KR101918244B1 - Composition for promoting apple regeneration and method for mass propagation of apple seedling preventing virus infection using 2-step leaf explant culture - Google Patents

Composition for promoting apple regeneration and method for mass propagation of apple seedling preventing virus infection using 2-step leaf explant culture Download PDF

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김진호
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충북대학교 산학협력단
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Abstract

The present invention relates to a composition for promoting apple regeneration and an efficient apple regeneration enhancing method via two-step leaf explant culture using the same and, more specifically, to a medium composition containing an MS medium having 0.1-2.0 mg/L of thidiazuron (TDZ), 0.1-0.5 mg/L of naphthalene acetic acid (NAA), 25-35 g/L of sucrose, and 6-10 g/L of agar as active ingredients to regenerate shoots from apple leaf explants, a method of enhancing regeneration of shoots from apple leaf explants using the same, and a manufacturing method of a regenerated apple plant. According to the present invention, the medium composition for shoot regeneration and the manufacturing method of an apple plant can efficiently regenerate shoots from apple leaf explants and produce virus-detoxified trees in large quantities.

Description

사과 재분화 촉진용 조성물 및 ２단계 엽편배양을 통한 바이러스 무독화 사과묘목의 대량생산 방법{Composition for promoting apple regeneration and method for mass propagation of apple seedling preventing virus infection using 2-step leaf explant culture}[Technical Field] The present invention relates to a composition for promoting apple regeneration and a method for mass-producing virus-detoxified apple seedlings using a two-step leaflet culture.

본 발명은 사과 재분화 촉진용 조성물 및 2단계 엽편배양을 통한 바이러스 무독화 사과묘목의 대량생산 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a composition for promoting apple regrowth and a method for mass production of virus-detoxified apple seedlings through a two-step leaflet culture.

사과(Malus domestica)는 주요 과수원예작물 중 하나로 전체 과실생산액의 20.6%를 차지하고 있으며, 최근 사과 가격의 호조, 신규 과원 조성 시 지자체의 지원 등으로 재배면적이 증가하고 있다. 이와 더불어 우량 사과묘목의 필요성 또한 증대되고 있으며 사과묘목의 생산은 농업분야의 고부가가치 산업으로 인식되고 있다. 그러나 사과를 포함한 영년생 과수묘목은 2∼3년간 번식 및 육묘하여 종묘가 보급되고 있으나 기지현상에 의해 연작이 어렵고, 산업화 및 도시화로 이동해야 할 대규모 육묘장 확보가 매우 어려워 묘목산업이 대규모화 되지 못하고 영세하다. 또한, 국내 대부분의 과수 묘목 재배 방식은 시설이 아닌 일반 노지에서 재배하는 방식이므로 환경의 영향을 상당히 많이 받는다. 또한 사과 묘목은 접목을 이용하여 번식시키므로 대목과 접수가 필요하며 사과 대목은 삽목이 어렵기 때문에 증식을 위해 취목(휘묻이)을 이용하게 되는데, 이 경우 균일한 대목의 확보가 어렵다. 현재 중앙과수묘목관리센터에서 무병대목을 생산하여 공급하지만 그 생산량이 턱없이 부족하여 원하는 만큼의 수량을 확보할 수가 없으며 이로 인한 무병묘목의 생산율과 보급률이 매우 낮은 문제점이 있다. Apple (Malus domestica) is one of the major orchard crops, accounting for 20.6% of the total fruit production. Recently, the cultivation area has been increasing due to the favorable price of apples and the support of local governments in the establishment of new clusters. In addition, the need for good apple seedlings is increasing, and the production of apple seedlings is recognized as a high value-added industry in the agricultural sector. However, young seedlings, including apples, are reproduced and cultivated for two to three years, and seedlings are distributed, but it is difficult to serialize them due to the base phenomenon, and it is very difficult to secure a large nursery to be moved to industrialization and urbanization. It is small. In addition, most of the domestic fruit tree seedlings are cultivated in general, rather than in the facility, so they are affected by the environment considerably. In addition, apple seedlings are propagated by grafting, so they need to be harvested and received, and apple trees are difficult to cut, so they use the stem for propagation. In this case, it is difficult to obtain uniform trees. Currently, there is a problem that the production rate and penetration rate of disease-free seedlings is very low due to the inability to obtain the desired quantity of seedlings because the seedlings are produced and supplied from the center and the seedlings management center.

한편, 사과의 바이러스는 생육과 생산량, 품질 등에 크게 영향을 미쳐 국내에서도 농식품 지원으로 농협연합회에서 중앙과수묘목관리센터를 설립하고 무병종묘 보급에 힘쓰고 있어 농가의 무병종묘 보급 요구가 급증하고 있다. 대규모 무병종묘 번식체계가 확립되지 않아 대목의 경우 네덜란드에서 무병종묘를 수입하여 취목번식하고 있으며, 일부 접수 품종의 무병종묘가 확보되어 있으나 생산량이 부족하여 묘목산업으로부터의 요청에 크게 미치지 못하는 실정이다. On the other hand, the virus of apple has a great influence on the growth, production, quality, etc., and the demand for the distribution of disease free seedlings of the farm household is increasing rapidly because the center of the Nonghyup Association is established at the NACF . In the case of the large-scale disease-free seedling breeding system, the seedlings are imported from the Netherlands in the case of the free-seedling seedlings, and the seedless seedlings of some of the received seedlings are secured, but the production is insufficient to meet the demand from the seedling industry.

식물체가 바이러스에 감염되면 품질과 수량이 30~50% 이상 떨어지게 되나, 직접적인 치료방법이 없기 때문에 정단분열조직(생장점) 배양을 통한 무병종묘를 육성하고 이를 이용하는 것이 현재 가장 효과적인 방법이다. 따라서 사과에서는 예전부터 무독묘를 획득하기 위하여 생장점 배양이 이루어져 왔다. 사과목에 존재하는 바이러스는 대부분 목부조직의 도관부를 통해 이동하게 되는데 생장점이 분포하고 있는 경정 부위는 도관이 발달 되어 있지 않아 바이러스가 침투하지 못한다. 따라서 병에 걸리지 않은 건전한 사과목을 생산하기 위해서 생장점, 혹은 경정배양 단계는 필수적으로 선행되어야 한다. 이때 절단된 생장점의 크기가 1mm 내외로 작기 때문에 생존율이 매우 낮고 따라서 이러한 생장점의 생존율을 높이기 위한 배지의 개발은 건전묘 생산 방법에서 매우 중요한 요인이고 할 수 있다. When the plant is infected with the virus, the quality and yield are lowered by 30 ~ 50%. However, since there is no direct treatment method, it is the most effective method to nurture and utilize disease free seedling through cultivation of apical meristem (growth point). Therefore, apple has been cultivated in order to acquire non-toxic seedlings. Most viruses in the apple tree migrate through the ducts of the throat tissues. The vaginal area where the growth points are distributed does not penetrate the virus because the conduits are not developed. Therefore, in order to produce a healthy apple tree that is not diseased, a growth point or a cultivation step must be preceded. Since the size of the cut - off point is as small as 1mm, the survival rate is very low. Therefore, the development of a medium for increasing the survival rate of such a growth point is very important factor in the production method of healthy seedlings.

또한, 생장점 배양과 더불어 기내 잎 절편배양 또한 바이러스를 제거하는 중요한 방법 중 하나이다. 바이러스는 대부분 줄기의 도관 부위를 따라 이동하므로 잎 절편에서 캘러스를 유도하고 이로부터 식물체를 재분화시킬 경우 도관을 따라 이동하는 바이러스의 감염을 차단하는 효과가 있다. In addition, in vitro leaf blade culture is one of the important ways to remove viruses. Most of the viruses move along the ducts of the stem. Therefore, when the callus is induced from the leaf slice and the plant is regenerated from the leaf slice, it is effective to block the infection of the virus moving along the duct.

그러나 현재 사과의 무독화묘를 효과적으로 대량 증식시킬 수 있는 기술이 개발되지 못하고 있어 이에 대한 새로운 기술개발이 필요한 실정이다. However, there is a need to develop a new technology for the effective reproduction of apples.

대한민국 공개특허 제10-2013-0071254호Korean Patent Publication No. 10-2013-0071254

이에 본 발명자들은 바이러스 이병주에서 무독화율을 증가시키고, 무독화묘의 대량 증식을 위한 새로운 방법으로서, 기내묘에서 다량 수득할 수 있는 잎 절편에서 신초를 재분화시키기 위한 최적 조건을 확립하였고, 실제 잎 절편 배양 시 2배 이상의 재분화율 증가 효과를 확인함으로써 본 발명을 완성하였다. Accordingly, the present inventors have established an optimum condition for regeneration of shoots in leaf sections obtained in a large number of seedlings in the cabin as a new method for increasing the detoxification rate in virus strain and mass proliferation of detoxified seedlings, The present inventors have completed the present invention by confirming the effect of increasing the regeneration rate at least twice.

따라서 본 발명의 목적은 사과 잎 절편으로부터 신초를 재분화하기 위한 최적의 배지 조성물을 제공하는 것이다.It is therefore an object of the present invention to provide an optimum medium composition for regrowth of shoots from apple leaf slices.

본 발명의 다른 목적은 사과 잎 절편으로부터 신초의 재분화를 증진시키는 방법을 제공하는 것이다. Another object of the present invention is to provide a method for promoting shoot regeneration from apple leaf slices.

본 발명의 또 다른 목적은 바이러스 무독화된 재분화 사과 식물체의 대량 제조방법을 제공하는 것이다.It is still another object of the present invention to provide a method for mass-producing virus-detoxified regenerated apple plants.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 티디아주론(thidiazuron; TDZ) 0.1~2.0 mg/L, 나프탈렌아세트산(NAA) 0.1~0.5 mg/L, 수크로스 25~35 g/L 및 아가 6~10 g/L가 첨가된 MS 배지를 유효성분으로 함유하는, 사과 잎 절편으로부터 신초를 재분화하기 위한 배지 조성물을 제공한다.In order to accomplish the object of the present invention, the present invention provides a pharmaceutical composition comprising 0.1 to 2.0 mg / L of thidiazuron (TDZ), 0.1 to 0.5 mg / L of naphthalene acetic acid (NAA), 25 to 35 g / L of sucrose And an MS medium supplemented with 6 to 10 g / L of agar as an active ingredient, is provided for regeneration of shoots from apple leaf slices.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 배지 조성물의 pH는 5.7~5.8일 수 있다. In one embodiment of the present invention, the pH of the culture medium may be 5.7 to 5.8.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물에는 뷰티르산(BA)이 0~2.0 mg/L의 농도로 함유되어 있는 것일 수 있다. In one embodiment of the present invention, the composition may contain 0 to 2.0 mg / L of butyric acid (BA).

또한, 본 발명은 사과의 잎 절편을 티디아주론(thidiazuron; TDZ) 0.1~2.0 mg/L, 나프탈렌아세트산(NAA) 0.1~0.5 mg/L, 수크로스 25~35 g/L 및 아가 6~10 g/L가 첨가된 MS 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 사과 잎 절편으로부터 신초의 재분화를 증진시키는 방법을 제공한다.In addition, the present invention relates to a leaf blade of apple, wherein the leaf slice of apple is blended with 0.1 to 2.0 mg / L of thidiazuron (TDZ), 0.1 to 0.5 mg / L of naphthalene acetic acid (NAA), 25 to 35 g / L of sucrose, lt; RTI ID = 0.0 > g / L < / RTI > in an MS medium.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 잎 절편은 잎의 중앙 엽맥이 포함되어 있는 것일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the leaf slice may include the central vein of the leaf.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 배지의 pH는 5.7~5.8일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the pH of the culture medium may be 5.7 to 5.8.

나아가 본 발명은, (1) 사과의 잎 절편을 티디아주론(thidiazuron; TDZ) 0.1~2.0 mg/L, 나프탈렌아세트산(NAA) 0.1~0.5 mg/L, 수크로스 25~35 g/L 및 아가 6~10 g/L가 첨가된 MS 배지 조성물로 8~9주간 배양하여 신초를 유도하는 1단계 엽편배양 단계; (2) 상기 1단계 엽편배양에서 사용된 배지 조성물로 3~4주간 더 배양 후, 티디아주론(thidiazuron; TDZ)이 0.1~0.2 mg/L으로 첨가된 MS 배지 조성물로 계대배양하는 2단계 엽편배양 단계; 및 (3) 상기 유도된 신초를 MS 배지에 치상하여 발근을 유도하는 단계를 포함하는, 재분화된 사과 식물체 제조방법을 제공한다. Further, the present invention relates to a method of producing a leaf blade comprising the steps of (1) blending leaf slices of apple with 0.1 to 2.0 mg / L of thidiazuron (TDZ), 0.1 to 0.5 mg / L of naphthalene acetic acid (NAA), 25 to 35 g / Step culture step in which shoots are induced by culturing in an MS medium composition containing 6 to 10 g / L for 8 to 9 weeks; (2) the medium composition used in the above-mentioned first stage leaf culture was further cultured for 3 to 4 weeks and then cultured in a second stage liposome composition which was subcultured in an MS medium composition in which thidiazuron (TDZ) was added in an amount of 0.1 to 0.2 mg / A culture step; And (3) inducing rooting by directing the induced shoots to an MS medium, thereby providing a regenerated apple plant producing method.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 배지 조성물의 pH는 5.7~5.8일 수 있다. In one embodiment of the present invention, the pH of the culture medium may be 5.7 to 5.8.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 배양은 광조건을 약광으로 10 μmol·m-2·s-1 PPFD 조건 하에서 1주일 동안 배양하고 강광으로 35~40 μmol·m-2·s-1 PPFD 조건 하에서 조사하는 것일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the culturing is carried out by culturing the light condition under weak light conditions of 10 μmol · m -2 · s -1 PPFD for 1 week and irradiating light with 35 to 40 μmol · m -2 · s -1 PPFD Under investigation.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 사과의 잎 절편은 잎의 중앙 엽맥이 포함되어 있는 것일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the leaf slice of the apple may contain the central vein of the leaf.

본 발명은 티디아주론(thidiazuron; TDZ) 0.1~2.0 mg/L, 나프탈렌아세트산(NAA) 0.1~0.5 mg/L, 수크로스 25~35 g/L 및 아가 6~10 g/L가 첨가된 MS 배지를 유효성분으로 함유하는 사과 잎 절편으로부터 신초를 재분화하기 위한 배지 조성물, 상기 배지 조성물을 이용한 사과 잎 절편으로부터 신초의 재분화를 증진시키는 방법 및 재분화된 사과 식물체의 제조방법에 관한 것으로, 본 발명의 신초 재분화용 배지 조성물은 사과의 잎 절편으로부터 신초의 재분화를 효율적으로 유도할 수 있고 바이러스에 의한 감염을 차단할 수 있어 바이러스 무독화 사과목의 대량생산을 가능하게 할 수 있다. The present invention relates to a process for the preparation of a medicament for the treatment of MS with 0.1 to 2.0 mg / L of thidiazuron (TDZ), 0.1 to 0.5 mg / L of naphthalene acetic acid (NAA), 25 to 35 g / L of sucrose and 6 to 10 g / The present invention relates to a medium composition for regeneration of shoots from apple leaf slices containing a medium as an active ingredient, a method for promoting regeneration of shoots from apple slices using the medium composition, and a method for preparing regenerated apple plants, The medium composition for shoot regeneration can efficiently induce shoot regeneration from leaf slices of apple and can prevent infection by viruses, thereby enabling mass production of virus-detoxified apple tree.

도 1은 본 발명의 신초 재분화 배지조건 하에서 4주간 배양 후, 사과 왜성대목 M.9 기내묘의 잎 절편에서 신초 재분화된 사진을 나타낸 것이며, a는 사과 왜성대목의 잎 절편체 치상을 나타낸 것이고, b 잎 중앙옆맥에서 캘러스가 형성된 것을 나타낸 것이며, c 내지 f는 캘러스에서 신초재분화된 것을 나타낸 것이다(4~8주).
도 2는 기외에서 재배된 사과 홍로의 잎절편에서 본 발명의 방법에 의한 신초 재분화된 사진을 나타낸 것으로, 1단계 배양에 의한 신초 재분화 사진(좌)과 2단계 배양에 의한 신초 재분화 사진(우)를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 방법에 의해 재분화되어 증식된 사과 기내묘(좌) 및 발근(우) 형태를 사진으로 나타낸 것이다.Fig. 1 is a photograph showing shoot regeneration in leaf slices of the seedlings of apple dwarf macrophyllum M.9 after 4 weeks of cultivation under shoot regeneration medium conditions of the present invention. (C) to (f) show shoot regeneration in callus (4-8 weeks).
FIG. 2 is a photograph showing the shoot regeneration by the method of the present invention in a leaf slice of an apple red flour cultivated in the out-of-flight, wherein the shoot regeneration photograph (left) and the shoot regeneration photograph (left) .
Fig. 3 is a photograph showing the seedling (left) and rooting (right) form of the apple which was regenerated by the method of the present invention and propagated.

본 발명은 종래 재분화가 어려웠던 사과의 재분화를 효과적으로 증진시킬 수 있으며 바이러스 감염 위험도를 해소할 수 있는 바이러스 무독화 사과묘의 대량 생산방법을 고안한 점에 특징이 있다.The present invention is characterized in that a method for mass production of virus-detoxified apple seedlings, which can effectively promote regeneration of apples which had been difficult to regenerate in the past and can eliminate the risk of virus infection, is developed.

앞서 종래기술에서도 기술한 바와 같이, 사과 묘목은 묘목산업이 대규모화 되지 못하고 있으며, 균일한 대목 확보를 못하고 있는 실정이고 바이러스 감염을 차단할 수 있는 방법에 대한 연구가 미비한 실정이다.As described in the prior art, the seedlings industry of apple tree seedlings has not been made large scale, and uniform seedlings can not be secured, and there is no research on a method for blocking virus infection.

이에 본 발명자들은 사과의 무병묘목을 대량생산하기 위한 기술을 연구하던 중, 사과 신초의 재분화를 위한 최적의 배지 조건을 확립하였는데, 이를 위해 각기 다른 배양 조건하에서 사과 잎 절편을 이용하여 신초 재분화율이 가장 우수한 최적 조건을 규명하였다.Therefore, the present inventors established optimal conditions for regeneration of apple shoots while studying techniques for mass production of apple seedless seedlings. For this purpose, the shoot regeneration rate using apple leaf slices under different culture conditions And the optimum conditions for the best results were identified.

먼저, 본 발명에서 제공하는 사과 잎 절편으로부터 신초를 재분화하기 위한 배지 조성물은 티디아주론(thidiazuron; TDZ) 0.1~2.0 mg/L, 나프탈렌아세트산(NAA) 0.1~0.5 mg/L, 수크로스 25~35 g/L 및 아가 6~10 g/L가 첨가된 MS 배지를 유효성분으로 함유한다.First, the medium composition for regeneration of shoots from the apple leaf slices according to the present invention comprises 0.1 to 2.0 mg / L of thidiazuron (TDZ), 0.1 to 0.5 mg / L of naphthalene acetic acid (NAA) 35 g / L and 6 to 10 g / L of agar as an active ingredient.

본 발명의 일실시예에 따르면, 티디아주론(thidiazuron; TDZ), 나프탈렌아세트산(NAA), 수크로스 및 아가를 각기 다른 함량으로 첨가된 MS 배지 조건하에서 사과 잎절편으로부터의 신초 재분화율을 분석하였는데, 그 결과 티디아주론(thidiazuron; TDZ) 0.1~2.0 mg/L, 나프탈렌아세트산(NAA) 0.1~0.5 mg/L, 수크로스 25~35 g/L 및 아가 6~10 g/L가 함유된 MS 배지를 유효성분 하는 배지 조성물을 사용할 경우, 가장 재분화율이 우수함을 확인할 수 있었다. 나아가 상기 배지 조성물에서 티디아주론(thidiazuron; TDZ)은 2.0 mg/L의 양으로 첨가되고 나프탈렌아세트산(NAA)는 0.1~0.2mg/L의 양으로 첨가된 군이 가장 높은 신초 재분화율을 나타내었다.According to one embodiment of the present invention, shoot regeneration rates from apple leaf slices were analyzed under MS medium supplemented with different amounts of thidiazuron (TDZ), naphthalene acetic acid (NAA), sucrose and agar , Resulting in an MS containing 0.1 to 2.0 mg / L of thidiazuron (TDZ), 0.1 to 0.5 mg / L of naphthalene acetic acid (NAA), 25 to 35 g / L of sucrose and 6 to 10 g / It was confirmed that the best regemination rate was obtained when the medium composition containing the medium as the active ingredient was used. Furthermore, in the medium composition, thidiazuron (TDZ) was added in an amount of 2.0 mg / L and naphthalene acetic acid (NAA) in an amount of 0.1 to 0.2 mg / L showed the highest shoot regrowth rate .

또한 본 발명의 배지 조성물은 pH가 5.7~5.8인 조건을 유지하도록 하였고, 상기 조성물에는 뷰티르산(BA)을 0~2.0 mg/L의 농도로 추가로 포함할 수 있다.Also, the medium composition of the present invention is maintained at a pH of 5.7 to 5.8, and the composition may further include a concentration of 0 to 2.0 mg / L of butyric acid (BA).

본 발명에 따른 사과의 무병묘목 대량생산을 위해, 본 발명자들은 신초 재분화를 사과의 잎 절편을 사용하였는데, 이는 바이러스는 대부분 목부조직의 도관부 및 줄기의 도관부위를 따라 이동하므로 이러한 바이러스 감염의 차단을 위해 바이러스가 이동되지 못하는 잎 절편을 선택하여 사용하였다.For the mass production of apple seedless seedlings according to the present invention, the present inventors used apple leaf slices as shoot regeneration, since the virus mostly travels along the ducts of the throat tissues and the ducts of the stem, Leaf sections that did not migrate to virus were selected and used.

또한 본 발명에 따른 상기 잎 절편은 잎의 중앙 엽맥이 포함되도록 하였다. 이는 중앙 엽맥이 포함되어야 재분화율이 증가할 수 있기 때문이다.In addition, the leaf slice according to the present invention included the central vein of the leaf. This is because the regeneration rate can be increased if the central vein is included.

따라서 사과의 잎 절편을 본 발명에서 개발한 상기 배지 조성물로 배양할 경우, 사과 잎 절편으로부터 신초의 재분화를 효율적으로 증진시킬 수 있다.Therefore, when the apple leaf slice is cultured with the above-mentioned medium composition developed in the present invention, shoot regeneration from the apple leaf slice can be efficiently promoted.

그러므로 본 발명은 사과의 잎 절편을 티디아주론(thidiazuron; TDZ) 0.1~2.0 mg/L, 나프탈렌아세트산(NAA) 0.1~0.5 mg/L, 수크로스 25~35 g/L 및 아가 6~10 g/L가 첨가된 MS 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 사과 잎 절편으로부터 신초의 재분화를 증진시키는 방법을 제공한다.Therefore, the present invention relates to a method for producing apple leaf slices, comprising applying 0.1 to 2.0 mg / L of thidiazuron (TDZ), 0.1 to 0.5 mg / L of naphthalene acetic acid (NAA), 25 to 35 g / L of sucrose and 6 to 10 g / L < / RTI > in a medium supplemented with MS.

나아가 본 발명자들은 본 발명의 배지 조성물을 이용하여 바이러스 무독화 사과 식물체를 제조하는 방법을 확립하였는데, 구체적으로 상기 방법은, (1) 사과의 잎 절편을 티디아주론(thidiazuron; TDZ) 0.1~2.0 mg/L, 나프탈렌아세트산(NAA) 0.1~0.5 mg/L, 수크로스 25~35 g/L 및 아가 6~10 g/L가 첨가된 MS 배지 조성물로 8~9주간 배양하여 신초를 유도하는 1단계 엽편배양 단계; (2) 상기 1단계 엽편배양에서 사용된 배지 조성물로 3~4주간 더 배양 후, 티디아주론(thidiazuron; TDZ)이 0.1~0.2 mg/L으로 첨가된 MS 배지 조성물로 계대배양하는 2단계 엽편배양 단계; 및 (3) 상기 유도된 신초를 MS 배지에 치상하여 발근을 유도하는 단계를 포함한다.In addition, the present inventors have established a method for producing a virus-detoxified apple plant using the medium composition of the present invention. Specifically, the method comprises (1) blending leaf slices of apple with thidiazuron (TDZ) 1 to induce shoots in an MS medium composition containing MS / L, 0.1 to 0.5 mg / L of naphthalene acetic acid (NAA), 25 to 35 g / L of sucrose and 6 to 10 g / Step leaf culture step; (2) the medium composition used in the above-mentioned first stage leaf culture was further cultured for 3 to 4 weeks, and then cultured in a second stage liposome composition for subculture in an MS medium composition in which thidiazuron (TDZ) was added in an amount of 0.1 to 0.2 mg / A culture step; And (3) inducing rooting by directing the induced shoots to an MS medium.

즉, 본 발명자들은 본 발명의 배지 조성물을 이용하고 2단계 엽편배양을 통해 재분화된 바이러스 무독화 사과묘(사과 식물체)를 대량생산할 수 있는 방법을 확립하였는데, 상기 방법을 보다 구체적으로 설명하면 다음과 같다. That is, the inventors of the present invention have established a method for mass-producing the virus-detoxified apple seedlings (apple plant) regenerated through the 2-stage leaf culture using the medium composition of the present invention. More specifically, same.

먼저, 사과의 잎 절편을 본 발명에 따른 상기 신초 재분화용 배지 조성물을 이용하여 1단계 엽편배양을 통해 신초를 유도한다.First, shoots of apple are obtained by culturing the leaf slice of the apple through the first stage leaf culture using the medium composition for regeneration of shoot according to the present invention.

이때 상기 배지 조성물은 티디아주론(thidiazuron; TDZ) 0.1~2.0 mg/L, 나프탈렌아세트산(NAA) 0.1~0.5 mg/L, 수크로스 25~35 g/L 및 아가 6~10 g/L가 첨가된 MS 배지 조성물이고, 1단계 엽편배양은 8~9주간 배양할 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는 8주간 동안 배양하였다.Wherein the medium composition comprises 0.1 to 2.0 mg / L of thidiazuron (TDZ), 0.1 to 0.5 mg / L of naphthalene acetic acid (NAA), 25 to 35 g / L of sucrose and 6 to 10 g / , And the first stage leaf culture can be cultured for 8 to 9 weeks. In one embodiment of the invention, the cells were cultured for 8 weeks.

1단계 엽편배양이 완료되면, 이후 1단계 엽편배양 조건으로 3~4주간 더 배양 후, 티디아주론(thidiazuron; TDZ)의 함량만을 0.1~0.2 mg/L로 감소시킨 배지로 계대배양하는 2단계 엽편배양을 수행한다. 또한 상기 계대배양은 매 4주마다 새 배지로 교체하면서 2단계 엽편배양을 수행한다.After completion of the first step leaf culture, the cells were further cultured for 3 to 4 weeks in the first step leaf culture condition, and then cultured in a medium in which the content of thidiazuron (TDZ) was reduced to 0.1 to 0.2 mg / L Leaf culture is performed. In addition, the subculture is carried out every two weeks by replacing the medium with fresh medium every 4 weeks.

상기 배양과정에서, 1단계 엽편배양이 2단계 엽편배양에 비해 TDZ의 농도를 높게 처리하여 배양하였는데, 이는 생장점이 분화되어 있는 재분화능이 높은 캘러스를 유도하기 위함이며, 또한 캘러스를 유도한 다음 이로부터 신초를 유도함으로써 직접적으로 신초가 발생할 경우 도관부를 통해 옮겨가는 바이러스 이병을 막기 위함이다. In the culturing process, the first stage leaf culture was cultured by treatment with a higher concentration of TDZ than the second stage leaf culture, in order to induce the callus having a high regenerative ability with differentiated growth points, This is to prevent the virus from moving through the duct if direct shoots are induced by inducing shoots.

또한, 높은 농도의 TDZ 처리에 의한 1단계 배양 후에는 TDZ 농도를 낮춘 2단계 배양을 진행하는데 TDZ의 농도를 낮춰 배양을 하는 이유는, 높은 농도의 생장조절제가 첨가된 배지에서만 배양을 하게 되면 신초가 자라지 않고 캘러스 증식만 이루어지는 문제가 발생할 수 있기 때문이다. 따라서 재분화능이 있는 캘러스로부터 신초를 유도하기 위해서는 NAA와 같은 오옥신을 제거하고 생장조절제의 농도가 낮은 배지에서 2차 배양을 진행한다.In addition, after one step cultivation by high-concentration TDZ treatment, two-stage cultivation with lower TDZ concentration is carried out. The reason for culturing by lowering the concentration of TDZ is that cultivation is carried out only on a medium supplemented with a high- The callus may be only propagated without growing. Therefore, in order to induce shoots from regenerated callus, dioxins such as NAA are removed and secondary cultivation is carried out in a medium having a low concentration of growth regulator.

한편, 본 발명에서는 2단계에 걸쳐 엽편배양을 수행하였는데, 엽편을 이용하여 신초 형성 및 식물체 재분화를 유도하는 배양 방법은 식물이 가지고 있는 전형성능(totipotency, 全形成能)을 이용하는 것으로, 단세포 혹은 식물 조직 일부분으로부터 완전한 식물체가 재생되는 능력을 말한다. 모든 세포가 전형성능을 지니고 있지만 세포조직의 분화 정도, 채취 부위, 배지의 조성, 배양환경 등에 따라 발현되는 결과는 현저히 차이가 나므로, 작물별로 또는 품종별로 배양 조건을 최적화하는 것이 필요하다. 보통 엽편으로부터 신초 재분화(shoot regeneration)를 유도하려면 미분화된 부정형의 세포덩어리인 캘러스(callus) 형성 이후, 신초가 형성되는 과정을 거치게 되므로, 배양 초기 왕성한 캘러스 형성 능력 또는 직접적인 신초 분화 능력을 유도하는 배양 조건을 찾는 것이 가장 중요하다.Meanwhile, in the present invention, the leaf culture was performed in two stages. The culture method for inducing shoot formation and plant regeneration using the leaf blade is based on the totipotency (total formation ability) Refers to the ability of a complete plant to be regenerated from a portion of the tissue. Although all the cells have typical performance, the results expressed by the degree of differentiation of the cell tissue, the harvesting site, the composition of the medium, and the culture environment are significantly different. Therefore, it is necessary to optimize the culturing conditions for each crop or variety. In order to induce shoot regeneration from shoots, it is necessary to cultivate callus, which is undifferentiated amorphous cell mass, to undergo shoot formation, Finding the condition is most important.

이러한 점에서 본 기술은 사과를 대상으로 최대의 캘러스 형성율 및 신초 재분화율을 유도할 수 있는 방법으로, 사과의 잎절편을 이용한 엽편배양의 최적 조건을 확립하였다. From this point of view, this technique was able to induce maximum callus formation rate and shoot regeneration rate in apple, and the optimal condition of leaf blade culture using apple leaf slice was established.

나아가, 상기 2단계에 걸쳐 엽편배양이 완료되면, 유도된 신초는 MS 배지에 치상하여 발근을 유도하는 단계를 통해 재분화된 사과 식물체를 대량생산할 수 있다.Further, when the leaf blade culture is completed through the above two steps, the induced shoots can be mass-produced in the regenerated apple plant by inducing rooting to the MS medium.

재분화 사과 식물체 생산을 위해, 배양 시 광조사를 함께 병행하였는데, 이때 광조사 조건은 약광으로 10 μmol·m-2·s-1 PPFD 조건 하에서 1주일 동안 배양하고 강광으로 35~40 μmol·m-2·s-1 PPFD 조건 하에서 조사한다.In order to produce regenerated apple plants, light irradiation was carried out simultaneously during the incubation. The light irradiation conditions were as follows: light irradiation at 10 μmol · m -2 · s -1 PPFD for 1 week, 35 ~ 40 μmol · m - 2 · s -1 Investigate under PPFD conditions.

본 발명에 따른 상기 광조사는 1단계 엽편배양 및 2단계 엽편배양의 총 기간 동안 조사할 수 있으며, 상기 약광 조사는 1단계의 초기 1주에만 조사하는 것이 바람직하다. 이는 옆 절편체를 절단한 다음, 스트레스를 받은 상태에서 바로 강광에 배양하게 되면 재분화율이 감소될 수 있으므로, 약광에서 1주간 배양하면서 스트레스를 경감시키고 캘러스의 형성을 촉진하도록 하였다. The light irradiation according to the present invention can be performed during the entire period of the first stage leaf culture and the second stage leaf culture, and it is preferable that the light irradiation is performed only in the first week of the first stage. This is because the regeneration rate can be reduced when the side slice is cut and cultured in the light immediately after the stressed condition, so that the stress is reduced and the callus formation is promoted by culturing for 1 week in the light.

이상 상기 본 발명의 방법은 사과의 잎절편으로부터 신초 재분화율을 효과적으로 향상시킬 수 있어 궁극적으로 바이러스 무독화 사과묘?을 대량생산할 수 있다. As described above, the method of the present invention can effectively improve shoot regeneration rate from leaf slices of apple, and ultimately mass-produce virus-detoxified apple seedlings.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. These examples are for further illustrating the present invention, and the scope of the present invention is not limited to these examples.

<< 실시예Example 1> 1>

사과 Apple 기내배양묘Cabin culture grave 잎에서  From leaves 신초Shinshu 재분화를 위한 최적  Optimal for regeneration 배지조건Medium condition 확립 Establish

기내묘 잎으로부터 신초를 재분화시키기 위한 최적 배지조건을 확립하기 위한 실험을 다음과 같이 진행하였다. 먼저 식물재료로서 충북 청주 소재 사과묘목 판매처인 임흥농원에서 구입한 사과 왜성대목 M.9 및 M.26을 사용하였고, 사과 왜성대목 M.9 및 M.26으로부터 0.3 x 0.6cm 의 잎 절편을 수득하였는데, 이때 절편 수득 시 잎의 중앙 엽맥이 포함되도록 하였다. Experiments were carried out as follows to establish optimal conditions for regeneration of shoots from seedlings in the cabin. First, apple dwarf seedlings M.9 and M.26 purchased from Imhung Plantation, which sells apple seedlings in Cheongju, Chungbuk Province, were used as the plant material, and 0.3 x 0.6 cm leaf slices were obtained from apple dwarf seedlings M.9 and M.26 At this time, when the section was obtained, the central vein of the leaf was included.

배양 조건으로 광처리는 약광(10 μmol·m-2·s-1 PPFD)으로 먼저 1주 간 배양한 다음, 강광(35~40 μmol·m-2·s-1 PPFD) 조건에서 배양하였다. Light treatment was carried out under light conditions (10 μmol · m -2 · s -1 PPFD) for 1 week and then under strong light (35 ~ 40 μmol · m -2 · s -1 PPFD).

배양을 위해 사용한 기본배지로는 MS 배지에 30 g/L 수크로스와 8 g/L 아가가 첨가되고 pH 5.7-5.8인 배지를 사용하였으며, 생장조절제인 티디아주론(thidiazuron) 0~2.0 mg/L, 뷰티르산(BA) 0~2.0 mg/L, 나프탈렌아세트산(NAA) 0~0.5 mg/L을 단용 또는 혼용 처리하여 배양하였다. 사과 왜성대목 M.9 및 M.26의 잎절편으로부터 신초 재분화를 위한 각각의 구체적인 배양 조건 및 각 조건에 따른 신초 재분화 정도, 캘러스 형성 정도 및 갈변화 정도의 분석 결과를 하기 표 1 및 표 2에 기재하였다. 또한 도 1에는 4주간 배양한 사과 왜성대목 M.9 기내묘의 잎절편에서 신초 재분화된 형상을 사진으로 나타내었다.As the basic medium used for the culture, 30 g / L sucrose and 8 g / L agar were added to the MS medium and the pH was 5.7-5.8, and the growth regulator thidiazuron was used in the range of 0 to 2.0 mg / L, butyric acid (BA) 0 to 2.0 mg / L, and naphthalene acetic acid (NAA) 0 to 0.5 mg / L were used for single or mixed treatment. The results of analysis of shoot regeneration degree, callus formation degree and browning degree according to each specific culturing condition and each condition for shoot regeneration from leaf slices of apple dwarf ginseng root M.9 and M.26 are shown in Tables 1 and 2 . Fig. 1 shows photographs of the shoot regeneration shape in leaf slices of the apple moxifloid M.9 inoculum cultured for 4 weeks.

Figure 112017052139866-pat00001
Figure 112017052139866-pat00001

Figure 112017052139866-pat00002
Figure 112017052139866-pat00002

분석결과, 최적의 신초 재분화 배양 조건을 확인한 결과, 재분화율이 가장 높으면서 동시에 신초수와 신초길이도 좋고, 100%로 캘러스를 형성할 수 있으며 갈변화가 없는 조건은, TDZ 2.0 mg/L 및 NAA 0.2 mg/L을 처리한 군과 TDZ 2.0 mg/L 및 NAA 0.1 mg/L을 처리한 군임을 알 수 있었고, 가장 좋은 군으로는 TDZ 2.0 mg/L 및 NAA 0.1 mg/L을 처리한 군임을 알 수 있었다.As a result of the analysis of optimal shoot regeneration culture conditions, TDZ 2.0 mg / L and NAA were the highest regeneration rate and at the same time, the shoot number and shoot length were good and 100% The group treated with 0.2 mg / L, TDZ 2.0 mg / L and NAA 0.1 mg / L were the treatment groups. The best group was treated with TDZ 2.0 mg / L and NAA 0.1 mg / L Could know.

따라서 본 발명자들은 상기와 같은 조건 하에서 배양할 경우, 사과 기내묘 잎절편으로부터 신초를 재분화할 수 있는 조건을 확립하였고, 규명한 조건하에서 배양할 경우, 매우 효과적인 신초 재분화가 가능하여 사과 무독화묘를 대량 증식시킬 수 있음을 알 수 있었다. Therefore, when cultivated under the above-mentioned conditions, the present inventors have established conditions for regeneration of shoots from the seedlings of apple leaves, and when cultivated under the identified conditions, highly effective shoot regeneration is possible, It was possible to proliferate.

<< 실시예Example 2> 2>

기외에서Outdoors 재배된 사과 접수 품종의  Grown apple 기내묘In-flight grave 잎으로부터  From the leaves 신초의Shoot 재분화 조건 확립 Establishment of regeneration condition

나아가 본 발명자들은 기외에서 재배된 5년생 홍로 사과 접수품종으로부터 0.3 x 0.6cm 의 잎 절편을 수득하였고, 이때 잎 절편은 잎의 중앙 엽맥이 포함되도록 하였다.Further, the present inventors obtained a leaf slice of 0.3 x 0.6 cm from a 5-year-old apple-bearing apple cultivar cultivated out of the atmosphere, wherein the leaf slice contained the central vein of the leaf.

배양 조건으로 광처리는 약광(10 μmol·m-2·s-1 PPFD)으로 먼저 1주 간 배양한 다음, 강광(35~40 μmol·m-2·s-1 PPFD) 조건에서 배양하였다.Light treatment was carried out under light conditions (10 μmol · m-2 · s-1 PPFD) for 1 week and then under strong light (35 ~ 40 μmol · m -2 · s -1 PPFD).

배양을 위한 배지로는 상기 실시예 1에서 최적 조건으로 확인한 신초 재분화 배지, 즉 30 g/L 수크로스, 8 g/L 아가, 티디아주론(thidiazuron; TDZ) 2.0 mg/L, 나프탈렌아세트산(NAA) 0.2 mg/L이 첨가되고 pH 5.7-5.8인 MS 배지를 이용하여 상기 수득한 잎 절편을 8주간 연속 배양하였다(1단계 배양). 이후 다시 4주간 배양한 다음, 상기 신초 재분화 배지에서 TDZ이 2.0 mg/L이 아닌 0.1 mg/L로 첨가된 배지를 이용하여 4주간 동안 계대배양 하였다(2단계 배양).As the medium for culturing, the shoot regeneration medium, that is, 30 g / L sucrose, 8 g / L agar, thidiazuron (TDZ) 2.0 mg / L, naphthalene acetic acid ) 0.2 mg / L was added and the obtained leaf slice was continuously cultured for 8 weeks using MS medium (pH 5.7-5.8) (one step culture). Thereafter, the cells were further cultured for 4 weeks, and subcultured in the shoot regeneration medium for 4 weeks using a medium supplemented with 0.1 mg / L but not 2.0 mg / L (step 2).

특히 본 실험은 2단계에 걸친 배양과정을 수행하였는데, 이는 오랜 기간 기내배양하여 배양체가 유령화(juvenation) 된 식물체의 재분화는 비교적 용이하지만, 본 실험과 같이 기내배양 한지 6개월 이내의 식물체는 성숙한 상태의 특성을 그대로 가지고 있어 캘러스만 형성되고 재분화가 어렵다. 따라서 본 실험에서는 6개월 이내의 기내배양 식물체의 온전한 재분화를 위해서는 2단계 배양이 필요하다는 것을 규명하였고, 이의 조건을 확립하였다.Particularly, this experiment was carried out in two stages, and it is relatively easy to regenerate plants that have been cultivated for a long period in vitro, but the plants within 6 months of cultivation as in this experiment are mature It has the characteristics of the state as it is, and only the callus is formed and the regeneration is difficult. Therefore, in this experiment, it was clarified that two-stage culture is necessary for complete regeneration of in-flight cultured plants within 6 months, and the condition was established.

상기와 같이 2단계 배양으로 재분화시킨 결과는 하기 표 3에 나타내었고, 1단계 배양 및 2단계 배양에 따른 재분화된 신초의 모습을 도 2에 나타내었으며, 도 3에는 본 발명의 실험에서 재분화된 사과 기내묘의 증식과 발근 형태의 사진을 나타내었다.The results of the regeneration in the two-stage culture are shown in Table 3 below. FIG. 2 shows the regenerated shoots according to the one-stage culture and the two-stage culture, and FIG. 3 shows the regenerated apple The photographs of breeding and rooting forms of the cabbage were shown.

Figure 112017052139866-pat00003
Figure 112017052139866-pat00003

분석결과, 상기 표 3에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 신초 재분화를 위한 최적 배지 조건에서 1단계 배양 및 2단계 배양을 통한 재분화율 분석 결과, 기외에서 재배된 사과 잎 절편을 이용할 경우에도 우수한 재분화율을 보였고, 특히 2단계의 배양을 진행할 경우 2배 이상의 재분화율 향상율을 나타내는 것을 확인할 수 있었으며, 캘러스도 100% 형성되는 것으로 확인되었고 재분화된 사과 기내묘의 증식과 발근도 잘 이루어지는 것을 알 수 있었다(도 2 및 도 3 참조).As a result of the analysis, as shown in Table 3, when the regeneration rate was analyzed through the one-step cultivation and the two-step cultivation under the optimum medium conditions for shoot regeneration according to the present invention, the excellent regemination rate . In particular, it was confirmed that the regeneration rate of the second stage cultivation was more than twice that of the second stage cultivation, and the callus was 100% 2 and 3).

따라서 본 발명자들은 본 발명의 방법으로 기존에 재분화가 어려웠던 사과를 효율적으로 재분화시킬 수 있고 무독화묘를 대량 증식시킬 수 있음을 알 수 있었다.Therefore, the inventors of the present invention have found that the method of the present invention can efficiently regenerate apples which were previously difficult to regenerate, and mass-proliferate undigested seedlings.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.The present invention has been described with reference to the preferred embodiments. It will be understood by those skilled in the art that various changes in form and details may be made therein without departing from the spirit and scope of the invention as defined by the appended claims. Therefore, the disclosed embodiments should be considered in an illustrative rather than a restrictive sense. The scope of the present invention is defined by the appended claims rather than by the foregoing description, and all differences within the scope of equivalents thereof should be construed as being included in the present invention.

Claims (10)

삭제delete 삭제delete 삭제delete 사과의 잎 절편을 티디아주론(thidiazuron; TDZ) 0.1~2.0 mg/L, 나프탈렌아세트산(NAA) 0.1~0.5 mg/L, 수크로스 25~35 g/L 및 아가 6~10 g/L가 첨가된 MS 배지에서 배양하는 단계를 포함하되, 상기 잎 절편은 잎의 중앙 엽맥이 포함되어 있는 것을 특징으로 하는,
사과 잎 절편으로부터 신초의 재분화를 증진시키는 방법.The leaves of the apples were added with 0.1 to 2.0 mg / L of thidiazuron (TDZ), 0.1 to 0.5 mg / L of naphthalene acetic acid (NAA), 25 to 35 g / L of sucrose and 6 to 10 g / Lt; RTI ID = 0.0 &gt; MS medium, &lt; / RTI &gt; characterized in that the leaf slice comprises the central vein of the leaf.
A method of promoting shoot regeneration from apple leaf slices. 삭제delete 삭제delete (1) 사과의 잎 절편을 티디아주론(thidiazuron; TDZ) 0.1~2.0 mg/L, 나프탈렌아세트산(NAA) 0.1~0.5 mg/L, 수크로스 25~35 g/L 및 아가 6~10 g/L가 첨가된 MS 배지 조성물로 8~9주간 배양하여 신초를 유도하는 1단계 엽편배양 단계;
(2) 상기 1단계 엽편배양에서 사용된 배지 조성물로 3~4주간 더 배양 후, 티디아주론(thidiazuron; TDZ)이 0.1~0.2 mg/L로 첨가된 MS 배지 조성물로 계대배양하는 2단계 엽편배양 단계; 및
(3) 상기 유도된 신초를 MS 배지에 치상하여 발근을 유도하는 단계를 포함하는, 재분화된 사과 식물체 제조방법. (1) apple leaf slices were treated with 0.1 to 2.0 mg / L of thidiazuron (TDZ), 0.1 to 0.5 mg / L of naphthalene acetic acid (NAA), 25 to 35 g / L of sucrose and 6 to 10 g / L-containing MS medium composition for 8 to 9 weeks to induce shoots;
(2) a culture medium used in the above-mentioned first stage leaf culture for 3 to 4 weeks, followed by subculturing with a MS medium composition containing 0.1 to 0.2 mg / L of thidiazuron (TDZ) A culture step; And
(3) inducing rooting by directing the induced shoots to an MS medium. 제7항에 있어서,
상기 배지 조성물의 pH는 5.7~5.8인 것을 특징으로 하는, 재분화된 사과 식물체 제조방법. 8. The method of claim 7,
Wherein the pH of the medium composition is 5.7 to 5.8. 제7항에 있어서,
상기 배양은 광조건을 약광으로 10 μmol·m-2·s-1 PPFD 조건 하에서 1주일 동안 배양하고 강광으로 35~40 μmol·m-2·s-1 PPFD 조건 하에서 조사하여 배양하는 것을 특징으로 하는, 재분화된 사과 식물체 제조방법. 8. The method of claim 7,
The culturing is carried out by culturing the photoperiod for 1 week under the condition of 10 μmol · m -2 · s -1 PPFD as a weak light, and culturing under irradiation of 35 to 40 μmol · m -2 · s -1 PPFD as strong light , A method for producing regenerated apple plants. 제7항에 있어서,
상기 사과의 잎 절편은 잎의 중앙 엽맥이 포함되어 있는 것을 특징으로 하는, 재분화된 사과 식물체 제조방법.8. The method of claim 7,
Wherein the leaf slice of the apple contains the central vein of the leaf.
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