KR101909382B1 - 혈관확장 유도형 기체발생 나노입자, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 약물전달체 - Google Patents

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Abstract

본 발명의 하이드록시기(hydroxyl group)를 포함하는 다당류 고분자 및 폴리에틸렌글리콜(Polyethylene glycol)을 포함하는 블록공중합체(block copolymer); 상기 블록공중합체의 하이드록시기에 유기질산염(organic nitrates)을 포함하는 나노입자는 산화질소 및 약물을 동시에 선택적으로 방출할 수 있다.

Description

혈관확장 유도형 기체발생 나노입자, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 약물전달체 {Vasodilation―inducing, gas―generating nanoparticles, preparation method and drug delivery system comprising the same}
본 발명은 나노입자 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 기체 및 약물을 방출하는 나노입자를 포함하는 약물전달체에 관한 것이다.
나노의약품(Nanamedicine)은 용매에 잘 녹지 않는 난용성 약제에 나노기술을 접목시킨 것으로, 약물의 용해도를 개선할 수 있었다. 게다가 암, 관절염 및 뇌졸중 등 부실한 신생혈관 형성 관련 질환의 병변부위에 선택적으로 투과 및 체류가 증진되는 효과(EPR효과, enhanced permeability and retention effect)에 기반하여 난치성 질환의 의약품으로 각광받아 왔다.
그러나 기존의 약물전달 나노의약품의 경우, 대부분이 10 % 미만의 낮은 약물 전달 효율을 갖는 것으로 보고되고 있어 상업화에 한계성을 나타냈다. 이러한 약물전달 효율의 개선을 위하여 표면개질, 표적 리간드 도입 등 다양한 구조의 나노의약품이 개발되어 왔으나 근본적으로 EPR 효과에 의한 전달 효율의 제한이 있다. 이를 해결하기 위해 브래디키닌(bradykinin), 산화질소(NO) 등의 혈관확장제를 병용하면서 병변조직의 혈관 확장을 통하여 나노 입자의 혈관 투과성을 증진시킴으로써 약물 전달 효율의 근본적인 제약을 극복하려는 연구가 진행되고 있다.
산화질소는 생체 내에서 다양한 생물학적 기능을 갖는 기체 형태의 신호전달체로, 혈관확장제로 사용될 수 있으나, 1 초 미만의 짧은 반감기로 인하여 일반적으로 산화질소 공여제로 사용되는 S-니트로소글루타티온(S-nitrosoglutathione), 다이아제니움다이올레이트(diazeniumdiolates) 등은 빠른 분해거동을 나타내어 병변조직에 도달하기 전에 분해되며 산화질소를 방출하여 병변 부위의 선택적 혈관확장 효과를 기대하기 어렵다. 따라서 최적화된 기능 수행을 위해서는 표적 부위에서의 선택적인 산화질소 생성이 필수적이다.
본 발명의 일 목적은 기체를 방출하는 나노입자 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 기체 및 약물을 선택적으로 방출하는 약물전달체를 제공하는 것이다.
본 발명의 일 목적을 위한 나노입자는 하이드록시기(hydroxyl group)를 포함하는 다당류 고분자 및 폴리에틸렌글리콜(Polyethylene glycol)을 포함하는 블록공중합체(block copolymer); 상기 블록공중합체의 하이드록시기에 유기질산염(organic nitrates)을 포함한다.
일 실시예에서 상기 하이드록시기를 포함하는 다당류 고분자는 덱스트란(Dextran), 히알루론산(Hyaluronic acid), 셀룰로오스(Cellulose), 키토산(Chitosan), 플루란(Pullulan) 및 알기네이트(Alginate)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상 일 수 있다.
일 실시예에서 상기 블록공중합체는 소수성을 나타내는 다당류 고분자 및 친수성을 나타내는 폴리에틸렌글리콜을 포함하는 양친성 고분자일 수 있다.
일 실시예에서 상기 나노입자는 미셀구조(micelle)를 형성할 수 있다.
일 실시예에서 상기 나노입자는 글루타티온(glutathione)과 반응하여 상기 유기질산염으로부터 산화질소(nitrogen oxide)를 방출할 수 있다.
본 발명의 다른 목적을 위한 나노입자 제조방법은 하이드록시기(hydroxyl group)를 포함하는 다당류 고분자 및 폴리에틸렌글리콜(Polyethylene glycol)을 용매에 녹여 고분자용액을 형성하는 제1 단계; 상기 고분자용액에 환원제를 첨가하여 블록공중합체(block copolymer)를 형성하는 제 2단계; 및 질산염 혼합용액을 상기 블록공중합체에 적가 하여 첨가하는 제 3단계;를 포함한다.
일 실시예에서 상기 폴리에틸렌글리콜은 아민기(NH2, amino group)를 포함할 수 있다.
일 실시예에서 상기 용매는 DMSO(dimethyl sulfoxide)일 수 있다.
일 실시예에서 상기 환원제는 NaCNBH3(sodium cyanoborohydride)일 수 있다.
일 실시예에서 상기 질산염 혼합용액은 아세트산(acetic acid), 무수 아세트산(acetic anhydride) 및 질산(nitric acid)을 포함할 수 있다.
일 실시예에서 상기 질산염 혼합용액은 아세트산 1 몰을 기준으로, 무수아세트산 0.5 몰 내지 2 몰 및 질산 1 몰 내지 3 몰을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적을 위한 약물전달체는 하이드록시기(hydroxyl group)를 포함하는 다당류 고분자 및 폴리에틸렌글리콜(Polyethylene glycol)을 포함하는 블록공중합체(block copolymer); 상기 블록공중합체의 하이드록시기에 유기질산염(organic nitrates)을 포함하는 나노입자; 상기 나노입자에 약물이 봉입된다.
일 실시예에서 상기 나노입자는 소수성을 나타내는 다당류 고분자 및 친수성을 나타내는 폴리에틸렌글리콜을 포함하는 양친성 고분자이며, 상기 양친성 고분자의 소수성 중심부에 약물이 봉입될 수 있다.
일 실시예에서 상기 약물전달체는 글루타티온과 반응하여, 상기 유기질산염으로부터 산화질소를 방출하는 동시에, 상기 소수성 중심부에 봉입된 약물을 방출할 수 있다.
일 실시예에서 상기 약물은 항암제를 포함할 수 있다.
본 발명의 나노입자는 유기질산염을 포함하므로 산화질소를 방출할 수 있고, 소수성 특성으로 인해 수용액 상에서 자가조립체를 형성하여 약물을 봉입하고, 소수성 중심부의 친수성 전환을 통해 선택적으로 약물을 방출 할 수 있다. 따라서, 암과 같은 특정 조직에 존재하는 글루타티온(GSH)에 감응하여 선택적으로 산화질소를 방출함으로써 혈관을 확장시키고, 동시에 약물을 방출할 수 있다. 이러한 혈관 확장으로 인해 암 치료제가 암조직으로 효율적으로 전달될 수 있다. 혈관확장제 주입 후, 순차적으로 약물 주입 단계를 거치는 종래의 기술과 달리 본 발명은 혈관확장제 및 약물을 동시에 방출 할 수 있는 나노입자를 제공한다.
도 1은 본 발명의 나노입자의 합성 경로를 나타낸 도면이다.
도 2는 생체 내에서의 약물전달체를 나타낸 도면이다.
도 3은 나노입자를 나타낸 도면이다.
도 4는 나노입자를 나타낸 도면이다.
도 5는 나노입자를 나타낸 도면이다.
도 6은 나노입자의 변화를 나타낸 도면이다.
도 7은 나노입자에 관한 도면이다.
도 8은 나노입자의 효과를 나타낸 도면이다.
도 9는 나노입자의 효과를 나타낸 도면이다.
도 10은 나노입자의 효과를 나타낸 도면이다.
도 11은 나노입자의 효과를 나타낸 도면이다.
도 12는 나노입자의 효과를 나타낸 도면이다.
이하, 첨부한 도면을 참조하여 본 발명의 실시예에 대해 상세히 설명한다. 본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 형태를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 본문에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나 이는 본 발명을 특정한 개시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 각 도면을 설명하면서 유사한 참조부호를 유사한 구성요소에 대해 사용하였다.
본 출원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로서 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 출원에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
본 발명의 나노입자는 하이드록시기(hydroxyl group)를 포함하는 다당류 고분자 및 폴리에틸렌글리콜(Polyethylene glycol)을 포함하는 블록공중합체(block copolymer); 상기 블록공중합체의 하이드록시기(hydroxyl group)에 유기질산염(organic nitrates)을 포함한다.
상기 하이드록시기(hydroxyl group)를 포함하는 다당류 고분자는 덱스트란(Dextran), 히알루론산(Hyaluronic acid), 셀룰로오스(Cellulose), 키토산(Chitosan), 플루란(Pullulan) 및 알기네이트(Alginate)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.
상기 하이드록시기를 포함하는 다당류 고분자는 유기질산염을 도입한 질산염 다당류 고분자 유도체일 수 있다.
상기 덱스트란은 포도당 중합체인 다당류이며, 하이드록시기를 포함할 수 있다. 상기 덱스트란은 하이드록시기에 유기질산염을 도입한 질산염 덱스트란 유도체 일 수 있다.
상기 폴리에틸렌글리콜 화합물은 말단에 아민기를 포함할 수 있으며, 예를 들어 PEG-NH2(α-메톡시-ω-아미노 폴리에틸렌글리콜)(α-methoxy-ω-amino PEG)일 수 있다.
상기 다당류 고분자 및 폴리에틸렌글리콜은 생체적합성이 우수하여 상기 나노입자는 긴 체내 순환 시간을 가질 수 있다.
상기 블록공중합체는 폴리에틸렌글리콜이 다당류 고분자에 결합된 고분자 기반의 나노입자일 수 있고, 하이드록시기를 포함할 수 있으며, 상기 하이드록시기에 유기질산염이 결합될 수 있다.
상기 블록공중합체의 하이드록시기는 상기 블록공중합체에 포함된 다당류 고분자의 하이드록시기일 수 있고, 상기 다당류 고분자가 가진 하이드록시기에는 유기질산염이 결합될 수 있다.
일 실시예에서 상기 나노입자는 소수성을 나타내는 다당류 고분자 및 친수성을 나타내는 폴리에틸렌글리콜을 포함하는 양친성 고분자일 수 있다.
상기 양친성 고분자는 각각의 친수성 및 소수성을 나타내는 물질들이 결합되어, 친수성 및 소수성을 모두 가진 고분자를 나타낸다. 따라서 상기 블록공중합체를 포함하는 본 발명의 나노입자는 양친성 고분자일 수 있다.
일 실시예에서 상기 나노입자는 미셀구조(micelle)를 형성할 수 있다.
상기 나노입자는 상기 나노입자가 소수성 및 친수성을 나타내는 부분을 동시에 가짐으로써 미셀구조를 형성할 수 있다. 상기 나노입자는 수용액에서 안정한 미셀구조(micelle)로 자가 조립(self-assembly)할 수 있다.
일 실시예에서 상기 나노입자는 글루타티온(glutathione)과 반응하여 상기 유기질산염으로부터 산화질소(nitrogen oxide)를 방출할 수 있다.
상기 나노입자는 생체 내에서 글루타티온에 감응하여 소수성에서 친수성으로 변하고(transition) 따라서 미셀 구조가 파괴될 수 있다. 상기 글루타티온은 생체 내에 존재하여 산화환원반응에 중요한 역할을 하는 물질로, 특히 암 조직 주변에 고농도로 존재하는 환원성 물질이다.
상기 나노입자는 글루타티온에 감응(response)하여 나노입자에 포함된 유기질산염으로부터 산화질소를 방출할 수 있고, 상기 산화질소에 의해 혈관이 확장될 수 있다. 따라서 유기질산염을 포함하는 본 발명의 나노입자가 생체 내 암 조직 주변에서 글루타티온과 반응하면 산화질소를 방출하여 혈관이 확장될 수 있다.
상기 산화질소는 종양 진행(tumour progression)에 유익하거나 유해한 영향을 줄 수 있다. 상기 산화질소의 농도로 산화질소의 유익하거나 유해한 활성이 결정될 수 있다. 예를 들어 산화질소의 농도가 낮으면, 종양으로부터 전이를 증가시키고, 항세포사멸 반응을 일으킬 수 있고, 반대로 산화질소의 농도가 높으면, DNA 손상이 발생되고, p53 유전자 및 성장인자 등을 조절함으로써 세포사멸효과가 있을 수 있다.
본 발명의 나노입자 제조방법은 하이드록시기(hydroxyl group)를 포함하는 다당류 고분자 및 폴리에틸렌글리콜(Polyethylene glycol)을 용매에 녹여 고분자용액을 형성하는 제1 단계; 상기 고분자용액에 환원제를 첨가하여 블록공중합체(block copolymer)를 형성하는 제 2단계; 및 질산염 혼합용액을 상기 블록공중합체에 적가 하여 첨가하는 제 3단계;를 포함한다.
일 실시예에서 상기 폴리에틸렌글리콜은 아민기(NH2, amino group)를 포함할 수 있고, 예를 들어 상기 폴리에틸렌글리콜은 α-메톡시-ω-아미노 폴리에틸렌글리콜(α-methoxy-ω-amino PEG)(PEG-NH2)일 수 있다.
일 실시예에서 상기 용매는 DMSO(dimethyl sulfoxide)를 사용할 수 있다.
일 실시예에서 상기 환원제는 NaCNBH3(sodium cyanoborohydride)를 사용할 수 있다.
상기 질산염 혼합용액은 적어도 한 종류 이상의 질산염이 포함될 수 있고, 적어도 하나 이상의 산성 용액이 포함될 수 있다. 예를 들어 상기 질산염 혼합용액은 2 개 이상의 산성 용액이 포함될 수 있다.
일 실시예에서 질산염 혼합용액은 아세트산(acetic acid), 무수 아세트산(acetic anhydride) 및 질산(nitric acid)을 포함할 수 있다.
상기 질산은 진한 질산(concentrated nitric acid)일 수 있으며, 상기 진한 질산은 약 63 % 이상의 질산(HNO3)이 포함되는 수용액일 수 있고, 시판되는 진한 질산을 이용할 수 있다.
일 실시예에서 상기 질산염 혼합용액은 아세트산 1 몰을 기준으로, 무수아세트산 0.5 몰 내지 2 몰 및 질산 1 몰 내지 3 몰을 포함할 수 있다. 예를 들어 상기 질산염 혼합용액은 아세트산 1 몰을 기준으로 무수아세트산 1 몰 및 질산 2 몰을 포함할 수 있다.
도 1은 본 발명의 나노입자의 합성 경로를 나타낸 도면이다. 도 1을 참조하면, 본 발명의 고분자를 기반으로 하는 나노입자 및 대조군 나노입자의 합성 경로를 나타낸 도면이다.
도 1을 구체적으로 살펴보면, 먼저 아민기를 갖는 PEG 및 덱스트란에 환원제인 NaCNBH3을 첨가하여 폴리에틸렌글리콜 고분자 주쇄가 접합된 덱스트란 블록 공중합체인 덱스트란-폴리에틸렌글리콜 블록공중합체(PEG-b-Dex)를 제조한다. 본 명세서 상에서 덱스트란-폴리에틸렌글리콜 블록공중합체를 PEG-b-Dex로 나타내어 설명하였다.
다음으로, 위와 같이 제조된 PEG-b-Dex의 덱스트란 블록에 포함된 하이드록시기에 유기질산염을 결합시킨다. PEG-b-Dex에 유기질산염을 결합시켜 글루타티온에 감응하여 유기질산염으로부터 산화질소를 방출할 수 있는 고분자 나노입자 PEG-b-NO-Dex를 형성하고, 제조된 PEG-b-Dex에 리토콜린산(lithocholic acid)을 반응시켜 대조군 나노입자인 PEG-b-LA-Dex를 제조한다.
대조군 나노입자의 합성 경로를 구체적으로 살펴보면, PEG-b-Dex 및 NaIO4(sodium periodate)를 반응시켜 중합체 1을 형성한 다음, 상기 중합체 1과 헥사메틸렌디아민(hexamethylene diamine)을 결합시켜 아민 관능화된 중합체 2를 제조한다. 그런 다음 이어서 상기 중합체 2에 리토콜린산(lithocholic acid), EDC(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide) 및 NHS(N-hydroxysulfosuccinimide)로 대조군 나노입자인 PEG-b-LA-DEX를 제조한다.
본 발명의 PEG-b-NO-Dex는 상기 제조된 PEG-b-Dex에 아세트산(acetic acid), 무수아세트산(acetic anhydride) 및 진한 질산(concentrated nitric acid)을 혼합한 산성혼합용액을 적가 하여 반응시킴으로써 제조할 수 있다.
본 발명의 약물전달체는 하이드록시기(hydroxyl group)를 포함하는 다당류 고분자 및 폴리에틸렌글리콜(Polyethylene glycol)을 포함하는 블록공중합체(block copolymer); 상기 블록공중합체의 하이드록시기에 유기질산염(organic nitrates)을 포함하는 나노입자; 상기 나노입자에 약물이 봉입된다.
일 실시예에서 상기 나노입자는 소수성을 나타내는 다당류 고분자 및 친수성을 나타내는 폴리에틸렌글리콜을 포함하는 양친성 고분자이며, 상기 양친성 고분자의 소수성 중심부에 약물이 봉입될 수 있다.
상기 나노입자는 미셀구조를 형성할 수 있고, 상기 미셀구조의 소수성 중심부에 약물이 봉입될 수 있으며, 상기 나노입자는 상기 소수성 중심부에 약물이 봉입된 미셀구조를 형성할 수 있다.
상기 나노입자의 미셀구조가 파괴되면 상기 소수성 중심부에 봉입된 약물이 방출될 수 있다.
일 실시예에서 상기 약물전달체는 글루타티온과 반응하여, 상기 유기질산염으로부터 산화질소를 방출하는 동시에, 상기 소수성 중심부에 봉입된 약물을 방출할 수 있다.
상기 약물전달체는 글루타티온과 반응하여 상기 약물전달체에 포함된 상기 유기질산염으로부터 산화질소를 방출할 수 있고, 소수성에서 친수성으로 변환되어 미셀구조가 파괴됨에 따라 소수성 중심부에 봉입된 약물이 방출될 수 있다.
일 실시예에서 상기 약물은 항암제를 포함할 수 있고, 예를 들어 상기 항암제는 독소루비신일 수 있다.
도 2는 생체 내에서의 약물전달체를 나타낸 도면이다. 도 2를 보면, 본 발명의 일 실시예에 따른 정맥 내에 투여된 독소루비신을 포함하는 약물전달체의 모습을 도식적으로 나타내었다. 본 발명의 약물전달체가 정맥에 투여되면 도 2에서 나타내고 있는 것과 같이 약물전달체가 혈관을 통해 암 세포에 접근하게 되고, 암 세포 주변에서 글루타티온과 감응하여 산화질소를 방출하게 되고 또한 동시에 항암제인 독소루비신을 방출하게 된다. 이 때 산화질소는 국소 혈관확장제로 작용하게 되어 혈관이 확장된다. 확장된 혈관으로 인해서 암세포 주변의 혈류가 증가하고, 신생혈관 형성 관련 질환의 병변부위에 선택적으로 투과 및 체류가 증진되는 효과(EPR효과, enhanced permeability and retention effect)가 증가된다. 이러한 과정은 산화질소 생성과 혈관 확장 속도 사이의 평형에 도달할 때 까지 반복된다.
이하 본 발명의 실시예들에 대해 상술한다. 다만, 하기 실시예들은 본 발명의 일부 실시 형태에 불과한 것으로서, 본 발명이 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 아니된다.
재료
덱스트란(Mw=40 kDa), EDC·HCl(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide·hydrochloride, NHS(N-hydroxysulfosuccinimide, PEG-NH2(α-methoxy-ω-aminoPEG), 아디팍산디하이드라지드(adipicaciddihydrazide), 과요오드산 나트륨(sodium periodate) 및 NaCNBH4(sodium cyanoborohydride)는 Sigma-Aldrich(MO, USA)에서 구입하였다. Cy5.5는 Amersham Biosciences(NJ, USA)에서 구입하였다. DIW(탈이온수)(deionized water)는 AquaMax-Ultra 수질 정화 시스템(YounglinCo., Korea)을 사용하여 준비하였다. HT29 세포주(cell line)는 American Type Culture Collection(Rockville, MD, USA)에서 구입하였다. 세포 배양을 위해 MEM(Minimum Essential Medium), 트립신-에틸렌다이아민테트라아세트산(trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid) 및 FBS(fetal bovine serum)을 Welgene Inc.(한국)에서 구입하였다.
PEG-b-Dex 공중합체 제조
일 실시예에 따라, 말단에 아민(amine)기를 갖는 mPEG-NH2(methoxy PEG)와 덱스트란의 환원적 아미노화(reductive amination) 반응을 이용하여, PEG가 접합된 덱스트란 블록 공중합체인 PEG-b-Dex 블록 공중합체 나노입자를 제조할 수 있다.
구체적으로, 약 200 mg의 mPEG-NH2(약 0.03 mM)와, 약 800 mg의 덱스트란(약 0.03 mM)을 디메틸술폭사이드(DMSO, dimethyl sulfoxide)에 녹인 후, 약 45 ℃에서 약 24 시간 동안 교반하였다. 이어서 약 6.28 mg의 NACNBH4(약 0.1 mM)를 첨가하고 약 72 시간 동안 더 교반하였다. 이후, 셀룰로스 막(cellulose membrane)(MWCO = 대략 6 내지 8 kDa)을 사용하여 DIW(deionized water)로 약 72 시간 동안 투석하고, DIW를 약 6 시간 마다 교체하였다. 생성된 블록공중합체용액을 동결 건조시켜 PEG-b-Dex 블록 공중합체 나노입자를 얻었고, 약 - 20 ℃에서 보관하였다.
PEG-b-LA-Dex 제조(대조군)
본 발명의 나노입자와 비교 실험을 수행하기 위해서, 글루타티온에 민감하게 반응하지 않는 나노입자를 일 실시예에 따라 제조하였다.
먼저, 덱스트란을 NaIO4(sodium periodate, 과요오드산 나트륨)와 산화시켜 덱스트란 알데히드(dextran aldehyde)(중합체 1)를 형성한다.
구체적으로 약 500 mg의 PEG-b-DEX (약 0.01 mmol)을 약 58.62 mg의 과요오드산 나트륨(약 0.217 mmol)을 함유하는 약 10 ml의 DIW에 용해시키고 어두운 조건의 실온에서 약 2 시간 동안 교반하였다. 산화가 완료되면, 미반응된 과요오드산을 비활성화시키기 위해서 약 2 ml의 에틸렌글리콜을 첨가하고, 산화가 완료된 용액을 DIW로 투석하였다. 대략 5 회 정도 물을 교체하며 약 24 시간 동안 투석하였고, 얻어진 중합체 1은 동결 건조시켰다.
다음으로, 헥사메틸렌디아민을 환원성 아미노화 반응으로 덱스트란 알데히드(중합체 1)에 결합시켜 아민 관능화된 PEG-b-DEX(중합체 2)를 제조한다.
구체적으로 약 400 mg의 PEG-b-DEX 공중합체를 약 20 ml의 붕산염 완충액(borate buffer)(약 200 mM, 약 pH 9.0)에 용해시키고, 헥사메틸렌디아민(약 50 mg, 약 0.430 mmol)을 첨가하였다. 이어서 반응은 약 45 ℃에서 약 4 일 동안 수행하였다. 상기 반응을 수행한 용액을 증류수로 약 72 시간 동안 투석하고, 동결 건조시켜 아민 관능화된 PEG-b-DEX(중합체 2)를 얻었다.
마지막으로, 리토콜린산(lithocholic acid)을 EDC 및 NHS를 사용하여 상기 중합체 2에 커플링(coupled)시켜 PEG-b-LA-DEX를 형성한다.
구체적으로 약 300 mg의 리토콜린산(약 0.79 mmol), 약 191.7 mg의 EDC(약 1 mmol) 및 약 172.6 mg의 NHS(약 1.5 mmol)를 약 10 ml의 DMSO에 용해시킨 혼합물을 실온에서 약 2 시간 동안 교반하였다. 상기 혼합물에 약 300 mg의 아민 관능화된 PEG-b-DEX(중합체 2)를 첨가하고, 약 12 시간 동안 반응시켰다. 중합체 결합체(polymer conjugate)를 DIW로 약 48 시간 동안 투석한 후 동결 건조시켜 대조군 나노입자를 얻었다.
NO-NPs 제조
먼저 약 500 mg의 PEG-b-DEX를 약 250 mg/ml의 농도로 디클로로메탄(dichloromethane)에 녹인 현탁(suspension)액을 약 0 ℃에서 유지된 아이스 바스(ice bath)에서 교반하였다.
이어서, 상기 현탁액을 교반하면서, 아세트산(acetic acid) 약 1 몰에 대해 무수아세트산(acetic anhydride) 및 진한 질산(concentrated nitric acid)을 약 1 몰 및 약 2 몰의 비율로 함유하는 질산염(nitrating) 혼합용액 약 1 ml를 적가(dropwise)하며 약 0 ℃에서 약 5 시간 동안 반응시켰다. 상기 반응 완료 후, 생성물인 유기질산염을 함유하는 PEG-b-DEX 블록 공중합체(PEG-b-NO-DEX)를 약 10 ml의 냉 메탄올(cold methanol)에 침전시키고 약 2 회 정도 세척하고 추후 사용을 위해 PEG-b-NO-DEX를 동결 건조시켜 저장하였다.
다음으로 NO-NP 제조를 위해서, 약 30 mg의 PEG-b-NO-DEX를 약 5 ml의 DMSO에 용해시키고(약 6 mg/ml), 교반한 후, 약 1 mg/ml의 농도가 되도록 약 30 ml의 DIW에 적가 하여 NO-NP 현탁액을 생성하였다. 상기 PEG-b-NO-Dex 나노입자 현탁액을 약 6 시간 마다 물을 교환하면서 DIW로 약 72 시간 동안 투석하여 DMSO를 정제하였고, 약 0.8 μm 실린지 필터(syringe filter)를 통해 여과하여 크기가 큰 응집체를 제거하였다.
약물전달체 제조
일 실시예에 따라 항암제인 독소루비신(DOX, doxorubicin)을 포함하는 본 발명의 약물전달체를(DOX-NO-NPs) 제조하였다.
doxorubicinㅇHCl 약 5 mg을 약 2 몰 당량의 트리에틸아민(triethylamine)을 함유한 클로로포름(chloroform)에 녹인 후, DIW로 추출하여 과량의 트리에틸아민 및 부산물 염을 제거하여 소수성의 독소루비신을 얻었다.
다음으로, 상기 독소루비신을 포함하는 유기층을 약 50 mg의 PEG-b-NO-Dex를 함유한 약 1 ml의 DMSO 용액에 직접 첨가하여 독소루비신 고분자 혼합용액을 형성하였다. 이어서 상기 혼합용액을 약 20 ml의 DIW에 교반하면서 적가 하여 첨가하였다. 상기 혼합용액을 약 24 시간 동안 증류수로 투석하여 담지 되지 않은 독소루비신을 제거하였고, 약 0.8 μm 실린지 필터로 여과하고 동결 건조시켜 DOX-NO-NPs를 제조하였다.
이와 같이 제조된 약물전달체 DOX-NO-NPs 및 동일 조건의 대조군으로 제조된 DOX-control-NPs를 UV/Vis spectrophotometer를 이용하여 485 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였고, 입자 크기 및 약물 봉입 효율을 표 1에 나타내었다.
시료 크기
(nm)		 다분산지수
(PDI)		 약물 농도
(μg/mg)
DOX-NO-NPs 130ㅁ4.2 0.17 6.8
DOX-control-NPs 162ㅁ2.8 0.12 7.4
특성 평가
일 실시예들을 통해서 제조된 고분자 기반의 NO-NP 나노입자 및 대조군 나노입자(PEG-b-LA-Dex)의 특성을 평가하였다.
먼저 각각 나노입자의 화학구조 등의 특성을 평가하기 위해 1H NMR(nuclear magnetic resonance) (500 MHz, Varian INOVA, USA), FTIR 분광기 (Nicolet ™ iS ™ 10, USA) 및 광 발광 분광기(FluoroMatye FS-2, SCINCO)를 사용하였다. 또한 입자의 크기 분포 및 형태는 200 kV의 가속 전압에서 제타사이저(Zetasizer Nano ZS 90, Malvern Instruments, Worcestershire, UK) 및 TEM (Transmission electron microscopy, Philips CM30)등 을 사용하여 측정하였다.
제조된 NO-NP의 질화도(degree of nitration)는 원소분석(elemental analysis) 결과 덱스트란의 당 분자(sugar molecule) 당 약 2.03 개의 질산염(nitrates)이 존재하는 것으로 추정되었다.
도 3은 나노입자를 나타낸 도면이다. 구체적으로 나노입자의 니트로화(nitration)에 관한 것으로, PEG-b-Dex가 니트로화를 통해 수용액에서 블록공중합체가 자가조립을 할 수 있다는 것을 확인하기 위해, D2O(중수)에서 PEG-b-Dex의 니트로화 전 후에 1H NMR 스펙트럼을 관찰하였다. 도 3의 a는 니트로화 전 PEG-b-Dex, 도 3의 b는 니트로화 후의 PEG-b-NO-Dex를 나타낸 것이다. 니트로화 전에는 폴리에틸렌글리콜 및 덱스트란의 피크가 모두 관찰되지만, 니트로화 후에는 폴리에틸렌글리콜의 피크만 확인되는 것을 알 수 있고, 이것은 니트로화 후에 PEG-b-NO-Dex의 덱스트란 블록은 D2O와 상호작용하지 않고 코어 구조의 중심으로 자가조립된다는 것을 나타낸다.
도 4는 나노입자를 나타낸 도면이다. 구체적으로 도 4는 나일레드(Nile red)의 발광 스펙트럼을 나타내는 것으로, 나일레드의 적색 형광은 니트로화 전에PEG-b-Dex에는 나타나지 않았고, 니트로화 후의 PEG-b-NO-Dex의 수용액에서만 관찰되었다. 도 4를 참고하면, 본 발명의 PEG-b-NO-Dex는 자가조립되어 코어를 형성하고, 따라서 PEG-b-NO-Dex에 염료를 봉입할 수 있다는 것을 알 수 있다.
도 5는 나노입자를 나타낸 도면이다. 도 5는 본 발명의 NO-NPs 및 대조군 나노입자의 TEM(transmission electron microscopy) 이미지 및 크기분포를 나타낸 것으로, 도 5의 a 및 c를 비교하면 NO-NPs 및 대조군 나노입자는 각각 약 134 ± 3.2 nm 및 약 113 ± 3.1 nm의 반경을 갖는 구형으로 확인되었다. 또한 도 5의 b는 글루타티온이 존재하는 경우의 NO-NPs를 나타낸 것으로, 글루타티온 존재하에서 NO-NPs는 구형의 구조가 파괴되고 불안정하게 변화한다는 것이 관찰되었다.
도 6은 나노입자의 변화를 나타낸 도면이다. 도 6의 a는 NO-NPs로부터 산화질소가 생성되는 것을 나타낸 것이며, 도 6의 b는 글루타티온과 감응하기 전, 후의 NO-NPs의 스펙트럼을 나타낸 것이다. 도 6의 a를 참조하면, NO-NPs는 글루타티온과 반응하여, 유기질산염(예를 들어 NO2)을 하이드록시기로 변환시키면서 산화질소를 발생시키는 것을 나타내고 있고, 도 6의 b를 보면 그래프에 하이드록시기에 해당하는 피크(3200 내지 3300 cm-1) 및 질산염을 나타내는 (1650 및 1260 cm-1)을 보면 글루타티온과 반응한 후 질산염보다 하이드록시기가 증가한 것을 알 수 있다.
도 5 내지 6을 통하여, 글루타티온에 의해 NO-NPs의 유기질산염이 하이드록시기가 되면서 산화질소가 발생하고, 구조적으로 불안정해지는 것을 알 수 있다.
약물 및 산화질소 방출 평가
NO-NPs의 산화질소 방출을 평가하기 위해서 방출되는 산화질소는 DAF-FM(4-amino-5-methylamino-2,7-difluorofluorescein) 및 정량 분석을 위한 그리스 시약(Griess reagent)을 형광 프로브(fluorescentprobe)로 사용하여 관찰하였다. 사용된 그리스 시약은 총 질산염 및 아질산염 농도를 측정하여 나노입자에서 방출되는 산화질소의 양을 정량화하는데 사용하였다.
도 7은 나노입자에 관한 도면이다. 도 7의 a를 참조하면, 약 10 mM 글루타티온 용액에 NO-NPs가 존재할 때, DAF-FM의 강도는 시간이 갈수록 증가하는 것으로 나타났다. 이것을 통해서 산화질소가 글루타티온 존재하에서 NO-NPs로부터 생성되었음을 알 수 있다. NO-NPs에 경우 약 48 시간 동안 산화질소가 지속적으로 방출되었으나, 대조군 나노입자의 경우는 이러한 산화질소의 방출이 관찰되지 않았다. 도 7의 b를 보면, 독소루비신을 용제 교환법으로 나노입자에 봉입하여 약 72 시간 동안 약 10 mM의 글루타티온이 존재하는 경우 및 글루타티온이 없는 경우에서 각각 독소루비신이 담지된 DOX-대조군 및 DOX-NO-NPs의 방출 거동을 나타낸 것으로, DOX-NO-NPs은 글루타티온이 존재하는 경우 독소루비신 방출이 뛰어났으며, DOX-대조군의 독소루비신 방출은 글루타티온 유무에 큰 영향을 받지 않는 것으로 나타난다. 이러한 차이는 DOX-대조군에는 글루타티온에 민감하게 반응할 수 있는 작용기가 없기 때문으로 보여진다.
NO-NPs의 생체 내 혈관확장 효과
HT29 종양 보유 마우스에 NO-NPs 및 식염수를 15 mg/kg를 정맥으로 투여한 후, 종양 혈류 변화에 대한 정량 분석을 3차원 초음파 도플러(ultrasound power Doppler)(VisualSonics Vevo2100 High Resolution System, Canada)를 사용하여 0, 2, 6 및 24 시간 마다 확인하였다.
도 8은 나노입자의 효과를 나타낸 도면이다. 도 8의 a 및 b를 참조하면 3차원 초음파 도플러로 측정한 결과 NO-NPs를 투여한 쥐의 경우, 처음 약 6 시간 동안 종양 조직의 혈류가 약 30 % 까지 급속히 증가한 후 서서히 감소하여 정상 수준으로 되돌아왔지만, 식염수를 투여한 쥐의 경우 유의미한 증가는 나타나지 않았다. 도 8의 c는 레이저 스펙클 이미지(laser speckle images)로 종양 혈관의 변화를 나타낸 것으로, 식염수를 투여한 경우 및 NO-NPs를 투여하기 전에는 종양에서 기존의 두드러진 혈관만 관찰되었다. 그러나 NO-NPs를 투여한 후 약 6 시간이 지난 후, 마우스에서 미세혈관계가 명확해지고 종양혈관계의 혈류가 강화되었다.
도 9는 나노입자의 효과를 나타낸 도면이다. 구체적으로, HT29 종양 이종 이식 마우스 모델에 생체 내 이미징 창(intravital imaging window)을 통해 투포톤 현미경(two-photonmicroscopy)을 사용하여 종양혈관(tumour blood vessels)을 관찰하여 나타낸 것이다. 마우스 정맥에 식염수 또는 NO-NPs를 투여하기 전에 종양 조직을 텍사스 레드로 표지된 덱스트란(Texas Red-labeled dextran (Texas Red-dextran, 70 kDa)으로 처리하여서 이미지에 빨간색으로 나타났다. 식염수 또는 NO-NPs를 투여하고 12 시간 후, NO-NPs를 투여한 경우에는 처음보다 빨간색으로 표시되는 부분이 증가하였으므로, 혈관에서 종양 조직으로 훨씬 더 많이 침투되는 것이 확인되었다. 플루오레신으로 표지된 덱스트란(FITC-dextran (fluorescein-labeled dextran), 150 kDa)은 혈관을 나타내기 위해 처리하여 녹색을 나타내어, 혈관 밖의 종양에 침투된 텍사스 레드 덱스트란과 구분 할 수 있도록 하였다. 관찰한 결과 혈관은 팽창되는 것으로 보이며, 종양 조직에서 NO-NPs로부터 방출된 산화질소에 의해서 혈관이 확장된다는 것을 알 수 있다.
NO-NPs의 생체 내 분포거동 평가
NO-NPs 및 대조군 나노입자의 생체 내 종양 탐색 능력은 실시간 근적외선 영상(real-time near-infrared fluorescence(NIRF)) 기법에 의해 모니터링되었다. 근적외선 형광체 Cy5.5를 대조군 나노입자 및 NO-NPs에 표시시켰다. 마우스에 HT29 세포 현탁액 약 80μl를 피하 주사한 HT29 종양 보유 마우스를 두 그룹으로 나누어 Cy5.5로 표지된 대조군 나노입자 및 NO-NPs를 꼬리에 각각 따로 정맥주사로 투여하고 NIRF 이미지를 관찰하였다.
도 10은 나노입자의 효과를 나타낸 도면이다. 도 9의 a를 보면 Cy5.5로 표지된 대조군 나노입자 및 NO-NPs를 투여한 후, 초기(약 3 시간)에는 NIRF 신호가 마우스의 전신에서 발견되어 각각의 나노입자들이 순환하고 있는 것을 알 수 있다. 그러나 시간이 갈수록 Cy5.5로 표지된 대조군 나노입자 보다 NO-NPs를 투여한 마우스에서 Cy5.5로 표지된 NO-NPs의 축적이 관찰되었고, 도 10의 b를 보면, 약 24 시간 후 총 형광 세기를 종양 크기에 비교하여 계산한 결과, 대조군 나노입자보다 NO-NPs가 종양조직에 대해 약 1.75 배 높은 축적을 나타내었다.
도 9 및 도 10을 통해서 NO-NPs가 산화질소를 방출하여 혈관을 확장시킴에 따라 혈류량 및 혈관 투과성이 증가하여 종양 조직에 축적된 다는 것을 알 수 있다.
NO-NPs의 생체 내 정량화 및 항종양효능 평가
free-DOX(독소루비신), DOX 대조군(DOX-control NPs) 및 DOX-NO-NPs(독소루비신을 봉입한 NO-NPs)의 약물 분포(drug distributions) 및 항종양효능(antitumour efficacies)을 종양 보유 마우스로 평가하였다. 독소루비신이 담지된 나노입자 전신 투여(systemic administration) 약 12 시간 후에 각 장기의 독소루비신은 정량화되었다.
도 11은 나노입자의 효과를 나타낸 도면이다. 구체적으로 도 11의 a를 보면, free-DOX, DOX 대조군 및 DOX-NO-NPs를 투여한 후, 다른 주요 장기들에서는 독소루비신의 함유량이 차이가 거의 없었지만, 종양 조직의 경우 free-DOX, DOX 대조군 및 DOX-NO-NPs가 각각 종양 조직 당 약 2.80 μg, 약 10.01 μg 및 약 15.20 μg으로 나타났다(p < 0.01). 정상 조직에서는 방출된 산화질소가 빠르게 비활성 질산염 및 아질산염 이온으로 변하지만, 종양 조직에서는 낮은 pH 및 저산소 조건에 의해 방출된 산화질소로부터 생성된 질산염 및 아질산염이 활성 산화질소로 변화하기 때문에 이러한 특이적 축적이 종양 조직에서만 나타나는 것으로 보여진다. 또한, 도 11의 b, c를 보면, 독소루비신이 담지된 나노입자 및 free-DOX의 항종양 효능을 평가하여 나타낸 것으로, DOX-NO-NPs를 투여한 마우스는 DOX 대조군, free-DOX 및 식염수를 투여한 마우스들과 비교하여 종양의 부피 및 무게가 가장 감소하였다. 투여하고 약 14 일 째, 식염수, free-DOX, DOX 대조군 및 DOX-NO-NPs를 투여한 마우스 군의 종양 체적은 각각 544.5 cm3, 393.8 cm3, 308.6 cm3 및 149.9 cm3로 나타났다(스케일바 1 cm). 종양 부피는 (가장 큰 직경×(가장 작은 직경)2 /2로 계산하였다.
이러한 종양 체적의 감소는 DOX-NO-NPs로 인해 강화된 EPR이 독소루비신을 보다 효과적으로 전달하는 것을 나타낸다. 또한, DOX-NO-NPs를 투여한 마우스는 free-DOX를 투여한 마우스에 비해 급격한 체중변화를 보이지 않았고, 종양에서 최대 세포 사멸을 보이며 다른 장기에 대한 손상이 가장 적었다.
치료 효능 평가
도 12는 나노입자의 효과를 나타낸 도면이다. 구체적으로 도 12의 a는 나노입자의 세포 내 흡수 및 산화질소 전달 거동을 알아보기 위해 공초점 레이저 현미경(confocal microscopy)을 통해서 HT29세포를 나타낸 것으로, 이 때 세포 내 산화질소 함량을 나타내기 위해 DAF-FM를 사용하였다. 초록색으로 산화질소는 초록색, 독소루비신은 빨간색, 세포핵은 파란색으로 보여진다. 도 12의 a를 보면 DOX-NO-NPs의 경우 약물(빨간색)이 의미 없이 분산되는 것이 아니라 종양 세포에 효율적으로 흡수되는 것으로 보이며, 산화질소(초록색)가 방출되는 것을 확인 할 수 있다. 따라서 산화질소 및 약물을 세포 내로 전달하는 것을 알 수 있다. 반대로, DOX-대조군 및 free-DOX로 처리된 세포에서는 산화질소가 거의 나타나지 않았다. 도 12의 b를 보면, 독소루비신 및 산화질소에 대한 전달체로서의 DOX-NO-NPs의 효과를 평가하기 위해 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라 졸륨 브로마이드 분석(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay)에 의해 세포 독성을 나타내었다. 확인을 위해 HT29 인간 결장암 세포(human colon carcinoma cells)를 독소루비신이 담지된 나노입자로 처리하였다. 세포를 PEG-b-Dex 및 대조군 나노입자로 처리한 경우는 500 μg/ml 농도에서도 독성이 나타나지 않았으나, 독소루비신이 담지된 DOX-NO-NPs, DOX-대조군 및 free-DOX의 경우는 독성이 나타났고, 이로인해 종양 세포 내부에서 항종양 효과를 나타낼 수 있다는 것이 확인되었다.
상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 참조하여 설명하였지만, 해당 기술 분야의 숙련된 당업자는 하기의 특허 청구 범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.

Claims (15)

  1. 덱스트란(Dextran) 및 폴리에틸렌글리콜(Polyethylene glycol)을 포함하는 블록공중합체;
    상기 블록공중합체의 하이드록시기에 유기질산염(organic nitrates)을 포함하는,
    나노입자.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    상기 블록공중합체는 소수성을 나타내는 덱스트란 및 친수성을 나타내는 폴리에틸렌글리콜을 포함하는 양친성 고분자인 것을 특징으로 하는,
    나노입자.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 나노입자는 미셀구조(micelle)를 형성할 수 있는 것을 특징으로 하는,
    나노입자.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 나노입자는 글루타티온(glutathione)과 반응하여 상기 유기질산염으로부터 산화질소(nitrogen oxide)를 방출하는 것을 특징으로 하는,
    나노입자.
  6. 덱스트란(Dextran) 및 폴리에틸렌글리콜(Polyethylene glycol)을 용매에 녹여 고분자용액을 형성하는 제1 단계;
    상기 고분자용액에 환원제를 첨가하여 블록공중합체(block copolymer)를 형성하는 제 2단계; 및
    질산염 혼합용액을 상기 블록공중합체에 적가(dropwise)하여 첨가하는 제 3단계;를 포함하는,
    나노입자 제조방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 폴리에틸렌글리콜은 아민기(NH2, amino group)를 포함하는 것을 특징으로 하는,
    나노입자 제조방법.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 용매는 DMSO(dimethyl sulfoxide)인 것을 특징으로 하는,
    나노입자 제조방법.
  9. 제6항에 있어서,
    상기 환원제는 NaCNBH3(sodium cyanoborohydride)인 것을 특징으로 하는,
    나노입자 제조방법.
  10. 제6항에 있어서,
    상기 질산염 혼합용액은 아세트산(acetic acid), 무수 아세트산(acetic anhydride) 및 질산(nitric acid)을 포함하는 것을 특징으로 하는,
    나노입자 제조방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 질산염 혼합용액은 아세트산 1 몰을 기준으로, 무수아세트산 0.5 몰 내지 2 몰 및 질산 1 몰 내지 3 몰을 포함하는 것을 특징으로 하는,
    나노입자 제조방법.
  12. 덱스트란(Dextran) 및 폴리에틸렌글리콜(Polyethylene glycol)을 포함하는 블록공중합체(block copolymer);
    상기 블록공중합체의 하이드록시기에 유기질산염(organic nitrates)을 포함하는 나노입자;
    상기 나노입자에 약물이 봉입된,
    약물전달체.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 나노입자는 소수성을 나타내는 덱스트란 및 친수성을 나타내는 폴리에틸렌글리콜을 포함하는 양친성 고분자이며, 상기 양친성 고분자의 소수성 중심부에 약물이 봉입될 수 있는 것을 특징으로 하는,
    약물전달체.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 약물전달체는 글루타티온과 반응하여, 상기 유기질산염으로부터 산화질소를 방출하는 동시에, 상기 소수성 중심부에 봉입된 약물을 방출하는 것을 특징으로 하는,
    약물전달체.
  15. 제12항에 있어서,
    상기 약물은 항암제를 포함하는 것을 특징으로 하는,
    약물전달체.
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KR102056338B1 (ko) 2019-08-09 2019-12-16 주식회사 에브릿 홍삼 진세노사이드와 미생물 마늘발효에서 유래된 글루타치온 성분이 함유된 혈행개선효과를 가지는 건강기능성 조성물

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WO2021029483A1 (ko) * 2019-08-09 2021-02-18 주식회사 에브릿 홍삼 진세노사이드와 미생물 마늘발효에서 유래된 글루타치온 성분이 함유된 혈행개선효과를 가지는 건강기능성 조성물

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