KR101896627B1 - 메밀 알레르겐 Ｆａｇ ｅ ３ 에 대한 항체 및 이를 이용한 메밀 알레르겐 Ｆａｇ ｅ ３ 정량분석방법 - Google Patents

메밀 알레르겐 Ｆａｇ ｅ ３ 에 대한 항체 및 이를 이용한 메밀 알레르겐 Ｆａｇ ｅ ３ 정량분석방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 메밀 Fag e 3 알레르겐의 정량분석방법에 관한 것이다. 본 발명의 분석방법은 재조합 Fag e 3에 대한 단클론항체 (하이브리도마)를 이용하여 알레르겐을 검출 및 정량하는 방법으로서, 메밀 알레르겐의 표준화(standardization) 및 식품에서의 메밀 오염을 모니터링하는데 유용하게 사용될 수 있다. 또한 현재의 식품 알러지 표시 시스템을 보완할 수 있을 것이며, 본 발명의 two-site ELISA 시스템을 이용하여 식품과 환경에서 메밀 알레르겐의 검출뿐 아니라 메밀 추출물의 표준화에 기여할 수 있을 것이다.

Description

메밀 알레르겐 Ｆａｇ ｅ ３ 에 대한 항체 및 이를 이용한 메밀 알레르겐 Ｆａｇ ｅ ３ 정량분석방법{Antibodies to recombinant Ｆａｇ ｅ ３ buckwheat allergen and a method for quantitative detection of Ｆａｇ ｅ ３}
본 발명은 메밀 알레르겐 Fag e 3 에 대한 항체 및 이를 이용한 메밀 알레르겐 Fag e 3 정량분석방법에 관한 것이다.
메밀은 아시아 국가들에서 인기 있는 음식이다. 서구 국가에서도 메밀의 무(無)글루텐 특성 덕분에 메밀 소비가 최근 늘어나고 있다[1]. 하지만 메밀은 피자나 파스타 같은 이탈리아 음식에서 숨겨진 알레르겐 항원으로 밝혀지고 있다[2]. 한국에서는 학생들의 (6세에서 15세) 2.1% (2,054명 중 44명)가 메밀 알러지가 있으며[3], 메밀은 과민증의 주요 원인이 되고 있다(2.9%, 4/138)[4].
식료품에서 알레르겐을 표시하는 것은 중요한 일이며, 대부분의 선진국들은 법적으로 일반 식품 알레르겐을 표시할 것을 요구하고 있다. 하지만, 국제식품규격위원회(Codex Alimentarius Commission)의 권고안에도 불구하고 관련법은 나라마다 다르다[5]. 메밀은 한국에서는 식품 알러지의 주요 원인 중 하나이며, 한국 식약청은 식품에서 메밀성분의 표시를 의무화하도록 했다(공식 발표 2015-7-7). 그러나 표시로는 특정 알레르겐의 내용에 대한 자세한 정보를 알 수 없으며, 식료품에서 이들 알러지를 일으키는 분자들의 농축 정도를 아는 것이 도움이 될 것이다.
다양한 9-, 16-. 19-, 24-kDa 단백질 알레르겐은 메밀의 주된 알레르겐이다[6]. 비실린(vicilin)과 상동인(homologous) 19-kDa의 알레르겐은 무증상 피실험자들보다는 알러지 환자들에서 더 특이적으로 인지된다. 재조합 19-kDa 알레르겐에 대한 특이적 IgE 측정은 통메밀 추출물에 대한 측정보다 더 나은 진단적 가치를 가진다[7]. 상기 19-kDa 알레르겐은 면역학회 국제연합의 알레르겐 명명 하위 위원회의 가이드라인에 따라, Fag e 3으로 지정되었다.
본 발명자들은 이러한 재조합 Fag e3에 대한 단일클론성항체(mAbs)를 생성하여, Fag e3 알레르겐 농도를 정량화하는 방법을 개발하였다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허 문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 신규한 메밀 알레르겐 검출 시스템을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 그룹 3 메밀 알레르겐인 Fag e 3 의 정량을 위한 two-site ELISA 시스템을 개발하였다. 재조합 Fag e 3에 대한 단일클론항체를 제작하였고 이를 이용하여 메밀 알레르겐인 Fag e 3 를 검출한계 0.8 μg/mL까지 정량분석할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은 메밀 Fag e 3 알레르겐의 정량분석방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 메밀 Fag e 3 알레르겐의 정량분석키트를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 하이브리도마 세포주(기탁번호: KCLRF-BP-00359) 및 하이브리도마 세포주(기탁번호: KCLRF-BP-00360)를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 메밀 Fag e 3 알레르겐의 정량분석방법을 제공한다: (a) 시료 내 Fag e 3 알레르겐을 해리(dissociation)시키는 단계; (b) 상기 단계 (a)의 시료와 Fag e 3에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 접촉시키는 단계; 및 (c) 상기 단계 (b)의 시료로부터 Fag e 3 를 정량분석하는 단계.
본 발명자들은 신규한 메밀 알레르겐 검출 시스템을 개발하고자 예의 연구 노력한 결과, 그룹 3 메밀 알레르겐인 Fag e 3 의 정량을 위한 two-site ELISA 시스템을 개발하였다. 재조합 Fag e 3에 대한 단일클론항체를 제작하였고 이를 이용하여 메밀 알레르겐인 Fag e 3 를 검출한계 0.8 μg/mL까지 정량분석할 수 있음을 확인하였다.
메밀(Buckwheat)은 과민항원항체반응인 아나필락시스(anaphylaxis)의 주요 원인이며, Fag e 3은 메밀에서 주요한 알레르겐이다. 그러나 Fag e 3 의 정량을 위한 면역분석시스템은 아직 개발된 바 없다. 이에, 본 발명자들은 재조합 Fag e 3에 대한 단일클론항체를 이용하는 two-site ELISA를 개발하였고, 이를 전체 메밀 추출물에서 Fag e 3을 정량하는데 적용하였다. 본 발명자들은 4개 클론의 단클론항체를 제작하였으며, 이들은 메밀 뿐만 아니라 땅콩과 호두에서도 비실린(vicilin) 알레르겐을 인지하였다. 이러한 항체를 이용한 ELISA는 1% SDS 첨가하고 가열하여 알레르겐이 해리된 후 전체 추출물에서 Fag e 3를 정량하는 것이 가능하였다. 전체 메밀 추출물의 약 12%가 Fag e 3 였다. 본 발명에서 개발된 two-site ELISA의 검출한계는 0.8 μg/mL 였다.
본 발명의 방법을 각각의 단계 별로 상세하게 설명하면 다음과 같다:
단계 (a) : 알레르겐 해리(dissociation)
우선, 시료 내 Fag e 3 알레르겐을 해리(dissociation)시킨다. 본 발명의 정량분석방법에 적용되는 시료로서는 생체시료나 환경시료, 식품으로부터의 추출물 등이 있다.
본 발명에서 용어 “해리(dissociation)”는 시료 내 Fag e 3 알레르겐이 항체에 의해 인지될 수 있는 적절한 구조 또는 상태가 되도록 시료에 물리적 또는 화학적 처리를 하는 것을 의미한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 해리는 열 불활성화(heat treatment) 처리를 의미하고, 상기 시료에 계면활성제를 첨가한 후 가열하여 실시할 수 있다. 첨가 가능한 계면활성제는 공지된 다양한 재료를 이용할 수 있으며, 예컨대 Triton X, Nonidet P40, 또는 SDS 등을 이용할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 상기 단계 (a)는 시료에 계면활성제를 처리한 후 95-110℃에서 5-10분간 가열함으로써 실시하거나, 100℃에서 5분간 가열함으로써 실시할 수 있다.
한편, 상기 단계 (a)의 시료는 환원 또는 비환원 조건 하에서 추출된 것을 이용할 수 있으나, 보다 적절한 시료는 비환원 조건 하에서 추출된 시료이다.
본 발명에서 용어 “비환원 조건”이란, 환원제를 첨가하지 않은 상태를 의미한다. 예컨대, 2-머캅토에탄올 등을 첨가하지 않은 조건하에서 시료를 얻는 것이다. 비환원 조건은 단백질의 3차 구조를 유지할 수 있도록 이황화물다리 (disulfide bridge)를 파괴하지 않은 상태를 의미한다.
단계 (b) : 시료와 Fag e 3 항체의 접촉
이어, 상기 단계 (a)의 시료와 Fag e 3에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 접촉시킨다.
본 명세서에서, 사용되는 용어 “항체(antibody)”는 Fag e 3 에 대한 특이 항체로서, 메밀의 Fag e 3 단백질에 대해 특이적으로 결합하며, 완전한 항체 형태뿐만 아니라 항체 분자의 항원 결합 단편을 포함한다.
완전한 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다 (Cellular and Molecular Immunology, Wonsiewicz, M. J., Ed., Chapter 45, pp. 41-50, W. B. Saunders Co. Philadelphia, PA(1991); Nisonoff, A., Introduction to Molecular Immunology, 2nd Ed., Chapter 4,pp. 45-65, sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA (1984)).
항체 분자의 항원 결합 단편이란 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등을 포함한다. 항체 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역(CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로 Fv 단편을 생성하는 재조합 기술은 PCT 국제 공개특허출원 WO 88/10649, WO 88/106630, WO 88/07085, WO 88/07086 및 WO 88/09344에 개시되어 있다. 이중쇄 Fv(two-chain Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변부위와 경쇄 가변부위가 연결되어 있고 단쇄 Fv(single-chain Fv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변 영역과 단쇄의 가변 영역이 공유 결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있다), 바람직하게는 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다. 본 발명에서 항체는 바람직하게는 완전한 항체 형태이고, IgG1 형태이다.
본 발명의 항체는 단일클론 항체, 다특이적 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 단쇄 Fvs(scFV), 단쇄 항체, Fab 단편, F(ab')단편, 다이설파이드-결합 Fvs(sdFV) 및 항-이디오타입(항-Id) 항체, 그리고 상기 항체들의 에피토프-결합 단편 등을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 항체는 단일클론 항체이다. 용어 “단일클론 항체”는, 실질적으로 동일한 항체 집단에서 수득한 단일 분자 조성의 항체분자를 의미하며, 단일클론 항체는 특정 에피토프에 대해 단일 결합 특이성 및 친화도를 나타낸다. 하기의 실시예에 기재된 바와 같이, 유전적 재조합 방법으로 제공될 수 있는 본 발명의 항체는 핵산 서열과 아미노산 서열이 동일하므로 단일클론 항체라 할 수 있다.
본 발명에 따르면, Fag e 3에 대한 마우스의 단일클론성 항체는 2주 간격을 두고 세 차례에 걸쳐 재조합 Fag e 3으로 면역성을 갖게 한 BALB/c 마우스의 비장 세포와 골수종 세포(Sp 2.0-Ag 14)를 결합하여(fusion) 생성하였다. 재조합 Fag e 3에 대항하는 항체를 생성한 하이브리도마는 ELISA 로 스크리닝하였다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 항체는 하이브리도마 세포(기탁번호: KCLRF-BP-00359 또는 KCLRF-BP-00360)에 의하여 생산된다. 상기 하이브리도마 세포는 한국세포주연구재단에 2016년 03월 09 일자로 기탁되었다. 상기 하이브리도마 세포에 의해 생산된 항체는 Fag e 3 를 인지하며, 2량체(dimerized) Fag e 3 를 보다 특이적으로 인지한다.
한편, 본 발명의 항체는 비실린-유사(vicilin-like) 알레르겐을 추가적으로 인지할 수 있다. 비실린-유사(vicilin-like) 알레르겐 Ara h 1 (64 kDa) 또는 Jug r 2 (44 kDa) 등이 있으며, 또한 검은 월넛(Jug n 2), 렌틸(Len c 1), 완두콩(Pis s 1), 캐슈(Ana o 1), 헤이즐(Cor a 1), 참깨(Sesi 3)에서도 나타난다.
단계 (c) : Fag e 3 정량분석
마지막으로, 상기 단계 (b)의 시료로부터 Fag e 3 를 정량분석한다.
본 발명의 정량분석방법은 공지된 다양한 면역분석방법을 사용할 수 있으며, 본 발명의 일 구현예에 따르면, Fag e 3는 ELISA 방법으로 정량분석할 수 있다. ELISA 방법을 이용할 경우 분석은 마이크로플레이트(microplate) 상에서 이루어진다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 ELISA 는 포획항체로서 하이브리도마 세포(기탁번호: KCLRF-BP-00359) 에 의하여 생산된 항체, 및 검출항체로서 하이브리도마 세포(기탁번호: KCLRF-BP-00360)에 의하여 생산된 항체를 이용하여 실시한다.
본 발명의 ELISA 방법은 two-site ELISA로서 이에 따른 Fag e 3 알레르겐의 검출한계은 0.8μg/ml 이다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 ELISA 는 포획항체로서 하이브리도마 세포(기탁번호: KCLRF-BP-00359) 에 의하여 생산된 항체, 및 검출항체로서 하이브리도마 세포(기탁번호: KCLRF-BP-00360)에 의하여 생산된 항체를 이용하는 메밀 Fag e 3 알레르겐의 정량분석키트를 제공한다.
본 발명의 정량분석키트는 상술한 본 발명의 정량분석방법을 이용하는 것으로서, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 시료 내 Fag e 3 알레르겐에 대한 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주(기탁번호: KCLRF-BP-00359)를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 시료 내 Fag e 3 알레르겐에 대한 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주(기탁번호: KCLRF-BP-00360)를 제공한다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 메밀 Fag e 3 알레르겐의 정량분석방법에 관한 것이다.
(b) 본 발명의 분석방법은 재조합 Fag e 3에 대한 단클론항체 (하이브리도마)를 이용하여 알레르겐을 검출 및 정량하는 방법으로서, 메밀 알레르겐의 표준화(standardization) 및 식품에서의 메밀 오염을 모니터링하는데 유용하게 사용될 수 있다.
(c) 또한 현재의 식품 알러지 표시 시스템을 보완할 수 있을 것이며, 본 발명의 two-site ELISA 시스템을 이용하여 식품과 환경에서 메밀 알레르겐의 검출뿐 아니라 메밀 추출물의 표준화에 기여할 수 있을 것이다.
도 1a-1b는 재조합 Fag e 3 (5μg)의 SDS-PAGE 분석과 메밀 추출물에 대한 항체 반응결과를 나타낸다. 재조합 단백질은 환원 및 비환원 조건 하에서 15% 폴리아크릴아마이드 겔에서 분리되었다(1a). 또한, ELISA 방법으로 하이브리도마 배양상층액을 이용하여 메밀 추출물에 대해 재조합 Fag e 3 단일클론항체의 반응성을 측정했다(1b).
도 2a-2b는 단일클론항체에 의한 천연상태의 비실린 유사 알레르겐의 검출반응을 나타낸다. 추출물(10 μg)로부터 단일클론항체를 이용하여 Fag e 3과 그 상동의 알레르겐을 측정하였다. 상기 추출물은 환원(2a) 및 비환원(2b) 조건 하의 15% 겔에서 분리 후 PVDF 막으로 옮겼다. Fag e 3을 검출하기 위해 사용된 단일클론항체는 각 멤브레인하에서 나타난다. M은 분자 질량 기준, B는 메밀 추출물, P는 땅콩 추출물, W는 호두 추출물. 1H6, 2A1, 3D1 및 4H8 는 각각의 하이브리도마 세포를 의미한다.
도 3은 two-site ELISA에 의한 재조합 Fag e 3의 용량 의존적 곡선을 나타낸다. Two-site ELISA는 25 μg/ml 재조합 Fag e 3로부터 4배 희석액으로 정량화되었다. 검출한계는 0.1 μg/ml이었다.
도 4는 천연 상태의 Fag e 3 정량을 용이하게 하기 위해서 전체 메밀 추출물에 계면활성제를 적용한 결과를 보여준다. 메밀추출물 및 재조합 Fag e 3에 1% 계면활성제를 첨가하였다.
도 5a-5b는 총 메밀 추출물에서 Fag e 3의 정량결과이다. SDS의 첨가로 재조합 Fag e 3 (5a)에 대한 민감도가 감소했지만, 총 메밀 추출물(5b)에서의 천연상태의 Fag e 3 민감성은 증가했다. 검출한계는 6 μg/ml이었다 (5a). 1 mg/ml 인 메밀 추출물을 4배 희석하여 용량 의존적 곡선을 생성하였다 (5b).
도 6a-6c는 SDS를 메밀에 첨가한 이후 가열했을 때의 결과이다. 추출물 상에서 재조합 Fag e 3 (6a)와 천연상태의 Fag e 3 (6b)의 검출을 비교하였다. 가열하는 것이 ELISA의 민감도를 향상시켰다. 재조합 Fag e 3의 검출 한계는 0.8μg/ml 이었다(6c).
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실험재료 및 실험방법
알레르겐 추출물
메밀, 호두 및 땅콩 추출물은 선행방법에 따라 준비하였다[6]. 간단히 말하면, 메밀 가루를 에틸 에테르로 지방을 제거한 후 4℃에서 72시간동안 인산완충식염수로 추출하였다. 상층액을 4℃에서 한 시간 동안 50,000 g 로 원심분리 한 후, 증류수로 48시간 동안 투석하였다. 이어 상기 추출물을 감압 하에 동결 건조하여 사용하기 전까지 -20℃에서 저장하였다. 인산완충식염수에서 원상태로 복원된 추출물의 단백질 농축도는 Bradford Assay 방법으로 결정하였다(Bio-Rad, Hercules, CA, USA).
재조합 Fag e 3에 대한 단일클론성 항체
대장균에서 재조합 Fag e 3을 발현시키고, Ni-column을 사용하여 봉입체(inclusion body)로부터 정제하였다[7]. Fag e 3에 대한 마우스의 단일클론항체는, 2주의 간격을 두고 세 차례에 걸쳐 재조합 Fag e 3으로 면역성을 갖게 한 BALB/c 마우스의 비장 세포와 골수종 세포(Sp 2.0-Ag 14)를 결합하여(fusion) 생성하였다. 재조합 Fag e 3에 대항하는 항체를 생성한 하이브리도마는 ELISA 로 스크리닝하였고 한계희석법으로 복제하였다. 상기 복제된 클론의 단일클론항체는 단백질 G (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)로 정제하였다. 마우스의 단일클론항체의 아이소타이핑 시약에 따라 항체는 모두 IgG1 이었다.
SDS-PAGE 및 면역블롯 분석
재조합 단백질 또는 메밀 추출물은 환원 조건 또는 비환원 조건 하에서 도데실황산나트륨(SDS)이 포함된 15% 아크릴아마이드 겔에서 분리되었다. 상기 겔을 쿠마씨 블루로 염색하거나 폴리불화비닐리덴멤브레인(0.45μμm, Millipore, Bedford, MA, USA)으로 트랜스퍼하였다. 상기 멤브레인은 0.05%의 Tween 20이 포함된 Tris 완충 식염수에서 3% 탈지우유로 하룻밤 동안 블로킹하었다. 그 후에,멤브레인을 하이브리도마배양 상층액과 반응시켰고, 알칼라인 포스파타아제(Sigma-Aldrich)가 컨쥬게이션된 고트 항-마우스 IgE를 1:1,000로 희석하여 반응시켰다(Sigma-Aldrich). 3-브로모-4-클로로-5-인돌-포스페이트로 현상하였으며, 니트로블루테트라졸륨을 기질로 사용하였다(Promega, Madison, WI, USA).
항체의 바이오티닐화
단백질 G-column으로 정제된 단일클론항체는 EZ-Link®Sulfo-NHS-LC-Biotin (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA)으로 바이오티닐화되었다. 즉, 항체 2 mg/ml를 NHS-LC-Biotin과 얼음 상에서 4시간 동안 반응시켰고, 미반응 NHS-LC-Biotin은 인산완충식염수에 대한 투석방법으로 제거하였다.
Two-site ELISA를 이용한 Fag e 3의 측정
세 가지 다른 항체를 이용하여 재조합 Fag e 3의 적정 곡선을 비교함으로써 최적의 항체 조합을 구축하였다. 포획 항체(capture antibody)로서 3D1 (10 μg/ml)과 검출 항체(detection antibody)로서 바이오티닐화된 4H8 (1:1000으로 희석)의 조합으로 최적의 결과를 얻었다. 추출물에서 Fag e 3 분리가 용이하도록, 항원을 1%의 여러 계면활성제(TritonX, NonidetP40, 또는 SDS)가 포함된 완충제로 희석하였다. 일부 시료는 계면활성 완충제로 시료를 희석시킨 후 5분간 100℃에서 가열하였다.
요약하자면, 상기 포획 항체를 탄산염 완충제(pH 9.6)로 희석시키고 4℃에서 하룻밤 동안 코팅시켰다. 연속 희석된 항원(재조합 Fage e 3 또는 알레르겐 추출물)을 웰(well)에 첨가하고 3% 탈지우유로 블로킹한 후 상온에서 한 시간 동안 반응시켰다. 검출 항체를 첨가한 후 한 시간 더 반응시켰으며, 30분 동안 스트렙타아비딘-컨쥬게이션된 과산화효소(Sigma-Aldrich)와 반응시켰다. 마이크로타이터 플레이트(microtiter plater)는 매 단계마다 적어도 세 차례 0.05% Tween 20을 포함하는 인산완충식염수로 세척하였다. 색은 2,2’-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)(ThermoFisher Scientific) 또는 3,3’,5,5’-테트라메틸벤지딘(Kirkegaard Perry Laboratories, Gaithersburg, MD, USA)으로 발현시켰다.
비교실험으로서, 땅콩에서 얻은 비실린 유사 알레르겐인 Ara h 1 농축도 역시 Ara h 1 ELISA 키트(Indoor Biotechnologies Inc., Charlottesville, VA, USA)로 측정하였다.
실험결과
단일클론성 항체의 특이성
음성 알레르겐을 포함하는 메밀 전체 추출물에 대한 mAb의 반응성은 mAb을 이용한 면역블로팅으로 측정하였다. ELISA 상에서 추출물에 대한 mAb의 반응성이 양호했음에도 불구하고, 환원 조건 하에서 분리된 Fag e 3은 mAb를 통해서는 거의 인식되지 않았다(도 1). 이에 본 발명자들은 비환원 조건 하에서 추출물을 분리하면서 면역블로팅을 다시 한 번 실시하였다. 흥미롭게도, mAb 모두 이량체화된(putative dimerized) Fag e 3인 38-kDa 단백질을 우선적으로 인식했다. Ara h 1 (64 kDa)와 Jug r 2(44kDa) 역시 땅콩과 월넛 추출물에서 각각 인식되었다(도 2).
Two-site ELISA 민감도
선별된 항체를 사용한 ELISA는 1 μg/ml 미만의 재조합 Fag e 3을 검출할 수 있었다(도 3). 하지만 전체 추출물에서 천연상태의(native) Fag e 3은 검출하기 어려웠다. 이에, 추출물에서 Fag e 3를 용이하게 분리할 수 있도록 여러 계면활성제를 첨가하였다(도 4). 본 연구에서 개발한 ELISA 시스템은 재조합 Fag e 3으로 테스트했을 때, 최대 6 μg/ml의 비실린 알레르겐을 검출할 수 있었다. Fag e 3을 효율적으로 검출하기 위해서는 100 μg/ml 이상의 메밀 단백질이 필요하다(도 5). 하지만 본 발명에서 ELISA의 민감도는 1%의 SDS를 첨가한 후, 항원 혼합물을 100℃에서 5분간 가열함으로써 향상될 수 있었다. 재조합 Fag e 3의 two-site ELISA 검출 한계는 0.8 μg/ml 이었다(도 6a). 메밀 추출물의 검출 한계 역시 계면활성제 첨가 후 가열함으로써 60 μg/mL (0.1 mL)까지 낮아졌다. 동일한 ELISA 방법을 이용하였을 때 땅콩과 호두 추출물에서 비실린-유사 알레르겐은 검출되지 않았다.
알레르겐 추출물에서 Fag e 3 측정
본 발명자들은 메밀 추출물 1 mg 내에 총 120 μg의 Fag e 3이 존재하는 것을 확인하였다. 하지만, 본 발명의 two-site ELISA 키트로는 땅콩이나 호두 추출물에서 비실린 알레르겐은 검출되지 않았다. 비록 143.75μg 의 Ara h 1이 1 mg의 땅콩 추출물에 존재하는 것으로 검출되기는 했지만, Fag e 3 또한 Ara h 1 ELISA 키트(Indoor Biotechnologies Inc.)로는 검출되지 않았다.
논의
식품 또는 환경에서 알레르겐의 정량화를 위한 면역분석은 알레르겐 회피 및알레르겐 추출물의 표준화에 유용하다[8]. 본 발명자들은 재조합 Fag e 3에 대한 mAb를 이용하여 메밀 알레르겐 Fag e 3을 정량화하기 위해 two-site ELISA 방식을 개발했다. 모든 mAb가 전체 메밀 추출물에 대해 양호한 반응성을 나타내었다(도 1). 그러나, 이들 mAb는 환원 조건 하에서 추출물로부터 천연 상태의 Fag e 3을 쉽게 검출할 수는 없었다(도 2). 재조합 Fag e 3에 대한 모든 mAb는 비실린-유사알레르겐의 입체구조적 에피토프(conformational epitope)를 인식하는 것으로 간주된다(도 2). Ara h 1 (64 kDa)와 Jug r 2 (44 kDa) 역시 비환원 조건 하에서 상기 mAb에 의해 인식되었다.
한편, 열처리나 계면활성체 처리를 하기 전에는 재조합 Fag e 3에 대한 mAb를 이용하는 two-site ELISA 방식으로는 전체 추출물에서 Fag e 3을 검출할 수 없었다. mAb와 Fag e 3의 결합은 다른 바실린 관련 단백질에 의해 저해되거나 다합체를 형성하는 것으로 알려져 있는 비실린 분자간의 상호작용에 의해 저해될 수 있다. 글리코실화도 항체 인식에 영향을 미칠 수 있다[9].
흥미롭게도, 각각의 mAb는 추출물에 양호한 반응을 나타내었다. 그러나 재조합 Fag e 3가 잘 정량되었더라도, 추출물로부터 천연 상태의 Fag e 3는 두 개의 mAb조합으로 검출되지 않았다. 재조합 Fag e 3에 대한 mAb는 서로 근접한 에피토프를 인식할 수 있다. 하나의 mAb가 하나의 에피토프 부위에 결합함으로써, 입체 장애로 인해 가까이에 위치한 에피토프에 대한 다른 mAb의 접근성을 감소시킬 수도 있다. 계면활성제로 인한 Fag e 3의 부분 변성이 다른 mAb의 접근성을 증가시킬 수도 있다. 이 가설을 설명하기 위해서는 에피토프 매핑이 수행되어야 한다.
재조합 Fag e 3는 우수한 IgE 반응성을 가지고 있으며, 이는 재조합 Fag e 3가 천연 상태의 대응물과 매우 유사한 것을 의미한다[7]. 본 발명자들은 환원 및 비환원 겔을 기반으로 한 재조합 Fag e 3에서 구조적인 차이점을 발견하지 못했다(도 1). 그러나, 천연 상태의 Fag e 3이 환원 조건에서 mAb에 대해 다른 반응성을 보인 것처럼, 환원 조건은 천연상태의 Fag e 3의 경미한 구성의 변화를 유발할 수도 있다(도 2). 천연 상태의 Fag e 3이 IgE 면역블로팅 분석을 기반으로 양호한 IgE 반응성을 나타낸 것처럼, 환원 조건 하에서 구조적으로 변화된 천연상태의 Fag e 3는 IgE 에피토프 대부분을 보유하는 것으로 예상된다[6]. SDS를 첨가하여 가열하는 것은 Ara h 1과 Jug r 2에서 유사한 변화를 유발시킬 것으로는 여겨지지 않는데, 이들 분자가 재조합 Fag e 3 mAb를 사용한 ELISA로 정량화되지 않았기 때문이다. 다당류 존재 하의 열처리(30-50분)는 달단종메밀(fagopyrum tataricum)의 비실린-유사 알레르겐인 Fag t 3에 구조적 변화를 일으킬 수 있다. 이는 메일라르(Maillard) 반응을 통해 면역원성을 현저하게 감소시킨다[10]. Fag t 3은 90℃에서 30분간 처리한 이후에도 안정적이었다. 따라서, 1% SDS를 첨가하여 100℃에서 5분간 열처리를 하는 동안 메일라르 반응이 일어나지 않았다고 생각된다.
본 발명자들은 희석 완충액에서 Fag e 3(도 4)의 검출을 향상시키기 위해 계면활성제인 SDS를 사용했다. 메밀 단백질의 대략 12%가 비실린인 것으로 확인되었다(도 5). 여러가지 양념, 첨가물 및 다른 식료품들이 섞인 식품에서 알러지 유발 요소를 검출하는 것은 어려운 일 일수 있다. 따라서, 연속적인 희석에 앞서 계면활성제를 사용하여 항원을 가열함으로써 다양한 식품 및 환경에서 메밀 알레르겐을 추출하고 검출할 수 있다. 항원을 연속적으로 희석하기 전에 가열함으로써 ELISA의 민감도는 대략 7.5배 가량 향상되었다(도 6).
Ara h 1은 잘 알려진 비실린 알레르겐이다. Ara h 1은 소수성 상호작용을 통해 안정적인 삼량체(64kDa)를 형성한 열에 안정적인 단백질이다. 이 단백질은 땅콩 추출물에서 총 단백질의 12% 내지 16%를 이루고 있다[12-14]. Ara h 1은 땅콩 및 식품 추출물에서 뿐 아니라 다양한 환경에서도 측정되었다[11,14,15]. 메밀을 제공하는 식당, 메밀면을 생산하는 공장, 메밀이 포함된 식사 등 다양한 환경에서 Fag e 3이 검출될 가능성이 높다. 메밀은 직업적 노출이나, 주로 메밀가루로 오염된 메밀 왕겨로 속을 채운 베개로 인한 가정에서의 노출로 인한 흡입으로 예민해질 수 있다[16].
재조합 Fag e 3에 대한 mAb는 견과류의 비실린-유사 알레르겐을 인지한다. 비실린-유사 알레르겐은 또한 검은 호두(Jug n 2), 렌틸(Len c 1), 완두콩(Pis s 1), 캐슈(Ana o 1), 헤이즐(Cor a 1), 참깨(Sesi 3)에서도 나타난다. 완두콩과 땅콩간 임상적으로 연관성 있는 교차반응은 비실린-상동성 알레르겐인 Pis s 1과 Ara h 1에 기인한 것이라고 보고되었다[17]. 하지만, 이들 알레르겐 간에는 임상 교차반응성의 비율이 낮다.
메밀 two-site ELISA키트는 이미 Crystal Chem Inc.(Downers Grove, IL, USA)와 ELISA systems(Windsor, Queensland, Australia)에서 생산된다. 이들 키트는 식품에서 메밀 알레르겐 오염의 감시를 위해 메밀 추출을 사용한다. 일본의 식품업계와 국가의 식품 통제기관 실험실에서는 24-kDa 알레르겐(추정 Fag e 1)을 검출하는 ALLERGENEYE ELISA 키트(Justia Legal Resources, Tokyo, Japan)를 사용하며, FASTKIT ELISA 키트(COSMO Bio CO., Ltd., Tokyo, Japan)를 사용한다(공고번호1106001, 2002)[18]. 메밀 DNA 검출 시스템(Shimadzu Cor., Kyoto Japan) 또한 이용가능하다. 현재의 식품 알러지 표시 시스템을 보완하기 위해 더 나은 메밀 알레르겐 검출 시스템을 개발하는 것은 중요한 목표이다. Fag e 2나 Fag e 3과 같이 임상적으로 관련있는 알레르겐의 검출은 전체 추출물의 진단적 가치보다 더 나은 진단적 가치가 있다[7,19].
본 연구진은 본 연구에서 개발한 Fag e 3 ELISA 가 식품과 환경에서 메밀 알레르겐의 검출뿐 아니라 메밀 추출물의 표준화에 도움이 되기를 희망한다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
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한국세포주연구재단 KCLRFBP00359 20160309 한국세포주연구재단 KCLRFBP00360 20160309

Claims (12)

  1. 다음 단계를 포함하는 메밀 Fag e 3 알레르겐의 정량분석방법:
    (a) 시료 내 Fag e 3 알레르겐을 해리(dissociation)시키는 단계;
    (b) 상기 단계 (a)의 시료와 Fag e 3에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 접촉시키는 단계로서, 상기 항체는 하이브리도마 세포(기탁번호: KCLRF-BP-00359 또는 KCLRF-BP-00360)에 의하여 생산되며, 메밀 Fag e 3에 특이적으로 결합하고; 및
    (c) 상기 단계 (b)의 시료로부터 Fag e 3 를 정량분석하는 단계.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (a)는 상기 시료에 계면활성제를 첨가한 후 가열하여 실시하는 것을 특징으로 하는 정량분석방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (a)의 시료는 비환원 조건 하에서 추출된 것을 특징으로 하는 정량분석방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 2량체(dimerized) Fag e 3 를 인지하는 것을 특징으로 하는 정량분석방법.
  5. 삭제
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 정량분석방법은 ELISA 인 것을 특징으로 하는 정량분석방법.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 ELISA 는 포획항체로서 하이브리도마 세포(기탁번호: KCLRF-BP-00359) 에 의하여 생산된 항체, 및 검출항체로서 하이브리도마 세포(기탁번호: KCLRF-BP-00360)에 의하여 생산된 항체를 이용하여 실시하는 것을 특징으로 하는 정량분석방법.
  8. 제 6 항에 있어서, 상기 정량분석방법은 Fag e 3 알레르겐의 검출한계가 0.8 μg/ml 인 것을 특징으로 하는 정량분석방법.
  9. 삭제
  10. 포획항체로서, 메밀 Fag e 3에 특이적으로 결합하며 하이브리도마 세포(기탁번호: KCLRF-BP-00359) 에 의하여 생산된 항체; 및 검출항체로서, 메밀 Fag e 3에 특이적으로 결합하며 하이브리도마 세포(기탁번호: KCLRF-BP-00360)에 의하여 생산된 항체를 이용하는 메밀 Fag e 3 알레르겐의 정량분석키트.
  11. 메밀 Fag e 3 알레르겐에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주(기탁번호: KCLRF-BP-00359).
  12. 메밀 Fag e 3 알레르겐에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주(기탁번호: KCLRF-BP-00360).
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