KR101934951B1 - Novel White clover mottle virus gene from white clover plant - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 흰 토끼풀 모틀 바이러스(White clover mottle virus) 유전자, 상기 흰 토끼풀 모틀 바이러스유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포, 흰 토끼풀 모틀 바이러스 진단용 조성물 및 진단방법에 관한 것이다. The present invention relates to a white clover mottle virus gene comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, a recombinant vector comprising the white clover mottle virus gene and a host cell transformed with the recombinant vector, Compositions and methods of diagnosis.
기후 온난화에 따른 생태계 변화, 식물과 바이러스의 진화 및 변이, 그리고 농산물 교역 확대에 따라 돌발 바이러스 및 새로운 바이러스 병의 출현 및 위험도는 점차 높아지고 있다. 지금까지 보고된 식물 바이러스는 전 세계적으로 약 1,000여 종이 알려져 있으며, 아직까지도 여러 가지 식물에서 새로운 바이러스들이 지속적으로 보고되고 있다. 현재 우리나라에서는 약 100여 종의 바이러스가 여러 가지 식물에서 보고되어 있으나, 발생하는 바이러스에 대한 상세한 조사가 일부 작물에서만 이루어졌고, 대부분의 작물과 자연기주 잡초 식물에서는 단편적인 조사만 이루어져 있다. 그리하여 아직까지 많은 주요 작물과 잡초에서 어떤 바이러스 병이 발생하고 있는지 구체적으로 파악되지 못하고 있는 실정이다.The emergence and risk of emergent viruses and new viral diseases are increasing gradually due to ecosystem changes due to climate warming, evolution and variation of plants and viruses, and increased trade in agricultural products. About 1,000 plant viruses have been reported so far worldwide, and new viruses are still reported in various plants. At present, about 100 viruses have been reported in various plants in Korea, but detailed investigation of the viruses has been done only in some crops, and most of the crops and natural host weed plants have only a fragmentary investigation. Thus, it is not yet understood how many viral diseases are occurring in many major crops and weeds.
식물병이란 식물기주에 대한 병원균 또는 환경요인의 지속적인 영향의 결과로 나타난 기주세포와 조직의 기능이상으로서, 식물의 형태, 생리 등에 비정상적인 변화가 나타난 상태를 말하며, 그 결과 나타난 경제적 가치의 감소를 포함하기도 한다. 이러한 식물병을 일으키는 원인으로는 곰팡이(Fungi), 박테리아(Bacteria), 선충(Nematode), 마이코플라스마(Mycoplasma), 원생동물(Protozoa) 및 바이러스(Virus)가 있다. 그러나, 바이러스는 크기가 1㎛ 보다 작은 병원체로 광학현미경으로도 그 실체를 관찰할 수 없고, 전자현미경을 필요로 하기 때문에, 육안으로 식물체에 발생한 바이러스를 진단하는 것은 곤란하다. 따라서 이러한 바이러스를 진단하기 위한 유전자 연구에 대한 필요성이 있으며 특히 국내 자생 자연기주 식물에 대한 바이러스를 진단하기 위한 유전적 연구가 필요한 실정이다. 이 중 흰 토끼풀은 국내 전역에 자생하는 자연기주 식물로 이에 병을 유발하는 바이러스에 대한 연구가 필요함에도 아직까지 이에 대한 연구가 널리 이루어지지 않았다.Plant diseases are abnormalities of the host cells and tissues that result from the continued influences of pathogens or environmental factors on the plant host, including abnormalities in plant morphology, physiology, etc., resulting in a reduction in the resulting economic value It is also said. Causes of these plant diseases include fungi, bacteria, Nematode, Mycoplasma, protozoa and viruses. However, the virus is a pathogen having a size of less than 1 占 퐉 and its substance can not be observed even with an optical microscope, and since it requires an electron microscope, it is difficult to diagnose a virus that has developed in a plant with the naked eye. Therefore, there is a need for genetic studies to diagnose these viruses. In particular, genetic studies for diagnosing viruses against native host plants are needed. Among these, white clover is a native host plant native to the whole country, and it is necessary to study the virus causing the disease.
이에, 본 발명자들은 국내 전역에 자생하는 흰 토끼풀 식물에 감염된 식물 샘플을 대상으로 cDNA 라이브러리를 제작하였고, 이의 콘티그들을 근거로 제작된 프라이머 세트의 PCR 결과를 통해 염기서열을 확보하였다. 최종적으로 흰토끼풀에서 병을 유발하는 약 6.2 kb 크기의 신규한 흰 토끼풀 모틀 바이러스(White clover mottle virus) 유전자를 확인하여 본 발명을 완성하였다.Therefore, the present inventors prepared a cDNA library for plant samples infected with white shamrock plants native to the whole country, and obtained a PCR sequence of a primer set based on their contiguous nucleotide sequences. Finally, the present inventors confirmed the novel white clover mottle virus gene of about 6.2 kb in size, which causes disease in white clover .
따라서 본 발명의 목적은 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 흰 토끼풀 모틀 바이러스 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 벡터로 형질전환된 숙주세포, 흰 토끼풀 모틀 바이러스 감염 진단용 조성물 및 감염 진단 방법을 제공하는 것이다.Accordingly, an object of the present invention is to provide a method for screening a white shamrock mite virus gene comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, a recombinant vector containing the gene, a host cell transformed with the vector, .
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 흰 토끼풀 모틀 바이러스 유전자를 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a white shamrock mite virus gene comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1.
또한 본 발명은 상기 흰 토끼풀 모틀 바이러스 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.In addition, the present invention provides a recombinant vector comprising the white clover mottle virus gene.
또한 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.The present invention also provides a host cell transformed with the recombinant vector.
또한 본 발명은 상기 흰 토끼풀 모틀 바이러스 유전자를 검출하는 제제를 포함하는 흰 토끼풀 모틀 바이러스 감염 진단용 조성물을 제공한다.The present invention also provides a composition for detecting a white shamroot mottle virus infection comprising an agent for detecting the white shamrock mite virus gene.
또한 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 흰 토끼풀 모틀 바이러스 유전자를 검출하는 단계;를 포함하는 식물체 내 흰 토끼풀 모틀 바이러스 감염 진단 방법을 제공한다.The present invention also provides a method for detecting white shrapnel mottle virus infection in a plant, comprising detecting a white shamrock mite virus gene comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
본 발명의 흰 토끼풀 모틀 바이러스 유전자를 이용하면 흰 토끼풀 모틀 바이러스 감염여부의 진단이 가능하기 때문에 국내 농작물 또는 잡초에 발생하는 바이러스 병 발생 양상 모니터링 또는 조사에 투입하여 병 발생 예측에 활용할 수 있다. 특히 흰 토끼풀을 포함하는 숙주 식물체에 발생하는 병해에 대한 실체를 밝히고, 흰 토끼풀을 포함하는 숙주 식물 무병주 보급 및 품질 향상에 기여할 수 있다.Since the white shamrock mite virus gene of the present invention can be used to diagnose the infection of white shamrock mite virus, it can be used in the monitoring or investigation of the occurrence of viral disease occurring in domestic crops or weeds to be used for the prediction of disease occurrence. Especially, it is possible to clarify the reality of the disease occurring in the host plants including white shamrock, and to contribute to the improvement of the quality distribution and quality improvement of host plants including white shamrock.
도 1은 Chickpea chlorotic stunt virus CHN을 레퍼런스 시퀀스로 하여 흰 토끼풀 모틀 바이러스의 콘티그 위치를 정렬한 것을 나타낸 도이다.
도 2는 흰 토끼풀 모틀 바이러스 유전자를 모식화한 도이다.
도 3은 흰 토끼풀 모틀 바이러스 유전자 및 상기 바이러스 외피 단백질 영역을 증폭하여 바이러스를 프라이머 세트로 진단한 결과를 나타낸 도이다.FIG. 1 is a diagram showing alignment of the contiguous positions of white shrimp mottle virus using Chickpea chlorotic stunt virus CHN as a reference sequence.
Fig. 2 is a schematic diagram of the white shrapnel mottle virus gene.
FIG. 3 is a diagram showing the result of diagnosing a virus as a primer set by amplifying a white shamrock mite virus gene and the virus envelope protein region.
본 발명은 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 흰 토끼풀 모틀 바이러스 유전자를 제공한다.The present invention provides a white shamrock mite virus gene comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1.
이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
본 발명의 흰 토끼풀(Trifolium repens L.)은 콩과에 속하는 다년생으로서 줄기는 포복형이고 꼭지 끝에 흰무늬가 있는 3개의 소엽이 붙어 있는 목초를 말한다. The white shamrock ( Trifolium repens L.) is a perennial plant belonging to the soybean family. It is a herb with three lobules with a stalk and a white pattern at the tip of the nipple.
상기 흰토끼풀 식물 유래의 흰 토끼풀 모틀 바이러스 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 상기 염기 서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.The white shamrock mite virus gene derived from the white shrimp plant may be composed of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, but is not limited thereto, and the homologue of the nucleotide sequence is within the scope of the present invention. Specifically, the gene has a nucleotide sequence having a sequence homology of 70% or more, more preferably 80% or more, still more preferably 90% or more, and most preferably 95% or more, with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 . &Quot;% of sequence homology to polynucleotides " is ascertained by comparing the comparison region with two optimally aligned sequences, and a portion of the polynucleotide sequence in the comparison region is the reference sequence for the optimal alignment of the two sequences (I. E., A gap) relative to the < / RTI >
또한 본 발명은 흰 토끼풀 모틀 바이러스 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.The present invention also provides a recombinant vector comprising a white shamroot mottle virus gene.
본 발명에서 흰 토끼풀 모틀 바이러스 유전자 뉴클레오티드 서열은 재조합 벡터 내로 삽입될 수 있다. 용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "재조합 벡터"는 세균 플라스미드, 파아지, 효모 플라스미드, 식물 세포 바이러스, 포유동물 세포 바이러스, 또는 다른 벡터를 의미한다. 본 발명의 재조합 벡터는 바람직하게는 식물 발현 벡터이다. 본 발명의 재조합 벡터는 숙주 내에서 복제 및 안정화할 수 있다면 어떠한 플라스미드 및 벡터도 사용될 수 있다. In the present invention, the white clover mottle virus gene nucleotide sequence can be inserted into a recombinant vector. The term " vector " is used to refer to a DNA fragment (s), nucleic acid molecule, which is transferred into a cell. The vector replicates the DNA and can be independently regenerated in the host cell. The term " carrier " is often used interchangeably with " vector ". The term " recombinant vector " means a bacterial plasmid, a phage, a yeast plasmid, a plant cell virus, a mammalian cell virus, or other vector. The recombinant vector of the present invention is preferably a plant expression vector. Any plasmid and vector may be used as long as the recombinant vector of the present invention can be cloned and stabilized in the host.
상기 발현벡터의 중요한 특성은 복제 원점, 프로모터, 마커 유전자 및 번역 조절 요소 (translation control element)를 가지는 것이다. 진핵세포에서 이용가능한 번역 조절 요소인 인핸서 (enhancer), 리보솜 결합 부위, 종결신호, 폴리아데닐레이션 신호 및 프로모터는 당업계에 공지되어 있다. 상기 발현벡터는 당업계에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관 내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 mRNA 합성을 이끌기 위해 발현벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다.An important characteristic of the expression vector is that it has a replication origin, a promoter, a marker gene and a translation control element. Enhancers, ribosome binding sites, termination signals, polyadenylation signals, and promoters, which are available in eukaryotic cells, are well known in the art. The expression vector can be constructed by a method known in the art. Such methods include in vitro recombinant DNA technology, DNA synthesis techniques, and in vivo recombination techniques. The DNA sequence can be effectively linked to appropriate promoters in the expression vector to drive mRNA synthesis.
흰토끼풀 식물 유래의 흰 토끼풀 모틀 바이러스 유전자 서열 및 적당한 전사/번역 조절 신호를 포함하는 발현 벡터는 당업자에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관 내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 mRNA 합성을 이끌기 위해 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 또한 발현 벡터는 번역 개시 부위로서 리보좀 결합 부위 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다.Expression vectors comprising the white shamoto mottle virus gene sequence and suitable transcription / translation control signals from the shamrock plant can be constructed by methods known to those skilled in the art. Such methods include in vitro recombinant DNA technology, DNA synthesis techniques, and in vivo recombination techniques. The DNA sequence can be effectively linked to appropriate promoters in the expression vector to drive mRNA synthesis. The expression vector may also include a ribosome binding site and a transcription terminator as a translation initiation site.
발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 수 있다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자, aadA 유전자 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.The expression vector may preferably comprise one or more selectable markers. The marker is typically a nucleic acid sequence having a property that can be selected by a chemical method, and includes all genes capable of distinguishing a transformed cell from a non-transformed cell. Examples include herbicide resistance genes such as glyphosate or phosphinothricin, antibiotics such as kanamycin, G418, Bleomycin, hygromycin, chloramphenicol, Resistant gene, aadA gene, and the like, but are not limited thereto.
본 발명에 따른 식물 발현 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. In the plant expression vector according to the present invention, the promoter may be CaMV 35S, actin, ubiquitin, pEMU, MAS or histone promoter, but is not limited thereto. The term " promoter " refers to the region of DNA upstream from the structural gene and refers to a DNA molecule to which an RNA polymerase binds to initiate transcription. A " plant promoter " is a promoter capable of initiating transcription in plant cells. A " constitutive promoter " is a promoter that is active under most environmental conditions and developmental conditions or cell differentiation. Constructive promoters may be preferred in the present invention because the choice of transformants can be made by various tissues at various stages.
본 발명에 따른 식물 발현 벡터에서, 터미네이터는 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제 (NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린 (phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 튜머파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인 (Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.In the plant expression vector according to the present invention, the terminator can be a conventional terminator such as nopaline synthase (NOS), rice α-amylase RAmy1 A terminator, phaseoline terminator, Agrobacterium tumefaci Agrobacterium and the terminator of the Octopine gene of Tumefaciens, but the present invention is not limited thereto.
또한 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.The present invention also provides a host cell transformed with the recombinant vector.
본 발명의 벡터를 원핵세포에 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다.Any host cell known in the art may be used as the host cell capable of continuously cloning and expressing the vector of the present invention in a stable and prokaryotic cell, for example, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1 , E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, Bacillus subtilis, Bacillus tulifene, and Salmonella typhimurium, Serratia marcesensus and various Pseudomonas species And enterobacteria and strains such as the species.
또한, 본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충세포, 사람세포 (예컨대, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물세포 등이 이용될 수 있다. 숙주세포는 바람직하게는 식물세포이다.When the vector of the present invention is transformed into eukaryotic cells, yeast (Saccharomyce cerevisiae), insect cells, human cells (for example, Chinese hamster ovary, W138, BHK, COS-7, 293 , HepG2, 3T3, RIN and MDCK cell lines) and plant cells. The host cell is preferably a plant cell.
본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl2 방법, 하나한 방법(Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기천공 방법 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리법, 및 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.The method of delivering the vector of the present invention into a host cell can be carried out by the CaCl 2 method, one method (Hanahan, D., J. MoI. Biol., 166: 557-580 (1983)) when the host cell is a prokaryotic cell, And an electric drilling method or the like. When the host cell is a eukaryotic cell, the vector is injected into the host cell by microinjection, calcium phosphate precipitation, electroporation, liposome-mediated transfection, DEAE-dextran treatment, and gene bombardment .
또한 본 발명은 흰 토끼풀 모틀 바이러스 유전자를 검출하는 제제를 포함하는 흰 토끼풀 모틀 바이러스 감염 진단용 조성물을 제공한다.The present invention also provides a composition for detecting a white shamroot mottle virus infection comprising a preparation for detecting a white shamrock mottle virus gene.
본 발명의 흰 토끼풀 모틀 바이러스 유전자를 검출하는 제제는 흰 토끼풀 모틀 바이러스 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브인 것을 특징으로 할 수 있다. 또한 상기 조성물은 반응 증폭 혼합물을 더 포함할 수 있으며, 반응 증폭 혼합물은 증폭 반응을 수행하기에 필요한 시약, 열 안정성 DNA 중합효소, 데옥시뉴클레오티드, 뉴클레아제가 없는 멸균수 및 2가 금속 양이온을 함유하는 용액 등을 지칭하며, 바람직하게는 반응 완충액, 데옥시뉴클레오티드, DNA 중합효소를 포함할 수 있다. The agent for detecting the white clover mottle virus gene of the present invention may be a primer or a probe that specifically binds to the white clover mottle virus gene. The composition may further comprise a reaction amplification mixture, wherein the reaction amplification mixture contains a reagent necessary for performing an amplification reaction, a thermostable DNA polymerase, a deoxynucleotide, a sterile water without nucleases, and a divalent metal cation Or the like, and preferably includes a reaction buffer, a deoxynucleotide, and a DNA polymerase.
본 발명의 프로브를 사용할 경우, 프로브의 말단에 형광 물질 등의 리포터를 표지(labeling)할 수 있다.When the probe of the present invention is used, a reporter such as a fluorescent substance can be labeled at the end of the probe.
본 발명에서 용어 "프라이머"는 짧은 자유 3 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 핵산의 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 핵산 주형의 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다.The term " primer " in the present invention is a nucleic acid sequence having a short free 3 'hydroxyl group, capable of forming base pairs with a template of a complementary nucleic acid, Lt; RTI ID = 0.0 > nucleic acid < / RTI > The primer can initiate DNA synthesis in the presence of reagents and four different nucleoside triphosphates for polymerization reactions (i. E., DNA polymerase or reverse transcriptase) at appropriate buffer solutions and temperatures.
상기 프라이머 설계시, 프라이머의 A, G, C, T 함량비, 프라이머 결합체(dimer) 형성 방지, 같은 염기서열의 3회 이상 반복금지 등 여러 가지 제약이 따르며, 그 외에 단독 PCR 반응조건에 있어서 주형(template) DNA의 양, 프라이머의 농도, dNTP의 농도, Mg2 +의 농도, 반응온도, 반응시간 등의 조건이 적정해야 한다.In the design of the primer, there are various restrictions such as a ratio of A, G, C and T content of the primer, prevention of formation of a primer complex (dimer) and repetition of the same base sequence three times or more. the conditions such as the amount of template DNA, the concentration of the primer, the concentration of dNTP, the concentration of Mg 2 + , the reaction temperature, and the reaction time should be appropriate.
상기의 프라이머는 기본 성질을 변화시키지 않은 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 즉 핵산 서열이 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형될 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 뉴클레오타이드의 하나 이상의 동족체로의 치환 및 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트 또는 카바메이트 등의 하전되지 않은 연결체나 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트 등의 하전된 연결체로의 뉴클레오타이드의 변형이 가능하다. 또한 핵산은 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그날 펩타이드, 폴리 L 리신 등의 단백질, 아크리딘 또는 프소랄렌 등의 삽입제, 금속, 방사성 금속, 철 산화성 금속 등의 킬레이트화제 및 알킬화제 등의 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기를 가질 수 있다.Such primers may incorporate additional features that do not alter the basic properties. I.e. the nucleic acid sequence can be modified using many means known in the art. Examples of such modifications include, but are not limited to, methylation, capping, substitution of one or more nucleotides into nucleotides, and uncharged linkages such as phosphonates, phosphotriesters, phosphoramidates or carbamates, phosphorothioates or phosphorodithioates Or the like can be transformed into a charged nucleus. The nucleic acid may be at least one of a protein such as a nuclease, a toxin, an antibody, a signal peptide, a poly-L-lysine, an intercalating agent such as acridine or psoralen, a chelating agent such as a metal, a radioactive metal, And may have additional covalently bonded moieties.
또한 본 발명의 프라이머 서열은 검출 가능한 시그날을 직접적 또는 간접적으로 제공할 수 있는 표지를 이용하여 변형시킬 수 있다. 상기 프라이머는 분광학, 광화학, 생화학, 면역화학 또는 화학적 수단을 이용하여 검출 될 수 있는 표지를 포함할 수 있다. 유용한 표지는 32P, 형광 염료, 전자 밀집 시약, 효소(일반적으로 ELISA 에 이용되는 것), 바이오틴 또는 합텐 및 항혈청 또는 단일클론성 항체가 이용가능한 단백질을 포함한다.The primer sequences of the present invention can also be modified using a label that can directly or indirectly provide a detectable signal. The primers can include labels that can be detected using spectroscopic, photochemical, biochemical, immunochemical or chemical means. Useful labels include 32P, fluorescent dyes, electron dense reagents, enzymes (commonly used in ELISA), biotin or haptens, and proteins that are available for antisera or monoclonal antibodies.
본 발명의 프라이머는 적절한 서열의 클로닝 및 제한효소 분해 및 나랭(Narang)등의 포스포트리에스테르 방법(1979, Meth, Enzymol. 68:90-99), 보카지(Beaucage)등의 디에틸포스포라미다이트 방법(1981, Tetrahedron Lett. 22: 1859-1862), 및 미국 특허 제 4458066호의 고형물 지지 방법과 같은 직접적인 화학적 합성법을 포함하는 임의의 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다.The primers of the present invention can be prepared by cloning and restriction cleavage of appropriate sequences and digestion with restriction enzymes such as the phosphotriester method of Narang et al. (1979, Meth, Enzymol. 68: 90-99), diethylphosphoramidate Including, for example, direct chemical synthesis methods, such as the solid support method of Tetrahedron Lett. 22: 1859-1862 (1981), and the solid support method of US 4458066.
본 발명의 바이러스 유전자를 검출하는 제제는 서열번호 18 및 서열번호 19로 표시되는 염기서열을 포함하는 흰 토끼풀 모틀 바이러스 감염 진단용 프라이머 세트를 포함할 수 있으며, 또는 서열번호 20 및 서열번호 21로 표시되는 염기서열을 포함하는 흰 토끼풀 모틀 바이러스 감염 진단용 프라이머 세트를 포함할 수 있다. 서열번호 20 및 서열번호 21로 표시되는 프라이머 세트는 흰토끼풀 모틀 바이러스의 외피단백질(CP)을 검출할 수 있는 프라이머 세트이다. 상기 프라이머 세트를 이용하면 흰토끼풀 모틀 바이러스와 같은 속에 속하는 Polerovirus에 감염된 시료로부터 흰 토끼풀 모틀 바이러스만을 특이적으로 검출할 수 있다.The agent for detecting a viral gene of the present invention may comprise a primer set for the detection of a white shamrock mite virus infection comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 18 and SEQ ID NO: 19, And a primer set for the detection of a white shamroot virus infection including a base sequence. The primer set set forth in SEQ ID NO: 20 and SEQ ID NO: 21 is a primer set capable of detecting the coat protein (CP) of the white shamroot virus. Using the primer set, only the white shrapnel mottle virus can be specifically detected from Polerovirus -infected samples belonging to the genus such as white shrimp mottle virus.
본 발명에서 제작하여 사용한 프라이머 세트는 하기 표 1 및 2와 같다.The primer sets manufactured and used in the present invention are shown in Tables 1 and 2 below.
[표 1] [Table 1]
[표 2][Table 2]
또한 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 흰 토끼풀 모틀 바이러스 유전자를 검출하는 단계;를 포함하는 식물체 내 흰 토끼풀 모틀 바이러스 감염 진단 방법을 제공한다.The present invention also provides a method for detecting white shrapnel mottle virus infection in a plant, comprising detecting a white shamrock mite virus gene comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
본 발명의 흰 토끼풀 모틀 바이러스 감염 진단 방법은 식물체 내 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 바이러스 유전자의 존재를 확인함으로써 흰 토끼풀 모틀 바이러스 감염 여부를 진단하는 방법을 말한다. 바람직하게는 본 발명의 흰 토끼풀 모틀 바이러스 감염 진단 방법은 서열번호 18 및 서열번호 19로 표시되는 염기서열 또는 서열번호 20 및 서열번호 21로 표시되는 염기서열을 포함하는 흰 토끼풀 모틀 바이러스 감염 진단용 프라이머 세트를 사용하여 바이러스를 검출하는 방법일 수 있다.The method of the present invention for diagnosing a white shamrock mite virus infection refers to a method for diagnosing whether a white shamrock mite virus is infected by confirming the presence of a viral gene consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 in a plant. Preferably, the method for diagnosing infectious white poultry virus infection according to the present invention comprises the step of detecting the infection with a primate set of a primate set for the detection of P. shorelin virus infection comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 18 and SEQ ID NO: 19 or the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: And the like.
본 발명에 따른 흰 토끼풀 모틀 바이러스 진단 방법을 수행함에 있어, 바람직하게는 프라이머 세트의 농도를 7 내지 13 pmol/㎕로 사용할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 10 pmol/㎕으로 사용할 수 있다. In carrying out the method of diagnosing white bladder mottle virus according to the present invention, the concentration of the primer set may be preferably 7 to 13 pmol / μl, more preferably 10 pmol / μl.
또한 RT-PCR을 수행함에 있어, 50℃에서 30분 동안 역전사하는 단계; 95℃에서 10분의 변성 단계; 95℃에서 30초간 반응시킨 다음 55℃에서 30초간 반응 후 72℃에서 1분간 증폭시키는 단계를 포함하며 본 단계를 35 사이클을 반복하고, 마지막으로 72℃에서 5분 동안 최종적으로 신장(elongation)시키는 단계를 수행할 수 있다.Also, in performing RT-PCR, reverse transcription was performed at 50 캜 for 30 minutes; Denaturation step at 95 DEG C for 10 minutes; Reacting at 95 ° C for 30 seconds, then reacting at 55 ° C for 30 seconds, and then amplifying at 72 ° C for 1 minute. This step is repeated 35 cycles and finally elongated at 72 ° C for 5 minutes Step can be performed.
본 명세서에서 달리 정의되지 않은 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것이다.Terms not otherwise defined herein have meanings as commonly used in the art to which the present invention belongs.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to examples. However, the following examples are illustrative of the present invention and are not intended to limit the scope of the present invention.
실시예Example 1. 흰 토끼풀 1. white shamrock 모틀Motley 바이러스 동정 Virus identification
1.11.1 샘플의 수득 및 흰 토끼풀 The yield of the sample and the white shamrock 모틀Motley 바이러스의 총 RNA 추출 Total RNA extraction of virus
경상북도 청도군 복숭아시험장 유전자포 주변에 자생하는 식물에 감염된 식물 바이러스를 분리·동정하기 위하여, 흰토끼풀 2점과 다른 식물체 5점을 수득하였다. 상기 식물 시료는 각각 액체 질소를 이용하여 마쇄하였다. 마쇄한 모든 시료는 초저온냉동고에서 보관하였다. 마쇄한 각각의 샘플을 동량으로 혼합한 후 Easy-Spin Total RNA extraction Kit(iNtRON Biotechnology)를 이용하여 총 RNA를 추출하였다.Two white shamrock and five other plants were obtained in order to isolate and identify the plant virus infected with the plant native to the genus of the peach test site of Cheongdo-gun, Gyeongbuk province. The plant samples were each ground using liquid nitrogen. All samples were stored in a cryogenic freezer. Total RNA was extracted with Easy-Spin Total RNA Extraction Kit (iNtRON Biotechnology) after mixing the same amount of each sample in the same amount.
1.2 RNA 1.2 RNA 시퀀스의Sequence of 분석, cDNA 라이브러리 제작 Analysis, cDNA library production
추출된 총 RNA에서 Ribo-ZeroTM Magnetic Kit (plant leaf) (Epicentre)를 이용하여 리보솜 RNA를 제거하였다. 준비된 RNA는 짧은 단편으로 파쇄한 후, 이중 가닥 cDNA로 합성하였고, 합성된 이중 가닥 cDNA는 말단 수정(end-repair)하여 라이브러리 제작에 요구되는 클로닝을 위해서 어댑터(adapter)를 붙였다. 이러한 일련의 과정은 TrueqRNA 샘플 프렙 키트 (Illumina)를 이용하여 수행하였으며, BluePippin™ 2% 아가로스 겔 카세트(Sage Science)를 이용하여 정제된 적당한 크기의 삽입 DNA(insert DNA)를 PCR 증폭을 위해서 선발하였다. 최종적으로 라이브러리 제작에 적합한 삽입 DNA의 크기 및 양/질을 Agilent 2100 BioAnalyzer 2100 (Agilent Technologies)를 이용하여 측정하였다. cDNA 라이브러리의 절편 크기는 대략 350-450bp라는 것을 확인하였다. Illumina HiSeq2500을 이용하여 라이브러리를 시퀀싱 하였으며, 페어-엔드 시퀀싱(paired-end sequencing) 방법을 이용하여 약 5 Gbp의 로우 데이터(raw data)를 생성하였다.Ribosomal RNA was removed from the extracted total RNA using Ribo-Zero ™ Magnetic Kit (plant leaf) (Epicenter). The prepared RNA was disrupted with short fragments and synthesized with double-stranded cDNA. The synthesized double-stranded cDNA was end-repaired and an adapter was attached for the cloning required for library production. This series of steps was performed using a TrueqRNA sample prep kit (Illumina), and an appropriate size purified insert DNA (purified by
1.3 식물 바이러스 관련 1.3 Plant Virus Related 콘티그(contig)의Contiguous 제작 making
로우 데이터에서 양질의 데이터를 선발한 후, 데노보 합성 전사체 분석(de novo transcriptome analysis) 방법을 통해 식물 바이러스 관련 리드(reads)를 확보하여 콘티그를 제작하였다. 콘티그의 길이가 너무 짧거나(<200bp), 바이러스 관련 데이터베이스(DataBase)에서 비교했을 때 적용범위(coverage)가 낮은 데이터는 제거하여 최종 약 400여개의 콘티그를 확보하였다.After selecting good data from the raw data, plant virus-related readings were obtained through a de novo transcriptome analysis method to construct contigs. When the length of the conti is too short (<200bp), data with low coverage is removed when compared with a virus database (DataBase), and finally about 400 contigs are obtained.
1.4 1.4 프라이머primer 제작 및 바이러스 전체 게놈 Genome and virus genome 시퀸스Sequence 규명 Identification
바이러스의 전체 유전자의 시퀀스를 알아내기 위해서 실시예 4에서 수득한 콘티그를 바이러스 관련 데이터베이스(DataBase)의 염기서열 유사도 검사를 통하여 가장 상동성이 높은 바이러스를 확인하는 단계를 수행하였다. Chickpea chlorotic stunt virus CHN isolate(CpCSV, NCBI GenBank accession no.JF507725)에 높은 상동성을 보이는 4개의 콘티그를 확인하여 CpCSV 바이러스를 레퍼런스 시퀀스(reference sequence)로 하여 콘티그 위치를 정렬하였으며, 이를 도 1에 나타내었다.In order to find the sequence of the entire gene of the virus, the step of confirming the most homologous virus was performed through the nucleotide sequence similarity test of the virus-related database (DataBase) obtained in Example 4. The four contigs showing high homology to Chickpea chlorotic stunt virus CHN isolate (CpCSV, NCBI GenBank accession no. JF507725) were identified and the contig position was aligned using the CpCSV virus as a reference sequence. Respectively.
또한, 상기 콘티그의 염기서열을 바탕으로 프라이머를 제작하고 이를 이용하여 7개의 식물 샘플을 대상으로 PCR을 수행하였다. 아가로스 겔 전기영동을 통해서 밴드를 확인하고, 밴드가 확인된 PCR 산물은 시퀀싱하여 염기서열을 확인하였다. 콘티그를 근거로 제작된 프라이머 세트의 PCR 결과를 통해서 얻어진 염기서열을 바탕으로 다시 프라이머를 제작하여 추가의 염기서열을 확보하였으며, 바이러스의 전체 게놈 결정에 사용된 프라이머를 표 3에 나타내었다.In addition, a primer was prepared based on the nucleotide sequence of the contig, and PCR was performed on 7 plant samples using the primer. The band was confirmed by agarose gel electrophoresis and the sequence of the PCR product confirmed by band was sequenced to confirm the base sequence. Based on the nucleotide sequence obtained from the PCR result of the primer set based on the contig, another primer was prepared based on the obtained nucleotide sequence to obtain an additional base sequence, and the primers used for the whole genome crystal of the virus are shown in Table 3.
[표 3][Table 3]
1.5 새로운 식물 바이러스의 염기서열 동정1.5 Identification of the Nucleotide Sequence of a New Plant Virus
실시예 5에서 제작된 프라이머 세트의 PCR 결과를 통해서 얻어진 바이러스 염기서열을 규명하였으며, 이를 서열번호 1과 도 2에 나타내었다. The viral sequences obtained through PCR of the primer set prepared in Example 5 were identified and are shown in SEQ ID NO: 1 and FIG.
상기 바이러스는 약 6.2 kb의 (+) 단일-가닥 RNA 게놈((+) single-stranded RNA genome)이며, 모든 암호화 된 단백질(Open Reading Frame, ORF)의 염기서열이 다른 Polerovirus 속에 속하는 바이러스들과 10% 이상 차이를 보이므로 국제 바이러스 분류위원회(International Committee on Taxonomy of Viruses, ICTV)의 종 분류 기준에 따라 신종바이러스로 동정하였다. 본 바이러스 이름은 흰 토끼풀 모틀 바이러스(White clover mottle virus, WClMoV)로 명명하였다. The virus is approximately 6.2 kb (+) single-stranded RNA genome, ((+) single-stranded RNA genome) , and the base sequences of all the encoded protein (Open Reading Frame, ORF) other Polerovirus The virus was identified as a new virus according to the classification standard of the International Committee on Taxonomy of Viruses (ICTV). This virus was named White clover mottle virus (WClMoV).
실시예Example 2. 흰 토끼풀 2. White shamrock 모틀Motley 바이러스의 진단 Diagnosis of virus 프라이머의Primer 제작 및 진단의 수행 Performing production and diagnosis
최종 결정된 염기서열을 바탕으로 흰 토끼풀 모틀 바이러스를 진단하기 위한 프라이머를 제작하였다. 구체적으로, 외피단백질(coat protein, CP) 영역을 증폭시킬 수 있는 진단 프라이머를 제작하였으며, 동시에 최종 결정된 CP 유전자 염기서열은 NCBI GenBank에 등록하였다. 흰토끼풀 모틀 바이러스 염기서열 프라이머의 서열을 표 1에 나타내었으며, 상기 바이러스의 외피단백질(CP) 프라이머를 표 2에 나타내었다.Based on the determined base sequence, a primer for diagnosing white shrimp mottle virus was constructed. Specifically, a diagnostic primer capable of amplifying the coat protein (CP) region was prepared, and at the same time, the finally determined CP gene sequence was registered in NCBI GenBank. The sequences of the white clover mottle virus sequence primers are shown in Table 1, and the envelope protein (CP) primers of the viruses are shown in Table 2.
[표 1] [Table 1]
[표 2][Table 2]
상기 최종 결정된 프라이머를 통해 같은 Polerovirus속 감염된 시료로부터 흰 토끼풀 모틀 바이러스만을 특이적으로 검출할 수 있는지를 확인하기 위하여 RT-PCR을 수행하였으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다. RT-PCR was performed to confirm whether only the white shrapnel mottle virus could be specifically detected from the same Polerovirus- infected sample through the above-mentioned final determined primer. The results are shown in FIG.
멀티플렉스 RT-PCR은 Genetbio suprimescript RT-PCR premix SR-8000 (GeNeTBio Inc., 한국)에 의해 수행되었다. RT-PCR premix SR-8000 (GeNeTBio Inc., Korea) 10 ㎕에 바이러스에 대한 정방향/역방향 프라이머를 농도 10 pmol/㎕로 각각 1 ㎕씩 넣고 DNase/RNase-free water 7 ㎕ 및 주형 Total RNA 1 ㎕를 추가하여 최종 반응액 20㎕를 조성으로 하여 RT-PCR을 수행하였다. Multiplex RT-PCR was performed by Genetbio suprimescript RT-PCR premix SR-8000 (GeNeTBio Inc., Korea). To each 10 μl of RT-PCR premix SR-8000 (GeNeTBio Inc., Korea), add 1 μl of the forward / reverse primer to the concentration of 10 pmol / μl and add 7 μl of DNase / RNase-free water and 1 μl of template total RNA And RT-PCR was performed using 20 μl of the final reaction solution as a composition.
RT-PCR은 하기와 같은 조건으로 수행하였다. 50℃에서 30분 동안 역전사하는 단계 후, 95℃에서 10분의 변성 단계를 수행하였다. 이후, 95℃에서 30초간 반응시킨 다음 55℃에서 30초간 반응 후 72℃에서 1분간 증폭시키는 단계를 35 사이클을 수행하고 최종적으로 72℃에서 5분 동안 연장시키는 단계를 수행하였다.RT-PCR was performed under the following conditions. After a reverse transcription step at 50 DEG C for 30 minutes, a denaturation step at 95 DEG C for 10 minutes was performed. Thereafter, the reaction was carried out at 95 ° C for 30 seconds, followed by 30 seconds at 55 ° C, followed by 1 minute at 72 ° C, followed by 35 cycles and finally extension at 72 ° C for 5 minutes.
RT-RCR 실험을 수행 후, 1% 아가로즈 겔에서 100V로 40분 동안 전기영동을 수행하여, 증폭물을 확인하였다.After performing the RT-RCR experiment, electrophoresis was performed on 1% agarose gel at 100 V for 40 minutes to confirm the amplification.
M은 마커이며, 레인 1은 BWYV (Beet western yellows virus), 레인 2는 PDMV(Panicum distortion mosaic virus), 레인 3은 SeYDV(Setaria yellow dwarf virus), 레인 4는 CABYV(Cucurbit aphid-borne yellows virus), 레인 5는 PLRV(Potato leafroll virus), 레인 6은 BVG(Barley virus G), 레인 7은 WClMoV(White clover mottle virus)에 감염된 시료의 실험결과를 나타내었다.M is a marker,
도 3에서 나타난 바와 같이, 각각의 바이러스들이 모두 같은 Polerovirus속에 속한 바이러스이나 본원 발명의 상기 프라이머들을 통한 진단방법을 통하면 흰토끼풀 모틀 바이러스와 같은 속에 속하는 Polerovirus에 감염된 시료로부터 흰 토끼풀 모틀 바이러스만을 높은 특이성으로 진단할 수 있음을 확인하였다.As shown in FIG. 3, the viruses belonging to the same genus Polerovirus or the diagnostic methods of the primers of the present invention can be used to detect only the white shrimp mottle virus from the Polerovirus -infected samples belonging to the genus such as white shrimp mottle virus And the diagnosis was made.
<110> Kyungpook National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Novel White clover mottle virus gene from white clover plant <130> 1-297 <160> 21 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 6205 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> white clover mottle virus <400> 1 caaaagaaag atagagggaa gctttgctgc tttagcgcaa gtttatgaat ttcttgatca 60 acaatcaaaa ttcacgaatc gaattaactt tttcgaactc tctttctcta gatacaagaa 120 gatctttaac tgctcttttc ctaatctcag cagagcagta tttacaaatt tctcacgagc 180 aacatggcac ccaaaatagc gttgcttatt gctctcttct tgtctgctcc ttttctactc 240 gggggattca atttccgaga tggcaaactt gtcatcccct cgagttcgag aaatcgccac 300 cgttacgagc tcttccgaga gcttttggcg agggagaatt ttgcattctc tcctcctctg 360 aaaatggagc ggctgaatta tactccccca atccaaattc ctgtcacaga gcaaacttat 420 atagacttac ttacagctct ttggcagaag gcctacctag atatccagaa atatttgggt 480 acggcacttc attcatccaa acactcattg gctcatatat tagaaaaatc gagcgaggtg 540 ttttcttcct gcgtccagtc tttcctatgg gcgatagtct tggtgtggac ttacgcactt 600 tgggttttct gctactggac 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Non-Patent Citations (3)
Title |
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McKirdy, S. J. 등. 1998. Annals of applied biology. vol. 132, no. 1, pp. 91-105. |
White clover mottle virus genomic RNA, complete genome, strain: CD, GenBank: LC192169.1, 2016.11.02.* |
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