KR101923815B1 - Measurement method for microoriganism concentration using chromaticity measure - Google Patents
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Abstract
본 발명은 미생물의 농도를 실시간으로 측정하기 위해 색도계(colorimeter)를 이용하는 방법으로 보다 상세하게는 미생물을 pH 지시약이 포함된 배양 배지에서 배양하는 동안 pH 변화로 인한 pH 지시약의 색변화를 측정하여 데이터베이스화하고 이를 이용해 색도 측정만으로 배양 배지 속의 미생물의 농도를 측정하는 방법이다. 일반적으로 미생물의 살균 여부를 확인하기 위해 하루 이상 장시간의 시간이 요구되는 대신 본 발명은 수 시간 이내로 빠르게 미생물의 개체수 파악이 가능하므로 일정 수준의 미생물 배양이나 신속한 살균 정도 파악을 필요로 하는 다양한 분야에 활용이 가능하다.The present invention relates to a method of using a colorimeter to measure the concentration of a microorganism in real time, and more particularly, to a method of measuring a color change of a pH indicator due to a pH change during culturing a microorganism in a culture medium containing a pH indicator, And measuring the concentration of the microorganism in the culture medium by only measuring the chroma using this. In general, it takes a long time more than one day to check whether microbes are sterilized. Instead, the present invention can quickly grasp the number of microbes within a few hours, so that they can be cultivated in various fields requiring a certain level of microbial cultivation or rapid disinfection It is available.
Description
본 발명은 미생물의 농도를 실시간으로 측정하기 위해 색도계(colorimeter)를 이용하는 방법으로 보다 상세하게는 배양 배지에 미생물을 배양하는 동안 pH 변화로 나타나는 pH 지시약의 색변화와 개체수 변화를 배양 시간에 따라 측정하여 수치화한 데이터를 이용하여 미지의 미생물의 농도를 색도 측정만으로 수 시간 이내로 빠르게 식별하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method of using a colorimeter to measure the concentration of microorganisms in real time, and more particularly, to a method of measuring color change and population change of a pH indicator represented by a pH change during culturing a microorganism on a culture medium, The present invention also relates to a method for quickly identifying the concentration of an unknown microorganism within a period of several hours using only chromaticity measurement using data obtained by quantification.
최근 신종 바이러스를 비롯한 다양한 균주들의 등장으로 인해 인간의 건강을 위협하고 있다. 하지만 매우 낮은 농도의 균주들은 기하급수적으로 개채수가 증식되기 때문에 신속하게 미생물의 개체수를 파악하는 등 균주의 오염을 방지하기 위한 필요성이 요구되고 있다.Recently, the emergence of a variety of new strains, including viruses, are threatening human health. However, since very low concentrations of the strains grow exponentially in number, the need to prevent the contamination of the strains, such as rapid identification of the number of microorganisms, is required.
균주들의 오염농도를 측정하기 위해서 일반적으로 도말 평판법(spread plate method)을 활용하는데 균주가 포함된 일정량의 액상을 한천배지에 도말하고 균주의 온도 및 습도 등 일정 환경조건을 유지한 상태에서 일정 시간이 지난 후에 균주의 개체수를 측정함으로써 오염농도를 측정하는 방법이지만 고농도의 개체수를 도말할 경우 균주의 집락수(colony)를 세기 위해 희석과정을 거쳐야하므로 48시간 혹은 일주일 이상이 소요되는 번거러움이 존재했다.In order to measure the contamination concentration of the strains, a spread plate method is generally used. A certain amount of the liquid containing the strain is applied to the agar medium, and a predetermined time is maintained in a state where the temperature and humidity of the strain are maintained, However, when the population of high concentration is smeared, it has to be diluted to increase the colony number of the strain. Therefore, there is a problem that it takes more than 48 hours or more than a week.
또 다른 방법으로는 혼탁도 측정법(turbidity)으로 분광광도계와 광원을 이용하여 흡광도(optical density, O.D)를 측정하는 방법이 있다. 이러한 혼탁도 측정법은 쉽고 빠르며 시료의 파괴와 훼손이 일어나지 않는 장점을 가지고 있으나, 죽은 개체수가 함께 포함될 수 있기 때문에 정확한 측정법이라고 하기는 어렵다.Another method is to measure the optical density (OD) using a spectrophotometer and a light source with turbidity measurement. This turbidity measurement method is easy and quick, and has the advantage of not causing destruction or destruction of the sample, but it is difficult to say that it is an accurate measurement method because the dead population can be included together.
액체 시료 속의 세포나 개체수를 측정하는 방법으로 레이저빔, 형광염색약을 이용하여 세포에 레이저광을 쬐여 방사되는 형광과 산란광을 분석하여 농도를 정밀하게 측정하는 유동세포계수기(flow cytometer)이 존재하지만, 이는 정밀한 장비 구성으로 장비 도입 및 측정 시 비용이 많이 요구된다.There is a flow cytometer that measures the concentration and fluorescence of a cell by irradiating a laser beam to a cell using a laser beam or a fluorescent dye, This is a precise equipment configuration, which is expensive to introduce and measure.
상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명은 기존에 알려진 균주들의 개체수를 수 시간 이내로 신속하게 파악하기 위한 방법으로 pH에 따라 변색되는 pH 지시약을 이용하여 미생물 농도별 색변화 및 개체수 변화를 측정하여 데이터베이스화 시켜놓고, 측정 대상 미생물의 배양액의 색도를 측정하여 기존의 저장된 데이터베이스와 비교만으로도 개체수의 농도를 신속하게 파악 가능한 색도 측정을 이용한 미생물 농도 측정 방법을 제공하는 데 그 목적이 있다.In order to solve the above problems, the present invention provides a method for quickly grasping the population of known strains in a few hours, using a pH indicator which is discolored according to pH, The present invention provides a method of measuring the concentration of microorganisms by measuring the chromaticity of the culture medium of the microorganism to be measured and measuring the chromaticity of the microorganism by which the concentration of the microorganism can be quickly detected even when compared with the existing stored database.
상기와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명의 색도 측정을 이용한 미생물의 색변화 측정 방법(S100)은 배양 배지 포함된 미생물의 pH에 따른 색변화를 측정하는 것으로서, 농도별로 희석한 미생물 시료를 준비하는 준비 단계(S110), 배양 배지에서 상기 미생물 시료가 배양되면서 배양 시간별로 나타나는 pH 변화에 따른 변색되는 pH 지시약의 색을 색 측정 장치로 측정하는 색변화 측정 단계(S120), 상기 색변화 측정 단계(S120)를 통해 측정된 pH 지시약의 색의 색도 값으로 RGB 값으로 산출하는 색도 값 산출 단계(S130), 상기 색도 값 산출 단계(S130)를 통해 산출된 RGB 값과 배양 시간 사이의 상관관계를 나타내는 색변화 추세선을 미생물 농도별로 도출하는 색변화 추세선을 미생물 농도별로 도출하는 색변화 추세선 도출 단계(S140), 및 상기 색변화 추세선을 토대로 미생물 농도별 색변화 데이터베이스를 생성하고 저장하는 단계(S150)를 포함할 수 있다.In order to achieve the above object, the present invention provides a method for measuring color change of a microorganism using colorimetry (S100), which comprises measuring the color change of a microorganism containing a culture medium according to pH, A color change measuring step (S120) of measuring the color of the pH indicator, which is discolored according to a change in pH of the microorganism sample, S120), a chromaticity value calculation step (S130) of calculating a chromaticity value of a color of the pH indicator measured through the colorimetric value calculation step (S120), a correlation value between the RGB value calculated through the chromaticity value calculation step (S130) A color change trend line derivation step (S140) of deriving a color change trend line for deriving a color change trend line for each microorganism concentration, and a color change trend line Generating a biological concentrations color change database and may include a step (S150) of storing.
상기 준비 단계에서 미생물 시료의 농도는 1 내지 1010 CFU/ml 일 수 있다.In the preparation step, the concentration of the microorganism sample may be 1 to 10 10 CFU / ml.
상기 색변화 측정 단계(S120)에서 측정되는 pH 지시약의 색은 배양 배지에 pH 지시약이 첨가된 배양 배지의 색이거나, pH 지시약이 포함된 pH 검출지의 색일 수 있다.The color of the pH indicator measured in the color change measuring step (S120) may be the color of the culture medium to which the pH indicator is added in the culture medium, or the color of the pH indicator including the pH indicator.
상기 색 측정 장치는 RGB 카메라, DSLR(Digital Single Lens Reflex) 카메라 및 분광광도계(spectrophotometer) 중의 어느 하나 이상을 사용할 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.The color measuring apparatus may be any one or more of an RGB camera, a digital single lens reflex (DSLR) camera, and a spectrophotometer, but is not limited thereto.
그리고 pH 지시약(pH indicator)은 미생물 시료가 배양 배지에 배양됨으로써 발생되는 pH 변화에 대응하여 변색되는 물질이며, 구체적으로 알리지린 레드(Alizarin Red), 알리지린 엘로우(Alizarin Yellow), 알리지린 레드 에스(Alizarin Red S), E.Bogen, 브로모크레졸 그린(Bromocresol Green), 브로모크레졸 그린-클로로페놀 레드(Bromocresol Green-Chlorophenol Red), 브로모크레졸 그린-메틸 레드(Bromocresol Green-Methyl Red), 브로모크레졸 그린-메틸 엘로우(Bromocresol Green-Methyl Yellow), 브로모크레졸 퍼플(Bromocresol Purple), 브로모페놀 블루(Bromophenol Blue), 브로모티몰 블루(Bromothymol Blue), 브로모티몰 블루-페놀 레드(Bromothymol Blue-Phenol Red), 칼세인(Calcein), 칼콘(Calcon), 칼마지트(Calmagite), 칼 레드(Cal Red), 콩고 레드(Congo Red), 클로로페놀 레드(Chlorophenol Red), o-크레졸프탈레인(o-Cresolphthalene), 크레졸 레드(Cresol Red), 크레졸 레드-티몰 블루(Cresol Red-Thymol Blue), 크로마즈롤 에스(Cromazurol S), 커큐민(Curcumin), 2,5-디니트로페놀(2,5-Dinitrophenol), 2,6-디니트로페놀(2,6-Dinitrophenol), 디페닐아민 용액(Diphenylamine Solution), 디티존 알코올 용액(Dithizone Alcohol Solution), 에리오크롬 블랙 티(Eriochrome Black T), 하이드록시나프톨 블루(Hydroxynaphthol Blue), 라크모이드(Lacmoid), 메타닐 엘로우(Metanil Yellow), 메틸 오렌지(Methyl Orange), 메틸 오렌지-자일렌 시아놀 FF(Methyl Orange-Xylene Cyanol FF), 메틸 오렌지-자일렌 시아놀 FF-페놀프탈레인(Methyl Orange-Xylene Cyanol FF-Phenolphthalein), 메틸 오렌지-인디고 카민(Methyl Orange-Indigo Carmine), 메틸 레드(Methyl Red), 메틸 레드-메틸렌 블루(Methyl Red-Methylene Blue), 메틸 티몰 블루(Methyl Thymol Blue), 메틸 엘로우(Methyl Yellow), 내추럴 레드(Neutral Red; Dimethyl diaminophenasin chloride), 내추럴 레드-브로모티몰 블루(Neutral Red-Bromothymol Blue), 피크릴메틸 니트라민(Picrylmethyl nitramine), p-니트로페놀(p-Nitrophenol), 페놀프탈레인(Phenolphthalene), 페놀프탈레인-티몰프탈레인(Phenolphthalein-Thymolphthalein), 페놀 레드(Phenol Red), 푸아르리 블루 4B(Poirrier's Blue 4B), 피로카테콜 바이올렛(Pyrocatechol Violet), 1-(2-피리딜아조)-2-나프톨(1-(2-Pyridylazo)-2-naphthol), 피리딜아조 나프톨-Cu. EDTA(Pyridylazo naphthol-Cu. EDTA mixed indicator), 로졸산(Rosolic Acid), 살리실산(Salicylic Acid), 녹말 용액(Starch Solution), 테트라브로무페놀 블루(Tetra bromophenol Blue), 토린(Thorin), 티몰 블루(Thymol blue), 티몰 블로 페놀프탈레인(Thymol Blue-Phenolphthalein), 티몰프탈레인(Thymolphthalene), 티론(Tiron), 1,3,5-트리나이트로벤젠(1,3,5-Trinitrobenzene), 트로필린 O(Tropeoline O; Resorcine-azo-benzene sulfonic acid), 트로필린(Tropeoline), 바리아민 블루 B(Variamine Blue B), 자일레놀 오렌지(Xylenol Orange), 진콘(Zincon) 중 어느 하나 이상을 사용할 수 있다.The pH indicator is a substance which is discolored in response to the pH change caused by the culture of the microorganism sample in the culture medium. Specifically, Alizarin Red, Alizarin Yellow, Alizarin Red S, E.Bogen, Bromocresol Green, Bromocresol Green-Chlorophenol Red, Bromocresol Green-Methyl Red, Bromocresol Green-Methyl Yellow, Bromocresol Purple, Bromophenol Blue, Bromothymol Blue, Bromothymol Blue-Phenol Red, Bromothymol Blue-Phenol Red), Calcein, Calcon, Calmagite, Cal Red, Congo Red, Chlorophenol Red, O-Cresolphthalene, Cresol (Cres) ol Red, Cresol Red-Thymol Blue, Cromazurol S, Curcumin, 2,5-Dinitrophenol, 2,6-di Diphenylamine Solution, Dithizone Alcohol Solution, Eriochrome Black T, Hydroxynaphthol Blue, Lacquerol, and the like. Lacmoid, Metanil Yellow, Methyl Orange, Methyl Orange-Xylene Cyanol FF, Methyl Orange-Xylene Cyanol FF-Phenolphthalein (Methyl Orange-Xylene Cyanol FF) Orange-Xylene Cyanol FF-Phenolphthalein, Methyl Orange-Indigo Carmine, Methyl Red, Methyl Red-Methylene Blue, Methyl Thymol Blue, Methyl Yellow, Neutral Red; Dimethyl diaminophenasin chloride, Neutral Red-Bromothymol Blue, Picrylmethyl nitramine, p-Nitrophenol, Phenolphthalene, phenolphthalein-thymolphthalein Phenolphthalein-Thymolphthalein, Phenol Red, Poirrier's Blue 4B, Pyrocatechol Violet, 1- (2-pyridylazo) -2-naphthol (1- ( 2-Pyridylazo) -2-naphthol), pyridylazonaphthol-Cu. EDTA mixed indicator, Rosolic Acid, Salicylic Acid, Starch Solution, Tetra bromophenol Blue, Thorin, Tymol Blue, Thymol blue, Thymol Blue-Phenolphthalein, Thymolphthalene, Tiron, 1,3,5-Trinitrobenzene, tropylin O One or more of Tropeoline O, Resorcine-azo-benzene sulfonic acid, Tropeoline, Variamine Blue B, Xylenol Orange and Zincon may be used .
상기 제시된 pH 지시약의 명칭은 본 발명의 기술분야에 통용되는 화합물의 명칭에 대응되는 화합물을 의미한다.The designation of the above-mentioned pH indicator means a compound corresponding to the name of the compound commonly used in the technical field of the present invention.
상기 색변화 추세선 도출 단계(S140)에서 도출되는 색변화 추세선은 미생물 농도가 높을수록 RGB 값이 변화하지 않고 일정하게 유지하는 평형 상태에 도달하는 시간이 짧아지는 추이에 상응되어 기울기가 변화하는 추세선인 것을 특징으로 한다.The color change trend line derived in the color change trend line deriving step S140 is a trend line corresponding to the trend that the time to reach the equilibrium state in which the RGB value does not change and becomes constant as the concentration of the microorganism increases is shortened, .
또한, 상기와 같은 목적을 달성하기 위한 미생물의 개체수 변화 측정 방법(S200)은 농도별로 희석한 미생물 시료를 준비하는 준비 단계(S210), 배양 배지에 상기 미생물 시료를 배양됨으로써 나타나는 미생물의 개체수 변화를 시간별로 측정하는 개체수 변화 측정 단계(S220), 상기 개체수 변화 측정 단계(S220)를 통해 측정된 미생물의 개체수와 배양 시간 사이의 상관관계를 나타내는 개체수 변화 추세선을 미생물 농도별로 도출하는 개체수 변화 추세선 도출 단계(S230), 및 상기 개체수 변화 추세선을 토대로 미생물 농도별 개체수 변화 데이터베이스를 생성하고 저장하는 단계(S240)를 포함할 수 있다.In order to achieve the above object, a method for measuring the change in microbial population (S200) includes a preparation step (S210) of preparing a microbial sample diluted by concentration, a step of changing the number of microbial populations caused by culturing the microbial sample in the culture medium A population change trend line derivation step of deriving a population change trend line indicating a correlation between the population number of microorganisms and the cultivation time measured through the population number change measurement step S220, (S230), and generating and storing a population change database for each microbe concentration based on the population change trend line (S240).
상기 개체수 측정 단계(S220)는 배양 배지에 함유된 미생물을 통상적인 생균수 측정방법에 따라 측정할 수 있으며, 바람직하게는 도말 평판법, 혼탁도 측정법, 레이저 형광 산란법 및 배양된 시료를 유동계수기나 쿨터계수기(Coulter counter)로 측정하는 방법 중 어느 하나 이상의 방법으로 시간별로 변화하는 미생물의 개체수를 측정할 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.The population counting step (S220) may be performed by measuring the microorganism contained in the culture medium according to a conventional method for measuring the viable cell count. Preferably, the flat plate method, turbidity measurement method, laser fluorescence scattering method, The number of microorganisms that change over time may be measured by any one or more of the methods of measuring with a Coulter counter. However, the present invention is not limited thereto.
상기 개체수 변화 추세선 도출 단계(S230)는 배양 시간별로 측정된 미생물 개체수를 나타내는 생장 곡선인 개체수 변화 추세선을 작성하여 도출할 수 있다.The step of deriving the population number change trend line (S230) can be derived by creating a population number change trend line, which is a growth curve indicating the number of microorganisms measured for each culture time.
그리고 상기와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명의 색도 변화 측정을 이용한 미생물 농도 측정 방법은, 상기 미생물의 색변화 측정 방법으로부터 도출된 색변화 데이터베이스와 상기 미생물 개체수 변화 측정 방법으로부터 도출된 개체수 변화 데이터베이스 사이의 상관관계를 나타내는 색변화 및 개체수 변화 상관 곡선을 작성하는 단계(S300) 및 상기 색변화 및 개체수 변화 상관 곡선과 측정 대상 미생물의 색변화 결과를 비교하여 상기 측정 대상 미생물의 농도를 도출하는 단계(S400)를 포함하여 이루어질 수 있다.In order to achieve the above object, a method for measuring microbial concentration using the chromaticity change measurement according to the present invention is characterized in that the microbial concentration measurement method comprises the steps of: (S300) of generating a color change and a population change correlation curve showing a correlation between the color change and the population change correlation curve and a color change result of the measurement subject microorganism to derive the concentration of the measurement subject microorganism S400).
상기 측정 대상 미생물의 농도를 도출하는 단계(S400)는 측정 대상 미생물을 pH 지시약이 포함된 배양 배지에서 배양하는 단계(S410), 상기 배양하는 단계(S410)에서 배양 시간별로 나타나는 pH 변화에 따라 변색되는 배지의 색의 색도를 RGB 값으로 산출하여 상기 측정 대상 미생물의 색도 변화를 측정하는 단계(S420), 상기 측정된 RGB 값과 배양 시간 사이의 상관관계를 나타내는 측정 대상 미생물의 색변화 추세선을 도출하는 단계(S430), 및 상기 측정 대상 미생물의 색변화 추세선과 미리 저장된 색변화 및 개체수 변화 상관 곡선을 비교함으로써 측정 대상 미생물의 농도를 도출하는 단계(S440)를 포함하여 이루어질 수 있다.The step S400 of deriving the concentration of the microorganism to be measured may include a step S410 of culturing the microorganism to be measured in a culture medium containing the pH indicator, a step S410 of changing the pH, (S420) of calculating the chromaticity of the color of the culture medium to be measured by calculating the RGB value of the chromaticity of the medium to be measured (S420), and deriving a color change trend line of the microorganism to be measured which shows a correlation between the measured RGB value and the incubation time (S430), and comparing the color change trend line of the microorganism to be measured with the previously stored color change and population change correlation curve (S440), thereby deriving the concentration of the microorganism to be measured (S440).
본 발명의 색도 측정을 이용한 미생물 농도 측정 방법은 pH에 따라 변색되는 pH 지시약을 이용하여 미생물의 농도별로 배양 시간에 따른 pH 색변화 사이의 상관관계에 대한 색변화 추세선과 개체수 변화 추세선을 측정하고 이를 데이터베이스화함으로써, 농도를 알고자 하는 미지의 미생물에 대한 pH 지시약의 색변화를 실시간으로 색도계를 이용하여 측정하고, 측정된 색변화 결과와 상기 데이터베이스에 저장된 추세선과 비교하여 미생물의 농도를 확인할 수 있고, 더 나아가 생장 속도가 비슷한 미생물의 종류를 신속하게 확인할 수 있는 효과가 있다.The method of measuring the concentration of microorganisms using the colorimetric method of the present invention is to measure the color change trend line and the population change trend line for the correlation between the pH color change according to the culturing time by the pH indicator which is discolored according to the pH, By using a database, it is possible to measure the color change of the pH indicator with respect to an unknown microorganism whose concentration is to be known by using a colorimeter in real time, and compare the measured color change result with the trend line stored in the database to confirm the concentration of the microorganism , And further, it is possible to quickly identify the kind of microorganisms having a similar growth rate.
즉, 본 발명은 일반적으로 미생물의 농도를 확인하기 위해 하루 이상 장시간의 시간이 요구되는 종래의 혼탁도 측정법이나 평판 도말법을 대신하여 색도 측정만으로 미생물의 농도를 실시간으로 신속하게 파악이 가능하므로, 일정 수준의 미생물 배양이나 신속한 살균 정도 파악을 필요로 하는 환경정화기술, 의료 및 바이오 산업기술, 식품산업, 가공산업뿐만 아니라 군 무기체계 등 다양한 분야에서 다양한 형태의 기술로 활용이 가능한 효과가 있다.That is, since the present invention can quickly grasp the concentration of the microorganism in real time only by the chromaticity measurement instead of the conventional turbidity measurement method or flat plate smear method which requires a long time more than one day to check the concentration of the microorganism, There is an effect that various types of technology can be utilized in various fields such as environment purification technology that requires a certain level of microbial cultivation or rapid disinfection, medicine and bio industry technology, food industry, processing industry as well as military weapons system.
도 1은 본 발명에 따른 미생물 농도별 색변화와 개체수 변화 데이터베이스(DB) 생성 방법을 나타낸 순서도이다.
도 2는 본 발명에 따른 색도를 이용한 미생물 농도 측정 방법을 나타낸 순서도 이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 바실러스 아트로파에우스(Bacillus atrophaeus) 106 CFU/ml 농도에서 배양시 시간에 따른 pH 변화에 대해 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 배양 시간별로 배양액의 색변화 이미지를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에로 배양 시간별로 바실러스 아트로파에우스(Bacillus atrophaeus) 106 CFU/ml의 농도에서 색도(RGB) 변화 그래프를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라 바실러스 아트로파에우스(Bacillus atrophaeus) 농도에 따른 pH 배양액의 RGB 값 중 녹색 값(Green value)에 해당하는 값의 그래프를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따라 데이터베이스에 저장된 미생물 농도와 색도 측정값과의 비교를 통한 미생물의 농도 및 개체수 측정을 나타낸 것이다.1 is a flowchart illustrating a method of generating a color change database and a population change database according to microbial concentration according to the present invention.
2 is a flowchart showing a method for measuring microbial concentration using chromaticity according to the present invention.
FIG. 3 is a graph showing changes in pH with time in culture at a concentration of 10 6 CFU / ml of Bacillus atrophaeus according to an embodiment of the present invention.
FIG. 4 is a color change image of a culture medium according to an incubation time according to an embodiment of the present invention.
FIG. 5 is a graph showing a change in chromaticity (RGB) at a concentration of 10 6 CFU / ml of Bacillus atrophaeus according to an embodiment of the present invention.
FIG. 6 is a graph showing a value corresponding to a green value among RGB values of a pH culture solution according to Bacillus atrophaeus concentration according to an embodiment of the present invention.
Figure 7 shows the concentration and population counts of microorganisms by comparing microbiological concentrations and chromaticity measurements stored in a database according to one embodiment of the present invention.
이하 첨부된 도면을 참조하여 본 발명을 통해 실시하고자 하는 과정에 대해 상세히 설명한다. 그러나 이들 예는 예시적인 목적일 뿐 본 발명이 이들 예에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to the accompanying drawings. However, these examples are for illustrative purposes only, and the present invention is not limited to these examples.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 미생물 농도 측정 방법의 순서도를 나타낸 것으로, 도시된 바와 같이 본 발명의 미생물 농도 측정 방법은 색도 측정을 이용한 미생물의 색변화 측정 방법(S100)을 통해 구축된 색변화 데이터베이스와 미생물 개체수 변화 측정 방법(S200)을 통해 구축된 개체수 변화 데이터베이스로부터 이들 사이의 상관관계를 나타내는 색변화 및 개체수 변화 상관 곡선을 생성하여, 측정하고자 하는 미지의 미생물 시료의 농도를 측정할 수 있다.FIG. 1 is a flowchart of a method for measuring microbial concentration according to an embodiment of the present invention. As shown in FIG. 1, the microbial concentration measuring method of the present invention includes a microbial concentration measuring method From the population change database constructed through the color change database and the measurement method of microbial population change (S200), a color change and population change correlation curve indicating the correlation between them is generated and the concentration of the unknown microbial sample to be measured is measured .
상기 미생물의 색변화 측정 방법(S100)은 미생물의 pH에 따른 pH 지시약의 색변화를 측정하는 방법으로서, 농도별로 희석한 미생물 시료 준비 단계(S110), 색변화 측정 단계(S120), 색도 값 산출 단계(S130), 색변화 추세선 도출 단계(S140), 및 색변화 데이터베이스 생성 및 저장 단계(S150)을 포함한다.The method for measuring the color change of microorganisms (S100) is a method for measuring a color change of a pH indicator according to the pH of a microorganism. The method comprises preparing a microorganism sample diluted by concentration (S110), measuring a color change (S120) Step S130, a color change trend line derivation step S140, and a color change database creation and storage step S150.
먼저, 준비 단계(S110)는 이미 농도를 알고 있는 미생물을 포함하는 용액을 기준 시료로 하여 배양 배지에 연속 희석(serial dilution)하여 농도별로 준비할 수 있으며, 예를 들면 1 내지 1010 CFU/ml 농도 범위의 미생물 시료를 준비할 수 있다.First, in the preparation step (S110), a solution containing microorganisms already known in concentration may be prepared for each concentration by serial dilution into a culture medium as a reference sample, for example, 1 to 10 10 CFU / ml A microorganism sample in a concentration range can be prepared.
색변화 측정 단계(S120)는 상기 준비단계(S110)에서 준비된 미생물 시료가 배양 배지에서 배양됨으로써 발생하는 pH 변화에 대응하여 변색되는 pH 지시약으로 배양배지에 함유된 미생물 농도에 따른 색도 변화를 배양 시간별로 측정하는 비색법(colorimetric method)을 수행하는 단계로서, 배양 배지에 상기 미생물 시료가 배양되면서 배양 시간별로 pH변화에 따른 pH 지시약의 색을 색 측정 장치로 측정한다.The color change measuring step S120 is a pH indicator which is discolored corresponding to the pH change caused by culturing the microorganism sample prepared in the preparing step S110 in the culture medium. The chromanity change according to the microorganism concentration contained in the culture medium , Wherein the color of the pH indicator is measured with a colorimetric apparatus according to the change of pH by incubation time while the microorganism sample is cultured in a culture medium.
여기서 사용되는 pH 지시약(pH indicator)은 pH에 따라 자신의 색을 변화시킴으로써 그 물질이 산성, 중성 및 염기성과 같은 어떠한 성질을 지니는가를 구분하는 시약으로써, 본 발명에서는 배양 배지에 포함된 미생물의 농도로 인해 pH 지시약에 어떤 색을 띠는지를 확인함으로써 미생물의 농도를 판단할 수 있다.The pH indicator used here is a reagent for distinguishing properties of the substance such as acidity, neutrality and basicity by changing its color according to pH. In the present invention, the concentration of microorganisms contained in the culture medium The concentration of the microorganism can be determined by confirming the color of the pH indicator.
일반적으로 미생물의 개체수가 증가함에 따라 미생물의 호흡작용으로 인하여 탄산가스 등의 생성으로 인해 배양 배지의 pH 값이 떨어지므로, 본 발명에서 사용되는 pH 지시약은 바람직하게 산성의 변색범위를 갖는 산성 지시약을 사용할 수 있으나, 미생물의 종류에 따라 pH 변색 범위는 변하므로 이에 한정하지 않고 pH1 내지 pH14에 대한 변색범위를 갖는 pH 지시약을 적절하게 사용할 수 있다.Generally, as the number of microorganisms increases, the pH value of the culture medium is lowered due to the generation of carbon dioxide gas due to the respiration of the microorganisms. Therefore, the pH indicator used in the present invention preferably has an acidic indicator having an acidic discoloring range However, since the range of pH discoloration varies depending on the kind of microorganism, the pH indicator having a discoloring range from
구체적으로 pH 지시약은 알리지린 레드(Alizarin Red), 알리지린 엘로우(Alizarin Yellow), 알리지린 레드 에스(Alizarin Red S), E.Bogen, 브로모크레졸 그린(Bromocresol Green), 브로모크레졸 그린-클로로페놀 레드(Bromocresol Green-Chlorophenol Red), 브로모크레졸 그린-메틸 레드(Bromocresol Green-Methyl Red), 브로모크레졸 그린-메틸 엘로우(Bromocresol Green-Methyl Yellow), 브로모크레졸 퍼플(Bromocresol Purple), 브로모페놀 블루(Bromophenol Blue), 브로모티몰 블루(Bromothymol Blue), 브로모티몰 블루-페놀 레드(Bromothymol Blue-Phenol Red), 칼세인(Calcein), 칼콘(Calcon), 칼마지트(Calmagite), 칼 레드(Cal Red), 콩고 레드(Congo Red), 클로로페놀 레드(Chlorophenol Red), o-크레졸프탈레인(o-Cresolphthalene), 크레졸 레드(Cresol Red), 크레졸 레드-티몰 블루(Cresol Red-Thymol Blue), 크로마즈롤 에스(Cromazurol S), 커큐민(Curcumin), 2,5-디니트로페놀(2,5-Dinitrophenol), 2,6-디니트로페놀(2,6-Dinitrophenol), 디페닐아민 용액(Diphenylamine Solution), 디티존 알코올 용액(Dithizone Alcohol Solution), 에리오크롬 블랙 티(Eriochrome Black T), 하이드록시나프톨 블루(Hydroxynaphthol Blue), 라크모이드(Lacmoid), 메타닐 엘로우(Metanil Yellow), 메틸 오렌지(Methyl Orange), 메틸 오렌지-자일렌 시아놀 FF(Methyl Orange-Xylene Cyanol FF), 메틸 오렌지-자일렌 시아놀 FF-페놀프탈레인(Methyl Orange-Xylene Cyanol FF-Phenolphthalein), 메틸 오렌지-인디고 카민(Methyl Orange-Indigo Carmine), 메틸 레드(Methyl Red), 메틸 레드-메틸렌 블루(Methyl Red-Methylene Blue), 메틸 티몰 블루(Methyl Thymol Blue), 메틸 엘로우(Methyl Yellow), 내추럴 레드(Neutral Red; Dimethyl diaminophenasin chloride), 내추럴 레드-브로모티몰 블루(Neutral Red-Bromothymol Blue), 피크릴메틸 니트라민(Picrylmethyl nitramine), p-니트로페놀(p-Nitrophenol), 페놀프탈레인(Phenolphthalene), 페놀프탈레인-티몰프탈레인(Phenolphthalein-Thymolphthalein), 페놀 레드(Phenol Red), 푸아르리 블루 4B(Poirrier's Blue 4B), 피로카테콜 바이올렛(Pyrocatechol Violet), 1-(2-피리딜아조)-2-나프톨(1-(2-Pyridylazo)-2-naphthol), 피리딜아조 나프톨-Cu. EDTA(Pyridylazo naphthol-Cu. EDTA mixed indicator), 로졸산(Rosolic Acid), 살리실산(Salicylic Acid), 녹말 용액(Starch Solution), 테트라브로무페놀 블루(Tetra bromophenol Blue), 토린(Thorin), 티몰 블루(Thymol blue), 티몰 블로 페놀프탈레인(Thymol Blue-Phenolphthalein), 티몰프탈레인(Thymolphthalene), 티론(Tiron), 1,3,5-트리나이트로벤젠(1,3,5-Trinitrobenzene), 트로필린 O(Tropeoline O; Resorcine-azo-benzene sulfonic acid), 트로필린(Tropeoline), 바리아민 블루 B(Variamine Blue B), 자일레놀 오렌지(Xylenol Orange), 진콘(Zincon) 중 어느 하나 이상을 사용할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.Specifically, the pH indicator may be selected from the group consisting of Alizarin Red, Alizarin Yellow, Alizarin Red S, E.Bogen, Bromocresol Green, Bromocresol Green- Bromocresol Green-Chlorophenol Red, Bromocresol Green-Methyl Red, Bromocresol Green-Methyl Yellow, Bromocresol Purple, But are not limited to, Bromophenol Blue, Bromothymol Blue, Bromothymol Blue-Phenol Red, Calcein, Calcon, Calmagite, Cal Red, Congo Red, Chlorophenol Red, o-Cresolphthalene, Cresol Red, Cresol Red-Thymol, Blue), Cromazurol S, Curcumin, 2,5-
색변화 측정 단계(S120)에서 pH 지시약의 색은 배양 배지에 pH 지시약이 첨가된 배양 배지의 색이거나 pH 지시약이 포함된 pH 검출지의 색으로서, pH 지시약을 배양 배지 첨가하거나, 또는 pH 지시약이 포함된 pH 검출지를 이용하여 시간별로 배양 배지에 함유된 미생물의 농도에 따른 pH 지시약의 색변화를 색 측정 장치로 측정할 수 있다. 여기서 pH 지시약이 직접 포함된 배양 배지 및 pH 검출지뿐만 아니라 pH 측정센서류 등을 응용하여 미생물이 포함된 배양 배지의 pH 농도를 별도로 측정할 수 있다.In the color change measurement step (S120), the color of the pH indicator is the color of the culture medium to which the pH indicator is added in the culture medium, or the color of the pH detection paper including the pH indicator, the pH indicator is added to the culture medium, The color change of the pH indicator according to the concentration of the microorganism contained in the culture medium can be measured with a colorimeter. Here, the pH concentration of the culture medium containing the microorganism can be separately measured by applying a culture medium and pH detection paper directly containing a pH indicator, as well as a pH measurement sensor.
그러므로 색 측정 장비는 배지의 색 또는 pH 검출지의 색 이미지로부터 빨강색(Red, R), 녹색(Green, G), 파란색(Blue, B)의 3가지 색상 신호의 RGB 값을 명확히 구분할 수 있는 RGB 카메라, DSLR(Digital Single Lens Reflex) 카메라 및 분광광도계(spectrophotometer) 중 선택되는 어느 하나 이상이며, 이에 한정하지 않고 측정된 이미지로부터 RGB 값을 측정할 수 있는 다양한 장치가 선택적으로 적용되어 사용할 수 있다.Therefore, the color measurement equipment is capable of distinguishing the RGB values of the three color signals of red (R, R), green (G), blue (B) A camera, a digital single lens reflex (DSLR) camera, and a spectrophotometer. However, the present invention is not limited thereto, and various devices capable of measuring RGB values from measured images can be selectively used.
그 다음 색도 값 산출 단계(S130)에서는 상기 색 측정 장비를 통해 측정된 pH 지시약의 색을 색도를 RGB 값으로 산출하여 미생물의 농도에 따른 색도 변화를 측정하게 된다.In the next chromaticity value calculation step (S130), the color of the pH indicator measured through the color measuring equipment is calculated as RGB value, and the chromaticity change according to the concentration of the microorganism is measured.
색변화 추세선 도출 단계(S140)는 미생물의 농도별 배양 시간에 따른 R, G, B 각각에 대한 변화량에 대한 추세선을 산출하는 단계로서, 상기 색도 값 산출 단계(S130)에서 산출된 RGB 값과 배양시간 사이의 상관관계를 나타내는 색변화 추세선을 미생물의 농도별로 도출하는 단계이다.The step of deriving the color change trend line S140 is a step of calculating a trend line for a change amount with respect to each of R, G, and B according to the incubation time of each microorganism concentration. The RGB value calculated in the chroma value calculation step S130 And a color change trend line indicating a correlation between the times is derived for each concentration of microorganisms.
미생물 농도별 색변화 데이터베이스 생성 및 저장 단계(S150)는 상기 색변화 추세선 도출 단계(S140)에서 도출된 색변화 추세선을 분석하고, 이처럼 분석된 농도별 색변화 데이터는 실시간으로 컴퓨터에 저장되어 데이터베이스화할 수 있다.In the color change database creation and
본 발명은 앞서 설명한 미생물의 색변화 측정 방법과 함께 미생물 개체수 변화 측정방법이 수행되어 미생물 농도별에 따른 개체수 변화 추세선에 대한 데이터베이스를 확보할 수 있다.In the present invention, the above-described method for measuring the color change of the microorganism and the method for measuring the change of the microbial population can be performed, and a database for the trend of the population change according to the microbial concentration can be secured.
미생물 개체수 변화 측정방법은 도 1에 도시된 바와 같이, 농도별로 희석한 미생물 시료를 준비하는 준비 단계(S210), 배양 시간별로 미생물의 개체수 변화를 측정하는 개체수 변화 측정 단계(S220), 개체수 변화 추세선 도출 단계(S230) 및 미생물의 개체수 변화 데이터베이스 생성 및 저장 단계(S240)를 포함할 수 있다.As shown in FIG. 1, the method for measuring the change of microbial population includes preparing a microbial sample diluted by concentration (S210), measuring a population change of the microbial population at each incubation time (S220) (S230), and a step S240 of creating and storing a microbial population change database.
상기 준비 단계(S210)는 상기 준비 단계(S110)와 동일한 단계로서 이미 농도를 알고 있는 미생물을 포함하는 용액을 기준 시료로 하여 배양 배지에 희석하여 농도별로 준비할 수 있으며, 예를 들면 1 내지 1010 CFU/ml 범위의 농도를 갖는 연속 희석(serial dilution)한 미생물 시료를 준비할 수 있다.In the preparation step (S210), a solution containing microorganisms already known in concentration may be diluted in a culture medium and prepared for each concentration, for example, 1 to 10 A serial dilution of the microorganism sample with a concentration ranging from 10 CFU / ml can be prepared.
그 다음 개체수 변화 측정 단계(S220)는 배양 배지에 함유된 미생물의 개체수를 배양 시간별로 측정하는 단계이며, 이때 배양 배지에 함유된 미생물을 통상적인 생균수 측정방법을 사용하여 측정할 수 있다. 생균수 측정 방법으로 바람직하게는 도말 평판법, 혼탁도 측정법, 레이저 형광 산란법 및 배양된 시료를 유동계수기나 쿨터계수기(Coulter counter)로 측정하는 방법 중 어느 하나 이상의 방법으로 시간별로 변화하는 미생물의 개체수를 측정할 수 있다.Next, in the step of measuring population change (S220), the number of microorganisms contained in the culture medium is measured at each culture time. At this time, the microorganisms contained in the culture medium can be measured using a conventional method for measuring viable cell count. As a method for measuring the viable cell count, the number of microorganisms that change over time is preferably at least one of a smear flat plate method, turbidity measurement method, laser fluorescence scattering method, and a method of measuring a cultured sample with a flow counter or a Coulter counter Can be measured.
상기 개체수 변화 추세선 도출 단계(S230)는 미생물 농도에 따라 배양 시간별로 측정된 미생물 개체수 사이의 상관관계를 나타내는 추세선을 도출할 수 있다.In the step 230 of deriving the population change trend line, a trend line indicating the correlation between the number of microorganisms measured in each culture time may be derived according to the microorganism concentration.
미생물의 개체수 변화 데이터베이스 생성 및 저장 단계(S240)는 상기 개체수 변화 추세선 도출 단계(S230)에서 도출된 미생물 농도별 생장 곡선인 개체수 변화 추세선을 분석하고, 분석된 미생물의 농도에 따른 개체수 변화 데이터는 실시간으로 컴퓨터에 저장되어 데이터베이스화할 수 있다.In the microbial population change database creation and storage step S240, the population change trend line, which is the growth curve according to the microbial concentration derived in the population number change trend line derivation step S230, is analyzed, and the population change data according to the analyzed microbial concentration is stored in real time Can be stored in a computer and can be converted into a database.
그리고 본 발명의 색도 변화 측정을 이용한 미생물 농도 측정 방법은, 상기 미생물 색변화 측정 방법으로부터 도출된 색변화 데이터베이스와 상기 미생물 개체수 변화 측정 방법으로부터 도출된 개체수 변화 데이터베이스 사이의 상관관계를 나타내는 색변화 및 개체수 변화 상관 곡선을 생성하는 단계(S300) 및 상기 색변화 및 개체수 변화 상관 곡선과 측정 대상 미생물의 색변화 결과를 비교하여 상기 측정 대상 미생물의 농도를 산출하는 단계(S400)를 포함한다.The method of measuring microbial concentration using the chromaticity change measurement according to the present invention is characterized in that the microbial concentration measurement method of the present invention is characterized in that a color change database indicating the correlation between the color change database derived from the microbial color change measurement method and the population change database derived from the microbial population change measurement method (S300) of calculating a change correlation curve, and calculating a concentration of the microorganism to be measured by comparing the color change and the population change correlation curve with a color change result of the microorganism to be measured (S400).
색변화 및 개체수 변화 상관 곡선을 생성하는 단계(S300)는 미생물의 농도별로 pH 지시약의 색변화를 관찰하면서 이에 대한 RGB 값을 저장하고, 이와 동시에 미생물의 농도 즉, 미생물의 개체수를 통한 개체수 변화 추세선을 측정하여 미생물의 농도 변화를 관찰함으로써 각각의 추세선으로부터 농도별 색변화 및 개체수 변화 상관 곡선을 생성할 수 있다. 이때, 미생물의 종류와 측정 농도에 따라 도출되는 색도 변화 그래프와 개체수 변화 그래프는 다르게 나타나기 때문에 데이터베이스의 양은 미생물의 종류와 농도에 따라 달라진다.The step of generating a color change and population change correlation curve (S300) stores the RGB value of the pH indicator by observing the color change of the pH indicator according to the concentration of the microorganism and at the same time, the concentration of the microorganism, , It is possible to generate the correlation curve of color change and population number by concentration from each trend line by observing the concentration change of microorganisms. At this time, since the chromaticity change graph and the population change graph are different depending on the kind of the microorganism and the measurement concentration, the amount of the database depends on the kind and concentration of the microorganism.
측정 대상 미생물의 농도를 도출하는 단계(S400)는 다양한 종류의 미생물에 대한 농도별 색변화와 개체수 변화 데이터베이스가 준비된 상태에서 알고자 하는 미생물 시료를 준비하고 pH에 따라 색변화가 발생되는 pH 지시약에 포함된 배양 배지에 배양시키면서 농도별 미생물의 시간에 따른 색도변화를 측정을 이용한 농도 측정 단계이다. 이 단계에서는 측정 대상 미생물의 배양 시간에 따른 pH 색변화를 통해 색변화 추세선을 작성하고, 이렇게 작성된 추세선을 저장된 데이터베이스와 비교를 통해 미생물의 농도를 수 시간 이내에 빠르게 측정이 가능하다.The step of deriving the concentration of microorganisms to be measured (S400) is a step of preparing a microorganism sample to be known in a state in which a color change according to concentration and a population change database for various kinds of microorganisms are prepared and a pH indicator And then measuring the change in chromaticity of the microorganism with respect to time with incubation in the incubation medium. In this step, a color change trend line is created through pH color change according to the incubation time of the microorganism to be measured, and the concentration line of the microorganism can be quickly measured within several hours by comparing the created trend line with the stored database.
구체적으로 측정 대상 미생물의 농도를 도출하는 단계(S400)는 도 2에 순서도에 나타낸 바와 같이, 측정 대상 미생물을 pH 지시약이 포함된 배양 배지에서 배양하는 단계(S410), 시간에 따라 상기 측정 대상 미생물의 색도 변화가 측정되는 단계(S420), 상기 색도 변화로부터 측정 대상 미생물의 색변화 추세선을 도출하는 단계(S430), 및 측정 대상 미생물의 색변화 추세선과 미리 저장된 색변화 및 개체수 변화 상관 곡선을 비교함으로서 측정 대상 미생물의 농도를 도출하는 단계(S440)를 포함한다.Specifically, the step S400 of deriving the concentration of the microorganism to be measured (S400) includes a step (S410) of culturing the microorganism to be measured in a culture medium containing the pH indicator (S410) (S430) of deriving a color change trend line of the microorganism to be measured from the chromaticity change, and comparing the color change trend line of the microorganism to be measured with a previously stored color change and population change correlation curve And deriving the concentration of the microorganism to be measured (S440).
상기 배양하는 단계(S410)는 개체수를 알고자 하는 미생물의 시료를 준비하는 단계로 pH 지시약이 포함된 배양 배지에서 온도와 습도를 조절하면서 미생물을 배양하는 단계이다.The step of culturing (S410) is a step of preparing a sample of a microorganism to know the number of individuals, and culturing the microorganism while controlling temperature and humidity in a culture medium containing a pH indicator.
상기 미생물을 배양하는 단계(S410) 이후에는 농도별 미생물의 배양 시간에 따른 측정 대상 미생물이 포함된 배양 배지의 색도를 RGB 값으로 산출하여 측정 대상 미생물의 색도 변화를 측정한 뒤(S420), 산출된 RGB 값과 배양 시간 사이의 상관관계에 대한 색변화 추세선을 도출하는 단계(S430)를 거친다. 이렇게 색변화 추세선을 도출하는 단계(S430) 이후에는 상기 색변화 및 개체수 변화 상관 곡선을 생성하는 단계(S300)에서 기저장된 색변화 및 개체수 변화 상관 곡선관련 데이터베이스들과의 비교를 통해 미생물 시료의 농도를 도출하는 단계(S440)를 통해 미생물의 농도를 수 시간 이내에 빠르게 측정 가능하며, 더 나아가 미생물의 종류와 농도에 따라 색도 변화 그래프와 개체수 변화 그래프는 달라지기 때문에 실시간으로 미생물 농도 정보를 파악함으로써, 시간별 색도 변화 및 개체수 변화의 패턴 분석을 통한 미생물의 종류의 파악도 가능하다.After the step of culturing the microorganisms (S410), the chromaticity of the culture medium containing the microorganism to be measured according to the concentration time of the microorganisms according to the concentration is calculated as RGB values to measure the chromaticity of the microorganism to be measured (S420) And deriving a color change trend line for the correlation between the RGB value and the incubation time (S430). After the step of deriving the color change trend line (S430), the color change and the population change correlation curve are generated (S300), and the concentration of the microorganism sample is compared with the database of the previously stored color change and population change correlation curve (S440), it is possible to quickly measure the concentration of the microorganism within a few hours. Further, since the graph of the chromaticity change and the graph of the population number change depend on the type and concentration of the microorganism, It is also possible to identify the types of microorganisms by analyzing the pattern of changes in chromaticity and population changes over time.
한편, 본 발명에서 측정 대상 미생물은 세균(bacteria), 곰팡이(fungus), 바이러스(virus), 원충(protozoa) 등 다양한 미생물을 사용할 수 있으며 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 세균(bacteria)을 사용할 수 있다.Meanwhile, in the present invention, the microorganisms to be measured may be various microorganisms such as bacteria, fungus, virus, protozoa and the like, but not limited thereto, have.
구체적으로 바실러스(Bacillus) 속, 스타필로코커스(Staphylococcus) 속, 리스테리아(Listeria) 속, 스타필로코커스(Staphylococcus) 속, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속, 락토바실러스(Lactobacillus) 속, 에스케리아(Escherichia) 속, 슈도모나스(Pseudomonas) 속, 아시네토박터(Acinetobacter) 속, 살모넬라(Salmonella) 속, 크렙시엘라(Klebsiella) 속, 나이세리아(Neisseria) 속, 엔테로박터(Enterobacter) 속, 시겔라(Shigella) 속, 모락셀라(Moraxella) 속, 헬리코박터(Helicobacter) 속, 스테노트로포모나스(Stenotrophomonas) 속, 브델로비브리오(Bdellovibrio) 속, 레지오넬라(Legionella) 속 균주 등이 포함하며, 이에 제한되지 않고 당업계에 공지된 모든 균주 등을 사용할 수 있다.More specifically, the present invention relates to a method for producing a compound of the formula (I) which is selected from the group consisting of Bacillus, Staphylococcus, Listeria, Staphylococcus, Corynebacterium, Lactobacillus, Escherichia spp., Pseudomonas spp., Acinetobacter spp., Salmonella spp., Klebsiella spp., Neisseria spp., Enterobacter spp., Shigella spp. But are not limited to, strains belonging to the genus Escherichia, such as Moraxella, Helicobacter, Stenotrophomonas, Bdellovibrio, Legionella, All strains and the like known in the art can be used.
그리고 본 발명은 컴퓨터에서 실행될 수 있는 프로그램으로 작성 가능하다. 즉, 본 발명에 따른 방법에 포함된 여러 단계들은 컴퓨터로 읽을 수 있는 기록매체에 저장될 수 있다. 상기 컴퓨터가 읽을 수 있는 기록매체는 컴퓨터에 의하여 읽힐 수 있는 데이터가 저장되는 모든 종류의 기록 장치를 포함하며, 이러한 기록매체로는 ROM(Read Only Memory), RAM(Random Access Memory), 광학 디스크, 자기 테이프, 플로피 디스크, 하드 디스크와 같은 마그네틱 저장 매체와, CD-ROM, DVD 등과 같은 광학적 판독매체와, USB 메모리, 메모리카드(SD, CF, MS, XD) 등의 디지털 저장 매체와 인터넷을 통한 캐리어 웨이브와 같은 기록매체를 포함한다.The present invention can be written as a program that can be executed by a computer. That is, the various steps involved in the method according to the present invention may be stored in a computer readable recording medium. The computer-readable recording medium may include any type of recording device that stores data that can be read by a computer. Examples of the recording medium include a read only memory (ROM), a random access memory (RAM) A magnetic storage medium such as a magnetic tape, a floppy disk or a hard disk, an optical reading medium such as a CD-ROM or a DVD, a digital storage medium such as a USB memory, a memory card (SD, CF, MS, XD) And a recording medium such as a carrier wave.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples.
먼저, 미생물 시료로는 바실러스 아트로파에우스(Bacillus atrophaeus)를 사용하고, 이와 같은 균주 배양을 위한 배지는 일반 대두 카제인 소화배지(soybean casein digest medium) 대신에 Mesa Labs 사의 Releasat® media 제품을 사용하였으며, 여기에는 pH 지시약으로 브로모크레졸 퍼플(Bromocresol Purple)을 포함함으로서 pH 변화에 대응하여 색변화가 가능한 배양 배지를 구성하였다.First, Bacillus atrophaeus was used as a microorganism sample, and Releasat 占 media product of Mesa Labs was used instead of soybean casein digest medium for culture of such strains , Which contains a Bromocresol Purple as a pH indicator, to form a culture medium capable of changing colors in response to pH changes.
상기 배양 배지 속에 pH 지시약으로 포함된 브로모크레졸 퍼플(Bromocresol Purple)은 pH 7 정도에서는 보라색을 띠지만 pH 5정도로 내려갈수록 노란색으로 변한다. 따라서 바실러스 아트로파에우스(Bacillus atrophaeus)의 개체수 증가로 인해 pH농도가 낮아질 때 노란색으로 점차 노란색으로 변하는 색도 측정을 이용하여 미생물의 농도를 확인할 수 있다.Bromocresol purple, which is included as a pH indicator in the culture medium, is violet at
106 CFU/ml의 바실러스 아트로파에우스(Bacillus atrophaeus)를 3.5ml의 배양 배지에 접종하고, 50 내지 60℃에서 24시간까지 배양하면서, 배양 시간에 따른 pH 변화를 측정하였으며, 그 결과는 도 3 및 도 4에 나타내었다. Bacillus atrophaeus (10 6 CFU / ml) was inoculated in a culture medium (3.5 ml), and the pH change was measured according to the incubation time while culturing at 50 to 60 ° C for 24 hours. As a result, 3 and Fig.
도 3에 도시된 바와 같이, 바실러스 아트로파에우스(Bacillus atrophaeus)를 첨가하지 않은 배양 배지인 대조군(control)은 pH의 값의 변화가 없지만, 106 CFU/ml의 바실러스 아트로파에우스(Bacillus atrophaeus)를 첨가한 경우에는 배양 시간(incubating time)이 증가할수록 개체수 증가에 따라 pH 값이 pH 7에서 점차 pH 5 정도까지 감소됨을 확인할 수 있었다.3, the Bacillus art with par mouse (Bacillus atrophaeus) a non-culture medium of the control group (control) was not added, but the change in the pH value, 10 6 par mouse (Bacillus of the Bacillus art of CFU / ml Atrophaeus ), the pH value decreased gradually from
또한, 도 4는 배양 시간에 따른 배양 배지의 색 변화를 카메라로 관찰한 사진을 나타낸 것으로, 상기 도 3의 그래프처럼 배양 시간이 증가할수록 pH가 점차 감소됨에 따라 배양 배지에 함유된 pH 지시약으로 인해 보라색에서 점차 노란색으로 변화되는 것을 확인할 수 있었다.FIG. 4 is a photograph of the color change of the culture medium according to the incubation time. As the graph of FIG. 3 shows, as the incubation time is increased, the pH is gradually decreased and the pH indicator contained in the culture medium It turned out that it changed gradually from purple to yellow.
도 5는 상기 도 4에서 카메라를 이용하여 측정한 배양 배지의 색변화를 RGB 값으로 분석한 그래프를 나타낸 것이다. 이때, RGB(Red, Green, Blue) 값에서 R(Red, 빨강), G(Green, 녹색), B(Blue, 파랑)는 각각 0에서 255사이의 값을 가지며, RGB의 비율에 따라 모든 색상을 표현할 수 있다.FIG. 5 is a graph showing the color change of the culture medium measured by using the camera in FIG. 4 in terms of RGB values. At this time, R (Red, Red), G (Green, Green), B (Blue, Blue) in the RGB (Red, Green and Blue) values have values between 0 and 255 respectively. Can be expressed.
도 5에 도시된 바와 같이, 106 CFU/ml의 바실러스 아트로파에우스(Bacillus atrophaeus)는 배양 시간이 증가할수록 배양 배지의 색의 RGB 값에서 B(파랑) 값은 감소하고, R(빨강)과 G(녹색) 값은 증가됨을 확인할 수 있었다.As shown in FIG. 5, the B (blue) value of the 10 6 CFU / ml Bacillus atrophaeus decreased in the RGB values of the culture medium as the incubation time increased, and the R (red) And green (G) values were increased.
이처럼 상기 기술된 것과 동일한 방법으로 다양한 농도와 균주의 종류들에 대한 색도 변화를 측정하고, 이와 함께 비록 도면에는 도시되지 않았으나 미생물의 개체수 변화를 측정함으로써, 이의 각각에 대한 상관관계를 나타내는 추세선을 도출하고, 도출된 추세선 데이터를 확보하여 이를 토대로 데이터베이스(DB)화 할 수 있다.In the same manner as described above, chromaticity changes of various concentrations and types of strains were measured, and a trend line indicating a correlation with each of the microorganisms was determined, , The obtained trend line data can be acquired and converted into a database (DB) based on the acquired trend line data.
도 6은 바실러스 아트로파에우스(Bacillus atrophaeus)를 101 내지 1010 CFU/ml 농도별로 배양 시간에 따른 RGB 값 중 G(녹색) 값에 대한 색도 변화 분석 그래프를 나타낸 것이다.FIG. 6 is a graph showing an analysis of change in chromaticity with respect to G (green) value among RGB values according to incubation time for Bacillus atrophaeus at a concentration of 10 1 to 10 10 CFU / ml.
도 6에 나타낸 바와 같이, 색변화 추세선은 배양 시간이 지남에 따라 RGB 값이 더 이상 상승되지 않고 일정한 값으로 유지하는 평형상태에 도달하게 되는데, 바실러스 아트로파에우스(Bacillus atrophaeus)의 농도가 높을수록 평형상태에 도달하는데 배양 시간이 짧아져 이의 상응되어 기울기가 가파르게 변화하는 것을 확인할 수 있었다.As shown in FIG. 6, the color change trend line reaches an equilibrium state in which the RGB value is maintained at a constant value while the RGB value does not rise any more over time. When the concentration of Bacillus atrophaeus is high The incubation time was shortened when the equilibrium state was reached, and it was confirmed that the slope was steeply changed corresponding thereto.
이와 같이 확보된 추세선에 대한 데이터베이스를 토대로 도출된 색변화 및 개체수 변화 상관 곡선은 비교기준이 되어 이에 측정 대상의 미생물의 농도가 결정될 수 있다.The color change and population change correlation curve derived based on the database of the trend line thus obtained becomes a comparison standard and the concentration of the microorganism to be measured can be determined.
구체적으로 색도 변화 측정을 이용한 미생물 농도 측정하기 위해 측정하고자 하는 미생물의 시료를 pH 지시약으로 브로모크레졸 퍼플(Bromocresol Purple)이 포함된 색변화가 가능한 배양 배지에 배양하여, 배양 시간에 따른 변화하는 색도를 측정한다. 측정된 색도 값을 비교기준인 기확보된 데이터베이스와 비교함으로써 미생물 농도를 결정할 수 있다.Specifically, in order to measure the microbial concentration using the chromaticity change measurement, a sample of the microorganism to be measured is cultured in a color-changeable culture medium containing bromocresol purple with a pH indicator, . The microbiological concentration can be determined by comparing the measured chromaticity value with a pre-established database, which is a comparison standard.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 데이터베이스에 저장된 기준값과 측정하고자 하는 미생물 시료의 색도 측정값을 비교하여 미생물의 농도를 유추하는 것을 나타낸 것으로, 도시된 바와 같이 측정된 미생물의 색도 값이 기확보된 데이터베이스 상의 바실러스 아트로파에우스(Bacillus atrophaeus)의 106 CFU/ml에 대한 색도 변화 그래프와 일치되는 바, 측정 대상 미생물은 농도가 106 CFU/ml임을 확인할 수 있다.FIG. 7 is a graph illustrating the relationship between a reference value stored in a database and a chromaticity measurement value of a microorganism sample to be measured according to an embodiment of the present invention. As shown in FIG. 7, 10 6 bar, that is consistent with the measurement target microorganism chromaticity variation charts for the CFU / ml of the par-house (Bacillus atrophaeus) of the Bacillus art on the database is found to be a concentration of 10 6 CFU / ml.
이상 설명한 바와 같이 본 발명의 색도 측정을 이용한 미생물 농도 측정 방법은 측정하고자 하는 시료의 색도 측정만으로 기확립된 데이터베이스를 통해 생장속도가 비슷한 균주의 종류와 농도를 신속하게 파악이 가능한 바, 종래 많은 미생물의 농도를 확인하기 위해 많은 시간이 요구되는 방법에 비해 실시간으로 신속하게 농도를 파악할 수 있는 효과가 있다.As described above, the method of measuring the concentration of microorganisms using the chromaticity measurement of the present invention can quickly identify the types and concentrations of strains having similar growth rates through the previously established database only by measuring the chromaticity of the sample to be measured. It is possible to grasp the concentration quickly in real time as compared with a method requiring much time to confirm the concentration of the sample.
앞서 설명한 실시예는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 발명을 용이하게 실시할 수 있도록 하는 바람직한 실시예에서 구체적으로 기술되었으나, 상술한 실시예는 그 설명을 위한 것이며 그 제한을 위한 것이 아님을 주의하여야 한다. 또한, 본 발명의 기술적 분야의 통상의 지식을 가진자라면 본 발명의 기술적 사상의 범위 내에서 여러 가지 치환, 변형 및 변경한 다양한 실시예가 가능함을 이해할 수 있을 것이다. 따라서 본 발명은 당업자에 의해 용이하게 변경 가능한 부분도 본 발명의 권리범위에 포함됨은 자명하다.While the present invention has been particularly shown and described with reference to exemplary embodiments thereof, it is to be understood that the invention is not limited to the exemplary embodiments, It should be noted that it is not. It will also be understood by those skilled in the art that various changes in form and details may be made therein without departing from the spirit and scope of the invention as defined by the appended claims. Therefore, it is obvious that the present invention is included in the scope of the present invention, which can be easily changed by those skilled in the art.
Claims (11)
상기 색변화 및 개체수 변화 상관 곡선과 측정 대상 미생물의 색도 변화 결과를 비교하여 상기 측정 대상 미생물의 농도를 도출하는 단계;를 포함하되,
상기 미생물의 개체수 측정 방법은,
1 내지 1010 CFU/ml 농도 범위로 미생물 시료를 농도별로 희석하여 준비하는 단계;
도말 평판법, 혼탁도 측정법, 레이저 형광 산란법, 유동계수기 측정방법 중 어느 하나 이상의 방법으로 배양 배지에 상기 미생물 시료가 배양됨으로서 나타나는 미생물의 개체수 변화를 배양 시간별로 측정하는 개체수 변화 측정 단계;
상기 개체수 변화 측정 단계를 통해 측정된 미생물의 개체수와 배양 시간 사이의 상관관계를 나타내는 개체수 변화 추세선을 미생물 농도별로 도출하는 개체수 변화 추세선 도출 단계; 및
상기 개체수 변화 추세선을 토대로 미생물 농도별 개체수 변화 데이터베이스를 생성하고 저장하는 단계;를 포함하고,
상기 색도 측정을 이용한 미생물의 색변화 측정 방법은,
1 내지 1010 CFU/ml 농도 범위로 미생물 시료를 농도별로 희석하여 준비하는 단계;
배양 배지에서 상기 미생물 시료가 배양되면서 배양 시간별로 나타나는 pH 변화에 따라 변색되는 배양 배지에 pH 지시약이 첨가된 배양 배지의 색이거나 pH 지시약이 포함된 pH 검출지의 색인 pH 지시약의 색을 RGB 카메라, DSLR(Digital Single Lens Reflex) 카메라 및 분광광도계(spectrophotometer) 중의 어느 하나 이상의 색 측정 장치로 측정하는 색변화 측정 단계;
상기 색변화 측정 단계를 통해 측정된 pH 지시약의 색의 색도 값을 RGB 값으로 산출하는 색도 값 산출 단계;
상기 색도 값 산출 단계를 통해 산출된 RGB 값과 배양 시간 사이의 상관관계를 나타내는 색변화 추세선을 미생물 농도별로 도출하는 색변화 추세선 도출 단계; 및
상기 색변화 추세선을 토대로 미생물 농도별 색변화 데이터베이스를 생성하고 저장하는 단계; 를 포함하며,
상기 색변화 추세선은 미생물 농도가 높을수록 RGB 값이 변화하지 않고 일정하게 유지하는 평형 상태에 도달하는 시간이 짧아지는 추이에 상응되어 기울기가 변화하는 것이며,
상기 pH 지시약은 알리지린 레드(Alizarin Red), 알리지린 엘로우(Alizarin Yellow), 알리지린 레드 에스(Alizarin Red S), E.Bogen, 브로모크레졸 그린(Bromocresol Green), 브로모크레졸 그린-클로로페놀 레드(Bromocresol Green-Chlorophenol Red), 브로모크레졸 그린-메틸 레드(Bromocresol Green-Methyl Red), 브로모크레졸 그린-메틸 엘로우(Bromocresol Green-Methyl Yellow), 브로모크레졸 퍼플(Bromocresol Purple), 브로모페놀 블루(Bromophenol Blue), 브로모티몰 블루(Bromothymol Blue), 브로모티몰 블루-페놀 레드(Bromothymol Blue-Phenol Red), 칼세인(Calcein), 칼콘(Calcon), 칼마지트(Calmagite), 칼 레드(Cal Red), 콩고 레드(Congo Red), 클로로페놀 레드(Chlorophenol Red), o-크레졸프탈레인(o-Cresolphthalene), 크레졸 레드(Cresol Red), 크레졸 레드-티몰 블루(Cresol Red-Thymol Blue), 크로마즈롤 에스(Cromazurol S), 커큐민(Curcumin), 2,5-디니트로페놀(2,5-Dinitrophenol), 2,6-디니트로페놀(2,6-Dinitrophenol), 디페닐아민 용액(Diphenylamine Solution), 디티존 알코올 용액(Dithizone Alcohol Solution), 에리오크롬 블랙 티(Eriochrome Black T), 하이드록시나프톨 블루(Hydroxynaphthol Blue), 라크모이드(Lacmoid), 메타닐 엘로우(Metanil Yellow), 메틸 오렌지(Methyl Orange), 메틸 오렌지-자일렌 시아놀 FF(Methyl Orange-Xylene Cyanol FF), 메틸 오렌지-자일렌 시아놀 FF-페놀프탈레인(Methyl Orange-Xylene Cyanol FF-Phenolphthalein), 메틸 오렌지-인디고 카민(Methyl Orange-Indigo Carmine), 메틸 레드(Methyl Red), 메틸 레드-메틸렌 블루(Methyl Red-Methylene Blue), 메틸 티몰 블루(Methyl Thymol Blue), 메틸 엘로우(Methyl Yellow), 내추럴 레드(Neutral Red), 내추럴 레드-브로모티몰 블루(Neutral Red-Bromothymol Blue), 피크릴메틸 니트라민(Picrylmethyl nitramine), p-니트로페놀(p-Nitrophenol), 페놀프탈레인(Phenolphthalene), 페놀프탈레인-티몰프탈레인(Phenolphthalein-Thymolphthalein), 페놀 레드(Phenol Red), 푸아르리 블루 4B(Poirrier's Blue 4B), 피로카테콜 바이올렛(Pyrocatechol Violet), 1-(2-피리딜아조)-2-나프톨(1-(2-Pyridylazo)-2-naphthol), 피리딜아조 나프톨-Cu. EDTA(Pyridylazo naphthol-Cu.EDTA mixed indicator), 로졸산(Rosolic Acid), 살리실산(Salicylic Acid), 녹말 용액(Starch Solution), 테트라브로무페놀 블루(Tetra bromophenol Blue), 토린(Thorin), 티몰 블루(Thymol blue), 티몰 블로 페놀프탈레인(Thymol Blue-Phenolphthalein), 티몰프탈레인(Thymolphthalene), 티론(Tiron), 1,3,5-트리나이트로벤젠(1,3,5-Trinitrobenzene), 트로필린 O(Tropeoline O), 트로필린(Tropeoline), 바리아민 블루 B(Variamine Blue B), 자일레놀 오렌지(Xylenol Orange), 진콘(Zincon) 중 어느 하나 이상을 사용하는 것을 특징으로 하는 색도 측정을 이용한 미생물 농도 측정 방법.Generating a color change and population change correlation curve representing a correlation between a population change database constructed from a color change database and a population change database constructed from a method for measuring microbial color change using chromaticity measurement; And
And comparing the color change and the population change correlation curve with the chromaticity change result of the measurement subject microbe to derive the concentration of the measurement subject microbe,
A method for measuring the number of microorganisms,
Preparing a microbial sample by dilution by concentration in a concentration range of 1 to 10 10 CFU / ml;
Measuring the number of microbial populations by culturing the microbial sample on a culture medium by any one of the following methods: smear plating method, turbidity measurement method, laser fluorescence scattering method and flow counter measurement method;
A step of deriving a population change trend line for deriving a population change trend line indicating a correlation between the population of microorganisms and the cultivation time measured by the population count change step for each microorganism concentration; And
And generating and storing a population change database for each microbe concentration on the basis of the population change trend line,
A method for measuring color change of a microorganism using the chromaticity measurement,
Preparing a microbial sample by dilution by concentration in a concentration range of 1 to 10 10 CFU / ml;
The color of the culture medium to which the pH indicator was added or the color of the pH indicator containing the pH indicator was changed to RGB camera, DSLR (Digital Single Lens Reflex) camera and a spectrophotometer using a color measurement device;
A chroma value calculating step of calculating a chroma value of the color of the pH indicator measured through the color change measuring step as an RGB value;
A color change trend line derivation step of deriving a color change trend line indicating a correlation between the RGB value calculated through the chroma value calculation step and the incubation time for each microbe concentration; And
Generating and storing a color change database for each microbe concentration based on the color change trend line; / RTI >
The color change tendency line corresponds to the trend that the time to reach the equilibrium state in which the R, G, and B values do not change as the microbial concentration increases, and the slope changes.
The pH indicator may be selected from the group consisting of Alizarin Red, Alizarin Yellow, Alizarin Red S, E.Bogen, Bromocresol Green, Bromocresol Green- Bromocresol Green-Chlorophenol Red, Bromocresol Green-Methyl Red, Bromocresol Green-Methyl Yellow, Bromocresol Purple, Bromocresol Green- Such as Bromophenol Blue, Bromothymol Blue, Bromothymol Blue-Phenol Red, Calcein, Calcon, Calmagite, Red, Red, Congo Red, Chlorophenol Red, o-Cresolphthalene, Cresol Red, Cresol Red-Thymol Blue, ), Cromazurol S, Curcumin, 2,5-dinitrophenol (2,5-Dini trophenol, 2,6-dinitrophenol, diphenylamine solution, Dithizone Alcohol Solution, Eriochrome Black T, hydroxy- Such as Hydroxynaphthol Blue, Lacmoid, Metanil Yellow, Methyl Orange, Methyl Orange-Xylene Cyanol FF, Methyl Orange- Methylene Orange-Indigo Carmine, Methyl Red, Methyl Red-Methylene Blue, Methyl Red-Methylene Blue, Methyl Orange-Xylene Cyanol FF-Phenolphthalein, Methyl Thymol Blue, Methyl Yellow, Neutral Red, Neutral Red-Bromothymol Blue, picrylmethyl nitramine, p- Nitrophenol (p-nitrophenol), phenolphthalene (phenolphthalene), phenol Phenolphthalein-Thymolphthalein, Phenol Red, Poirrier's Blue 4B, Pyrocatechol Violet, 1- (2-pyridylazo) -2 1- (2-Pyridylazo) -2-naphthol), pyridylazonaphthol-Cu. EDTA (Pyridylazo naphthol-Cu.EDTA mixed indicator), Rosolic Acid, Salicylic Acid, Starch Solution, Tetrabromophenol Blue, Thorin, Thymol blue, Thymol Blue-Phenolphthalein, Thymolphthalene, Tiron, 1,3,5-Trinitrobenzene, tropylin O Wherein at least one of Tropeoline O, Tropeoline, Variamine Blue B, Xylenol Orange and Zincon is used. Method of measuring concentration.
상기 측정 대상 미생물의 농도를 도출하는 단계는,
측정 대상 미생물을 pH 지시약이 포함된 배양 배지에서 배양하는 단계;
상기 배양하는 단계에서 배양 시간별로 나타나는 pH 변화에 따라 변색되는 배지의 색의 색도를 RGB 값으로 산출하여 상기 측정 대상 미생물의 색도 변화를 측정하는 단계;
상기 산출된 RGB 값과 배양 시간 사이의 상관관계를 나타내는 측정 대상 미생물의 색변화 추세선을 도출하는 단계; 및
상기 측정 대상 미생물의 색변화 추세선과 미리 생성된 색변화 및 개체수 변화 상관 곡선을 비교함으로서 측정 대상 미생물의 농도를 도출하는 단계;를 포함하는 특징으로 하는 색도 측정을 이용한 미생물 농도 측정 방법.11. The method of claim 10,
Wherein the step of deriving the concentration of the microorganism to be measured comprises:
Culturing the microorganism to be measured in a culture medium containing a pH indicator;
Measuring the chromaticity of the microorganism to be measured by calculating the chromaticity of the color of the medium which is discolored according to the pH change appearing in the incubation step as the RGB value;
Deriving a color change trend line of the microorganism to be measured, which indicates a correlation between the calculated RGB value and the incubation time; And
And comparing the color change trend line of the microorganism to be measured with the previously generated color change and population change correlation curve to determine the concentration of the microorganism to be measured.
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