores having a diameter of 500 nm to 2 占 퐉 in the deposited thin film.
또한 본 발명은 미세기공 멤브레인을 이용한 단일세포(single cell)의 임피던스 측정방법을 제공한다. 상기 임피던스 측정방법은 미세기공 멤브레인을 미세유체칩(microfluidic chip)에 결합시키는 단계, 유체채널(fluidic channel)에 세포배양배지를 채우는 단계, 미세유체칩의 챔버에 단일세포를 주입하는 단계, 흡인력을 조절하여 주입된 단일세포를 미세기공에 위치시키는 단계 및 상기 미세기공에 위치한 단일세포의 임피던스를 측정하는 단계를 포함한다.The present invention also provides a method of measuring impedance of a single cell using a microporous membrane. The impedance measurement method includes the steps of: bonding a microporous membrane to a microfluidic chip; filling a fluidic channel with a cell culture medium; injecting a single cell into the chamber of the microfluidic chip; Placing the adjusted single cells in the micropores, and measuring the impedance of the single cells located in the micropores.
상기와 같은 본 발명에 따르면, 미세기공 칩을 이용하여 임피던스를 측정함으로써, 미세기공에 위치한 세포의 특성을 비표지, 실시간으로 검출할 수 있다. According to the present invention, by measuring the impedance using the microporous chip, the characteristics of the cells located in the micropores can be detected in an unlabeled and real time manner.
미세기공 칩과 임피던스 분광법을 결합시킴으로써 세포독성시험 또는 암세포의 표현형 연구에서의 세포막 또는 세포의 형태학적 변화의 모니터링이 가능하다.By combining the microporous chip with impedance spectroscopy, it is possible to monitor morphological changes of cell membranes or cells in cytotoxicity tests or phenotypic studies of cancer cells.
미세기공 칩이 단일세포를 기반으로 한 분석에 이용될 경우 고속 대량 스크리닝(high-throughput) 및 정량분석을 위한 시간 및 노력을 줄일 수 있는 효과가 있다. When the microporous chip is used for single-cell-based analysis, the time and effort for high-throughput and quantitative analysis can be reduced.
도 1은 미세기공 칩의 사시도이다.
도 2는 미세기공 칩의 단면도이다.
도 3은 미세기공 칩의 제조과정을 도시한 것이다.
도 4는 미세기공 칩을 이용한 단일세포의 임피던스 측정과정을 도시한 것이다.
도 5a는 미세기공 칩의 주사전자현미경(SEM) 사진이다.
도 5b는 미세기공 칩의 미세기공 상에 위치한 단일세포(HEK-293)의 위상차현미경 사진이다.
도 6은 단일세포의 존재 유무에 따른 미세기공 칩의 임피던스 크기(a) 및 상(b)을 도시한 것이다.
도 7a는 단일세포의 유형에 따른 10Hz에서의 정규화 임피던스 크기를 도시한 것이다.
도 7b는 단일세포의 유형에 따른 1kHz에서의 정규화 임피던스의 상을 도시한 것이다.1 is a perspective view of a micro pore chip.
2 is a cross-sectional view of a microporous chip.
FIG. 3 shows a manufacturing process of a micro pore chip.
4 shows a process of measuring the impedance of a single cell using a microporous chip.
5A is a scanning electron microscope (SEM) photograph of a microporous chip.
Figure 5b is a phase contrast micrograph of a single cell (HEK-293) located on the micropores of the microporous chip.
FIG. 6 shows the impedance magnitudes (a) and (b) of the microporous chip according to the presence or absence of a single cell.
Figure 7a shows the normalized impedance magnitude at 10 Hz according to the type of single cell.
Figure 7b shows an image of the normalized impedance at 1 kHz according to the type of single cell.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
도 1은 본 발명의 일 형태에 따른 미세기공 칩(100)을 사시도이다. 상기 미세기공 칩은 미세기공이 형성되어 있는 미세기공 멤브레인을 포함하는 것을 특징으로 한다.1 is a perspective view of a
도 2는 본 발명의 일 형태에 따른 미세기공 칩(100)의 단면도이다. 미세기공 칩은 박막이 증착된 기판에 미세기공 멤브레인(110)이 형성되어 있는 것이다. 미세기공 칩(100)의 기판(120)은 기계적인 지지역할을 담당하는 것으로, 실리콘(Si), 이산화규소(SiO2), 질화규소(Si3N4), 게르마늄(Ge), 갈륨비소(GaAs), 질화갈륨(GaN), 인화갈륨(GaP), 인화인듐(InP), 산화알루미늄(Al2O3), 탄화규소(SiC), 셀렌화카드뮴(CdSe), 황화카드뮴(CdS), 카드뮴텔루라이드(CdTe), InAs, ZnTe, ZnO, 또는 ZnS으로 이루어진 기판일 수 있다2 is a cross-sectional view of a
또한, 미세기공 칩(100)의 박막(130)은 상기 기판(120)상에 형성되어 있으며, 질화규소(Si3N4), 이산화규소(SiO2), 산화알루미늄(Al2O3), 이산화티타늄(TiO2), 티탄산바륨(BaTiO3) 또는 티탄산연(PbTiO3)막일 수 있다.The
미세기공 칩(100)에 형성되어 있는 미세기공 멤브레인(110)은 직경 500nm 내지 2μm인 원통형상인 것이 바람직하다. 상기 미세기공의 직경은 DNA를 검출할 경우 3 nm 이하, 단백질의 경우 크기에 따라 10 nm ~ 300 nm 수준, 박테리아의 경우 크기에 따른 100 nm ~ 500 nm, 단일 세포의 경우 500 nm ~ 2 μm 가 바람직하다. The
상기 미세기공 멤브레인(110)은 미세기공의 하부에 형성되어 있는 흡인조절구를 더 포함할 수 있다. 상기 흡인조절구는 미세기공 방향으로 수렴하는 형태이며, 수렴하는 각도는 기판에 대하여 54.74°인 것이 바람직하다.The
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 미세기공 칩의 제조과정을 도시한 것이다. 상기 칩 제조과정은 기판에 박막을 증착시키는 제1증착단계; 상기 박막이 증착된 기판의 일 면에 패터닝하여 기판을 노출시키는 패터닝 단계; 상기 노출된 기판을 에칭하는 에칭단계; 상기 에칭 된 면에 박막을 증착시켜 멤브레인을 제조하는 제2증착단계; 및 상기 제조된 멤브레인에 미세기공을 형성시키는 미세기공 형성 단계;를 포함한다.FIG. 3 illustrates a process of fabricating a microporous chip according to an embodiment of the present invention. Referring to FIG. The chip manufacturing process includes: a first deposition step of depositing a thin film on a substrate; A patterning step of patterning the substrate on one side of the substrate on which the thin film is deposited to expose the substrate; The exposed substrate An etching step of etching; A second deposition step of depositing a thin film on the etched surface to produce a membrane; And forming micropores in the prepared membrane.
상기 제1증착단계는 박막을 200 내지 300nm의 두께로 증착시키는 것이 바람직하다. 상기 박막의 두께는 미세기공 크기에 따라 달라지는 것이 공정수율을 높이기 위해 바람직하다. 상기 미세기공 공정수율은 가로세로비 (Aspect ratio)에 따라 결정되며 일례로 미세기공 직경이 10 nm 이하, 10 nm ~ 100 nm, 100 nm ~ 500 nm, 500 nm ~ 2 μm 일 경우 박막두께는 각각 10 nm, 100 nm, 500 nm, 2 μm가 바람직하다.In the first deposition step, the thin film is preferably deposited to a thickness of 200 to 300 nm. The thickness of the thin film depends on the micro pore size in order to increase the process yield. The yield of the microporous process is determined according to the aspect ratio. For example, when the micropores have a diameter of 10 nm or less, 10 nm to 100 nm, 100 nm to 500 nm, or 500 nm to 2 μm, 10 nm, 100 nm, 500 nm, and 2 μm are preferable.
상기 제2증착단계는 박막을 200 내지 300nm의 두께로 증착시키는 것이 바람직하다. 상기 증착되는 박막의 두께는 단계별 박막 증착을 통해 형성되는 최종 박막 두께는 제작할 미세기공 크기에 따라 공정수율을 높이기 위해 적절히 조절되는 것이 바람직하다.In the second deposition step, the thin film is preferably deposited to a thickness of 200 to 300 nm. It is preferable that the thickness of the deposited thin film is appropriately controlled in order to increase the process yield according to the micropore size to be formed.
상기 미세기공 형성단계는 증착된 박막에 직경 500nm 내지 2μm인 기공을 형성시킨다.The microporous-forming step forms pores having a diameter of 500 nm to 2 占 퐉 in the deposited thin film.
또한 미세기공은 전자빔 리소그래피(electron beam lithography), 반응성 이온에칭(reactive ion etching), 레이저 간섭 리소그래피(laser interference lithography), 콜로이드 리소그래피(colloidal lithography), 나노 구 리소그래피(nanosphere lithography), 희소 콜로이드 리소그래피(sparse colloidal lithography), 정공 마스크 콜로이드 리소그래피(hole-mask colloidal lithography), 나노 임프린트 리소그래피(nanoimprint lithography), 헬륨이온 현미경 밀링(helium ion microscope milling) 또는 집속이온빔(focused ion beam, FIB) 방법으로 제작할 수 있다.In addition, the micropores can be formed by various methods such as electron beam lithography, reactive ion etching, laser interference lithography, colloidal lithography, nanosphere lithography, sparse colloidal lithography, colloidal lithography, hole-mask colloidal lithography, nanoimprint lithography, helium ion microscope milling, or focused ion beam (FIB).
도 4는 미세기공 칩(100)을 이용한 단일세포(single cell)의 임피던스 측정과정을 도시한 것이다. 상기 미세기공 멤브레인을 이용한 단일세포의 임피던스 측정방법은 미세기공 칩(100)을 미세유체칩(microfluidic chip)(400)에 결합시키는 단계; 미세유체의 유체 채널(fluidic channel)(420)에 세포배양배지를 채우는 단계; 미세유체칩의 챔버(430)에 단일세포를 주입하는 단계; 흡인력을 조절하여 주입된 단일세포를 미세기공 멤브레인(110)에 위치시키는 단계; 및 상기 미세기공에 위치한 단일세포의 임피던스를 측정하는 단계;를 포함한다. FIG. 4 shows a process of measuring impedance of a single cell using the
상기 미세유체칩(400)은 2전극 배열(410)을 특징으로 한다. 또한 미세유체칩은 유체가 주입되는 유체 채널(fluidic channel)(420) 및 챔버(430)를 포함한다.The
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. It is to be understood by those skilled in the art that these examples are for illustrative purposes only and that the scope of the present invention is not construed as being limited by these examples.
실시예Example 1. 미세기공 1. Fine porosity 멤브레인Membrane 제작. making.
두께가 500μm 인 실리콘 기판의 양면에 질화규소(Si3N4) 박막을 300nm 두께로 증착시킨다. 상기 질화규소 박막은 저압화학 기상증착법(low-pressure chemical vapor deposition)으로 증착시켰다(도 3a).A silicon nitride (Si 3 N 4 ) thin film is deposited on both sides of a silicon substrate having a thickness of 500 μm to a thickness of 300 nm. The silicon nitride thin film was deposited by low-pressure chemical vapor deposition (Fig. 3A).
상기 질화규소 박막이 증착된 기판의 일면을 포토리소그래피(photolithography) 및 반응성 이온에칭(reactive ion etching)법으로 패터닝하여 실리콘 기판을 노출시켰다. 이때, 패터닝 된 영역은 20μmX20μm이며, 실리콘기판이 노출 된 부분이 에칭 될 면적을 고려하여 패터닝 하였다(도 3b).One surface of the substrate on which the silicon nitride thin film was deposited was patterned by photolithography and reactive ion etching to expose the silicon substrate. At this time, the patterned region was 20 μm × 20 μm, and the exposed portion of the silicon substrate was patterned in consideration of the area to be etched (FIG. 3B).
상기 패터닝 된 기판의 실리콘 기판이 노출된 영역은 30%KOH에서 6시간 30분 내지 7시간동안 이방성 에칭(anisotropic etching)을 수행하였다(도 3c). 상기 이방성 에칭의 에칭속도는 1.33μm/min이다.The exposed areas of the patterned substrate silicon substrate were subjected to anisotropic etching at 30% KOH for 6
실리콘 기판의 에칭 된 면의 절연을 위하여 질화규소 박막을 200nm 두께로 증착시킨다. 상기 질화규소 박막은 플라즈마 화학증착(plasma enhanced chemical vapor deposition)법으로 증착시켰다(도 3d). 결과적으로 면적 20μmX20μm, 두께 500nm인 질화규소 멤브레인이 제조되었다.A silicon nitride thin film is deposited to a thickness of 200 nm for insulation of the etched surface of the silicon substrate. The silicon nitride thin film was deposited by plasma enhanced chemical vapor deposition (FIG. 3D). As a result, a silicon nitride membrane having an area of 20 m X 20 m and a thickness of 500 mn was produced.
상기 제조된 질화규소 멤브레인을 포함하도록 실리콘 기판을 다이싱(dicing)하여 질화규소 멤브레인을 포함하는 칩을 제조한다.The silicon substrate is diced to include the silicon nitride membrane thus prepared to manufacture a chip including a silicon nitride membrane.
집속이온빔(focused ion beam) 시스템(acceleration voltage :30kV, extraxtor voltage : 6~7kV)을 이용하여 상기 제조된 칩의 질화규소 멤브레인에 단일 기공(single pore)을 제조하여 미세기공칩을 완성하였다(도 3e). A single pore was prepared on the silicon nitride membrane of the chip using a focused ion beam system (acceleration voltage: 30 kV, extra-6: 7 kV) to complete a microporous chip ).
제조된 미세기공 칩을 주사전자현미경(SEM)으로 확인하였으며, 미세기공칩의 SEM 사진은 도 5a에 도시하였다. 상기 도 5a로부터 제조 된 미세기공 칩에 직경 500nm, 두께 500nm인 원통형인 미세기공이 제조되었음을 알수 있다. The prepared microporous chip was confirmed by a scanning electron microscope (SEM), and an SEM photograph of the microporous chip was shown in FIG. 5A. It can be seen that cylindrical micropores having a diameter of 500 nm and a thickness of 500 nm were fabricated on the microporous chip manufactured from FIG. 5A.
도 5b는 미세유체 흡인조절을 통해 미세기공상에 위치한 단일세포의 위상차 현미경 사진이다. 제조 된 질화규소 멤브레인은 멤브레인 위의 세포를 위상차현미경으로 관찰이 충분할 만큼 얇을 것을 알 수 있다.FIG. 5B is a phase contrast micrograph of a single cell located on the microcavity through microfluid aspiration control. FIG. It can be seen that the silicon nitride membrane produced is thin enough to observe the cells on the membrane with a phase contrast microscope.
실시예Example 2. 미세기공 칩을 이용한 세포의 임피던스 측정. 2. Impedance measurement of cells using microporous chip.
상기 실시예1에서 제조한 미세기공 칩을 미세유체 칩(microfluidic chip)에도 4와 같이 결합시켰다. 상기 미세유체칩은 2전극 배열을 가지고 있다. 미세기공칩 아래의 유체 채널에 세포배양배지를 채우고, 세포가 혼합된 배지는 미세기공 칩 위의 챔버에 주입한다. The microporous chip prepared in Example 1 was bonded to a microfluidic chip. The microfluidic chip has a two-electrode arrangement. The fluid channel below the microporous chip is filled with the cell culture medium, and the mixed medium is injected into the chamber above the microporous chip.
상기 챔버에 주입된 세포가 혼합 된 배지에 부유 해 있는 단일세포(single cell)를 흡인조절을 통해 미세기공 위에 위치시킨다. 이때의 흡인조절은 세포막에 손상이가지 않도록 조절해야 한다. 미세기공 위에 배치된 세포는 위상차현미경을 이용하여 위치를 확인한다. 미세기공 칩의 미세기공 상에 단일세포의 유·무에 따라, 10Hz 내지 1kHz에서 임피던스를 측정한다. 상기 방법에 따라 임피던스를 측정한 세포주는 HEK-293, C2C12 및 MCF-7이다.A single cell suspended in a medium mixed with the cells injected into the chamber is placed on the micropores through suction control. At this time, the aspiration control should be controlled so as not to damage the cell membrane. The cells placed on the micropores are identified using a phase contrast microscope. The impedance is measured at 10 Hz to 1 kHz according to the presence or absence of a single cell on the micropores of the microporous chip. Cell lines measuring the impedance according to the above method are HEK-293, C2C12 and MCF-7.
미세기공 칩을 이용한 세포의 임피던스 측정결과는 도 6과 같다. 1kHz 아래 낮은 주파수에서의 임피던스 크기는 세포 없이 측정하였을 때가 세포가 있을 경우보다 낮았다. 다만, 1kHz에서의 임피던스 크기는 세포의 유·무에 따른 차이가 적었다(도 6a). 세포가 없을 때의 낮은 주파수에서의 임피던스 스펙트럼은 세포배양배지의 저항에 의한 것이다. 반면에 임피던스 위상(arc tangent of the reactance-toresistance ratio)은 주파수의 감소할수록 0에 접근하였다(도 6b). 낮은 주파수에서 전류의 흐름은 절연막에 의해 차단되었으므로, 기공구조는 측정된 임피던스 값에 영향을 주는 가장 큰 인자이다. 낮은 주파수에서 임피던스 크기의 증가한 것은 미세기공에 위치한 단일세포의 세포막이 전류를 방해하기 때문이다(도 6a). 미세기공 칩의 미세기공에 전류가 흐를 수 있을 만큼 주파수가 충분히 높아 임피던스 위상의 크기가 증가되었다(도 6b). 임피던스 위상 크기의 증가율은 세포가 미세기공에 위치하였을 때 더 큰 것을 알 수 있다. The measurement results of the impedance of the cells using the microporous chip are shown in FIG. Impedance magnitudes at frequencies below 1 kHz were lower when measured without cells than when cells were present. However, the magnitude of the impedance at 1 kHz was small depending on the presence or absence of the cells (Fig. 6A). Impedance spectra at low frequencies when cells are absent are due to the resistance of the cell culture medium. On the other hand, the arc tangent of the reactance-toresistance ratio approaches 0 as the frequency decreases (Fig. 6B). Since the current flow at low frequencies is blocked by an insulating film, the pore structure is the largest factor affecting the measured impedance value. The increase in the impedance magnitude at low frequencies is due to the cell membrane of the single cell located in the micropores interrupting the current (Fig. 6A). The frequency was sufficiently high enough to allow current to flow through the micropores of the microporous chip, thereby increasing the magnitude of the impedance phase (Fig. 6B). It can be seen that the rate of increase of the impedance phase size is larger when the cells are located in the micropores.
세포가 없을 경우 10Hz에서 측정된 임피던스 크기의 평균 및 표준편차는 1050±29.7kΩ, HEK-293세포주인 경우 3360±18.3kΩ, C2C12세포주인 경우 2833.5±126.5kΩ, MCF-7세포주인 경우 2911.9±86.1kΩ이다.The mean and standard deviation of the measured impedance at 10 Hz were 1050 ± 29.7 kΩ, 3360 ± 18.3 kΩ for the HEK-293 cell line, 2833.5 ± 126.5 kΩ for the C2C12 cell line and 2911.9 ± 86.1 for the MCF-7 cell line, k.
또한, 1kHz에서 측정된 임피던스 위상은 세포가 없는 경우 43.01±0.2°, HEK-293세포주인 경우 54.1±0.1°, C2C12세포주인 경우 52.51±0.3°, MCF-7세포주인 경우 52.47±0.1°이다.The impedance phase measured at 1 kHz is 43.01 ± 0.2 ° in the absence of cells, 54.1 ± 0.1 ° in the HEK-293 cell line, 52.51 ± 0.3 ° in the C2C12 cell line and 52.47 ± 0.1 ° in the MCF-7 cell line.
정규화 임피던스의 크기 및 위상은 도 7에 도시하였다. 상기 결과에 따르면 측정된 임피던스 값은 미세기공에 위치한 세포의 유형에 의존한다는 것을 알 수 있다. 또한 임피던스 값은 세포의 크기, 세포의 모양, 세포막의 탄성정도에 의존한다는 것을 알 수 있다. The magnitude and phase of the normalized impedance are shown in Fig. It can be seen from the above results that the measured impedance value depends on the type of cell located in the micropores. Also, it can be seen that the impedance value depends on the size of the cell, the shape of the cell, and the elasticity of the cell membrane.
이상, 본 발명내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다. Having described specific portions of the present invention in detail, those skilled in the art will appreciate that these specific embodiments are merely preferred embodiments and that the scope of the present invention is not limited thereby. something to do. Accordingly, the actual scope of the present invention will be defined by the appended claims and their equivalents.
100 : 미세기공 칩 110 : 미세기공 멤브레인
120 : 기판 130 : 박막
500 : 미세유체칩 510 : 전극
520 : 유체채널 530 : 챔버100: microporous chip 110: microporous membrane
120: substrate 130: thin film
500: microfluidic chip 510: electrode
520: fluid channel 530: chamber
Claims (10)
상기 미세기공 칩은 미세기공이 형성되어 있는 미세기공 멤브레인을 특징으로 하고,
상기 미세기공 멤브레인은 질화규소(Si3N4) 멤브레인이고,
상기 미세기공은 직경 500 nm 내지 2μm 이고,
상기 미세기공의 하부에 형성되어 있으며, 미세기공방향으로 수렴하는 형태인 흡인조절구를 더 포함하고,
상기 흡인조절구의 수렴하는 각도는 기판에 대하여 54.74° 인 것을 특징으로 하는 미세기공 칩(sub-micropore chip).
In a sub-micropore chip capable of measuring the impedance of a single cell,
Wherein the microporous chip is characterized by a microporous membrane having micropores formed therein,
Wherein the microporous membrane is a silicon nitride (Si3N4)
The micropores have a diameter of 500 nm to 2 占 퐉,
Further comprising a suction control port formed in the lower portion of the micro pore and configured to converge in the micro pore direction,
Wherein the angle of convergence of the suction regulator is 54.74 relative to the substrate. ≪ RTI ID = 0.0 > 11. < / RTI >
상기 박막이 증착된 기판의 일 면에 패터닝하여 기판을 노출시키는 패터닝 단계;
상기 노출된 기판을 에칭하는 에칭단계;
상기 에칭 된 면에 박막을 증착시켜 멤브레인을 제조하는 제2증착단계; 및
상기 제조된 멤브레인에 미세기공을 형성시키는 미세기공 형성 단계를 포함하고,
상기 박막은 질화규소(Si3N4)이고,
상기 제1증착단계는 박막을 300 nm의 두께로 증착시키고,
상기 제2증착단계는 박막을 200 nm의 두께로 증착시키고,
상기 미세기공 형성 단계는 증착된 박막에 직경 500 nm 내지 2μm인 기공을 형성시키고,
상기 미세기공의 하부에 형성되어 있으며, 미세기공방향으로 수렴하는 형태인 흡인조절구를 더 포함하고,
상기 흡인조절구의 수렴하는 각도는 기판에 대하여 54.74° 인 것
는 것을 특징으로 하는 미세기공 칩(sub-micropore chip)의 제조방법.
A first deposition step of depositing a thin film on a substrate;
A patterning step of patterning the substrate on one side of the substrate on which the thin film is deposited to expose the substrate;
An etching step of etching the exposed substrate;
A second deposition step of depositing a thin film on the etched surface to produce a membrane; And
And forming fine pores in the prepared membrane,
The thin film is silicon nitride (Si 3 N 4)
The first deposition step deposits a thin film to a thickness of 300 nm,
The second deposition step deposits the thin film to a thickness of 200 nm,
The micropores may be formed by forming pores having a diameter of 500 nm to 2 탆 in the deposited thin film,
Further comprising a suction control port formed in the lower portion of the micro pore and configured to converge in the micro pore direction,
The converging angle of the suction regulator is 54.74 DEG with respect to the substrate
Wherein the micro-pores are formed on the substrate.
미세유체 칩의 유체 채널(fluidic channel)에 세포배양배지를 채우는 단계;
미세유체 칩의 챔버에 단일세포를 주입하는 단계;
흡인력을 조절하여 주입된 단일세포를 미세기공에 위치시키는 단계; 및
상기 미세기공에 위치한 단일세포의 임피던스를 측정하는 단계;를 포함하고,
상기 미세기공 칩(submicropore chip)은 미세기공이 형성되어 있는 미세기공 멤브레인을 포함하고,
상기 미세기공 멤브레인은 질화규소(Si3N4) 멤브레인인 것을 특징으로 하고,
상기 미세기공은 직경 500 nm 이고,
상기 미세기공의 하부에 형성되어 있으며, 미세기공방향으로 수렴하는 형태인 흡인조절구를 더 포함하고,
상기 흡인조절구의 수렴하는 각도는 기판에 대하여 54.74° 인 것을 특징으로 하고,
상기 단일세포의 임피던스를 측정하는 단계는 10 Hz 내지 10 kHz 주파수를 사용하여 임피던스 값을 측정하고,
상기 단일세포의 임피던스를 측정하는 단계에서 단일세포를 1kHz 이하의 주파수로 측정 시 세포없이 측정한 임피던스 값보다 낮은 임피던스 값을 확인 할 수 있는 것을 특징으로 하는 미세기공 칩을 이용한 단일세포(single cell)의 임피던스 측정방법.
Bonding a micropore chip comprising a microporous membrane to a microfluidic chip;
Filling a fluidic channel of a microfluidic chip with a cell culture medium;
Injecting a single cell into the chamber of the microfluidic chip;
Placing the injected single cells in the micropores by controlling the suction force; And
Measuring the impedance of the single cell located in the micropores,
Wherein the micropore chip comprises a microporous membrane having micropores formed therein,
Characterized in that the microporous membrane is a silicon nitride (Si 3 N 4)
The micropores have a diameter of 500 nm,
Further comprising a suction control port formed in the lower portion of the micro pore and configured to converge in the micro pore direction,
Wherein the converging angle of the suction regulator is 54.74 DEG with respect to the substrate,
The step of measuring the impedance of the single cell may include measuring an impedance value using a frequency of 10 Hz to 10 kHz,
Wherein the measurement of the impedance of the single cell is performed at a frequency of 1 kHz or less, and an impedance value lower than the impedance value measured without the cell can be confirmed. In the single cell using the microporous chip, / RTI >
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