KR101906789B1 - Pharmaceutical composition for treatment or prevention of degenerative brain disease containing peucedanocoumarin iii - Google Patents
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Abstract
Description
본원은 퓨세다노쿠마린 III(Peucedanocoumarin III, PCIII)을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환의 치료 또는 예방용 약학 조성물, 및 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품에 관한 것이다.The present invention relates to a pharmaceutical composition for the treatment or prevention of degenerative brain diseases comprising Peucedanocoumarin III (PCIII) as an active ingredient, and a health functional food for preventing or improving degenerative brain diseases.
평균 수명이 증가하여 고령화 사회로 진입함에 따라, 노화에 따라 발병하는 퇴행성 질환이 커다란 의료 및 사회적 문제로 대두되고 있다. 이러한 퇴행성 질환 중에서도 특히 퇴행성 뇌질환은 노인 질환의 발병 순위 1 위를 차지할 정도로 높은 비중을 차지하고 있다.As the average life expectancy increases to enter an aging society, degenerative diseases that develop with aging are emerging as major medical and social problems. Among these degenerative diseases, especially degenerative brain diseases, occupies the first place in the ranking of diseases of geriatric diseases.
퇴행성 뇌질환에는 대표적으로 파킨슨병 (Parkinson's disease), 알츠하이머병 (Alzheimer's disease), 헌팅턴병 (Huntington's disease) 및 루게릭병으로 잘 알려진 근위축성 측삭경화증 (ALS; Amyotrophic Lateral Sclerosis) 등이 있다. Degenerative brain diseases are typically Parkinson's disease, Alzheimer's disease, Huntington's disease, and amyotrophic lateral sclerosis (ALS), well known as Lou Gehrig's disease.
이러한 퇴행성 뇌질환의 치료에서 가장 중요한 부분은 독성 단백질 집적체의 제어를 통한 세포 사멸 조절 연구인데, 여러 연구 결과에서 보이듯이 단백질 중합체 자체의 형성을 억제하거나 이미 생성된 중합체의 제거를 촉진함으로써 단백질 중합체가 교란하는 생체 내 신호전달 체계를 정상화하고 신경퇴화를 제어할 수 있다. 이러한 측면에서 인 비트로 상에서 재조합 아밀로이드 질병 단백질을 만들어 여러 활성 화합물과의 상호 작용 연구를 수행하거나, 질병 단백질 과발현 동물 모델을 활용한 독성 기전 연구 및 산발적인 치료제 확인 연구가 진행되어 왔다.The most important part in the treatment of such degenerative brain diseases is the control of apoptosis through the control of toxic protein aggregates. As shown in various studies, the inhibition of the formation of the protein polymer itself or the removal of the already- Can normalize the disturbed in vivo signaling system and control neurodegeneration. In this respect, studies have been conducted to study the interaction with various active compounds by making recombinant amyloid disease proteins on in vitro , or to investigate toxic mechanisms and sporadic therapeutic agents using animal models of disease protein overexpression.
기존에는 집적체 형성 억제제 개발을 위해, 주로 알츠하이머 병변으로 나타나는 집적체 단백질인 아밀로이드 베타 (Aβ42)를 이용한 인 비트로 실험 및, 세포 및 동물 모델 실험을 이용하였다. 대표적인 Aβ42 집적체 형성 억제 화합물로는 콩고 레드(Congo red), 크리사민 G(Chrysamine G), 커큐민(Curcumin) 및 EPPS 외 여러 저분자 화합물(small compounds)들이 보고되었지만, 파킨슨 질환의 α-시뉴클레인이나 헌팅턴 질환의 헌팅턴 단백질 집적체에 대한 저해제는 개발이 제한되어 있다. 특히 한방 천연물을 기반으로 하는 치료 및 예방 측면에서 약물화할 수 있는 천연물에 대한 연구는 전무한 상황이다.Previously , in vitro studies using amyloid beta (A? 42), an aggregate protein mainly expressed by Alzheimer's disease, and cell and animal model experiments were used for development of an aggregation formation inhibitor. Congo red, Chrysamine G, Curcumin and various small compounds other than EPPS have been reported as typical A? 42 aggregation formation inhibiting compounds, but α-synuclein of Parkinson's disease Inhibitors for Huntington's protein aggregates of Huntington's disease have limited development. In particular, there are no studies on natural products that can be pharmacologically treated in terms of treatment and prevention based on oriental natural products.
특히, α-시뉴클레인이나 헌팅틴(huntingtin)의 경우 세포 밖에서 집적체를 만드는 Aβ42와 달리 세포 내의 세포질 혹은 핵 내에서 올리고머 및 집적체를 형성하기 때문에, 효과적인 치료제 개발을 위해서는 인 비트로가 아닌 집적체 세포 모델 구축을 통한 신규 치료 선도 물질 발굴이 필요한 실정이다.In particular, α- sinyu Klein and huntingtin (huntingtin) of the case unlike the Aβ42 create a house outside the cell congestion due to form oligomers and home backlog in the cytoplasm or the nucleus in the cell, home, not in vitro for effective drug development backlog It is necessary to find new therapeutic substances through cell model construction.
본원에서는 파킨슨 질환 등에서 발견되는 α-시뉴클레인 집적체 뿐만 아니라 전형적인 아밀로이드 단백질 집적체를 제어할 수 있는 한방 천연물 단일 물질인 퓨세다노쿠마린 III을 확보함으로써 뇌병변 진행을 막고 신경세포 사멸을 억제하는 치료 용도로써 제안하고자 하였으며, 세포질 또는 핵 내 아밀로이드 집적체 형성으로 인한 신경 세포 독성을 제어할 수 있는 신규 치료 선도 천연 물질로서의 용도를 제공하고자 하였다. 또한, 이를 활용하여, 퇴행성 뇌질환의 주요 병리인 세포 내 집적체를 분해함으로써 점진적으로 나타나는 신경세포 기능 이상 및 독성을 억제 및 조절하는데 응용하고자 하였다.In this study, we have obtained fusadannocoumarin III, a single substance of natural herbal medicine, which can control not only α-synuclein aggregates found in Parkinson's disease but also typical amyloid protein aggregates, thereby preventing brain lesion progression and inhibiting neuronal cell death And to provide a new therapeutic use as a natural substance which can control the cytotoxicity of nerve cells due to formation of cytoplasmic or nuclear amyloid aggregates. In addition, the present invention is applied to inhibit and regulate progressive neuronal dysfunction and toxicity by decomposing intracellular aggregates, which are major pathologies of degenerative brain diseases.
그러나, 본원이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.However, the problems to be solved by the present invention are not limited to the above-mentioned problems, and other matters not mentioned can be clearly understood by those skilled in the art from the following description.
본원의 제 1 측면은, 퓨세다노쿠마린(Peucedanocoumarin) III을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환의 치료 또는 예방용 약학 조성물을 제공할 수 있다.The first aspect of the present invention can provide a pharmaceutical composition for treating or preventing degenerative brain diseases comprising Peucedanocoumarin III as an active ingredient.
본원의 제 2 측면은, 퓨세다노쿠마린 III을 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공할 수 있다.The second aspect of the present invention can provide a health functional food for preventing or ameliorating a degenerative brain disease comprising fusadanocoumarin III.
상술한 과제 해결 수단은 단지 예시적인 것으로서, 본 발명을 제한하려는 의도로 해석되지 않아야 한다. 상술한 예시적인 구현예 외에도, 도면 및 발명의 상세한 설명에 기재된 추가적인 구현예 및 실시예가 존재할 수 있다.The above-described task solution is merely exemplary and should not be construed as limiting the present invention. In addition to the exemplary implementations described above, there may be additional implementations and embodiments described in the drawings and detailed description of the invention.
본원에서는, 주요 퇴행성 뇌질환인 파킨슨 질환과 헌팅턴 질환, 나아가 집적체를 병태로 하는 관련 퇴행성 질환에 응용 가능한, α-시뉴클레인 및 헌팅틴 단백질 등의 핵내 집적체 형성에 의한 독성을 억제할 수 있는 치료 선도 물질인 퓨세다노쿠마린 III을 제공하고자 한다. 퓨세다노쿠마린 III은 파킨슨 질환의 α-시뉴클레인 집적체 뿐만 아니라 전형적인 아밀로이드 단백질 집적체 역시 제어하는 효과를 나타내므로, 다양한 퇴행성 뇌질환에서 뇌병변 진행을 막고 신경세포 사멸을 억제하는 용도 등으로 사용될 수 있다.The present invention relates to a method for inhibiting the toxicity due to the formation of intracellular aggregates such as α-synuclein and Huntingtin protein, which is applicable to Parkinson's disease, Huntington's disease, and related degenerative diseases, And to provide fucedanocoumarin III as a therapeutic agent. Fusadanocoumarin III has an effect of controlling not only α-synuclein aggregation of Parkinson's disease but also typical amyloid protein aggregates. Therefore, it can be used to prevent progression of brain lesion and inhibit neuronal cell death in various degenerative brain diseases .
도 1a 및 1b는 Tet-off β23의 핵내 발현을 위한 유전자 구조 및 전략을 나타내는 개략도이고, 도 1c 내지 1e는 핵내 β23 발현을 확인한 실험 결과이다.
도 2a는 집적체 β23의 발현에 따른 세포 독성 실험 결과이고, 도 2b 및 2c는 β23 저해 천연물질 스크리닝을 위한 전략을 나타내는 개략도이며, 도 2d 및 2e는 스크리닝 결과를 나타낸다.
도 3a 내지 3f는 퓨세다노쿠마린 III에 의한 β23 분해 촉진 효과를 실험한 결과이다.
도 4a 내지 4f는 퓨세다노쿠마린 III에 의한 α-시뉴클레인 집적체 독성 억제 실험 결과이다.
도 5a 내지 5d는 퓨세다노쿠마린 III에 의한 α-시뉴클레인 집적체의 분해 효과를 실험한 결과이다.FIGS. 1A and 1B are schematic diagrams showing the gene structure and strategy for nuclear expression of Tet-off β23, and FIGS. 1C to 1E are experimental results confirming intranuclear β23 expression.
FIG. 2 (a) is a cytotoxicity test result according to the expression of aggregate? 23, FIGS. 2 (b) and 2 (c) are schematic diagrams showing strategies for screening for? 23 inhibiting natural substances, and FIGS.
FIGS. 3A to 3F show the results of experiments on the stimulation of β23 decomposition by fusadanocoumarin III.
Figs. 4A to 4F show results of inhibition of α-synuclein aggregation toxicity by fusadanocoumarin III.
5a to 5d show the results of experiments on the decomposition effect of an aggregate of alpha-synuclein by fusadanocoumarin III.
아래에서는 첨부한 도면을 참조하여 본원이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본원의 실시예를 상세히 설명한다. 그러나 본원은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다. 그리고 도면에서 본원을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였다.Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail with reference to the accompanying drawings so that those skilled in the art can easily carry out the present invention. It should be understood, however, that the present invention may be embodied in many different forms and should not be construed as limited to the embodiments set forth herein. In order to clearly explain the present invention in the drawings, portions not related to the description are omitted.
본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다. Throughout this specification, when an element is referred to as "including " an element, it is understood that the element may include other elements as well, without departing from the other elements unless specifically stated otherwise.
본원 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 "약", "실질적으로" 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본원의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다. 본원 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 "~(하는) 단계" 또는 "~의 단계"는 "~ 를 위한 단계"를 의미하지 않는다. The terms "about "," substantially ", etc. used to the extent that they are used throughout the specification are intended to be taken to mean the approximation of the manufacturing and material tolerances inherent in the stated sense, Accurate or absolute numbers are used to help prevent unauthorized exploitation by unauthorized intruders of the referenced disclosure. The word " step (or step) "or" step "used to the extent that it is used throughout the specification does not mean" step for.
본원 명세서 전체에서, 마쿠시 형식의 표현에 포함된 "이들의 조합"의 용어는 마쿠시 형식의 표현에 기재된 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 혼합 또는 조합을 의미하는 것으로서, 상기 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 의미한다.Throughout this specification, the term "combination thereof" included in the expression of the machine form means one or more combinations or combinations selected from the group consisting of the constituents described in the expression of the machine form, And the like.
본원 명세서 전체에서, "A 및/또는 B" 의 기재는, "A, B, 또는, A 및 B" 를 의미한다. Throughout this specification, the description of "A and / or B" means "A, B, or A and B".
본원 명세서 전체에서, "퇴행성 뇌질환(degenerative brain disease)"이란 중추신경계의 신경세포에 퇴행성 변화가 나타나면서 발생하는 모든 뇌질환을 포함하는 광의의 개념을 의미한다. 퇴행성 뇌질환은 대부분 발병 원인이 알려져 있지 않지만, 연관 신경계를 선택적으로 침범하며, 질병의 발병이 천천히 시작해서 지속적인 진행을 보이는 것이 특징이다. 바람직하게는 알츠하이머병, 경도인지장애, 뇌졸중 및 혈관성 치매, 전두측두엽 치매, 루이소체 치매, 크로이츠펠트-야콥병, 외상성 두부 손상, 매독, 후천성 면역 결핍 증후군 및 기타 바이러스 감염, 뇌농양, 뇌종양, 다발성경화증, 대사성 질환에 의한 치매, 저산소증, 파킨슨병, 루게릭병, 헌팅턴병, 픽병, 근위축성 측삭 경화증, 간질, 허혈, 중풍, 주의력결핍-과잉행동장애, 정신분열증, 우울증, 조울증, 외상 후 스트레스 장애, 척수손상, 척수염 등을 포함할 수 있다.Throughout the present specification, the term "degenerative brain disease" refers to a broad concept including all brain diseases that occur as degenerative changes occur in nerve cells of the central nervous system. Most of the degenerative brain diseases are unknown, but they are characterized by the selective involvement of the associated nervous system and the onset of the onset of the disease slowly. The present invention relates to the use of a compound according to the invention in the manufacture of a medicament for the treatment of Alzheimer's disease, mild cognitive impairment, stroke and vascular dementia, frontotemporal dementia, rheisome dementia, Creutzfeldt-Jakob disease, traumatic head injury, syphilis, acquired immunodeficiency syndrome and other viral infections, Alzheimer's disease, ischemic stroke, stroke, attention deficit hyperactivity disorder, schizophrenia, depression, bipolar disorder, post-traumatic stress disorder, spinal cord injury, dementia caused by metabolic diseases, hypoxia, Parkinson's disease, Lou Gehrig's disease, Huntington's disease, , Myelitis, and the like.
이하, 본원의 퓨세다노쿠마린(Peucedanocoumarin) III을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환의 치료 또는 예방용 약학 조성물, 및 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품에 대하여 구현예 및 실시예와 도면을 참조하여 구체적으로 설명하도록 한다. 그러나, 본원이 이러한 구현예 및 실시예와 도면에 제한되는 것은 아니다. Hereinafter, a pharmaceutical composition for treating or preventing degenerative brain diseases comprising Peucadenocoumarin III of the present application as an active ingredient, and a health functional food for preventing or ameliorating degenerative brain diseases are described. Will be specifically described with reference to FIG. However, the present invention is not limited to these embodiments and examples and drawings.
본원의 제 1 측면은, 퓨세다노쿠마린(Peucedanocoumarin) III을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환의 치료 또는 예방용 약학 조성물을 제공할 수 있다.The first aspect of the present invention can provide a pharmaceutical composition for treating or preventing degenerative brain diseases comprising Peucedanocoumarin III as an active ingredient.
기존의 인 비트로 인큐베이션을 통한 아밀로이드 형성 억제 화합물의 검출 방법은 고속 스크리닝(high throughput screening)에 적합하지 않을 뿐만 아니라, 실제로 세포 독성 억제 효과가 있는지 그리고 나아가 안전한지에 대한 정보를 쉽게 확보하기 어려웠다. 또한 α-시뉴클레인, 헌팅틴 및 TDP-43와 같은 질병 아밀로이드 단백질의 경우 세포의 핵 내에 형성되어 세포의 전사 기능 등을 교란할 수 있는데, 이와 같은 세포 분획 특이적인 집적체의 독성 조절 화합물을 발굴하기 위해서는 세포 수준의 모델이 필요하였다. 이에 본원에서는 효과적인 핵 내 집적체 저해제 발굴을 위해 독시사이클린으로 단백질 집적체 발현 조절이 가능한 Tet-off β23 구조체를 이용하여 모든 아밀로이드 질병 단백질의 β-시트 구조를 대변할 수 있는 β23 시퀀스를 클로닝하여 구축하였다. 이를 통해 발굴된, 전호 추출물에 포함된 퓨세다노쿠마린 III은 다양한 종류의 아밀로이드 독성 단백질 관련 질환들, 예를 들어 이에 제한되지는 않으나, 파킨슨병, 알츠하이머병, 헌팅턴병 및 근위축성 측삭 경화증 등에 적용할 수 있다. It has been difficult to easily obtain information on whether the conventional method of detecting amyloid formation-inhibiting compounds via incubation is not suitable for high throughput screening, whether the compound has actually cytotoxic inhibitory effect and is safe. In the case of amyloid protein such as α-synuclein, Huntingtin and TDP-43, the amyloid protein can be formed in the nucleus of the cell to disturb the transcriptional function of the cell. Such a cell fraction- To do this, a cell-level model was required. Here, we constructed a β23 sequence capable of expressing the β-sheet structure of all amyloid disease proteins using a Tet-off β23 construct capable of controlling the expression of protein aggregates with doxycycline in order to find an effective nuclear accumulator inhibitor . Fusadanocoumarin III, which is found in the herbal extracts, has been used to treat various kinds of amyloid toxic protein related diseases such as, but not limited to, Parkinson's disease, Alzheimer's disease, Huntington's disease and amyotrophic lateral sclerosis .
전호 추출물은 기존에 거의 연구된 바가 없으며, 특히 파킨슨 질환 및 퇴행성 뇌질환들에 대한 아밀로이드 억제 효과 관련해서는 전혀 알려진 바가 없었다. 퓨세다노쿠마린 III은 또한 SH-SY5Y 세포에 고농도 처리시 특징적인 세포 독성이 관찰되지 않았다. 본원의 실시예에 따르면 상기 퓨세다노쿠마린 III은 α-시뉴클레인의 아밀로이드 형성을 억제할 뿐 아니라, 이미 형성된 아밀로이드 또한 분해시키는 효과를 보였으므로, 루이체 단백질 집적체가 이미 축적된 65 세 이상의 파킨슨 임상 증상을 보이는 환자 등에서도 치료 효과를 기대할 수 있다. 즉, 현재 파킨슨 질환의 임상 증상이 나타나기 이전에 이를 효과적으로 진단하는 방법이 없기 때문에, 본원의 퓨세다노쿠마린 III와 같이 이미 형성된 아밀로이드를 제거함으로써 파킨슨 질환 환자의 질병 진행 및 악화를 막고 도파민 신경세포 기능을 되돌릴 수 있는 약물이 임상적으로 높은 가치가 있다. 또한, 퓨세다노쿠마린 III의 집적체 억제능이 α-시뉴클레인에 제한되지 않으므로 (β23의 경우 인위적인 β-시트 스트랜드를 함유하게 만든 단백질로서 Aβ, 헌팅틴 및 TDP-43 외 다양한 뇌질환 단백질의 독성을 띠는 단백질 변성을 대변하는 것임), 퓨세다노쿠마린 III는 파킨슨 질환을 포함한 다양한 퇴행성 뇌질환 병변에 적용 가능하며, 실제 질병에 적용 가능한 안전하고 효과적인 화합물로서 사용될 수 있다.There have been few studies on the extracts of Chunhoe, and there is no known effect of amyloid inhibition on Parkinson's disease and degenerative brain diseases. Fusadanocoumarin III also showed no characteristic cytotoxicity upon treatment with SH-SY5Y cells at high concentrations. According to the embodiment of the present invention, the fusadanocoumarin III not only inhibits the amyloid formation of a-synuclein but also decomposes already formed amyloid. Therefore, And the like can be expected. In other words, since there is no effective way to diagnose Parkinson's disease before its manifestation, it is possible to prevent disease progression and deterioration in patients with Parkinson's disease by removing already formed amyloid like fusadanocoumarin III, Is a clinically valuable drug. In addition, since the ability to inhibit the aggregation of fusadanocoumarin III is not limited to a-synuclein (β23 is a protein that contains an artificial β-sheet strand, toxicity of Aβ, Huntingtin and TDP- Fusadanocoumarin III is applicable to a variety of degenerative brain lesions including Parkinson's disease and can be used as a safe and effective compound applicable to actual diseases.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 퇴행성 뇌질환의 치료 또는 예방용 약학 조성물은 아밀로이드 형성 억제 또는 아밀로이드 분해 효과를 가지는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.According to one embodiment of the present invention, the pharmaceutical composition for treating or preventing the degenerative brain disease may be, but not limited to, inhibiting or inhibiting amyloid formation.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 아밀로이드가 α-시뉴클레인 아밀로이드, 헌팅틴 및 TDP-43로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.According to one embodiment of the invention, the amyloid may be selected from alpha-synuclein amyloid, Huntingtin and TDP-43, but is not limited thereto.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 퇴행성 뇌질환의 치료 또는 예방용 약학 조성물은 신경세포 사멸을 억제하는 효과를 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.According to one embodiment of the present invention, the pharmaceutical composition for treating or preventing the degenerative brain disease may have an effect of inhibiting neuronal cell death, but the present invention is not limited thereto.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 퇴행성 뇌질환이 알츠하이머병, 경도인지장애, 뇌졸중, 치매, 크로이츠펠트-야콥병, 외상성 두부 손상, 매독, 후천성 면역 결핍증후군, 뇌농양, 뇌종양, 다발성경화증, 저산소증, 파킨슨병, 루게릭병, 헌팅턴병, 픽병, 근위축성 측삭 경화증, 간질, 허혈, 중풍, 주의력결핍-과잉행동장애, 정신분열증, 우울증, 조울증, 외상 후 스트레스 장애, 척수손상 및 척수염으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.According to one embodiment, the degenerative brain disorder is selected from the group consisting of Alzheimer's disease, mild cognitive impairment, stroke, dementia, Creutzfeldt-Jakob disease, traumatic head injury, syphilis, acquired immunodeficiency syndrome, brain abscess, brain tumor, multiple sclerosis, hypoxia, Wherein the disorder is selected from the group consisting of: a disorder selected from the group consisting of Alzheimer's disease, Huntington's disease, Pick's disease, amyotrophic lateral sclerosis, epilepsy, ischemia, stroke, attention deficit hyperactivity disorder, schizophrenia, depression, manic depression, But may not be limited thereto.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 퓨세다노쿠마린 III은 전호(Peucedani Radix) 추출물로부터 분리된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 전호로부터 퓨세다노쿠마린 III을 추출하는 방법은 본원발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 천연물 추출 방법 및 천연물 유래 화합물 추출 방법 등을 제한 없이 사용하여 수행될 수 있다.According to one embodiment of the present invention, the fusadanocoumarin III may be isolated from, but not limited to, the Peucedan Radix extract. The method of extracting fusadanocoumarin III from the prior art can be carried out without limitation using a natural substance extraction method and a natural substance-derived compound extraction method which are commonly used in the technical field to which the present invention belongs.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 퇴행성 뇌질환의 치료 또는 예방용 약학 조성물은 정제, 산제, 경질 또는 연질 캅셀제, 현탁제, 주사용 제제, 유화액, 분말 또는 과립으로 제형화된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.According to one embodiment of the present invention, the pharmaceutical composition for treating or preventing the degenerative brain disease may be formulated into tablets, powders, hard or soft capsules, suspensions, injectable preparations, emulsions, powders or granules, But may not be limited.
본원의 약학 조성물은 그 사용 목적에 맞게 통상의 방법에 따라 정제, 산제, 경질 또는 연질 캅셀제, 현탁제, 주사용 제제, 유화액, 분말 또는 과립 등 다양한 형태로 제형화하여 사용할 수 있으며, 경구 투여하거나 정맥내, 복강내, 피하, 직장, 국소 투여 등을 포함한 다양한 경로를 통해 투여될 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention may be formulated into various forms such as tablets, powders, hard or soft capsules, suspensions, injectable preparations, emulsions, powders or granules according to a conventional method, Intravenous, intraperitoneal, subcutaneous, rectal, topical, and the like.
본원의 약학 조성물이 고형 제제인 경우, 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면 전분, 탄산칼슘, 수크로스, 락토즈, 젤라틴 등을 혼합하여 제형화될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.When the pharmaceutical composition of the present invention is a solid preparation, the composition may be formulated by mixing at least one or more excipients such as starch, calcium carbonate, sucrose, lactose, gelatin, etc., but may not be limited thereto.
약학 조성물의 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 예시될 수 있으며, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.Examples of the liquid preparation for oral administration of the pharmaceutical composition include suspensions, solutions, emulsions, syrups, and the like. In addition to water and liquid paraffin which are commonly used simple diluents, various excipients such as wetting agents, sweeteners, , Preservatives, and the like, but the present invention is not limited thereto.
약학 조성물의 비경구 투여를 위한 제제로는 멸균된 수용액제, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있으며, 주사제에는 용해제, 등장화제, 현탁화제, 유화제, 안정화제, 방부제 등과 같은 종래의 첨가제가 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.Agents for parenteral administration of the pharmaceutical composition may include, but are not limited to, sterilized aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, freeze-dried preparations and suppositories. Examples of the suspending agent include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable esters such as ethyl oleate, etc. Injectables may contain solubilizers, isotonic agents, suspending agents, emulsifiers, stabilizers, But are not limited to, conventional additives such as solvents, preservatives, and the like.
본원의 약학 조성물은 사용된 화합물의 활성, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 정식, 투여시간, 투여 경로, 배출률, 약물 배합 및 예방 또는 치료될 질환의 경중을 포함한 여러 요인에 따라 다양하게 변할 수 있고, 상기 약학 조성물의 투여량은 환자의 상태, 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만 통상의 기술자 의해 적절하게 선택될 수 있고, 예를 들어 1일 0.0001 내지 50 mg/kg 또는 0.001 내지 50 mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. The pharmaceutical compositions herein may vary widely, depending on various factors including the activity of the compound employed, age, weight, general health, sex, diet, time of administration, route of administration, rate of excretion, drug combination and the severity of the disease to be prevented or treated. The dosage of the pharmaceutical composition varies depending on the condition of the patient, the body weight, the severity of the disease, the drug form, the route of administration, and the period of time, but may be appropriately selected by a person skilled in the art, for example, 0.0001 to 50 mg / kg or 0.001 to 50 mg / kg. The administration may be carried out once a day or divided into several doses. The dose is not intended to limit the scope of the invention in any way.
본원의 제 2 측면은, 퓨세다노쿠마린 III을 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공할 수 있다.The second aspect of the present invention can provide a health functional food for preventing or ameliorating a degenerative brain disease comprising fusadanocoumarin III.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품은 캡슐, 정제, 분말, 과립, 액상, 환, 편상, 페이스트상, 시럽, 겔, 또는 바 형태일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.According to one embodiment of the present invention, the health functional food for preventing or ameliorating the degenerative brain disease may be in the form of a capsule, tablet, powder, granule, liquid, ring, flake, paste, syrup, gel, But may not be limited.
상기 건강기능식품 중의 천연물 추출물의 양은 섭취의 목적, 섭취자의 연령, 건강상태, 성별 및 체중 등을 고려하여 통상의 기술자가 적절하게 선택할 수 있다.The amount of the natural product extract in the health functional food can be appropriately selected by a person skilled in the art in consideration of the purpose of consumption, the age, health condition, sex, body weight and the like of the consumer.
상기 건강기능식품은 상기 천연물 추출물 외에도 다양한 성분을 제한 없이 더 포함할 수 있으며, 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 예를 들어, 천연 탄수화물로서 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당 알콜을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제 및 합성 향미제를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.The health functional food may further contain various components in addition to the natural product extract, and may contain a flavoring agent or a natural carbohydrate as an additional ingredient. For example, natural carbohydrates include monosaccharides such as glucose, fructose, and the like; Disaccharides such as maltose, sucrose and the like; And polysaccharides such as, for example, conventional sugars such as dextrin, cyclodextrin and the like, and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol, erythritol, and the like. Other flavors other than those mentioned above may include, but are not limited to, natural flavors and synthetic flavors.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 퓨세다노쿠마린 III은 전호(Peucedani Radix) 추출물로부터 분리된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.According to one embodiment of the present invention, the fusadanocoumarin III may be isolated from, but not limited to, the Peucedan Radix extract.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 하나, 하기의 실시예는 단지 설명의 목적을 위한 것이며 본원의 범위를 한정하고자 하는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to the following examples. However, the following examples are for illustrative purposes only and are not intended to limit the scope of the present invention.
[실시예][Example]
실험 방법Experimental Method
세포 배양 및 형질주입Cell culture and transfection
A. 세포 계대(Cell subculture)A. Cell subculture
1. 배양중인 세포(Human neuroblastoma SH-SY5Y)의 배지를 제거하였다 (배지 조건: 10% FBS 및 1% P/S를 포함하는 DMEM).1. Medium for human neuroblastoma SH-SY5Y was removed (medium conditions: DMEM containing 10% FBS and 1% P / S).
2. PBS로 세척하였다.2. Wash with PBS.
3. 트립신 2 ml을 넣은 후 37℃ CO2 인큐베이터에서 1~2 분간 반응시켰다.3. Add 2 ml of trypsin and incubate for 1 to 2 minutes at 37 ° C in a CO 2 incubator.
4. 2 ml 배지를 첨가하여 트립신을 불활성화한 후 피펫을 사용하여 세포를 부유시켰다.4. Add 2 ml medium to inactivate trypsin and float the cells using a pipette.
5. 배지 10 ml을 새로운 디쉬에 넣고, 부유시킨 세포액 중 1 ml을 첨가하여 배양시켰다.5. Add 10 ml of the medium to a new dish, add 1 ml of the suspended cell solution, and incubate.
B. 형질주입(Transfection)B. Transfection
1. Opti-MEM 200 ㎕에 DNA 2 ㎍을 첨가하였다 (6-웰 규모 기준).1. 2 μg of DNA was added to 200 μl of Opti-MEM (on a 6-well scale).
2. 2 ㎕ 형질주입 시약 (X-tremeGENE HP)을 추가한 후 가볍게 탭핑(tapping)하였다.2. Add 2 μl of trait injection reagent (X-tremeGENE HP) and tap lightly.
3. 상온에서 약 15 분 정도 반응시켰다.3. Reaction was carried out at room temperature for about 15 minutes.
4. 세포 배지에 DNA-X-treme 유전자 혼합액을 골고루 뿌려주었다.4. The DNA-X-treme gene mixture was evenly distributed in the cell culture medium.
β23 안정 세포주 (HEK-293T) 생성Production of β23 stable cell line (HEK-293T)
1. pCMV-tTA 및 TetP-NLS-FLAG-β23-HA를 HEK-293T에 형질주입하였다.1. pCMV-tTA and TetP-NLS-FLAG-p23-HA were transfected into HEK-293T.
2. 독시사이클린 (200 ng/ml)으로 β23의 발현을 조절하였다 (expression turn off/on) (Tet off 시스템 구축) : Dox(+) -> β23 발현 억제; Dox(-) -> β23 과발현.2. Expression of β23 was regulated by using doxycycline (200 ng / ml) (Tet off system construction): Dox (+) -> β23 expression inhibition; Dox (-) -> β23 overexpression.
알라마Al Ramah 블루blue (( AlamarAlamar blue) 분석 및 고속 스크리닝 (high throughput screening) blue analysis and high throughput screening.
1. 96-웰 플레이트에 β23 안정 세포를 분주하였다.1. β23 stable cells were dispensed into 96-well plates.
2. Dox (w/o, 48 시간 발현 유도)와 화합물을 처리하였다 (각각 1 μM).2. Treatment with Dox (w / o, induction of 48 h expression) and compound (1 μM each).
3. 물에 레자주린(Resazurin) (1 mg/ml)을 첨가하여 알라마 블루 용액을 준비하였다.3. Reagazurin (1 mg / ml) was added to the water to prepare an Allama Blue solution.
4. 알라마 블루 용액을 0.22 μM 기공 필터로 필터링하였다.4. The alamar blue solution was filtered with a 0.22 μM pore filter.
5. 10 μl 씩 웰에 첨가하였다 (96-웰 플레이트 배지 부피: 100 μl).5. Add 10 μl per well (96-well plate medium volume: 100 μl).
6. 4 시간 가량 반응시켰다 (2 시간씩 배지 색깔 변화를 체크함: 핑크 -> 바이올렛)6. Reaction was carried out for about 4 hours (checked for changes in medium color for 2 hours: pink -> violet)
7. 형광 분석하였다 (530 nm 여기, 590 nm 방출)7. Fluorescence analysis (530 nm excitation, 590 nm emission)
8. 대조군으로 정규화하였다.8. Normalized as a control group.
인 비트로In bito 응집 (aggregation) 및 티오플라빈 T 분석 Aggregation and Thioflavin T Analysis
A. 재조합 α-시뉴클레인 또는 선조체 피브릴(Preformed fibril, PFF)A. Recombinant alpha-synuclein or preformed fibril (PFF)
1. 100 μl 인큐베이션 버퍼: 100 mM 아세트산나트륨 pH 7.5에 최종 100 μM 농도의 단백질 (α-시뉴클레인 또는 PFF)과 특정 농도의 화합물을 첨가하여 E-튜브에 준비하였다.1. 100 [mu] l Incubation buffer: Prepared in an E-tube by adding a final concentration of 100 [mu] M protein (alpha-synuclein or PFF) and a certain concentration of compound to 100 mM sodium acetate pH 7.5.
2. 37℃, 250 rpm 조건으로 0~7일 동안 하루 간격으로 샘플링하였다.2. Sampling was performed at 37 ° C and 250 rpm for 0 to 7 days at intervals of one day.
3. 인큐베이션이 완료된 단백질들은 -70℃에서 보관하였다.3. Incubated proteins were stored at -70 ° C.
B. 티오플라빈 T 분석B. Thioflavin T assay
1. 최종 10 μM 티오플라빈 T 용액과 50 μM 인큐베이션된 α-시뉴클레인 또는 PFF를 첨가하였다.1. Final 10 μM thiopurin T solution and 50 μM incubated α-synuclein or PFF were added.
2. 96-웰 플레이트에 각각 샘플을 넣고 15 분 동안 37℃에서 인큐베이션하였다.2. Each sample was placed in a 96-well plate and incubated at 37 ° C for 15 minutes.
3. 여기: 450 nm 및 방출 : 490 nm 조건에서 형광 리더기(SYNERGY neo microplate reader, BioTek.) 를 이용하여 분석하였다.3. Analysis was performed using a fluorescence reader (SYNERGY neo microplate reader, BioTek.) At 450 nm and emission: 490 nm.
α-시뉴클레인 피브릴의 분해 분석Degradation analysis of α-synuclein fibril
1. 6-웰 규모에 SH-SY5Y 세포를 플레이팅하였다.1. SH-SY5Y cells were plated on 6-well scale.
2. 배양 세포에 a-시뉴클레인 PFF을 처리하였다 (200 nM).2. Cultured cells were treated with a-synuclein PFF (200 nM).
3. 0h, 12h 및 24h 별로 세포를 수득하고, 단백질을 샘플링하였다.3. Cells were obtained at 0 h, 12 h and 24 h, and proteins were sampled.
웨스턴 블롯 분석Western blot analysis
1. 용해 버퍼: 150 mM NaCl, 50 mM Tris pH 8.0, 1% NP40, 1% SDS, 0.5% 디옥시콜산 나트륨 + 프로테아제 저해제1. Dissolution buffer: 150 mM NaCl, 50 mM Tris pH 8.0, 1% NP40, 1% SDS, 0.5% sodium deoxycholate + protease inhibitor
2. 세포 배양 배지를 제거하고 PBS로 세척하였다.2. Cell culture medium was removed and washed with PBS.
3. 용해 버퍼를 첨가하여 세포를 수득하였다.3. Dissolution buffer was added to obtain cells.
4. 얼음에서 30 분간 인큐베이션하였다.4. Incubate on ice for 30 min.
5. 22,250 g, 4℃에서 20 분간 원심분리하였다.5. 22,250 g, centrifuged at 4 ° C for 20 minutes.
6. 확보된 단백질 BCA 키트를 이용하여 정량하였다.6. Quantified protein BCA kit.
7. 20 ㎍의 단백질을 이용하여 SDS-PAGE 전기영동을 수행하였다.7. SDS-PAGE electrophoresis was performed using 20 μg of the protein.
8. SDS-PAGE로 러닝(Running)된 겔에서 NC (nitrocellulose) 멤브레인으로 트랜스퍼하였다.8. Transferred from NC (nitrocellulose) membranes to gels run on SDS-PAGE.
9. 5% 탈지유 (TBST: Tris-buffer solution-tween20) (10 mM Tris-HCl [pH 7.6], 150 mM NaCl, 및 0.05% Tween-20) 기반으로 1 시간 가량 멤브레인을 블로킹하였다.9. The membrane was blocked for about 1 hour based on 5% skim milk (TBST: Tris-buffer solution-tween 20) (10 mM Tris-HCl pH 7.6, 150 mM NaCl, and 0.05% Tween-20).
10. NC 멤브레인을 TBST로 가볍게 세척 후 1 차 항체를 넣고 4℃ 오버나잇으로 락킹(Rocking)하였다.10. The NC membrane was washed gently with TBST, and the primary antibody was added and rocked at 4 ° C overnight.
11. 상온에서 TBST로 10 분씩 3 번 세척하였다.11. Washed three times for 10 minutes at room temperature with TBST.
12. TBST 내의 5% 탈지유로 2 차 항체 (HRP-conjugated)를 넣고 90 분 정도 상온에서 부착시켰다.12. Secondary antibody (HRP-conjugated) was added with 5% skim milk in TBST and allowed to attach at room temperature for about 90 minutes.
13. 상온에서 TBST로 10 분간 3 번 세척하였다.13. It was washed 3 times with TBST at room temperature for 10 minutes.
14. ECL (Chemiluminescence solution)에 반응시킨 후 면역블롯 발광 신호(Immunoblot luminescence signal)을 암실에서 필름으로 현상하였다.14. After reacting with ECL (chemiluminescence solution), the immunoblot luminescence signal was developed in the dark room.
세포주로부터 세포 분획화(Subcellular fractionation)Cellular fractionation from cell lines (Subcellular fractionation)
1. 분리 버퍼를 만들었다 (얼음 내): 1 M 만니톨 (최종 0.3 M), 10% BSA (최종 0.1%), 0.5 M EDTA (최종 0.2 mM), 1 M HEPES (최종 10 mM), 100X PI (최종 1X)1. Separation buffer (in ice): 1 M mannitol (final 0.3 M), 10% BSA (final 0.1%), 0.5 M EDTA (final 0.2 mM), 1 M HEPES Final 1X)
2. 세포 배지를 제거하였다.2. The cell culture medium was removed.
3. PBS를 이용하여 1~2 회 세척하였다.3. Washed 1-2 times with PBS.
4. 분리 버퍼 1 mL (세포 < 1.0*10^7)를 넣고 스크래퍼로 긁어 회수하였다 (얼음 위에서)4. Add 1 mL of isolation buffer (cells <1.0 * 10 ^ 7) and scrape with scraper (on ice)
5. 1.5 mL 튜브로 옮겼다.5. Transfer to a 1.5 mL tube.
6. 주사기 (2.5 G)를 이용해 5~10 회 부유시켰다.6. Floated 5-10 times with a syringe (2.5 G).
7. 얼음에 10 분간 두었다 (간간이 볼텍스함)7. Place on ice for 10 minutes (occasional vortex)
8. 볼텍스 후, 300x g , 4℃에서 2~3 분간 원심분리하였다 (전세포 잔해 제거)8. After vortexing, centrifugation was carried out at 300 x g , 4 ° C for 2 to 3 minutes (removal of whole cell debris)
9. 상층액을 새로운 튜브로 옮겼다.9. Transfer the supernatant to a new tube.
10. 1100 x g, 4℃에서 10 분간 원심분리하였다.10. Centrifuged at 1100 x g, 4 ° C for 10 minutes.
11. 상층액을 따서 새로운 튜브로 옮겼다.11. Transfer the supernatant to a new tube.
12. 펠렛은 2x SB 50 ㎕을 넣고 부유시켰다 (--> 핵 분획).12. The pellet was suspended in 50 μl of 2x SB (-> nuclear fraction).
13. 상층액 10 ㎕ + 5x SB 40 ㎕ 와 혼합하였다 (--> 후핵/세포질 분획).13.
14. 95~100℃에서 5 분간 끓였다.14. Boiled for 5 minutes at 95 ~ 100 ℃.
15. -80℃에서 보관하였다.15. Store at -80 ° C.
형광 이미징Fluorescence Imaging
1. 폴리-D-리신을 커버슬립이 있는 웰에 1 ml씩 넣어 약 1 시간 동안 반응시켰다 (6-웰 기준).1. Poly-D-lysine was added to wells with cover slips in 1 ml increments (6-wells) for about 1 hour.
2. 1 시간 가량 코팅이 완료되면 용액을 제거하고 PBS로 3 회 세척하였다.2. After the coating was completed for about 1 hour, the solution was removed and washed three times with PBS.
3. SH-SY5Y 세포를 플레이팅하였다.3. SH-SY5Y cells were plated.
4. 형질주입하였다.4. Transfection.
5. 4% 파라포름알데히드로 10~15 분간 고정하였다.5. Fixed with 4% paraformaldehyde for 10-15 minutes.
6. PBS로 5 분씩 2 회 세척하였다.6. Washing with PBS twice for 5 min.
7. PBS 내 0.1% 트리톤-X100를 넣고 10 분간 투과화하였다.7. 0.1% Triton-X100 in PBS was added and permeabilized for 10 minutes.
8. PBS로 5 분씩 3 회 세척하였다.8.
9. 5% 염소 혈청으로 (0.1% 트리톤-X100 기반) 1 시간 동안 블로킹하였다.9. Blocked with 5% goat serum (0.1% Triton-X100) for 1 hour.
10. 1 차 항체 (PBS 내)를 넣고 4℃에서 밤새 락킹하였다.10. Primary antibody (in PBS) was added and locked overnight at 4 ° C.
11. PBS로 5 분씩 3 회 세척하였다.11. Wash with
12. 2 차 항체 (PBS 내)를 넣어주고 상온에서 1 시간 부착시켰다.12. Add secondary antibody (in PBS) and incubate for 1 hour at room temperature.
13. PBS로 5 분씩 3 회 세척하였다.13. Wash three times with PBS for 5 min.
14. DAPI로 핵을 염색하였다.14. Nuclei were stained with DAPI.
15. 슬라이드에 마운팅하였다.15. Mounted on the slide.
세포 생존성 분석Cell viability analysis
1. 세포 배양 배지를 제거하였다.1. Cell culture medium was removed.
2. PBS를 넣어서 세포를 부유시켜 E-튜브로 옮겼다.2. The cells were suspended in PBS and transferred to an E-tube.
3. 0.4% 트리판 블루와 세포 부유액을 1:1로 혼합하고 상온에서 2 분간 반응시켰다.3. 0.4% Trypan blue and cell suspension were mixed 1: 1 and allowed to react at room temperature for 2 minutes.
4. 반응물 10 ㎕를 세포 계수 슬라이드에 넣고 Countess II 자동 세포 계수기를 이용하여 세포 생존성을 확인하였다.4. 10 μl of the reaction was added to the cell count slides and the cell viability was checked using a Countess II automated cell counter.
실험 결과Experiment result
Tet-off β23의 핵내 발현Intranuclear Expression of Tet-off β23
핵내 집적체 형성은 헌팅턴 질환의 헌팅턴 단백질 및 파킨슨 질환의 α-시뉴클레인 집적체 등에서 나타난다. 즉각적인 핵내 집적체 병리를 실험적으로 이용하기 위해서 β-시트 집적체 구조를 발현하는 유전자 (β23)를 클로닝하였으며, 핵전이 신호와 웨스턴에서의 검출을 위해 FLAG과 HA 태그를 첨가하였다 (도 1a). 도 1a는 집적체 단백질 β23의 구조 및 아미노산 서열 정보이다. β23 아미노산 서열은 β-시트 구조를 자발적으로 형성함으로써 집적체를 형성한다. N-말단에 핵전이 시퀀스 (nuclear localization sequence, NLS) 및 FLAG 태킹과 C-말단에 HA 태킹을 갖도록 디자인하였다. Nuclear aggregation is seen in Huntington's disease of Huntington's disease and in alpha-synuclein aggregates of Parkinson's disease. In order to experimentally utilize the immediate nuclear accumulation pathway, a gene expressing a β-sheet aggregation structure (β23) was cloned, and FLAG and HA tags were added for nuclear transduction signals and Western detection (FIG. 1a). Fig. 1A shows the structure and amino acid sequence information of the aggregation protein? 23. The? 23 amino acid sequence forms an aggregate by spontaneously forming a? -sheet structure. Nuclear localization sequence (NLS) at the N-terminus and HA tagging at the FLAG and C-terminus were designed.
β23의 발현이 독성을 유발하여 세포를 유지하는데 어려움이 있을 것으로 예상되었기 때문에, 독성 유전자 발현을 독시사이클린으로 조절 가능한 Tet-off 시스템을 활용하였다. pCMV-tTA와 TetP-NLS-FLAG-β23-HA (TetP-β23)를 세포에 동시에 형질주입하게 되면 β23와 형광 리포터인 mCherry가 동시에 발현된다. Tet-off 시스템에서는 이러한 유전자들의 발현이 독시사이클린의 처리에 의해서 소멸된다 (도 1b). 도 1b는 독시사이클린으로 발현 조절이 가능한 Tet-off β23 발현 시스템 도식도를 나타낸 것이다. 테트라사이클린 조절 프로모터 (Tet 프로모터)에 의해 발현 조절되는 형광 리포터 mCherry와 집적체 형성 단백질인 β23를 암호화하는 TetP-β23 플라스미드와 pCMV-tTA 플라스미드를 함께 형질주입시에 mCherry와 β23의 발현이 함께 유도된다. 독시사이클린 처리시 tTA의 불활성화를 통해 트랜스진(transgene)인 mCherry 및 β23의 발현이 정지된다. Since β23 expression was expected to cause toxicity and difficulties in maintaining the cells, a Tet-off system was used to regulate toxic gene expression with doxycycline. When pCMV-tTA and TetP-NLS-FLAG-β23-HA (TetP-β23) are co-transfected into cells, β23 and mCherry, a fluorescent reporter, are expressed simultaneously. In the Tet-off system, expression of these genes is abolished by treatment with doxycycline (Fig. 1B). FIG. 1B shows a schematic diagram of a Tet-off β23 expression system capable of regulating expression to doxycycline. Expression of mCherry and β23 was induced together with the TetP-β23 plasmid encoding the fluorescent reporter mCherry, which is regulated by the tetracycline-regulated promoter (Tet promoter) and β23, which is an aggregation-forming protein, and the pCMV-tTA plasmid . The inactivation of tTA in the treatment of doxycycline results in the arrest of the transgene mCherry and β23.
HEK-293T 세포에 Tet-off 시스템으로 pCMV-tTA 및 TetP-β23 형질주입시 독시사이클린으로 조절 가능한 β23 발현을 성공적으로 유도할 수 있었으며, 발현시킨 β23는 집적체 형성에 의해 불용성 분획에서만 검출되었다 (도 1c 및 1d). 도 1csms HEK-293T 세포에 pCMV-tTA 및 TetP-NLS-FLAG-β23-HA (TetP-β23)을 형질주입 후 2 일 뒤에 총 용출물(total lysates)에 대해서 β23의 발현을 표지된 태깅에 대한 항체 (항-HA 및 항-FLAG)를 이용하여 웨스턴 블랏 분석한 결과이다. β-액틴은 내부 로딩 대조군(internal loading control)으로 사용되었다. 도 1d는 HEK-293T 세포에 pCMV-tTA 및 TetP-β23를 형질주입 후 독시사이클린 (200 ng/ml) 을 처리하거나 비히클을 처리한 후 2 일 뒤에 1% 트리톤 X 가용성/불용성 분획으로 분리한 후 항-FLAG 항체를 이용해 웨스턴 블랏 분석한 결과이다.HEK-293T cells were able to successfully induce β23 expression, which was regulated by the dacystycin, in the Tet-off system when pCMV-tTA and TetP-β23 were injected. Expressed β23 was detected only in the insoluble fraction by aggregation 1c and 1d). Expression of [beta] 23 for total lysates was measured 2 days after the injection of pCMV-tTA and TetP-NLS-FLAG-beta23-HA (TetP-beta 23) into ccs HEK-293T cells Western blot analysis using antibodies (anti-HA and anti-FLAG). β-Actin was used as an internal loading control. FIG. 1D shows the results of the isolation of 1% Triton X soluble / insoluble fraction after 2 days of treatment with vehicle (200 ng / ml) or vehicle treatment after transfection of pCMV-tTA and TetP-β23 into HEK- -FLAG < / RTI > antibody.
면역 염색 실험 결과 집적체 β23는 첨가한 핵전이 시그널 (NLS)에 의해서 의도한대로 DAPI로 염색되는 핵에만 발현되는 것을 확인할 수 있었다 (도 1e). 도 1e는 HEK-293T 세포에 pCMV-tTA 및 TetP-β23을 형질주입 후 β23 집적체의 핵내 발현을 항-HA 항체를 이용한 면역 형광 염색 이미징으로 확인한 결과이다. 핵은 DAPI 염색으로 표지하였다.As a result of the immunohistochemical staining, it was confirmed that the aggregate β23 was expressed only in nuclei stained with DAPI as intended by the nuclear transfer signal (NLS) added (FIG. FIG. 1E shows the results of immunohistochemical staining of β23 aggregates after transfection with pCMV-tTA and TetP-β23 in HEK-293T cells using an anti-HA antibody. Nuclei were labeled with DAPI staining.
β23 독성 저해 천연물 스크리닝β23 Toxicity-inhibiting natural material screening
집적체 β23 발현에 의해 나타나는 세포 독성을 알라마 블루 형광 분석법으로 정량한 결과, HEK-293T 세포에 β23를 48 시간 동안 발현 유도시 50%에 이르는 세포독성이 나타났다 (도 2a). 도 2a는 β23 의 발현 (2 일)에 의한 HEK-293T 세포의 생존성을 알라마 블루(alamar blue) 형광 에세이를 통해 분석한 결과이다 (n = 4). The cytotoxicity induced by aggregation [beta] 23 expression was quantitated by Alama blue fluorescence analysis. As a result, HEK-293T cells showed 50% cytotoxicity when inducing? 23 expression for 48 hours (Fig. FIG. 2A shows the viability of HEK-293T cells by β23 expression (day 2) analysis using an alamar blue fluorescence assay ( n = 4).
확연하고 유의성 있는 세포 독성 발현을 이용하여 β23를 저해할 수 있는 천연물질 스크리닝을 디자인하였다 (도 2b 및 2c). 도 2b는 β23 독성 저해 천연물질 스크리닝의 모식도를 나타낸 것이다. HEK-293T 세포에 pCMV-tTA 와 TetP-β23를 공-형질주입시킨 후 β23의 발현에 의해 나타나는 세포 독성을 640 여개의 천연물질 (각각 1 μM)을 처리하여 변화 양상을 알라마 블루 세포 생존성 분석을 통해 검사하는 과정을 나타낸 것이다. 도 2c는 β23 독성 저해 물질 스크리닝의 데일리 스케쥴을 요약한 개략도이다.Natural substance screening that could inhibit < RTI ID = 0.0 > s23 < / RTI > was designed using distinct and significant cytotoxic expression (Figures 2b and 2c). Fig. 2b is a schematic diagram of screening for? 23 toxicity-inhibiting natural materials. After co-transfection of pCMV-tTA and TetP-β23 into HEK-293T cells, the cytotoxicity of β23-expressing cells was treated with 640 natural substances (1 μM each) It is the process of inspection through analysis. FIG. 2C is a schematic diagram summarizing the daily schedule of screening for the? 23 toxic inhibitor. FIG.
이 시스템을 사용하여 640 종의 천연물질 처리시 β23에 의해 유발되는 세포 독성이 완화되는 화합물들을 알라마 블루 형광으로 동정하였다 (도 2d). 1 차 스크리닝을 통해 β23 독성을 억제하는 것으로 나타나는 여러 화합물들을 검색할 수 있었다 (도 2d). 도 2d는 HEK-293T 세포에 β23 발현으로 나타나는 독성에 대한 각 화합물 처리의 보호 효과를 분석한 결과로서, 알라마 블루를 이용한 플레이트 형광 분석 값을 산출 후 DMSO 처리군에서 나타나는 형광값에 대한 상대 값으로 표현한 것이다.Using this system, compounds that mitigate cytotoxicity induced by? 23 in the treatment of 640 natural substances were identified as Alama blue fluorescence (Fig. 2d). Primary screening was able to detect several compounds that appeared to inhibit beta 23 toxicity (Fig. 2d). Figure 2d shows the expression of HEK-293T cells As a result of analyzing the protective effect of each compound treatment on the toxicity represented by? 23 expression, plate fluorescence analysis value using alamar blue was expressed as relative value with respect to the fluorescence value appearing in the DMSO treatment group after the calculation.
이 중에서 가장 큰 세포 보호 효과를 보이는 5 종의 천연물에 대해서 반복실험을 수행하여 효과를 검증하였다 (도 2e). 5 종의 화합물 (Peucedanocoumarin III, Kaempferol, Oregonin, Ophiocarpine, 그리고 Lupenone)은 모두 유의미한 β23 독성 저해 효과를 나타냈으며 이중 퓨세다노쿠마린 III(Peucedanocoumarin III, PCIII)의 경우 세포의 생존능력을 음성 대조군 수준으로 회복시켰다 (도 2e). 도 2e는 1차 스크리닝에서 β23 독성에 대한 세포 보호 효과를 보인 5 종의 화합물에 대해서 알라마 블루 형광 분석 반복 시행하고, Dox (－)/DMSO 군의 형광 값을 기준으로 상대적인 각 그룹의 알라마 블루 형광값을 표시한 결과이다 (n = 6).Among these, 5 kinds of natural products showing the largest cytoprotective effect were repeatedly tested to verify the effect (FIG. 2E). All five compounds (Peucedanocoumarin III, Kaempferol, Oregonin, Ophiocarpine, and Lupenone) showed significant inhibitory effects on the β23 toxin. In the case of Peucedanocoumarin III (PCIII) (Fig. 2E). FIG. 2 (e) is a graph showing the cytoprotective effect of β23 toxicity in the first screening. The results are shown in FIG. 2 (a) and FIG. 2 Blue fluorescence values ( n = 6).
PCIII에 의한 β23 분해 촉진 효과Promotion of β23 decomposition by PCIII
이들 β23 저해제들의 독성 저해 효과가 HEK-293T 세포에서 검증되었기 때문에, 신경퇴행성 질환에 보다 광범위하게 사용되는 SH-SY5Y 신경모세포종 세포주에도 유사한 효과가 보이는지 여부를 확인하기 위해 가장 큰 효과를 보인 PCIII를 이용해 추가 연구를 진행하였다. SH-SY5Y 세포에서도 마찬가지로 Tet-off 시스템으로 mCherry 와 핵 내의 β23 발현을 면역 형광 염색으로 확인할 수 있었으며, β23의 발현은 80% 정도의 세포 사멸을 유도하는 것을 트리판 블루 제외 분석을 통해 확인하였다 (도 3a 및 3b). 도 3a는 SH-SY5Y 신경모세포종(neuroblastoma) 세포주에 pCMV-tTA 및 TetP-β23 플라스미드를 형질주입 후 β23 의 발현을 항-FLAG 항체를 이용한 면역 형광 이미징으로 확인한 결과이다. 리포터 형광 단백질인 mCherry의 발현 또한 적색 형광으로 확인하였으며, DAPI 염색으로 핵을 표지하였다. 반면 PCIII를 처리한 SH-SY5Y 세포의 경우 β23의 발현에도 불구하고 40% 정도의 세포 독성 수준으로 보호효과를 보였다 (도 3b). 도 3b는 SH-SY5Y 세포 핵내 β23 발현 (48 시간)에 의해 나타나는 세포 독성에 대한 PCIII (1 M)의 세포 보호 효과를 트리판 블루 제외 에세이를 통해 확인한 결과이다 (n = 6). Since the inhibitory effects of these β23 inhibitors have been verified in HEK-293T cells, using PCIII, which has the greatest effect to confirm similar effects in the SH-SY5Y neuroblastoma cell line used more extensively in neurodegenerative diseases Further research was conducted. Similarly, in SH-SY5Y cells, expression of β23 in mCherry and nuclei could be confirmed by immunofluorescent staining with Tet-off system, and β23 expression was induced by 80% 3a and 3b). FIG. 3A shows the results of immunofluorescence imaging of β23 expression after transfection of pCMV-tTA and TetP-β23 plasmids into SH-SY5Y neuroblastoma cell line using an anti-FLAG antibody. The expression of mCherry, a reporter fluorescent protein, was also confirmed by red fluorescence and the nuclei were labeled with DAPI stain. On the other hand, SH-SY5Y cells treated with PCIII exhibited a cytotoxic level of about 40% despite the expression of β23 (FIG. 3B). Figure 3b shows the results of SH-SY5Y cells The cytoprotective effect of PCIII (1 M) on cytotoxicity induced by intranuclear β23 expression (48 hours) was assessed through the exclusion of triplan blue ( n = 6).
PCIII에 의한 세포 보호 효과의 기전 연구를 위해 집적체 β23의 분해능에 대한 실험을 진행하였다. Tet-off 시스템으로 mCherry 와 β23를 24 시간 발현 유도 후에 독시사이클린을 처리하여 추가적인 β23의 발현을 억제하면, 시간이 지남에 따른 β23의 분해 양상을 표지 태깅에 대한 특이 항체를 사용하여 효과적으로 추적할 수 있다. 면역 염색 실험 결과, 독시사이클린 처리 후 37 시간 후에도 DMSO를 처리한 대조군에서는 강한 β23의 발현이 핵에서 검출되는 반면, PCIII (1 μM)를 처리한 SH-SY5Y 세포의 경우에는 β23가 80% 이상 분해되어 검출이 잘 되지 않는 것을 확인하였다 (도 3c 및 3d). 도 3c는 β23 핵 집적체의 PCIII에 의한 분해능을 확인하기 위한 실험 디자인이다. pCMV-tTA 와 TetP-β23를 SH-SY5Y 세포에 형질주입하여 β23 및 mCherry의 발현을 24 시간 동안 유도하였다. 24 시간 동안 발현 유도 후 독시사이클린 (200 ng/ml)을 처리하여 추가적인 β23의 발현을 막고 각 시간 흐름에 따른 β23의 분해를 웨스턴 블랏 (WB) 및 면역 형광 이미징 (IF)를 통해 모니터링하였다. 아래의 형광 이미징은 독시사이클린 처리 후 37 시간 후에 DMSO 또는 PCIII (1 μM)을 처리한 SH-SY5Y 세포에 대해서 항-FLAG 항체를 이용하여 잔여 β23를 녹색 형광으로 표지하였다. 리포터 형광 단백질 mCherry 및 핵 표지 마커인 DAPI는 각각 적색 및 청색 형광으로 시각화하였다. 도 3d는 도 c의 샘플 그룹에 대해서 mCherry로 염색되는 각 세포에서의 FLAG 형광 세기를 정량 후 DMSO에 대한 상대값으로 계산한 결과이다 (2 슬라이드로부터 n = DMSO 23 세포, PCIII 28 세포). In order to investigate the mechanism of cell protection effect by PCIII, an experiment on the resolution of aggregate β23 was carried out. When the Tet-off system is used to treat mCherry and β23 after inducing 24-hour expression of doxycycline to inhibit the expression of additional β23, the degradation pattern of β23 over time can be effectively tracked using a specific antibody to the labeling tag . In immunohistochemical staining experiments, strong β23 expression was detected in the nucleus in the DMSO-treated
추가 웨스턴 블롯 실험을 통한 β23의 분해 양상 확인에서도 DMSO 처리군의 경우 β23가 상당히 안정한 상태로 37 시간 동안 거의 분해되지 않는 반면, PCIII 처리시 60% 이상의 β23가 제거된 것을 확인하였다 (도 3e 및 3f). 도 3e는 도 3c의 실험 스케줄로 SH-SY5Y 세포에 β23을 발현 후 DMSO 또는 PCIII를 처리하고 37 시간 후에 β23의 양적인 변화를 항-FLAG 항체를 이용한 웨스턴 블랏으로 확인한 결과이다. 도 3f는 도 3c의 항-FLAG 밴드 강도 정량 및 β-액틴 밴드 강도로 보정후 대조군에 대한 상대값으로 계산하여 막대 그래프로 표현한 것이다 (n = 3).In the confirmation of the degradation pattern of β23 through the additional Western blot experiment, β23 in the DMSO-treated group was found to be almost stable in 37 hours, whereas β23 in 60% or more was eliminated in PCIII treatment (FIGS. 3E and 3F ). FIG. 3E shows the results of Western blot analysis using anti-FLAG antibody after quantitative analysis of β23 expression in SH-SY5Y cells after DMSO or PCIII treatment and 37 hours after the expression of FIG. 3C. Fig. 3F is a histogram ( n = 3) calculated as a relative value for the control group after correction with the anti-FLAG band intensity quantification and beta -actin band intensity in Fig. 3C.
이상의 결과는 PCIII가 핵 내 집적체인 β23의 분해를 촉진시킴으로써 β23에 의해 나타나는 세포 사멸을 억제했다는 것을 보여주는 것이다.These results demonstrate that PCIII inhibited apoptosis induced by β23 by promoting the degradation of β23, an intracellular accumulation.
PCIII 에 의한 α-시뉴클레인 집적체 독성 억제Inhibition of α-synuclein aggregation toxicity by PCIII
인위적인 집적체 단백질인 β23의 분해 및 독성 억제 효과가 검증된 PCIII가 파킨슨 질환의 아밀로이드 형성 질병 단백질 α-시뉴클레인에 대해서도 비슷한 효과를 보이는지를 확인하기 위해, 세포 분획 및 웨스턴 블랏을 통해 실험을 수행하였다. HA-α-시뉴클레인을 SH-SY5Y 세포에 형질주입 후 6-히드록시도파민 (6-OHDA) 산화 스트레스를 가하면, α-시뉴클레인의 핵 및 세포질에서의 1% 트리톤 X 에 용해되지 않는 불용성 분획으로의 분포가 증가하였다. 반면 PCIII를 처리할 경우에는 6-OHDA에 의한 α-시뉴클레인의 핵 내 그리고 세포질에서의 불용성 분획으로의 분포가 감소하였다 (도 4a 및 4b). 도 4a는 HA-α-시뉴클레인을 과발현시킨 SH-SY5Y 세포에 6-OHDA (70 μM, 16 시간)을 처리한 후 DMSO 또는 PCIII를 처리하고, 32 시간 후 세포질과 핵으로 분리 및 1% 트리톤 X 가용성/불용성 분획에서의 α-시뉴클레인 분포를 항-α-시뉴클레인 항체를 이용한 웨스턴 블랏으로 확인한 결과이다. PARP1과 GAPDH는 핵과 세포질에 대한 분획 마커인 동시에 내부 로딩 대조군으로 사용되었다. 도 4b는 도 4a의 각 그룹에서의 α-시뉴클레인의 가용성 분획 대비 불용성 분획으로의 상대적인 분포를 웨스턴 상의 α-시뉴클레인 밴드 강도를 정량함으로써 계산한 것이다 (n = 3).Experiments were carried out through cell fractionation and Western blotting in order to confirm whether PCIII, which has been proved to be effective in the degradation and toxicity inhibition of β23, an artificial aggregation protein, has similar effects on the amyloid-forming disease protein α-synuclein of Parkinson's disease . When 6-hydroxydopamine (6-OHDA) oxidative stress was applied after transfection of HA-α-synuclein into SH-SY5Y cells, insoluble fractions not soluble in 1% Triton X in the nucleus and cytoplasm of α- The distribution of On the other hand, when PCIII was treated, the distribution of the α-synuclein into the insoluble fraction in the nucleus and cytoplasm by 6-OHDA decreased (FIGS. 4A and 4B). FIG. 4A shows that SH-SY5Y cells overexpressing HA-α-synuclein were treated with 6-OHDA (70 μM, 16 hours) and then treated with DMSO or PCIII. After 32 hours, The X-synuclein distribution in the X soluble / insoluble fractions was determined by Western blotting using an anti-alpha-synuclein antibody. PARP1 and GAPDH were both fraction markers for nuclear and cytoplasm and were used as an internal loading control. Figure 4b shows the relative distribution of the soluble fraction to the insoluble fraction of the alpha-synuclein in each group of Figure 4a, calculated by quantifying the alpha-synuclein band intensity on the western ( n = 3).
결국 PCIII는 핵 내 집적체 뿐 아니라, 세포질에 형성되는 집적체에 대해서도 분해 효과를 보였다. 6-OHDA를 α-시뉴클레인을 발현하는 SH-SY5Y 세포에 처리시 아밀로이드의 형성이 증가된다는 것을 티오플라빈 S 형광염색으로도 확인하였으며, PCIII는 티오플라빈 S에 의해 염색되는 아밀로이드의 형성을 현저히 감소시켰다 (도 4c 및 4d). 도 4c는 HA-α-시뉴클레인을 과발현 (24 시간)하는 SH-SY5Y 세포에 6-OHDA (70 μM, 16 시간) 처리시 나타나는 아밀로이드 형성 및 PCIII (1 μM) 처리에 의한 저해 효과를 티오플라빈 S 형광 염색으로 현미경 이미징한 결과이다. 도 4d는 도 4c의 각 그룹에서의 티오플라빈 S 형광 강도를 정량한 결과이다 (2 슬라이드로부터 n = DMSO 17 세포, PCIII 23 세포).As a result, PCIII showed decomposition effect not only on the nucleus but also on the aggregates formed in the cytoplasm. It was also confirmed by thiophlain S fluorescence staining that the formation of amyloid is increased during treatment of SH-SY5Y cells expressing 6-OHDA with? -Synucleolin. PCIII inhibits the formation of amyloid stained by thiophlain S (Figs. 4C and 4D). Figure 4c shows the inhibitory effect of amyloid formation and PCIII (1 [mu] M) treatment on 6-OHDA (70 [mu] M, 16 hr) treatment of SH-SY5Y cells overexpressing HA- Microscopic imaging with empty S fluorescent staining is the result. Figure 4d is the result of quantifying the thiophlain S fluorescent intensity in each group of Figure 4c ( n = DMSO 17 cells, PCIII 23 cells from 2 slides).
6-OHDA 처리에 의한 아밀로이드의 형성은 60%에 달하는 세포의 사멸로 나타났으며, PCIII는 세포의 생존능을 20% 정도 향상시킴을 트리판 블루 제외 분석을 통해 증명하였다 (도 4e). 도 4e는 HA-α-시뉴클레인을 과발현 (24 시간)하는 SH-SY5Y 세포에 6-OHDA (70 μM, 16 시간) 처리시 나타나는 세포 독성 및 PCIII (1 μM) 처리에 의한 보호 효과를 트리판 블루 제외 에세이를 통해 확인한 결과이다 (n = 6).The formation of amyloid by 6-OHDA treatment resulted in the death of 60% of the cells, and PCIII enhanced cell viability by 20% (Fig. 4e). Figure 4e shows the cytotoxicity and cytoprotective effect of SH-SY5Y cells treated with 6-OHDA (70 [mu] M, 16 h) on HA-alpha-synuclein overexpression (24 hours) This is the result of checking through the blue exclusion ( n = 6).
α-시뉴클레인의 집적체 형성 및 세포 독성에 대한 PCIII의 보호 기전 확인을 위해 재조합 단백질 α-시뉴클레인을 100 mM 아세트산나트륨 용액에 1, 3 및 5 일간 인 비트로에서 반응시키면서 아밀로이드/올리고머 형태로의 변성 추이를 티오플라빈 T 형광 측정을 통해 확인하였다. 기존의 연구와 일치하게, 재조합 단백질 α-시뉴클레인을 용액에서 37℃에 인큐베이션시 티오플라빈 T에 반응하는 아밀로이드의 양이 증가하면서 5 일째에는 최대의 형광이 측정되었다. 10 μM에서 50 μM의 PCIII를 함께 인큐베이션시 α-시뉴클레인의 집적체 형성이 저해된다는 것을 티오플라빈 T 형광의 증가가 완만히 억제되는 것을 통해 확인하였다 (도 4f). 특히 50 μM PCIII를 첨가하였을 경우 5 일째에 약 70% 정도 티오플라빈 T 형광을 억제하였다 (도 4f). 도 4f는 재조합 단백질 α-시뉴클레인 (pH 7.5, 100 mM 나트륨 아세테이트 내 100 μM)을 37℃에서 1, 3 및 5 일 동안 PCIII (0, 10, 50 μM)와 함께 반응시키면서 아밀로이드의 형성을 티오플라빈 T 형광 값으로 측정한 결과이다 (n = 3).In order to confirm the protective mechanism of PCIII against aggregation and cytotoxicity of α-synuclein, the recombinant protein α-synuclein was reacted in 100 mM sodium acetate solution for 1, 3 and 5 days in vitro to form amyloid / oligomer The metamorphic trend was confirmed by thioflavin T fluorescence measurement. Consistent with previous studies, maximum fluorescence was measured on
PCIII에 의한 α-시뉴클레인 집적체의 분해Decomposition of α-synuclein aggregates by PCIII
질환 독성 단백질에 대한 치료효과를 기대하기 위해서는, 집적체의 형성 억제 보다도 이미 병이 진행된 상태에서 나타나는 아밀로이드 집적체를 분해하는 능력이 있어야 한다. PCIII가 이러한 이미 형성된 α-시뉴클레인 집적체 분해능을 가지고 있는지 여부를 검증하기 위해 SH-SY5Y 세포에 α-시뉴클레인 선조체(preformd fibril, PFF)을 처리하여 세포 내로 집적체가 들어가도록 처리하였다. 배양액을 교체한 후 시간이 지남에 따른 세포내로 들어온 α-시뉴클레인 집적체가 소실되어 가는 추이를 웨스턴 블롯으로 확인한 결과, PCIII 처리시에 α-시뉴클레인 올리고머 및 집적체의 양이 빠르게 감소함을 확인하였다 (도 5a 및 5b). 도 5a는 α-시뉴클레인 선조체(200 nM, 24 시간)를 처리하여 업테이크(uptake)가 이루어진 SH-SY5Y 세포에 PCIII (1 μM) 처리에 의해 나타나는 PFF의 분해 양상을 항-α-시뉴클레인 특이 항체를 이용한 웨스턴 블랏으로 확인한 결과이다. 도 5b는 도 5a의 각 그룹에서의 항-α-시뉴클레인 웨스턴 블랏 밴드 강도를 정량 및 β-액틴 밴드 강도로 보정한 결과이다 (n = 3).To anticipate the therapeutic effect of the disease toxic protein, it should have the ability to degrade the amyloid aggregate that is already present in the diseased state rather than inhibiting aggregation formation. In order to verify whether PCIII has these already formed α-synuclein aggregation resolutions, SH-SY5Y cells were treated with an α-synuclein strand (PFF) to allow aggregates to enter the cells. As a result of western blotting, the amount of α-synuclein oligomers and aggregates rapidly decreased during the treatment with PCIII as a result of confirming the disappearance of the α-synuclein aggregates entering the cells over time after the replacement of the culture medium (Figs. 5A and 5B). FIG. 5A shows the degradation pattern of PFF induced by up-regulated SH-SY5Y cells treated with PCIII (1 μM) by treating α-synuclein striatum (200 nM, 24 hours) And Western blotting using a specific antibody. Fig. 5B shows the results obtained by calibrating the anti-alpha-synuclein Western blot band intensities in each group of Fig. 5A with the quantitative and beta -actin band intensities ( n = 3).
이러한 PCIII의 효과가 α-시뉴클레인 집적체에 직접적으로 작용해서 나타나는 것인지 증명하기 위해 재조합 α-시뉴클레인 PFF에 PCIII 100 μM을 혼합하여 인 비트로 인큐베이션하고, 티오플라빈 T 형광을 측정하였으며, 항-α-시뉴클레인 항체를 이용한 웨스턴 블롯을 수행하였다. PFF의 인 비트로 인큐베이션은 집적체의 안정성에 전혀 영향을 주지 않는 반면, PCIII를 함께 반응시킬 경우 아밀로이드 집적체가 분해되어 감소되는 것을 티오플라빈 T 형광의 감소 및 웨스턴 블롯 상의 α-시뉴클레인으로 표지되는 고분자량 올리고머 밴드의 감소로 확인하였다 (도 5c 및 5d). 도 5c는 PFF를 DMSO 혹은 PCIII (100 μM)과 함께 100 mM 나트륨 아세테이트 버퍼 (pH 7.5)에서 인 비트로 인큐베이션을 수행하고, 1, 3 및 7 일 째 반응시킨 샘플에 대해서 티오플라빈 T 형광 에세이를 통해 아밀로이드 분해 정도를 정량한 것이다 (n = 3). 도 5d는 도 5c의 샘플에 대해서 SDS-PAGE 전기 영동 후 항-α-시뉴클레인 특이 항체를 이용한 웨스턴 블랏을 통해 PFF의 분해 정도를 확인한 결과이다. 이 결과들은 PCIII가 이미 형성되어 있는 α-시뉴클레인 아밀로이드 집적체와 직접적으로 반응하여 비-아밀로이드 형태로 전환시킬 수 있는 화합물이라는 것을 제시하는 것이다.To demonstrate that this effect of PCIII appears directly on α-synuclein aggregates, 100 μM of PCIII was mixed with recombinant α-synuclein PFF, incubated in vitro , thiopurin T fluorescence was measured, and anti- western blotting was carried out using an a-synuclein antibody. Incubation with PFF's in vitro does not affect the stability of the aggregate at all, whereas the reaction of PCIII together results in degradation of the amyloid aggregate resulting in a reduction in thiophilin T fluorescence and a decrease in the < RTI ID = 0.0 > And a decrease in the high molecular weight oligomer band (Fig. 5C and 5D). FIG. 5c shows the results of the in vitro incubation of PFF with 100 mM sodium acetate buffer (pH 7.5) with DMSO or PCIII (100 [mu] M) and the thiophurabin T fluorescence assay for the samples reacted on
전술한 본원의 설명은 예시를 위한 것이며, 본원이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본원의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며, 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다. It will be understood by those of ordinary skill in the art that the foregoing description of the embodiments is for illustrative purposes and that those skilled in the art can easily modify the invention without departing from the spirit or essential characteristics thereof. It is therefore to be understood that the above-described embodiments are illustrative in all aspects and not restrictive. For example, each component described as a single entity may be distributed and implemented, and components described as being distributed may also be implemented in a combined form.
본원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.The scope of the present invention is defined by the appended claims rather than the detailed description, and all changes or modifications derived from the meaning and scope of the claims and their equivalents should be interpreted as being included in the scope of the present invention.
Claims (10)
Wherein the composition is selected from the group consisting of Alzheimer's disease, Parkinson's disease and Huntington's disease, which comprises Peucedanocoumarin III (PCIII) as an active ingredient. A pharmaceutical composition for the treatment or prevention of brain diseases.
아밀로이드 형성 억제 또는 아밀로이드 분해 효과를 가지는, 퇴행성 뇌질환의 치료 또는 예방용 약학 조성물.
The method according to claim 1,
A pharmaceutical composition for the treatment or prevention of a degenerative brain disease having amyloid formation inhibition or amyloid degradation effect.
상기 아밀로이드가 α-시뉴클레인, 헌팅틴(huntingtin) 및 아밀로이드 베타(Aβ)로부터 선택되는 것인, 퇴행성 뇌질환의 치료 또는 예방용 약학 조성물.
3. The method of claim 2,
Wherein the amyloid is selected from alpha-synuclein, huntingtin and amyloid beta (A [beta]).
신경세포 사멸을 억제하는, 퇴행성 뇌질환의 치료 또는 예방용 약학 조성물.
The method according to claim 1,
A pharmaceutical composition for the treatment or prevention of degenerative brain diseases, which inhibits neuronal cell death.
상기 퓨세다노쿠마린 III은 전호(Peucedani Radix) 추출물로부터 분리된 것인, 퇴행성 뇌질환의 치료 또는 예방용 약학 조성물.
The method according to claim 1,
Wherein the fusadanocoumarin III is isolated from the Peucedani Radix extract.
정제, 산제, 경질 또는 연질 캅셀제, 현탁제, 주사용 제제, 유화액, 분말 또는 과립으로 제형화된, 퇴행성 뇌질환의 치료 또는 예방용 약학 조성물.
The method according to claim 1,
A pharmaceutical composition for the treatment or prevention of degenerative brain diseases, which is formulated into tablets, powders, hard or soft capsules, suspensions, injectable preparations, emulsions, powders or granules.
Parkinson's disease and Huntington's disease, including fusadano-coumarin-III, which is useful for the prevention or amelioration of degenerative brain diseases caused by the sheet structure of amyloid protein. food.
캡슐, 정제, 분말, 과립, 액상, 환, 편상, 페이스트상, 시럽, 겔, 또는 바 형태인, 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
9. The method of claim 8,
A health functional food for preventing or improving a degenerative brain disease which is in the form of a capsule, tablet, powder, granule, liquid, ring, flake, paste, syrup, gel or bar.
상기 퓨세다노쿠마린 III은 전호 추출물로부터 분리된 것인, 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품.9. The method of claim 8,
Wherein said fusadanocoumarin (III) is separated from the extract of the present invention.
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| KR1020170051223A KR101906789B1 (en) | 2017-04-20 | 2017-04-20 | Pharmaceutical composition for treatment or prevention of degenerative brain disease containing peucedanocoumarin iii |
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|---|---|
| KR (1) | KR101906789B1 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115804768A (en) * | 2023-01-09 | 2023-03-17 | 北京大学 | Application of peucedanum praeruptorum dunn in preparing medicine for treating nerve degenerative disease |
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2017
- 2017-04-20 KR KR1020170051223A patent/KR101906789B1/en active IP Right Grant
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| AMND | Amendment | ||
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