KR101912857B1 - 스위칭 용매를 이용하여 효모균으로부터 지질을 추출하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 명세서는 건조 과정 등 없이도 적은 양의 스위칭 용매로 미생물 배양물에서 지질을 효과적으로 추출할 수 있는 방법에 관한 것으로서, 본 명세서를 통해 기존 바이오연료 생산의 한계를 극복할 수 있으므로, 본 명세서는 바이오연료 관련 분야의 발전에 크게 기여할 수 있다.

Description

스위칭 용매를 이용하여 효모균으로부터 지질을 추출하는 방법{METHOD OF LIPID EXTRACTION FROM YEASTS BY USING SWITCHABLE SOLVENT}

본 명세서는 스위칭 용매를 이용하여 미생물, 특히 효모균으로부터 지질을 추출하는 방법에 관한 것이다.

최근 화석 연료의 과다 사용에 따른 에너지 자원 고갈 및 환경오염에 대한 우려가 증가함에 따라 비화석연료 기반의 재생가능하고 지속가능하며 환경친화성이 높은 연료 및 소재 제조에 대한 관심이 급증하고 있다. 육지 또는 해양에서 발생하는 바이오매스는 재생 가능한 에너지원으로, 화석원료와는 달리 이용된 후 발생하는 이산화탄소를 다시 바이오매스로 흡수하는 탄소중립(carbon-nutral)의 특성을 갖고 있어 전 세계적으로 많은 주목을 받고 있다.

바이오연료 중 당질계 원료를 이용하는 바이오에탄올 및 식물성유지를 이용하는 바이오디젤은 상업적인 생산이 이루어지고 있으나, 식량자원과의 경쟁이라는 원천적인 한계를 가지고 있고, 분자구조식에 산소를 포함하고 있기 때문에 기존 화석원료에서 생산되고 있는 가솔린, 항공유 및 디젤과 비교하였을 때 에너지 함량이 낮은 단점이 있다.

최근 바이오디젤의 사용량이 급증하면서, 바이오디젤의 제조 원료인 식물성 오일의 가격이 폭등한 바 있고, 세계적으로 식량 자원 및 토지 자원의 부족 문제가 해결되지 않고 있어, 비식용 원료를 이용한 바이오디젤의 제조 필요성이 부각되고 있다. 대표적인 비식용 원료인 식물 플랑크톤은 육상계 식물 대비 높은 효율로 이산화탄소를 고정하고, 생장속도가 빨라 비식용 원료로 주목받고 있으나, 식물 플랑크톤에 의해 생산된 오일은 수율 및 경제성 면에서 아직 한계가 있다.

점차 증가하는 바이오디젤 수요에 대응하고, 기존의 식물성 유지 또는 식물성 플랑크톤 기반의 바이오디젤 생산의 한계를 극복할 수 있는 방안으로, 각종 미생물을 이용한 바이오연료 생산 방법 연구가 진행되고 있으나, 가시적인 성과를 나타내고 있는 것은 거의 없으며, 미생물 바이오매스로부터 바이오디젤의 원료인 지질을 고농도로 생산하여 바이오디젤의 경제성 및 지속가능성을 향상시킬 수 있는 기술이 절실한 상황이다.

미국 등록특허 US 8,513,464호

본 명세서는, 스위칭 용매(switchable solvent)를 이용하여 미생물 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 추출물, 및 이들의 파쇄물 등에서 지질을 수득하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 명세서는 가역적으로 친수성과 소수성으로 성질이 전환되는 스위칭 용매(switchable solvent)로 미생물 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 추출물, 및 이들의 파쇄물로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상에서 지질을 추출하는 과정을 포함하는, 지질을 수득하는 방법 을 제공한다.

또한, 본 명세서는, 미생물 균주를 배양하여 배양물을 얻는 단계; 스위칭 용매를 상기 배양물에 첨가하는 단계; 지질을 추출하는 단계; 지질을 분리 및 수득하는 단계; 및 상기 단계 이후의 스위칭 용매를 재사용하는 단계;를 포함하는, 효모 균주에서 지질을 추출하는 방법을 제공한다.

또한, 본 명세서는, 지질을 수득하는 단계; 및 상기 수득된 지질을 이용하여 트랜스에스테르화하여 바이오디젤을 수득하는 단계를 포함하는, 바이오디젤 생산 방법을 제공한다.

아울러, 본 명세서는 미생물 균주 및 스위칭 용매를 포함하는, 지질 수득용 키트를 제공한다.

본 발명의 일 측면에 따른 방법을 통해, 세포분리, 탈용매 및 건조 과정 없이 적은 양의 용매로 미생물 균주 및 배양물 등에서 지질을 효과적으로 추출할 수 있게 되어, 기존 바이오연료 생산의 한계를 극복할 수 있으므로, 본 명세서는 바이오연료 및 바이오소재 생산 관련 분야의 발전에 크게 기여할 수 있다.

도 1은 스위칭 용매를 이용하여 효모균주에서 지질을 추출하는 전반적인 공정을 도식화한 것이다.
도 2는 야로위아 리폴리티카 균주를 회분식 반응기에서 배양하였을 때의 글루코스 소진량, 바이오매스 증가량, 및 바이오매스 생산량을 나타낸 것이다.
도 3은 효모균주 세포내에 축적 된 지질에 대한 스위칭 용매의 추출율을 비교하기 위하여 DMCHA, EB, DP를 이용한 지질 추출율과 클로로포름 및 메탄올의 혼합용매(클로로포름:메탄올의 부피비가 2:1인 경우)의 추출율을 비교한 것이다.
도 4는 효모 배양물에 대하여 동일한 양의 지질을 추출하기 위해 요구되는 스위칭 용매의 부피와 클로로포름 및 메탄올 혼합용매(클로로포름:메탄올의 부피비는 2:1)의 부피비를 나타낸 것이다.
도 5는 스위칭 용매와 클로로포름 및 메탄올 혼합용매(클로로포름:메탄올의 부피비는 2:1)로 추출한 지질의 조성을 비교한 것이다.

본 명세서에서 "바이오매스(biomass)"는 일정한 생물 집단에서 임의의 공간에 존재하는 생물체의 양을 중량, 농도 또는 에너지의 양으로 표시한 것을 말한다. 본 발명의 일 측면에서 배양물 내의 바이오매스는 배양물 내 미생물 균주(특히, 효모 균주)의 양을 g/L 단위로 표시할 수 있다.

본 명세서에서 "배양물"은 액체배지 상에서 배양한 배양액, 고체배지 상에서 배양한 배양물, 이들을 건조시킨 것, 이들을 희석한 것 등을 모두 포함하는 것이다. 본 발명의 일 측면에 따른 방법에서는 미생물 균주 자체, 그 균주의 배양물, 그 배양물의 추출물, 및 이들의 파쇄물 등 지질을 추출할 수 있는 원료가 될 수 있는 것이면 어느 것이든 사용이 가능하다.

본 명세서에서 "스위칭 용매(switchable solvent)"는 가역적으로 극성과 비극성의 성질을 갖거나 가역적으로 친수성과 소수성의 성질을 갖는 용매를 말하고, 성질의 전환은 폭기, 가열, 냉각 등과 같은 방법에 의해 가능하며, 상기 폭기(曝氣, aeration, air purging)에 사용하는 기체는 이산화탄소, 질소 등을 포함하며, 스위칭 용매의 성질을 전환시킬 수 있는 기체이면 어느 것이든 사용이 가능하다.

본 명세서에서 "지질"은, 기본적으로 지방산과 글리세롤로 구성된 유기물 또는 유기 화합물로서, 단순지질, 복합지질, 및 유도지질로 구분된다. 유기용매 또는 소수성 용매에 용해되는 성질을 가진다.

본 명세서에서 "지방산"은 포화, 불포화 지방산을 포함하고, 불포화 지방산은 하나 이상의 탄소-탄소 이중결합을 가지며, 하나 이상의 이중결합이 있는 경우 시스 배위 또는 트랜스 배위가 있을 수 있다.

본 명세서에서 "아실글리세롤"은 단순지질의 일종으로 글리세롤에스테르를 총칭하는 말이기도 하다. 모노아실글리세롤, 디아실글리세롤, 트리아실글리세롤을 포함하고, 지질 가수분해 효소 등에 의해 가수분해되면 지방산을 유리한다.

본 명세서에서 "폭기(曝氣, aeration, air purging)"는 액체 내에 공기를 주입하거나 불어넣는 것을 말한다.

본 명세서에서 "OD₆₀₀"는 파장 600nm의 빛에서의 흡광도나 광학밀도(Optical density)를 뜻하는 것으로서, 분광광도계(spectrophotometer) 등과 같은 장비를 통해 측정할 수 있고, 측정된 OD₆₀₀을 통해 용액이나 시료 속의 미생물이나 세포의 밀도나 농도를 확인할 수 있다.

본 명세서에서 "트랜스에스테르화"는 지질과 알코올(특히, 메탄올)을 촉매와 함께 적정한 온도와 압력에서 반응시켜 알킬에스테르(특히, 메틸에스테르)를 형성하는 것을 말한다.

본 명세서에서 "바이오디젤"은 바이오연료 중 하나로서, 보통 메탄올을 이용해 3가의 지방산에 글리세롤이 결합한 트라이글리세리드로부터 글리세롤을 분리한 다음, 지방산에스터를 만들어 내는 에스테르 교환방법을 통하여 만든 지방산 메틸에스테르(fatty acid methyl ester, FAME)를 말한다.

본 명세서는, 점차 증가하는 바이오디젤 수요에 대응하기 위하여 기존의 식물성 기름 또는 미세조류 기반의 바이오디젤 생산의 한계를 극복할 수 있는 새로운 바이오디젤 생산기술로서, 지질을 생산하거나 내포하는 효모균주를 이용하여 바이오매스로부터 바이오디젤의 원료인 지질을 고농도로 생산하여 바이오디젤의 경제성 및 지속가능성을 향상시킬 수 있는 기술에 관한 것이다.

본 발명은 일 측면에서, 가역적으로 친수성과 소수성으로 성질이 전환되는 스위칭 용매(switchable solvent)로 미생물 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 추출물, 및 이들의 파쇄물로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상에서 지질을 추출하는 과정을 포함하는, 지질을 수득하는 방법일 수 있다. 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica)는 대표적인 지질생산 미생물이다. 이러한 지질생산 효모균주가 생산한 지질은 트랜스에스테르화 과정을 거쳐 바이오디젤과 같은 바이오연료로 사용 가능하나, 이를 위해서는 균주 내에 축적된 지질을 효과적으로 추출하는 과정이 필요하다. 본 발명은 일 측면에서 이러한 과제를 해결한 것이다.

미생물 균주 내에 생산된 지질을 추출하는 일반적인 방법은 Bligh and Dyer 추출법으로 클로로포름과 메탄올을 2:1의 부피 비율로 혼합한 용매를 이용한 추출법이다. 이러한 Bligh and Dyer 추출법은 미생물 배양물 내의 미생물을 수확, 탈용매(용매를 제거하는 것) 및 건조한 후 추출해야 하기 때문에 추출공정이 복잡하고 고비용이 소요되며, in-situ 추출(탈용매 및 건조 등의 별도 과정을 거치지 않고 곧바로 추출하는 것)이 어려운 단점이 있다. 특히 지질생산 효모균주가 생산하는 지질에 대해서는 효과적인 추출법이 제시되어 있지 않다. 본 발명은 일 측면에서, 스위칭 용매(Switchable solvent)를 이용하여 지질생산 효모균주 세포 내에 축적된 지질을 효과적으로 추출할 수 있는 방법에 관한 것일 수 있다. 즉, 본 발명의 일 측면에 따른 방법에 의하면, 미생물 세포의 분리, 탈용매 및 건조 과정 없이도 고농도의 지질을 고효율로 추출할 수 있고, 특히 적은 부피의 용매로도 효과적으로 지질을 추출할 수 있으며, 그에 따라 지질 추출 비용도 현저하게 절감되는 효과를 얻을 수 있다.

본 발명은 다른 측면에서 1) 효모 균주를 배양하여 배양물을 얻는 단계; 2) 스위칭 용매를 상기 배양물에 첨가하는 단계; 3) 지질을 추출하는 단계; 4) 지질을 분리 및 수득하는 단계; 및 5) 상기 단계 4) 이후의 스위칭 용매를 상기 단계 2)에서 재사용하는 단계;를 포함하는, 효모 균주에서 지질을 추출하는 방법일 수 있다.

일 구현 예로서, 상기 스위칭 용매는 가역적으로 극성과 비극성의 성질을 갖거나, 가역적으로 친수성과 소수성의 성질을 갖는 용매로서, 이를 이용할 경우 시료의 탈용매 및 건조가 필요하지 않으며 추출된 지질의 분리가 매우 용이한 장점이 있다.

다른 구현 예로서, 상기 스위칭 용매는 2차 아민(Secondary amine) 및 3차 아민(Tertiary amine) 중 하나 이상일 수 있다.

또 다른 구현 예로서, 상기 스위칭 용매는 N,N-디메틸사이틀로헥실아민(N,N-dimethylcyclohexylamine, DMCHA), N-에틸 부틸아민(N-ethyl butylamine, EB), 및 디프로필아민(Dipropylamine, DP)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.

일 구현 예에 의하면, 상기 미생물 균주, 상기 배양물, 상기 추출물, 및 이들의 파쇄물로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상과 상기 스위칭 용매의 부피비는 1:0.1 내지 1:10일 수 있다. 일 측면에서, 상기 부피비는 1:0.1이상, 1:0.3이상, 1:0.5이상, 1:0.8이상, 1:1이상, 1:1.2이상, 1:1.4이상, 1:1.5이상, 1:1.7이상, 1:1.9이상, 1:2이상, 1:2.5이상, 1:3이상, 1:3.5이상, 1:4이상, 1:5이상, 1:6이상, 또는 1:8이상일 수 있다. 또한, 다른 측면에서, 상기 부피비는 1:10이하, 1:9이하, 1:8이하, 1:7이하, 1:6이하, 1:5이하, 1:4이하, 1:3.5이하, 1:3이하, 1:2.5이하, 1:2이하, 1:1.5이하, 1:1.2이하, 1:1이하, 1:0.8이하, 1:0.5이하, 또는 1:0.3이하 일 수 있다. 바람직하게는 상기 부피비는 1:0.8 내지 1:1.2 일 수 있다.

본 발명의 일 측면에 따른 방법은 체내산물이나 지질을 생산할 수 있는 박테리아, 효모, 곰팡이 또는 미세조류라면 제한 없이 적용할 수 있다. 상기 박테리아로는 아시네토박터(Acinetobacter), 악티노박터(Actinobacter), 아나베나(Anabaena), 아스로박터(Arthrobacter), 바실러스(Bacillus), 클로스트리듐(Clostridium), 플렉시박테리움(Flexibacterium), 마이크로코쿠스(Micrococcus), 마이코박테리움(Mycobacterium), 노카르디아(Nocardia), 노스톡(Nostoc), 오실라토리아(Oscillatoria), 슈도모나스(Pseudomonas), 로도코쿠스(Rhodococcus), 로도미크로븀(Rhodomicrobium), 로도슈도모나스(Rhodopseudomonas), 쉬와넬라(Shewanella), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 비브리오(Vibrio) 등을 예시할 수 있고, 상기 효모로는 리포마이세스(Lipomyces), 트리코스포론(Trichosporon), 로로스포리듐(Rhorosporidium), 크립토코쿠스(Cryptococcus), 칸디다(Candida), 야로위아(Yarrowia) 등을 예시할 수 있으며, 상기 곰팡이로는 아스퍼질러스(Aspergillus), 케토뮴(Chaetomium), 클로도스포리듐(Clodosporidium), 커닝하멜라(Cunninghamella), 에메리셀라(Emericella), 푸사리움(Fusarium), 모티어렐라(Mortierella), 무코르(Mucor), 페니실리움(Penicillium), 피시움(Pythium), 리조푸스(Rhizopus), 트리코더마(Trichoderma) 등을 예시할 수 있으며, 상기 미세조류로는 보트리오코쿠스(Botryococcus), 브라키오모나스(Brachiomonas), 클라미도모나스(Chlamydomonas), 클로렐라(Chlorella), 크립테코디늄(Crypthecodinium), 두날리엘라(Dunaliella), 유글레나(Euglena), 나노클로리스(Nannochloris), 나노클로롭시스(Nannochloropsis), 나비큘라(Navicula), 니치시아(Nitzschia), 치조키트리움(Schizochytrium), 셀레토네마(Sceletonema), 세네데스무스(Scenedesmus), 테트라셀미스(Tetraselmis), 트라우스토키트리움(Thraustochytrium), 울케미아(Ulkenia) 등을 예시할 수 있으며 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 미생물들은 야생형 균주 또는 형질전환 균주에 한정되지 않는다.

다른 구현 예에 의하면, 상기 미생물은 효모 균주일 수 있고, 상기 효모 균주는 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica) 균주일 수 있다. 일 측면에서, 상기 야로위아 리폴리티카는 야생형 균주일 수 있으나, 형질전환 균주도 사용이 가능하다. 상기 야로위아 리폴리티카 균주는 시중에서 판매되고 있는 것일 수도 있고, 신용할 수 있는 보존기관에 보존되며 보존기관이 발행하는 카탈로그 등에 의하여 자유롭게 분양될 수 있는 사실이 확인된 것일 수 있다.

다른 구현 예에 의하면, 상기 지질을 추출하는 단계에서 추출하는 시간은 15분 이상, 20분 이상, 30분 이상, 45분 이상, 1시간 이상, 2 시간 이상, 3 시간 이상, 4 시간 이상, 5 시간 이상, 6 시간 이상, 7 시간 이상, 8 시간 이상, 9 시간 이상, 10 시간 이상, 11 시간 이상, 12 시간 이상, 15 시간 이상, 또는 18 시간 이상일 수 있다. 또는 추출하는 시간은 20시간 이하, 18 시간 이하, 16 시간 이하, 15 시간 이하, 12 시간 이하, 11 시간 이하, 10 시간 이하, 9 시간 이하, 8 시간 이하, 7 시간 이하, 6 시간 이하, 5 시간 이하, 4 시간 이하, 3 시간 이하, 2 시간 이하, 1 시간 이하, 45분 이하, 30분 이하, 20분 이하일 수 있다.

다른 구현 예에 의하면, 상기 방법은 추출된 지질을 분리하는 과정을 더 포함하고, 상기 분리는 스위칭 용매를 친수성으로 전환시켜 상기 스위칭 용매로부터 지질을 분리하는 것일 수 있다.

다른 구현 예에 의하면, 상기 친수성으로의 전환은 폭기를 통해 실시하는 것일 수 있다.

예시적으로, 상기 폭기는 이산화탄소로 실시하는 것일 수 있다.

일 측면에서, 상기 폭기 시간은 30분 내지 8시간일 수 있다. 다른 측면에서, 30분 이상, 40분 이상, 50분 이상, 1시간 이상, 2시간 이상, 3시간 이상, 4시간 이상, 5시간 이상, 6시간 이상, 8시간 이상, 또는 9시간 이상일 수 있다. 또한, 다른 측면에서, 10시간 이하, 9시간 이하, 8시간 이하, 7시간 이하, 6시간 이하, 5시간 이하, 4시간 이하, 3시간 이하, 2시간 이하, 1시간 30분 이하, 1시간 이하, 50분 이하, 40분 이하, 또는 35분 이하일 수 있다. 바람직하게는 2 내지 4시간 일 수 있고, 더욱 바람직하게는 3시간 일 수 있다.

다른 구현 예에 의하면, 상기 방법은 지질을 추출하고 추출된 지질을 분리한 이후, 남은 스위칭 용매를 지질 추출용 용매로 재사용하는 것일 수 있다.

다른 구현 예에 의하면, 상기 스위칭 용매는 폭기 또는 가열을 통해 소수성으로 전환시켜 재사용하는 것일 수 있다. 일 측면에서, 상기 스위칭 용매는 폭기 또는 가열을 통하여 친수성에서 소수성으로 전환되는 성질을 가진 것을 사용할 수 있고, 이 때문에 소수성으로 성질을 전환시켜 지질추출에 재사용할 수 있는 것이다. 일 구현 예로서, 폭기 시간은 10분 이상, 20분 이상, 30분 이상, 45분 이상, 1시간 이상, 1시간30분 이상, 2시간 이상, 2시간30분 이상, 3시간 이상, 3시간30분 이상, 4시간 이상, 5시간 이상, 6시간 이상, 7시간 이상, 또는 8시간 이상일 수 있다. 다른 구현 예에서 폭기 시간은 9시간 이하, 8 시간 이하, 7 시간 이하, 6 시간 이하, 5시간 이하, 4시간 이하, 3시간30분 이하, 3시간 이하, 2시간30분 이하, 2시간 이하, 1시간30분 이하, 1시간 이하, 45분 이하, 30분 이하, 20분 이하, 또는 10분 이하일 수 있다. 바람직하게는 2시간 내지 4시간일 수 있다. 다른 구현 예로서, 상기 가열시 온도는 25 ℃ 이상, 30 ℃ 이상, 35 ℃ 이상, 40 ℃ 이상, 45 ℃ 이상, 50 ℃ 이상, 55 ℃ 이상, 60 ℃ 이상, 65 ℃ 이상, 70 ℃ 이상, 75 ℃ 이상, 80 ℃ 이상, 또는 85 ℃ 이상일 수 있다. 또한, 상기 온도는 90 ℃ 이하, 85 ℃ 이하, 80 ℃ 이하, 75 ℃ 이하, 70 ℃ 이하, 65 ℃ 이하, 60 ℃ 이하, 55 ℃ 이하, 50 ℃ 이하, 45 ℃ 이하, 40 ℃ 이하, 35 ℃ 이하, 또는 30 ℃ 이하일 수 있다. 바람직하게는 50 내지 65 ℃일 수 있다.

다른 예에 의하면, 상기 폭기는 질소를 사용하여 실시하는 것일 수 있다.

일 측면에서, 스위칭 용매에 의해 추출된 지질은, 스위칭 용매에 이산화탄소와 같은 기체를 폭기하여 스위칭 용매를 친수성으로 전환시킴으로서, 용매로부터 분리할 수 있으며, 친수성으로 전환된 스위칭 용매는 질소 폭기 또는 가열을 통하여 다시 소수성으로 전환되기 때문에 지질추출에 재사용될 수 있는 것이다.

또 다른 구현 예에 의하면, 상기 지질은 아실글리세롤, 글리세라이드 및 자유지방산으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다.

다른 구현 예에 의하면, 상기 아실글리세롤은 트리아실글리세롤(Triacylglycerol, TAG), 디아실글리세롤(Diacylglycerol, DAG), 및 모노아실글리세롤(Monoacylglycerol, MAG)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.

일 실시태양에 의하면, 상기 글리세라이드는 모노글리세라이드(Monoglyceride), 디글리세라이드(Diglyceride), 및 트리글리세라이드(Triglyceride)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.

다른 실시태양에 의하면, 상기 지질은 부티르산(부탄산, C4:0), 카프로산(헥산산, C6:0), 카프릴산(옥탄산, C8:0), 카프르산(데칸산, C10:0), 라우르산(도데칸산, C12:0), 미리스트산(테트라데칸산, C14:0), 미리스톨레산(ω-5, C14:1),펜타데실릭산(Pentadecylic acid, C15:0), 팔미트산(헥사데칸산, C16:0), 팔미톨레산(ω-7, C16:1), 헥사데카디에노산(Hexadecadienoic acid, C16:2), 헥사데카트리엔산(Hexadecatrienoic acid, C16:3), 마가릭 산(Margaric acid, C17:0), 헵타데노익산(Heptadenoic acid, C17:1), 스테아르산(옥타데칸산, C18:0), 올레산(ω-9, C18:1), 리놀레산(LA, ω-6, C18:2), 알파-리놀렌산(ALA, ω-3, C18:3), 옥타데카테트라에노익산(Octadecatetraenoic acid, C18:4), 노나데실릭산(Nonadecylic acid, C19:0), 노나데실릭산(Nonadecylic acid, C19:1), 아라키드산(에이코산산, C20:0), 아라키돈산(AA, ω-6, C20:4), 에이코사펜타엔산(EPA, ω-3, C20:5), 베헨산(도코산산, C22:0), 에루크산(ω-9, C22:1), 도코사펜타엔산(DPA, ω-3, 22:5), 및 도코사헥사엔산(DHA, ω-3, C22:6)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다. 바람직하게는 C16:0, C16:1, C16:2, C16:3, C18:0, C18:1, C18:2, C18:3, 및 C18:4으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 지방산일 수 있다. 일 실시예에 따르면, 상기 지질을 트랜스에스테르화하여 FAME(fatty acid methyl ester)형태로 전환할 경우, C16:0 지방산 10중량% 이상, C16:1 지방산 6 중량 % 이상, C18:0 지방산 2 중량 % 이상, C18:1 지방산 50 중량 % 이상, 및 C18:2 지방산 7 중량 % 이상일 수 있다. 일 측면에서, C16:0 지방산은 10중량%이상, 11중량%이상, 12중량%이상, 13중량%이상, 14중량%이상, 15중량%이상, 16중량%이상, 또는 17중량%이상일 수 있다. 또한, C16:0 지방산은 18중량% 이하, 16중량% 이하, 15중량% 이하, 14중량% 이하, 13중량% 이하, 12중량% 이하, 또는 11중량% 이하일 수 있다. 일 측면에서, C16:1 지방산은 6중량% 이상, 7중량% 이상, 8중량% 이상, 9중량% 이상, 10중량% 이상, 11중량% 이상, 12중량% 이상, 13중량% 이상, 14중량% 이상, 또는 15중량% 이상일 수 있다. 또한, C16:1 지방산은 16중량% 이하, 15중량% 이하, 14중량% 이하, 13중량% 이하, 12중량% 이하, 11중량% 이하, 10중량% 이하, 9중량% 이하, 8중량% 이하, 또는 7중량% 이하일 수 있다. 일 측면에서, C18:0 지방산은 1중량% 이상, 2중량% 이상, 3중량% 이상, 4중량% 이상, 5중량% 이상, 6중량% 이상, 7중량% 이상, 8중량% 이상, 9중량% 이상, 또는 10중량% 이상일 수 있다. 또한, C18:0 지방산은 11중량% 이하, 10중량% 이하, 9중량% 이하, 8중량% 이하, 7중량% 이하, 6중량% 이하, 5중량% 이하, 4중량% 이하, 3중량% 이하, 또는 2중량% 이하일 수 있다. 일 측면에서, C18:1 지방산은 50중량% 이상, 55중량% 이상, 60중량% 이상, 65중량% 이상, 70중량% 이상, 75중량% 이상, 80중량% 이상, 또는 85중량% 이상일 수 있다. 또한, C18:1 지방산은 87중량% 이하, 85중량% 이하, 80중량% 이하, 75중량% 이하, 70중량% 이하, 65중량% 이하, 60중량% 이하, 또는 55중량% 이하일 수 있다. 일 측면에서, C18:2 지방산은 5중량% 이상, 6중량% 이상, 7중량% 이상, 8중량% 이상, 9중량% 이상, 10중량% 이상, 11중량% 이상, 12중량% 이상, 13중량% 이상, 또는 14중량% 이상일 수 있다. 또한, C18:2 지방산은 15중량% 이하, 14중량% 이하, 13중량% 이하, 12중량% 이하, 11중량% 이하, 10중량% 이하, 9중량% 이하, 8중량% 이하, 7중량% 이하, 또는 6중량% 이하일 수 있다.

다른 실시태양에 의하면, 상기 추출되는 지질의 양은 클로로포름 및 메탄올 혼합용매로 추출한 지질의 양과 같거나 그보다 1중량% 이상 많은 것일 수 있다. 일 구현 예에서, 상기 추출되는 지질의 양은 클로로포름 및 메탄올 혼합용매로 추출한 지질의 양 보다 1중량% 이상, 2중량% 이상, 3중량% 이상, 4중량% 이상, 5중량% 이상, 6중량% 이상, 7중량% 이상, 8중량% 이상, 9중량% 이상, 10중량% 이상, 11중량% 이상, 12중량% 이상, 13중량% 이상, 14중량% 이상, 14.5중량% 이상, 15중량% 이상, 15.5중량% 이상, 16중량% 이상, 16.5중량% 이상, 17중량% 이상, 18중량% 이상, 19중량% 이상, 20중량% 이상, 22중량% 이상, 24중량% 이상, 25중량% 이상, 28중량% 이상, 30중량% 이상, 32중량% 이상, 35중량% 이상, 40중량% 이상, 45중량% 이상, 50중량% 이상, 또는 55중량% 이상 많은 것일 수 있다. 또한, 상기 추출되는 지질의 양은 클로로포름 및 메탄올 혼합용매로 추출한 지질의 양 보다 60중량% 이하, 55중량% 이하, 50중량% 이하, 45중량% 이하, 40중량% 이하, 35중량% 이하, 32중량% 이하, 30중량% 이하, 28중량% 이하, 25중량% 이하, 24중량% 이하, 22중량% 이하, 20중량% 이하, 19중량% 이하, 18중량% 이하, 17중량% 이하, 16.5중량% 이하, 16중량% 이하, 15.5중량% 이하, 15중량% 이하, 14.5중량% 이하, 14중량% 이하, 13중량% 이하, 12중량% 이하, 11중량% 이하, 10중량% 이하, 9중량% 이하, 8중량% 이하, 7중량% 이하, 6중량% 이하, 5중량% 이하, 4중량% 이하, 3중량% 이하, 또는 2중량% 이하 많은 것일 수 있다.

다른 실시태양에 의하면, 상기 추출되는 지질의 중량은 상기 효모 균주의 바이오매스 총중량 대비 2 중량% 이상일 수 있다. 일 측면에서, 상기 지질의 중량은 2중량% 이상, 10중량% 이상, 15중량% 이상, 20중량% 이상, 25중량% 이상, 30중량% 이상, 35중량% 이상, 40중량% 이상, 45중량% 이상, 50중량% 이상, 55중량% 이상, 60중량% 이상, 60.5중량% 이상, 61중량% 이상, 61.5중량% 이상, 62중량% 이상, 62.5중량% 이상, 63중량% 이상, 63.5중량% 이상, 64중량% 이상, 64.5중량% 이상, 65중량% 이상, 65.5중량% 이상, 66중량% 이상, 66.5중량% 이상, 67중량% 이상, 67.5중량% 이상, 68중량% 이상, 68.5중량% 이상, 69중량% 이상, 69.5중량% 이상, 70중량% 이상, 80중량% 이상, 90중량% 이상, 95중량% 이상, 또는 99중량% 이상 일 수 있다. 또한, 상기 지질의 중량은 100중량% 이하, 96중량% 이하, 94중량% 이하, 90중량% 이하, 85중량% 이하, 80중량% 이하, 75중량% 이하, 71중량% 이하, 70중량% 이하, 69.5중량% 이하, 69중량% 이하, 68.5중량% 이하, 68중량% 이하, 67.5중량% 이하, 67중량% 이하, 66.5중량% 이하, 66중량% 이하, 65.5중량% 이하, 65중량% 이하, 64.5중량% 이하, 64중량% 이하, 63.5중량% 이하, 63중량% 이하, 62.5중량% 이하, 62중량% 이하, 61.5중량% 이하, 61중량% 이하, 60.5중량% 이하, 60중량% 이하, 55중량% 이하, 50중량% 이하, 45중량% 이하, 40중량% 이하, 35중량% 이하, 30중량% 이하, 25중량% 이하, 20중량% 이하, 15중량% 이하, 10중량% 이하, 5중량% 이하, 또는 3중량% 이하일 수 있다.

최적 지질추출용매의 선정을 위해서는 지질추출율 뿐 아니라 추출된 지질의 조성을 평가하는 것이 중요하다. 조성 분석을 위해, 스위칭 용매로 추출한 지질을 트랜스에스테르화 하여 FAME(Fatty Acid Methyl Ester)형태로 전환하여 지질조성을 확인하고, 스위칭 용매로 추출한 지질 중 바이오연료로 전환이 가능한 지질 조성을 클로로포름 및 메탄올 혼합용매로 추출한 지질의 조성과 비교한 결과, 본 발명의 일 측면에 의한 스위칭 용매로 추출한 지질의 조성은 주로 바이오디젤의 주요성분인 C16:0, C16:1, C18:0, C18:1~3으로 구성되어 클로로포름 및 메탄올 혼합용매로 추출한 지질의 조성과 거의 일치하는 결과가 나타남을 확인하였다(도 5 참조). 따라서, 본 발명의 일 측면에 의한 스위칭 용매를 이용한 지질추출방법이 지질 추출량 뿐만 아니라 질적인 측면에서도 효과적인 추출방법이 될 수 있음을 알 수 있다.

일 구현 예에 의하면, 상기 배양에 사용되는 배지는 배양하고자 하는 미생물의 특징에 따라 적절하게 선택하여 사용할 수 있으며, 배양하고자 하는 미생물이 효모 균주일 경우, YSC(Yeast Synthetic Complete)배지를 사용할 수 있다.

다른 구현 예에 의하면, 상기 배양에 사용되는 배지는 적당한 탄소원, 질소원, 아미노산, 비타민 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 함유한 통상의 배지 내에서 온도, pH 등을 조절하면서 적절한 방식으로 효모 균주의 배양 요건을 충족하는 것을 사용할 수 있다. 예를 들면, 사용될 수 있는 탄소원으로는 글루코즈, 자일로즈, 수크로즈, 락토즈, 프락토즈, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산, 아세트산, 부티르산, 이소부티르산, 프로피온산, 발레르산, 이소발레르산, 카프로산 등과 같은 휘발성 지방산(volatile fatty acid, VFA) 등이 포함될 수 있다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합되어 포함될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 및 질산암모늄과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메티오닌, 글루타민과 같은 아미노산 및 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해생성물 등 유기질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 상기 배지에는 인원으로서 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨 및 대응되는 소듐-함유 염이 포함될 수 있다. 사용될 수 있는 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함된다. 또한, 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간 및 탄산칼슘 등이 사용될 수 있다. 마지막으로, 상기 물질에 더하여 아미노산 및 비타민과 같은 물질이 사용될 수 있다.

다른 구현 예에 의하면, 상기 단계 1)의 배양은 글루코스 또는 수크로즈를 탄소원으로 사용하여 배양하는 것일 수 있다.

또한, 배양 배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 상기된 원료들은 배양과정에서 배양물에 적절한 방식에 의해 회분식, 유가식 또는 연속식으로 첨가될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다. 적절한 농도의 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아와 같은 기초 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물을 적절한 양과 방식으로 사용하여 배양물의 pH를 조절할 수 있다. 바람직하게는 2.5M의 NaOH 및 2.5M의 H₃PO₄를 첨가하여 pH를 조절하는 것일 수 있다.

또 다른 구현 예에 의하면, 상기 단계 1)의 배양은 진탕배양, 정치배양, 회분식 배양, 유가식 배양, 및 연속식 배양으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나에 의한 배양일 수 있다. 상기 진탕배양은 미생물을 접종한 배양물을 흔들면서 배양하는 방법을, 상기 정치배양은 미생물을 접종한 액체 배양물을 흔들지 아니하고 놓아둔 채로 배양하는 방법을 의미하고, 상기 회분식 배양은 배양물의 부피를 고정하고 외부에서 새로이 배양물을 첨가하지 아니한 상태에서 배양하는 방법을 의미하고 이러한 배양 방법을 실현할 수 있는 장치를 회분식 반응기라 한며, 상기 유가식 배양은 원료를 최초에 전부 배양 탱크에 넣어서 배양하는 단일배양(batch)에 대조되는 말로서 먼저 소량의 원소를 넣고 이것에 소량씩 원료를 추가하여 가며 배양하는 방법을 의미하고 이러한 배양 방법을 실현할 수 있는 장치를 유가식 반응기라고 하며, 상기 연속식 배양은 새로운 영양배지가 계속 공급되며 동시에 세포 및 생산물을 포함하는 배양물이 계속 제거되는 배양방법을 의미하고, 이러한 배양 방법을 실현할 수 있는 장치를 연속식 반응기라고 한다. 바람직하게는 상기 단계 1)의 배양은 회분식 반응기, 연속식 반응기, 또는 유가식 반응기에서 실시하는 것일 수 있다. 본 발명의 일 측면에 따라, 회분식 또는 연속식 반응기를 운전하여 효모균주를 배양할 경우 고농도로 효모균주를 배양할 수 있으며, 그러한 배양물을 이용하여 고농도의 지질을 추출할 수 있다.

다른 구현 예에 의하면, 상기 단계 1)의 배양은 용존산소 40% 내지 70%, pH 2.5 내지 7의 조건에서 일정 시간 이상 배양하는 것일 수 있다. 일 측면에서, 상기 용존산소는 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 또는 68% 이상일 수 있다. 또한, 다른 측면에서 상기 용존산소는 70% 이하, 68% 이하, 65% 이하, 60% 이하, 55% 이하, 50% 이하, 45% 이하, 또는 42% 이하일 수 있다. 일 측면에서, 상기 pH는 2.5이상, 2.8이상, 3이상, 3.3이상, 3.5이상, 3.8이상, 4이상, 4.5이상, 4.8이상, 5.0이상, 5.3이상, 5.6이상, 5.9이상, 6이상, 6.2이상, 6.5이상, 또는 6.8이상 일 수 있다. 또한, 다른 측면에서 상기 pH는 7이하, 6.8이하, 6.5이하, 6.2이하, 6이하, 5.95.6이하, 5.3이하, 5이하, 4.8이하, 4.5이하, 4이하, 3.8이하, 3.5이하, 3.3이하, 3이하, 또는 2.8이하일 수 있다. 일 측면에서 배양시간은 0시간 이상, 30분 이상, 45분 이상, 1시간 이상, 2시간 이상, 3시간 이상, 5시간 이상, 7시간 이상, 10시간 이상, 15시간 이상, 20시간 이상, 30시간 이상, 40시간 이상, 50시간 이상, 60시간 이상, 70시간 이상, 80시간 이상, 90시간 이상, 95시간 이상, 96시간 이상, 98시간 이상, 100시간 이상, 110시간 이상, 120시간 이상, 130시간 이상, 140시간 이상, 150시간 이상, 155시간 이상, 160시간 이상, 165시간 이상, 170시간 이상, 175시간 이상, 180시간 이상, 185시간 이상, 190시간 이상, 또는 195시간 이상일 수 있다. 또한, 다른 측면에서 상기 배양시간은 200시간 이하, 195시간 이하, 190시간 이하, 185시간 이하, 180시간 이하, 175시간 이하, 170시간 이하, 165시간 이하, 160시간 이하, 155시간 이하, 150시간 이하, 140시간 이하, 130시간 이하, 120시간 이하, 110시간 이하, 100시간 이하, 98시간 이하, 96시간 이하, 95시간 이하, 92시간 이하, 90시간 이하, 80시간 이하, 70시간 이하, 60시간 이하, 50시간 이하, 40시간 이하, 30시간 이하, 20시간 이하, 10시간 이하, 7시간 이하, 5시간 이하, 3시간 이하, 2시간 이하, 또는 1시간 이하일 수 있다. 바람직하게는 상기 배양시간은 90시간 이상일 수 있다.

일 측면에서, 상기 배양을 위한 온도는 15℃ 이상, 18℃ 이상, 20℃ 이상, 25℃ 이상, 28℃ 이상, 30℃ 이상, 33℃ 이상, 또는 35℃ 이상일 수 있다. 다른 측면에서 상기 온도는 38℃ 이하, 35℃ 이하, 33℃ 이하, 30℃ 이하, 28℃ 이하, 25℃ 이하, 20℃ 이하, 또는 18℃ 이하일 수 있다.

다른 측면에서, 상기 배양은 rpm 200 내지 900 범위에서 교반하여 용존산소 농도를 유지하는 것일 수 있다. 일 구현예에 의하면, 상기 rpm은 200이상, 250이상, 300이상, 350이상, 400이상, 450이상, 500이상, 550이상, 600이상, 650이상, 700이상, 750이상, 800이상, 또는, 850이상일 수 있다. 또는 상기 rpm은 900이하, 850이하, 800이하, 750이하, 700이하, 650이하, 600이하, 550이하, 500이하, 450이하, 400이하, 350이하, 300이하, 250이하, 또는 220이하일 수 있다. 바람직하게는 상기 rpm은 250 내지 800일 수 있다.

또 다른 구현 예에 의하면, 상기 단계 1)의 배양물은 OD₆₀₀ 은 0이상, 5이상, 10이상, 20이상, 30이상, 40이상, 50이상, 60이상, 70이상, 80이상, 85이상, 90이상, 95이상, 90이상, 95이상, 100이상, 105이상, 110이상, 또는 115이상일 수 있다. 또한, 상기 OD₆₀₀은 120이하, 115이하, 110이하, 105이하, 100이하, 95이하, 90이하, 85이하, 80이하, 70이하, 60이하, 50이하, 40이하, 30이하, 20이하, 10이하, 5이하, 2이하, 또는 1이하일 수 있다. 바람직하게는 상기 OD₆₀₀ 은 80 내지 120일 수 있다.

또 다른 구현 예에 의하면, 상기 단계 1)의 배양물의 바이오매스의 양은 0g/L 이상, 3g/L 이상, 5g/L 이상, 9g/L 이상, 10g/L 이상, 15g/L 이상, 20g/L 이상, 25g/L 이상, 30g/L 이상, 35g/L 이상, 40g/L 이상, 45g/L 이상, 50g/L 이상, 55g/L 이상, 60g/L 이상, 또는 70g/L 이상일 수 있다. 또한, 상기 바이오매스의 양은 80g/L 이하, 70g/L 이하, 60g/L 이하, 55g/L 이하, 50g/L 이하, 45g/L 이하, 40g/L 이하, 35g/L 이하, 30g/L 이하, 25g/L 이하, 20g/L 이하, 15g/L 이하, 10g/L 이하, 9g/L 이하, 5g/L 이하, 3g/L 이하, 또는 2g/L 이하일 수 있다. 바람직하게는, 상기 바이오매스의 양이 20 내지 40g/L 일 수 있다.

본 발명의 일 측면에 따라, 글루코스를 탄소원으로 공급하며 효모균주를 배양할 경우, 반응기 내에 효모균주 바이오매스량이 상기 수치까지 증가함을 확인하였으며, 이때 배양물 내 미생물 농도를 나타내는 OD600 값은 100 가까이 증가하는 것을 알 수 있었다(도 2 참조). 이는 미세조류의 배양물과는 크게 상이한 것으로, 리터 수준의 회분식 반응기에서 배양할 수 있는 미세조류의 OD600 값이 일반적으로 5 이하인 것에 비해, 본 발명의 일 측면에 의해 효모균주를 배양할 경우 훨씬 고농도의 바이오매스가 생성됨을 알 수 있다. 이러한 결과를 통해 보다 현저한 효율로 고농도의 지질을 추출할 수 있게 되는 것이다(도 3 참조). 또한, 기존의 용매보다 훨씬 적은 용매양으로도 기존 방식과 유사한 양의 지질 추출이 가능하고, 또한 기존 용매와는 달리 재사용도 가능하므로, 용매 자체의 사용량 면에서도 기존의 방식보다 현저하게 효과적이라 할 수 있다(도 4 참조).

본 발명은 일 측면에서, 상기 방법에 의해 지질을 수득하는 단계 및 상기 수득된 지질을 이용하여 트랜스에스테르화하여 바이오디젤을 수득하는 단계를 포함하는, 바이오디젤 생산 방법일 수 있다.

또한, 본 발명은 다른 측면에서, 미생물 균주; 및 가역적으로 친수성과 소수성으로 성질이 전환되는 스위칭 용매;를 포함하는, 지질 수득용 키트일 수 있다. 일 구현 예에 따르면, 상기 키트는 상기 미생물 균주를 배양할 수 있는 배지를 더 포함하는 것일 수 있고, 다른 구현 예에 의하면, 상기 키트는 상기 스위칭 용매의 혼합비율, 폭기 방법, 및 지질수득 방법에 대한 설명서를 더 포함하는 것일 수 있다.

이하, 실시예, 실험예를 통하여, 본 발명 일측면의 구성 및 효과를 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 아래 예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위해 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐 본 발명의 범주 및 범위가 그에 의해 제한되는 것은 아니다.

[실시예 1] 효모 균주 배양을 통한 바이오매스 생산

스위칭 용매를 이용하여 지질생산 효모균주가 생산한 고농도 지질을 효과적으로 추출할 수 있는지 평가하기 위하여 야로위아 리폴리티카를 고농도로 배양하였다. 야로위아 리폴리티카는 시중에서 용이하게 입수 가능한 Yarrowia lipolytica의 wild type(예를 들어, National Collections of Industrial, Marine and Food Bacteria(NCIMB, UK)로부터 분양받은 Yarrowia lipolytica NCIMB 3589, Yeastern Biotech사(Taiwan)에서 구매한 Yarrowia lipolytica po1g 등), 또는 Yarrowia lipolytica E26E1; Δpex10, Δmfe1, DGA1(즉, pex10 및 mfe1 유전자를 결실(deletion)시키고, DGA1은 과발현(overexpression)되도록 엔지니어링된 균주임. 구체적인 엔지니어링은 John et al., 2014.　Harnessing Yarrowia lipolytica lipogenesis to create a platform for lipid and biofuel production.　Nature Communications　5:3131　와 같이 공지된 방법을 통해 가능하며, 통상의 기술자가 이러한 문헌 등을 참고하여 시중에서 용이하게 입수할 수 있는 균주를 대상으로 용이하게 엔지니어링할 수 있음)를 사용하였으며(다만, 이는 실험을 위한 선택적 예일 뿐이고, 지질을 추출하기 위한 균주는 스위칭 용매에 의해 추출할 수 있는 지질을 생산하거나 함유하는 균주라면 어떤 것이든 사용가능), YSC(Yeast Synthetic Complete)배지(배지는 균주의 종류가 변경될 경우 해당 균주의 배양에 적합한 것으로 적절히 교체하여 선택 가능)에서 배양하였다.

구체적으로, 상기 야로위아 리폴리티카를 포함하는 YSC배지(초기 접종 OD₆₀₀은 0.1)를 회분식 반응기 또는 연속식 반응기에 넣어서 배양하되, 회분식 반응기 또는 연속식 반응기는 섭씨 28도에서 250 내지 800rpm으로 교반하였다. 반응기 내 용존산소 농도를 50% 이상으로 유지하기 위하여 250 내지 800rpm 범위 내에서 교반 속도를 조정하였다. 반응기 내 pH가 3.5로 유지되도록 하였고, 이를 위해 필요한 경우 2.5M NaOH와 2.5M H₃PO₄ 용액을 첨가하였다. 탄소원으로는 글루코스(160g/L)를 사용하였으며 166시간 동안 반응기를 운전하였으며, 글루코스가 모두 소모된 시점에서 상기 효모 균주를 수확하였다.

그 결과, 반응기 운전 후 약 96시간부터 효모균주의 바이오매스량이 급격히 증가하기 시작하였고, 반응기 운전 후 약 166시간에는 OD₆₀₀가 100까지 도달하였으며, 이 때, 바이오매스의 양은 약 30 g/L 였다(도 2).

[실시예 2] 스위칭 용매를 이용하여 추출된 지질의 함량 및 추출 효율 분석

스위칭 용매를 이용하여 야로위아 리폴리티카가 생산하는 지질을 추출하기 위하여, 회분식 반응기 또는 연속식 반응기에서 취한 배양물에 스위칭 용매인 DMCHA, EB, DP를 부피비 1 : 1(v:v)로 첨가하여 지질을 추출하였다.

구체적으로, 수직교반장치를 이용하여 추출을 진행하였으며, 시간대 별(용매를 배양물에 첨가한 뒤 3시간 후, 9시간후, 및 24시간 후)로 상기 스위칭 용매를 첨가한 배양물을 원심분리한 후 상등액(스위칭 용매와 추출된 지질이 포함된 층)과 침전물(물과 효모균주 세포가 포함된 침전층)을 분리하였다. 분리해낸 상등액은 이산화탄소를 공급하여(폭기 과정, CO₂ purging) 스위칭 용매와 지질의 분리 및 용매의 제거가 가능하다. 스위칭 용매를 이용하여 추출된 지질을 정확하게 정량하기 위하여 무게를 미리 측정한 빈 병에 상등액을 옮겨 담고 질소를 폭기한 뒤 스위칭 용매를 제거한 후 병의 무게를 다시 측정함으로서 추출된 지질의 양을 무게로 정량하였다. 정량된 지질의 무게를 배양물 내에 존재하는 바이오매스의 무게로 나누어 추출된 지질 함량을 계산하였으며, 도 3("B&D method"는 클로로포름 및 메탄올 혼합용매로 추출한 경우를 뜻함)으로 나타내었다. 이러한 지질 추출의 대상이 되는 미생물은 야로위아 리폴리티카에 한정되지 않고, 상기 스위칭 용매로 지질을 추출할 수 있는 미생물에 해당되면, 그러한 미생물을 대상으로 상기 방법에 따라 지질을 추출할 수 있을 것으로 여겨진다.

지질 추출 효율을 비교하기 위하여 클로로포름 및 메탄올 혼합용매(클로로포름:메탄올의 부피비는 2 : 1)를 이용하여 추출한 결과를 대조군으로 하였으며, 대조군의 지질 함량을 도 3에 붉은 색 선으로 표시하였다. 비교 결과, DMCHA와 EB를 사용한 경우 지질 추출율이 대조군보다 약 15% 높음을 확인하였다(도 3). 특히 DMCHA와 EB의 경우 모든 반응시간에서 클로로포름 및 메탄올 혼합용매를 사용한 경우 보다 높은 추출효율을 나타내어, 효모균주를 대상으로 한 지질추출에 효과적인 용매가 될 수 있음을 확인하였다.

아울러, 효모균주 단위무게당 사용된 스위칭 용매의 사용량을 클로로포름 및 메탄올 혼합용매 사용량과 비교하였다. 스위칭 용매의 경우(DP의 경우 약 9시간 동안 추출하였고, DMCHA와 EB의 경우 약 3시간 동안 추출하였다) 클로로포름 및 메탄올 혼합용매 사용량보다 약 1/8 부피의 용매를 사용하였음에도 불구하고 동일한 지질 추출효율을 얻을 수 있음을 확인하였다(도 4, "B&D method"는 클로로포름 및 메탄올 혼합용매로 추출한 경우를 뜻함.). 클로로포름 및 메탄올 혼합용매의 경우 추출에 필요한 용매의 부피가 크고 탈용매 및 건조과정을 거쳐야 하는 점을 감안할 때, 스위칭 용매를 이용한 효모균주의 지질추출방법이 훨씬 효율적인 추출방법인 것으로 판단된다.

[실시예 3] 효모균주에 의해 생산된 지질의 분리 및 스위칭 용매의 재사용 확인

실시예 2에서 야로위아 리폴리티카가 생산한 지질을 포함한 스위칭 용매로부터 지질을 분리하기 위하여 이산화탄소를 폭기시켜 스위칭 용매를 친수성으로 전환시키면, 스위칭 용매와 야로위아 리폴리티카가 생산한 지질을 분리할 수 있다.

구체적으로, 스위칭 용매로부터 지질을 분리하기 위하여, 스위칭 용매 및 지질 혼합액에 이산화탄소를 2시간 이상(예를 들어, 3시간) 동안 폭기하였으며, 스위칭 용매가 친수성으로 변함에 따라 스위칭 용매로부터 지질이 분리되는 것을 확인할 수 있다(도 1의 phase seperation 참고). 분리된 지질에 0.1% 사프라닌(safranin) 용액을 첨가하여 염색함으로서 스위칭 용매와 분리된 지질이 육안으로 확실히 구분되도록 하였다.

또한, 이산화탄소 폭기를 통해 친수성으로 변한 상기 스위칭 용매는 질소를 폭기 또는 가열을 통해 다시 소수성으로 전환됨을 확인하였다. 즉, 질소 폭기 또는 가열을 통해 소수성으로 성질이 전환된 상기 스위칭 용매를 상기 실시예와 같은 조건으로 재사용한 결과, 동일하거나 유사한 결과가 나타남을 확인하여, 상기 실시예와 같거나 유사한 지질 추출 공정에서 상기 스위칭 용매를 재사용할 수 있음을 알 수 있었다.

[실시예 4] 스위칭 용매를 이용하여 추출한 지질 성분의 조성 분석

스위칭 용매를 이용하여 야로위아 리폴리티카가 생산한 지질성분을 추출한 뒤, 트랜스 에스테르화 과정을 통하여 바이오디젤로 사용이 가능한 성분을 확인하기 위하여, 추출된 지질 성분을 트랜스에스테르화 하여 조성을 분석하였다.

구체적으로, 실시예 2 또는 3에서 회수된 지질에 1ml의 2.5% (v/v) 황산/메탄올 용액을 첨가한 후 섭씨 90도에서 약 45분간 트랜스에스테르화 반응을 진행하였다. 트랜스에스테르 반응이 끝난 시료를 냉각시킨 후 1ml의 물과 2ml의 헥산을 첨가하여 혼합한 후 2000rpm에서 15분간 원심분리하였다. 이후 분리된 상층액에 존재하는 지방산(Fatty acid)를 GC-FID(Gas Chromatography Flame Ionization Detector: Agilent technology 6890N Network GC system)로 분석하였다. 도 5에 나타난 바와 같이 스위칭 용매를 사용하여 추출한 야로위아 리폴리티카의 지질 조성이, 클로로포름과 메탄올 혼합용매(클로로포름:메탄올의 부피비는 2:1)로 추출한 지질조성과 유사한 것을 확인하였다.

Claims (25)

1. 가역적으로 친수성과 소수성으로 성질이 전환되는 스위칭 용매(switchable solvent)로 미생물 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 추출물, 및 이들의 파쇄물로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상에서 지질을 추출하는 과정을 포함하고,
   상기 미생물 균주는 효모 균주이고,
   상기 스위칭 용매는 N,N-디메틸사이클로헥실아민(N,N-dimethylcyclohexylamine, DMCHA) 또는 N-에틸 부틸아민(N-ethyl butylamine, EB)이며,
   상기 과정으로 3 시간 동안 추출되는 지질의 양이 클로로포름 및 메탄올 혼합용매로 추출한 지질의 양보다 3 중량% 이상 많은, 지질을 수득하는 방법.
2. 삭제
3. 삭제
4. 제1항에 있어서, 상기 미생물 균주, 상기 배양물, 상기 추출물, 및 이들의 파쇄물로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상과 상기 스위칭 용매의 부피비는 1:0.1 내지 1:10인, 방법.
5. 삭제
6. 제1항에 있어서, 상기 효모 균주는 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica) 균주인, 방법.
7. 제1항에 있어서, 상기 추출된 지질을 분리하는 과정을 더 포함하고, 상기 분리는 스위칭 용매를 친수성으로 전환시켜 상기 스위칭 용매로부터 지질을 분리하는 것인, 방법.
8. 제7항에 있어서, 상기 친수성으로의 전환은 폭기를 통해 실시하는 것인, 방법.
9. 제8항에 있어서, 상기 폭기는 이산화탄소를 폭기하는 것인, 방법.
10. 제1항에 있어서, 상기 방법은 지질을 추출하고, 추출된 지질을 분리한 이후, 남은 스위칭 용매를 지질 추출용 용매로 재사용하는 과정을 더 포함하는 것인, 방법.
11. 제10항에 있어서, 상기 스위칭 용매는 폭기 또는 가열을 통해 소수성으로 전환시켜 재사용하는 것인, 방법.
12. 제11항에 있어서, 상기 폭기는 질소를 폭기하는 것인, 방법.
13. 제1항에 있어서, 상기 지질은 아실글리세롤, 글리세라이드 및 자유지방산으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것인, 방법.
14. 제13항에 있어서, 상기 아실글리세롤은 트리아실글리세롤(Triacylglycerol, TAG), 디아실글리세롤(Diacylglycerol, DAG), 및 모노아실글리세롤(Monoacylglycerol, MAG)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인, 방법.
15. 제13항에 있어서, 상기 글리세라이드는 모노글리세라이드(Monoglyceride), 디글리세라이드(Diglyceride), 및 트리글리세라이드(Triglyceride)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인, 방법.
16. 제1항에 있어서, 상기 지질은 C16:0, C16:1, C16:2, C16:3, C18:0, C18:1, C18:2, C18:3, 및 C18:4으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 지방산인, 방법.
17. 제1항에 있어서, 상기 추출되는 지질의 양은 클로로포름 및 메탄올 혼합용매로 추출한 지질의 양과 같거나 그보다 1중량% 이상 많은, 방법.
18. 제1항에 있어서, 상기 방법은,
    1) 미생물 균주를 배양하여 배양물을 얻는 단계;
    2) 스위칭 용매를 상기 배양물에 첨가하는 단계;
    3) 지질을 추출하는 단계;
    4) 지질을 분리 및 수득하는 단계; 및
    5) 상기 단계 4) 이후의 스위칭 용매를 상기 단계 2)에서 재사용하는 단계;
    를 포함하는, 지질을 수득하는 방법.
19. 제18항에 있어서, 상기 단계 1)의 배양은 회분식 배양, 연속식 배양, 또는 유가식 배양인, 방법.
20. 제18항에 있어서, 상기 단계 1)의 배양은 용존산소 40% 내지 70%, pH 2.5 내지 7의 조건에서 90시간 이상 배양하는 것인, 방법.
21. 제18항에 있어서, 상기 단계 1)의 배양은 글루코스 또는 설탕을 탄소원으로 사용하여 배양하는 것인, 방법.
22. 제1항, 제4항 및 제6항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 지질을 수득하는 단계; 및
    상기 수득된 지질을 이용하여 트랜스에스테르화하여 바이오디젤을 수득하는 단계를 포함하는, 바이오디젤 생산 방법.
23. 지질 수득용 키트로서,
    미생물 균주; 및 가역적으로 친수성과 소수성으로 성질이 전환되는 스위칭 용매;를 포함하고,
    상기 미생물 균주는 효모 균주이고,
    상기 스위칭 용매는 N,N-디메틸사이클로헥실아민(N,N-dimethylcyclohexylamine, DMCHA) 또는 N-에틸 부틸아민(N-ethyl butylamine, EB)이고,
    상기 지질 수득용 키트로 3 시간 동안 추출되는 지질의 양이 상기 스위칭 용매 대신 클로로포름 및 메탄올 혼합용매를 포함하는 키트로 추출한 지질의 양보다 3 중량% 이상 많은, 지질 수득용 키트.
24. 제23항에 있어서, 상기 키트는 상기 미생물 균주를 배양할 수 있는 배지를 더 포함하는 것인, 지질 수득용 키트.
25. 제23항에 있어서, 상기 키트는 상기 스위칭 용매의 혼합비율, 폭기 방법, 및 지질수득 방법에 대한 설명서를 더 포함하는 것인, 지질 수득용 키트.

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