KR101893819B1 - Quality control of stem cell by electrotaxis and migration analysis - Google Patents

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Abstract

본 발명은 전기 주성과 세포이동분석을 이용한 줄기세포의 품질 관리 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 줄기세포 시료에 직류 전기장을 적용하여 미분화 줄기세포와 골분화 과정의 줄기세포의 판별에 의한 줄기세포의 품질 관리 방법 및 이를 이용한 품질 관리 장치에 관한 것이다.
본 발명에 따른 방법을 사용하여 줄기세포 시료에 전기장을 적용하여 미분화 상태의 줄기세포 및 분화된 줄기세포를 간편하게 판별하여 줄기세포 시료에 대한 품질을 판단할 할 수 있다. 특히, 지방유래 줄기세포 시료에 대하여 직류에 의해 형성되는 전기장을 적용하여 미분화 상태의 지방유래 줄기세포 및 골세포 분화된 줄기세포를 간편하고 효과적으로 판별할 수 있다. The present invention relates to a method for quality control of stem cells using electrophoresis and cell migration assay. More particularly, the present invention relates to a method for quality control of stem cells by distinguishing stem cells from undifferentiated stem cells and bone differentiation by applying a DC electric field to a stem cell sample, and a quality control apparatus using the same.
By using the method according to the present invention, it is possible to easily determine the undifferentiated stem cells and the differentiated stem cells by applying an electric field to the stem cell samples, thereby judging the quality of the stem cell samples. In particular, by applying an electric field formed by DC to an adipose-derived stem cell sample, it is possible to easily and effectively discriminate undifferentiated adipose-derived stem cells and osteocyte-differentiated stem cells.

Description

전기 주성과 세포이동분석을 이용한 줄기세포의 품질 관리 방법{Quality control of stem cell by electrotaxis and migration analysis}BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention relates to a method for quality control of stem cells by electrophoresis and cell migration analysis,

본 발명은 전기 주성과 세포이동분석을 이용한 줄기세포의 품질 관리 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 줄기세포 시료에 직류 전기장을 적용하여 미분화 줄기세포와 골분화 과정의 줄기세포를 판별하는 줄기세포의 품질 관리 방법 및 이를 이용한 품질 관리 장치에 관한 것이다.The present invention relates to a method for quality control of stem cells using electrophoresis and cell migration assay. More particularly, the present invention relates to a method for quality control of stem cells and a quality control apparatus using the same to discriminate between undifferentiated stem cells and stem cells of bone differentiation process by applying a DC electric field to a stem cell sample.

손상된 조직의 기능을 회복시키는 줄기세포 치료법은 면역억제제를 사용하지 않고 숙주의 거부 반응을 회피하고 염증 발생을 감소시킬 수 있다(비특허문헌 1). 특이적으로, 성체 중간엽 줄기세포 및 혈관형성을 촉진시키는 다능성 줄기세포는 다양한 형태의 연결조직으로 분화할 수 있고 염증 반응을 감소시킬 수 있어서, 현재까지 다양한 임상연구의 대상으로 관심을 받고 있다. 중간엽 줄기세포는 심혈관 질환, 심근 경색(MI, Myocardial Infarction), 뇌 손상 및 척수 손상, 뇌일혈(stroke), 당뇨, 연골 및 골 손상 유래의 염증을 치료하고 손상된 조직을 재생시킬 수 있는지에 대하여 연구되고 있다(비특허문헌 2). 이외에도 줄기세포를 다양한 분야에 응용하기 위하여, 2014년도 국가중점과학기술 전략로드맵에서는 줄기세포의 실용화를 위한 핵심 인프라로 줄기세포 은행이 제시된 바도 있다. 하지만, 줄기세포는 신체 내 대부분의 조직에서만 분리될 뿐만 아니라 언제든지 분화가 가능하기 때문에 실제 치료에 적용하기 이전에 줄기세포의 순도 검증, 즉, 임상등급으로의 판단 및 품질관리가 필요한 실정이다. 특히, 치료에 이용하고자 하는 줄기세포 시료 내에는 분화도에 따른 다양한 줄기세포가 포함되어 있어서 줄기세포를 이용한 연구 및 임상 적용을 방해하는 주요한 원인이 되고 있다(비특허문헌 3 내지 6).Stem cell therapy that restores damaged tissue function can avoid host rejection and reduce inflammation without using immunosuppressants (Non-Patent Document 1). Specifically, adult mesenchymal stem cells and pluripotent stem cells that promote angiogenesis are capable of differentiating into various types of connective tissues and reducing the inflammatory response, and have been attracting interest in various clinical studies to date . Mesenchymal stem cells are used to treat inflammation from cardiovascular disease, myocardial infarction (MI), brain injury and spinal cord injury, stroke, diabetes, cartilage and bone damage, (Non-Patent Document 2). In addition, in order to apply stem cells to various fields, the stem cell bank has been proposed as a key infrastructure for the practical use of stem cells in the 2014 National Science and Technology Strategy Roadmap. However, since stem cells are not only isolated from most tissues in the body but also can be differentiated at any time, it is necessary to verify the purity of the stem cells before they are applied to actual treatment, that is, to judge to clinical grade and quality control. In particular, the stem cell sample to be used for treatment contains various stem cells depending on the degree of differentiation, which is a major cause of obstructing research and clinical application using stem cells (Non-patent Documents 3 to 6).

한편, 세포 이동은 직류 전류의 영향을 받고 이러한 현상을 전기주성(electrotaxis)이라 한다(비특허문헌 7). 세포의 방향 또는 이동 속도는 직류에 의해 영향을 받으며 전기 주성은 세포 형태에 대하여 특이적이다. 이러한 특이성에 근거하여, 전기 주성은 세포 이동의 특징 연구에 도움이 되고, 각각의 세포에 대한 특징이 될 수 있다. On the other hand, cell migration is affected by direct current and this phenomenon is called electrotaxis (Non-Patent Document 7). The direction or migration rate of the cells is influenced by DC, and the electrophoresis is specific for cell morphology. Based on this specificity, electrophoresis helps characterize cell migration and can be a hallmark of each cell.

세포 선별 방법은 혈액 연구, 진단 및 치료 분야에서 지속적으로 개발되고 있다(비특허문헌 8 및 9). 유세포 분석 및 형광-활성 세포 분류(FACS) 기술은 형광 표지(예-세포 표면의 항원)에 근거한 세포군의 판별 방법을 제공하고 있다(비특허문헌 10 및 11). 세포 표면 마커에 대한 확정된 조합은 FACS 또는 면역 자기성 세포 분리(MACS, ImmunoMagnetic Cell Separation)에 의해 특이적인 줄기세포 마커를 검증 및 판별에 사용할 수 있다(비특허문헌 12). 이러한 줄기세포 선별 과정 및 마커는 중간엽 줄기세포에 대한 여러 가지 세포군의 분석, 특성화 및 판별을 가능하게 하였다.Cell sorting methods are being continuously developed in the field of blood research, diagnosis and therapy (Non-Patent Documents 8 and 9). Flow cytometry and fluorescence activated cell sorting (FACS) techniques provide methods for identifying cell populations based on fluorescent markers (eg, cell surface antigens) (Non-Patent Documents 10 and 11). A defined combination of cell surface markers can be used for validation and discrimination of specific stem cell markers by FACS or ImmunoMagnetic Cell Separation (MACS, non-patent document 12). These stem cell selection processes and markers enabled the analysis, characterization, and discrimination of various cell populations of mesenchymal stem cells.

하지만, 상기 방법에 따른 줄기세포 군의 판별 과정은 긴 시간 및 많은 준비과정이 필요하여 새로운 세포 분리 방법이 필요한 실정이다. However, the process of distinguishing stem cells according to the above method requires a long time and a lot of preparation steps, and thus a new cell separation method is required.

한국등록특허 제10-1541958호.Korean Patent No. 10-1541958. 한국등록특허 제10-1465263호.Korean Patent No. 10-1465263.

Ankrum J and Karp JM, 2010, Mesenchymal stem cell therapy, 16: 203.Ankrum J and Karp JM, 2010, Mesenchymal stem cell therapy, 16: 203. Phinney DG and Prockop DJ, 2007, Stem Cells, 25: 2896.Phinney DG and Prockop DJ, 2007, Stem Cells, 25: 2896. Stewart MH and et al., 2006, Nat Methods, 3: 807.Stewart MH and et al., 2006, Nat Methods, 3: 807. Isacson O and et al., 2003, Ann Neurol, 53(suppl 3): S135.Isacson O and et al., 2003, Ann Neurol, 53 (suppl 3): S135. Carson CT and et al., 2006, Nat Med, 12: 1237.Carson CT and et al., 2006, Nat Med, 12: 1237. Roy NS and et al., 2006, Nat Med, 12: 1259.Roy NS and et al., 2006, Nat Med, 12: 1259. Kim MS and et al., 2015, J. Tissue Eng Regen Med, DOI:10.1002/term. 1986.Kim, MS and et al., 2015, J. Tissue Eng Regen Med, DOI: 10.1002 / term. 1986. Perez OD and et al., 2006, Immunol Rev, 210: 208.Perez OD and et al., 2006, Immunol Rev, 210: 208. Herzenberg LA and et al., 2002, Clin Chem, 48: 1819.Herzenberg LA and et al., 2002, Clin Chem, 48: 1819. Kantor AB and et al., 1996, Blackwell Science, 43.1-49.13.Kantor AB and et al., 1996, Blackwell Science, 43.1-49.13. Baumgarth N and et al., 2000, J Immunol Methods, 243: 77.Baumgarth N and et al., 2000, J Immunol Methods, 243: 77. Miltenyi S and et al., 1990, Cytometry, 11: 231.Miltenyi S et al., 1990, Cytometry, 11: 231. Kim MS and et al., 2015, Biochem Bioph Res Co, 460: 255.Kim, MS and et al., 2015, Biochem Bioph Res Co, 460: 255. Pittenger MF and et al., 1999, Science, 284: 143.Pittenger MF and et al., 1999, Science, 284: 143. Dennis JE and Charbord P, 2002, Stem Cells, 20: 205.Dennis JE and Charbord P, 2002, Stem Cells, 20: 205. Caplan AI., 2005, Tissue Eng, 11: 1198.Caplan AI., 2005, Tissue Eng, 11: 1198. Rochefort GY and et al., 2006, Stem Cells, 24: 2202.Rochefort GY and et al., 2006, Stem Cells, 24: 2202. Conget PA and Minguell JJ, 2000, Exp Hematol, 28: 382.Conget PA and Minguell JJ, 2000, Exp Hematol, 28: 382. Geoffroy V and et al., 2002, Mol Cell Biol, 22: 6222.Geoffroy V et al., 2002, Mol Cell Biol, 22: 6222. Yang S and et al, 2003, J Bone Miner Res, 18: 705.Yang S and et al, 2003, J Bone Miner Res, 18: 705. Frendo JL and et al., 1998, J Biol Chem, 273: 30509.Freundo JL and et al., 1998, J Biol Chem, 273: 30509. Kern B and et al., 2001, J Biol Chem, 276: 7101.Kern B and et al., 2001, J Biol Chem, 276: 7101. Gersbach CA and et al., 2004, Exp Cell Res, 300: 406.Gersbachce and et al., 2004, Exp Cell Res, 300: 406. Gazit D and et al., 1999, J Gene Med, 1: 121.Gazit D et al., 1999, J Gene Med, 1: 121. Delorme B and et al., 2008, Blood, 111: 2631.Delorme B and et al., 2008, Blood, 111: 2631. Yang JW and et al., 2006, Biorheology, 43: 389.Yang JW and et al., 2006, Biorhology, 43: 389.

본 발명은 상기와 같은 종래의 기술 상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 전기 주성을 활용하여 줄기세포 시료 내 미분화 상태의 줄기세포 및 골분화 과정의 줄기세포를 판별하여 줄기세포 시료의 품질을 관리하는 방법을 제공하는데 있다.SUMMARY OF THE INVENTION The present invention has been made to solve the above-mentioned problems of the prior art, and it is an object of the present invention to provide a method for diagnosing a stem cell in an undifferentiated state and a stem cell in a bone differentiation process in a stem cell sample, And to provide a method for managing the quality of a sample.

그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.However, the technical problem to be solved by the present invention is not limited to the above-mentioned problems, and other matters not mentioned can be clearly understood by those skilled in the art from the following description.

본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위하여, 직류에 의해 형성되는 전기장 내에서 줄기세포 및 분화 과정의 줄기세포에 대하여 평균 이동속도 및 방향성에 따른 줄기세포의 판별 기준을 확정하고, 다양한 세기의 직류 조건을 적용하여 줄기세포의 품질을 관리하는 최적의 방법을 검증하였다.DISCLOSURE OF THE INVENTION In order to solve the above problems, the present inventors have determined stem cell discrimination standards for stem cells and differentiation stem cells in an electric field formed by direct current according to the average moving speed and direction, And the optimal method for managing the quality of stem cells was verified.

이하, 본원에 기재된 다양한 구체예가 도면을 참조로 기재된다. 하기 설명에서, 본 발명의 완전한 이해를 위해서, 다양한 특이적 상세사항, 예컨대, 특이적 형태, 조성물 및 공정 등이 기재되어 있다. 그러나, 특정의 구체예는 이들 특이적 상세 사항 중 하나 이상 없이, 또는 다른 공지된 방법 및 형태와 함께 실행될 수 있다. 다른 예에서, 공지된 공정 및 제조 기술은 본 발명을 불필요하게 모호하게 하지 않게 하기 위해서, 특정의 상세사항으로 기재되지 않는다. "한 가지 구체예" 또는 "구체예"에 대한 본 명세서 전체를 통한 참조는 구체예와 결부되어 기재된 특별한 특징, 형태, 조성 또는 특성이 본 발명의 하나 이상의 구체예에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체에 걸친 다양한 위치에서 표현된 "한 가지 구체예에서" 또는 "구체예"의 상황은 반드시 본 발명의 동일한 구체예를 나타내지는 않는다. 추가로, 특별한 특징, 형태, 조성, 또는 특성은 하나 이상의 구체예에서 어떠한 적합한 방법으로 조합될 수 있다. Hereinafter, various embodiments described herein will be described with reference to the drawings. In the following description, for purposes of complete understanding of the present invention, various specific details are set forth, such as specific forms, compositions and processes, and the like. However, certain embodiments may be practiced without one or more of these specific details, or with other known methods and forms. In other instances, well-known processes and techniques of manufacture are not described in any detail, in order not to unnecessarily obscure the present invention. Reference throughout this specification to "one embodiment" or "embodiment" means that a particular feature, form, composition, or characteristic described in connection with the embodiment is included in at least one embodiment of the invention. Accordingly, the appearances of the phrase " in one embodiment "or" an embodiment "in various places throughout this specification are not necessarily indicative of the same embodiment of the present invention. In addition, a particular feature, form, composition, or characteristic may be combined in any suitable manner in one or more embodiments.

출원서 내 특별한 정의가 없으면 본 출원서에 사용된 모든 과학적 및 기술적인 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 당업자에 의하여 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. Unless defined otherwise in the application, all scientific and technical terms used in this application have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs.

본 발명의 목적은 줄기세포 시료에 전기장을 적용하여 미분화된 줄기세포 및 분화된 줄기세포를 판별하여 줄기세포 시료의 품질을 관리하는 방법 및 이를 이용한 장치를 제공하는 것이다.An object of the present invention is to provide a method for managing the quality of a stem cell sample by discriminating undifferentiated stem cells and differentiated stem cells by applying an electric field to the stem cell sample, and a device using the same.

본 발명의 일 구체예에서 줄기세포 시료에 대하여 직류에 의해 형성된 전기장을 적용하고, 상기 전기장에 의한 줄기세포의 이동 속도 및 방향성의 차이에 의해 줄기세포를 판별하는 단계를 포함하는 줄기세포의 품질 관리(quality control) 방법을 제공하였다. 상기 구체예에서, 상기 판별은 미분화 상태의 줄기세포 및 분화 과정의 줄기세포를 판별하는 것이며, 상기 줄기세포는 배아 줄기세포, 조혈모세포, 중간엽 줄기세포, 신경줄기세포, 및 지방줄기세포를 포함하는 군으로부터 선택된 어느 하나이며, 상기 판별은 (a) 줄기세포의 최대 이동 속도(maximum speed)와 최소 이동 속도(minimum speed)의 차를 총 세포 수(total cell number)로 나누어 계급 구간을 설정하는 단계; (b) 상기 계급 구간 중 세포 빈도(frequency)가 "0"인 계급 구간이 총 계급 구간의 5% 이상 연속적으로 나타나는 구간을 공백(gap) 구간으로 설정하는 단계; (c) 상기 공백 구간 내에서 줄기세포 이동 속도의 평균 값과 가장 가까운 계급 구간을 컷오프(cut off)로 설정하는 단계; 및 (d) 상기 컷오프 값보다 빠른 속도 구간 내의 줄기세포는 미분화 상태의 줄기세포로, 느린 속도 구간 내의 줄기세포는 분화 과정의 줄기세포로 판별하는 단계를 포함하는 것이며, 상기 방향성은 분화 과정의 줄기세포가 미분화 상태의 줄기세포에 비해 더 높으며, 상기 방향성은 양극 방향이며, 상기 직류는 900μA 내지 1100 μA 이며, 상기 분화 과정의 줄기세포의 이동 속도는 분화가 진행됨에 따라 감소하는 것을 특징으로 하는 미분화 상태의 줄기세포 및 분화 과정의 줄기세포에 대한 품질 관리 방법을 제공하였다.In one embodiment of the present invention, a stem cell is subjected to quality control by applying an electric field formed by direct current to a stem cell sample, and discriminating the stem cell by a difference in the moving speed and direction of the stem cell by the electric field (quality control) method. In this embodiment, the discrimination is for discriminating stem cells in undifferentiated state and stem cells in differentiation process, wherein the stem cells include embryonic stem cells, hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, neural stem cells, and adipose stem cells (A) dividing the difference between a maximum speed and a minimum speed of a stem cell by a total cell number to set a class interval, ; (b) setting a period in which the class interval in which the frequency of the cell frequency is "0 " is continuously 5% or more of the total class interval as a gap interval; (c) setting a cutoff period that is closest to an average value of the stem cell movement speed within the blank interval; And (d) determining that the stem cells in the velocity section earlier than the cutoff value are stem cells in the undifferentiated state and the stem cells in the slow-speed section are stem cells in the differentiation process, Wherein the direction is an anode direction, the direct current is 900 μA to 1100 μA, and the migration rate of the stem cells in the differentiation process is decreased as the differentiation proceeds. The present invention provides a method for quality control of stem cells and differentiation stem cells.

본 발명의 다른 구체예에서, 미분화 줄기세포 및 분화과정의 줄기세포를 포함하는 줄기세포 시료를 배양하고 줄기세포의 이동이 가능한 세포 배양부; 상기 세포 배양부 외부에 장착되어 있고 세포 시료내 줄기세포에 전기장을 적용하는 전류 발생부; 및 상기 세포 배양부 하단에서 줄기세포 이동의 관찰을 위한 현미경 관찰부를 포함하는 줄기세포의 품질 관리 장치를 제공하였다. 상기 구체예에서, 상기 장치는 줄기세포의 방향성 및 이동 속도에 의해 형성되는 공백 구간 내 컷오프 구간을 기준으로 줄기세포를 판별하고, 상기 공백 구간은 세포 빈도(frequency)가 0인 계급 구간이 전체 계급 구간 내 5% 이상 연속으로 나타나는 구간이며 상기 컷오프는 공백 구간 내에서 전체 세포의 이동 속도의 평균값과 가장 가까운 계급 구간이며, 상기 계급 구간은 세포의 이동 속도 중 가장 빠른 속도와 가장 느린 속도의 차이를 총 세포수로 나누어서 설정하며, 상기 판별은 상기 컷오프 구간보다 이동 속도가 빠른 줄기세포는 미분화 줄기세포로 판별하고 이동 속도가 느린 줄기세포는 분화 과정의 줄기세포로 판별하며, 상기 줄기세포는 배아줄기세포, 조혈모세포, 중간엽 줄기세포, 신경줄기세포, 및 지방줄기세포를 포함하는 군으로부터 선택된 어느 하나이며, 상기 방향성은 분화 과정의 줄기세포가 미분화 상태의 줄기세포에 비해 더 높으며, 상기 방향성은 양극 방향이며, 상기 전류는 900 μA 내지 1100μA의 직류이며, 상기 분화 과정의 줄기세포의 이동 속도는 분화가 진행됨에 따라 감소하는 것을 특징으로 하는 줄기세포의 품질 관리 장치를 제공하였다.In another embodiment of the present invention, there is provided a stem cell preparation method comprising: culturing a stem cell sample containing undifferentiated stem cells and stem cells of a differentiation stage and culturing the stem cells; A current generator installed outside the cell culture unit and applying an electric field to the stem cells in the cell sample; And a microscope observation unit for observing stem cell migration at the lower end of the cell culture unit. In this embodiment, the device discriminates stem cells based on a cut-off period in a blank section formed by the directionality and the moving speed of the stem cell, and the blank section has a hierarchical section in which the cell frequency is 0, And the cutoff is the closest class interval to the average value of the total cell movement rate in the blank interval, and the class interval is the difference between the fastest and slowest rate of cell movement speed Wherein the stem cell is determined to be an undifferentiated stem cell having a faster moving speed than the cutoff section and the stem cell having a slower moving speed is determined as a stem cell of a differentiation process, Cells, hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, neural stem cells, and adipose stem cells Wherein the directionality is higher than that of the undifferentiated stem cells, the direction is the direction of the anode, the current is a direct current of 900 μA to 1100 μA, the migration rate of the stem cells of the differentiation process The present invention provides a quality control apparatus for a stem cell.

본 발명에서 "줄기세포"는 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 새로운 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 의미하며, 분화능에 따라 만능 줄기세포(totipotent stem cell), 전분화능 줄기세포(pluripotent stem cell), 및 다분화능 줄기세포(multipotent stem cell)로 분류할 수 있고, 줄기세포의 유래 조직에 따라 성체줄기세포, 배아줄기세포 및 역분화줄기세포로 분류할 수 있다. 이 중 성체줄기세포는 신체의 각 조직에 소량으로 존재하는 세포로, 특정한 조직을 구성하는 세포이며 이의 대표적인 예로 다분화성 조혈모세포와 중간엽줄기세포가 있다. 이러한 성체줄기세포는 몸이 항상 건강한 상태로 유지되는 데에 필요한 세포를 제공하며, 또한 손상이 발생하였을 때 손상된 부위로 이동한 다른 장기에 있던 줄기세포와 함께 손상된 조직으로 분화하여 복구한다.The term "stem cell" in the present invention means a cell capable of self-replicating and capable of differentiating into two or more new cells. According to the differentiation ability, pluripotent stem cells, pluripotent stem cells ), And multipotent stem cells, and classified into adult stem cells, embryonic stem cells, and degenerated stem cells depending on the stem tissues derived from the stem cells. These adult stem cells are small numbers of cells in each tissue of the body, and they constitute specific tissues. Typical examples are pluripotent stem cells and mesenchymal stem cells. These adult stem cells provide the cells necessary for the body to remain healthy at all times and, when the damage occurs, the stem cells in the other organs that have migrated to the damaged area are differentiated into damaged tissues and restored.

본 발명에서 "지방유래줄기세포(adipocyte-derived stem cell, ADSC)"는 지방세포, 골모세포, 연골모세포, 근섬유모세포 등 대부분의 중간엽 세포로 분화할 수 있는 지방조직으로부터 분리된 줄기세포로서, 지방전구세포, 기질세포, 다분화능 지방 유래 세포(multipotent adipose-derived cells) 또는 지방유래성체줄기세포(adipose derived adult stem cells) 등으로 불려온 세포를 의미한다. 상기 지방유래줄기세포는 특별히 이에 제한되지는 않으나, 인간에게 이식할 수 있는 돼지, 소, 영장류 및 인간 등을 포함하는 포유류 유래일 수 있다. 한편, 중간엽 줄기세포는 성체 줄기세포의 전형을 나타내므로, 본 발명에서 지방유래 줄기세포(ADSC, Adipose-Derived Stem Cell)는 통상적으로 지방-유래 중간엽 줄기세포(Adipose-derived Mesenchymal Stem Cell)로 사용된다. 중간엽 줄기세포(MSC)는 골수(Bone Marrow, BM) 흡인물로부터 통상적으로 분리되고, 다능성 세포군으로 검증되어 지방, 골 및 연골 마커를 발현하도록 유도될 수 있다(비특허문헌 14 내지 17). 한편, 지방유래 줄기세포는 성체줄기세포의 하나로서 성체줄기세포는 신체의 각 조직에 소량으로 존재하는 세포이다. 배아줄기세포와는 다르게 제한된 증식력을 가지고 있으므로 암세포화 가능성이 없고 수정란의 파괴가 없어 윤리적으로도 문제가 되지 않는다. 이에 따라 신속한 연구가 진행되어 임상 적용이 가능한 단계까지 도달한 상태이다. 다만, 개체로부터 얻을 수 있는 줄기세포의 수가 적고 배양이 어려우며 특정 세포로만 분화가 가능한 단점이 연구의 한계로 지적되고 있어서, 이의 극복을 위한 연구가 진행되고 있다. 특히, 줄기세포 시료 내 분화가 진행되는 세포가 혼합되어 있어 이는 세포 치료제로서의 활용에 제한이 되므로, 줄기세포 시료 내 미분화 줄기세포만을 분리할 수 있는 기술의 개발이 필요한 상황이다. 한편, 지방유래줄기세포와 비슷한 성향의 중간엽줄기세포를 포함하는 줄기세포 시료 내 노화된 중간엽줄기세포를 정상 중간엽줄기세포와 구분하는 방법이 개시되어 있다(특허문헌 1).In the present invention, "adipocyte-derived stem cell (ADSC)" is a stem cell isolated from adipose tissue that can differentiate into most mesenchymal cells such as adipocytes, osteoblasts, chondroblasts and myofibroblasts, Refers to cells called lipopolitan cells, stromal cells, multipotent adipose-derived cells or adipose derived adult stem cells. The adipose-derived stem cells may be derived from mammals, including, but not limited to, pigs, cows, primates, and humans, which can be transplanted to humans. In the present invention, adipose-derived stem cells (ADSCs) are usually adipose-derived mesenchymal stem cells (ADSCs), since adipose stem cells represent typical adult stem cells. . Mesenchymal stem cells (MSCs) are routinely isolated from bone marrow (BM) aspirates and can be validated with pluripotent cell lines to induce expression of fat, bone and cartilage markers (Non-Patent Documents 14 to 17) . On the other hand, adipose derived stem cells are adult stem cells, and adult stem cells are cells that exist in small amounts in each tissue of the body. Unlike embryonic stem cells, it has limited proliferative power, so there is no possibility of cancer cell formation, and there is no ethical problem because there is no destruction of embryo. As a result, rapid research has progressed to the stage where clinical application is possible. However, since the number of stem cells available from an individual is low, culturing is difficult, and the disadvantage of being able to differentiate into only specific cells is pointed out as a limitation of the study, studies are under way to overcome this problem. In particular, since the cells that are differentiated in the stem cell sample are mixed, it is limited to be used as a cell therapy agent. Therefore, it is necessary to develop a technique capable of separating only the undifferentiated stem cells in the stem cell sample. On the other hand, a method of distinguishing aged mesenchymal stem cells from normal mesenchymal stem cells in a stem cell sample containing mesenchymal stem cells having a similar tendency to adipose derived stem cells has been disclosed (Patent Document 1).

본 발명에서 "줄기세포의 품질 관리"란 줄기세포 시료 내 다양한 줄기세포의 상태에 따라 줄기세포 시료의 현황을 파악하는 방법을 포괄적으로 의미하며, 바람직하게는 줄기세포 시료 내 미분화 상태의 줄기세포와 분화(예, 골세포 분화)가 발생한 줄기세포를 분류하는 방법에 관한 것으로, 줄기세포 시료의 줄기세포의 임상 적용(예, 세포 치료제) 이전에 분화가 발생하지 않은 미분화 상태의 줄기세포의 함량을 분석하는 과정을 의미하나, 줄기세포를 실질적으로 치료에 사용할 수 있는 요건을 분석 및 관리하는 분야라면 이에 제한되지 않는다.The term " quality control of stem cells "in the present invention means a method for grasping the status of stem cell samples according to the state of various stem cells in a stem cell sample. Preferably, the stem cells include undifferentiated stem cells The present invention relates to a method for classifying stem cells that have undergone differentiation (for example, osteoclast differentiation). The present invention relates to a method for classifying stem cells in which undifferentiated stem cells Analysis, but is not limited to, the field in which stem cells are substantially analyzed and managed for use in therapy.

본 발명에서 "판별"이란 정량 및/또는 정성 분석을 포함하는 것으로, 존재, 부존재의 검출 및 농도 측정을 포함하는 것으로 이러한 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 당업자라면 본원의 실시를 위해 적절한 방법을 선택할 수 있을 것이다. 본 발명에서의 "판별"은 바람직하게는 줄기세포 시료 내 미분화된 줄기세포 및 분화된 줄기세포에 대하여 본 발명에 따른 장치 및 이를 이용한 방법에 의해 구분하는 것을 의미하나, 줄기세포의 질(quality)을 관리할 수 있는 요소라면 이에 제한되지 않는다.In the present invention, "determination" includes quantitative and / or qualitative analysis, including detection of presence and absence and concentration measurement, and such methods are well known in the art, and those skilled in the art will appreciate that suitable methods You will be able to choose. The term "discrimination" in the present invention means to distinguish undifferentiated stem cells and differentiated stem cells in a stem cell sample by the apparatus according to the present invention and the method using the same, But is not limited thereto.

본 발명에서 "골세포 분화(osteogenic differentiation)"는 동물의 발달과정에서 나타나는 골아세포 또는 골전구세포가 분화되어 골기질을 형성하고, 상기 형성된 골기질이 석회화되어 골을 형성하는 일련의 생리적 반응인 골형성(osteogenesis) 과정 중에서 골기질을 형성하는 단계를 의미할 수도 있고, 자연적으로 또는 인위적으로 동물의 줄기세포에 분화를 유도하여 골기질을 형성하는 과정을 의미할 수도 있다.In the present invention, "osteogenic differentiation" refers to a phenomenon in which osteoblast or osteoblast differentiated in the development of an animal is differentiated to form bone matrix, and the formed bone matrix is calcified to form a bone, may refer to a step of forming bone matrix during the osteogenesis process, or may be a process of naturally or artificially inducing differentiation into animal stem cells to form bone matrix.

본 발명에서 "줄기세포 마커"란 분화가 진행되기 전의 줄기세포와 미분화된 줄기세포를 구분하여 판별할 수 있는 물질로서, 분화가 개시, 진행 또는 완료된 줄기세포에서 증가 또는 감소 양상을 보이는 단백질 또는 핵산, 지질, 당지질, 당단백질 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다.In the present invention, the term "stem cell marker" refers to a substance capable of distinguishing stem cells before differentiation from undifferentiated stem cells, wherein the protein or nucleic acid exhibiting an increase or decrease in the differentiated stem cells, , Lipids, glycolipids, glycoproteins, and the like.

본 발명에서 "RUNX2"는 전사 인자로서 골세포 분화, 뼈의 형성 및 유지에 필수적인 요소로서 골세포 분화시 발현이 증가하는 세포 마커이다(비특허문헌 18 내지 20). COLI(골분화 초기) 및 OCN(골분화 후기) 같은 다수의 골세포 특이적인 유전자는 Runx2에 의해 양성으로 조절될 수 있는 프로모터 영역 내 보존적인 Runx2-결합 영역을 포함하고 있다(비특허문헌 21 및 22).In the present invention, "RUNX2" is a cell marker that is an essential factor for osteoclast differentiation, bone formation and maintenance as transcription factor and increases expression upon bone cell differentiation (Non-Patent Documents 18 to 20). Many osteoclast-specific genes, such as COLI (early bone turnover) and OCN (late bone turnover), contain a conserved Runx2-binding region in the promoter region that can be positively regulated by Runx2 22).

본 발명에서 "CD105"는 중간엽 줄기세포의 표면 마커로서 분화가 진행되면 이의 발현이 감소되는 특징을 갖는다(비특허문헌 25 및 26). CD105의 발현 감소는 지방유래 줄기세포(ADSC) 및 중간엽 줄기세포(MSC)의 분화에 대한 일반적인 특징이 될 수 있다.In the present invention, "CD105" is a surface marker of mesenchymal stem cells, and its expression is reduced when differentiation proceeds (Non-Patent Documents 25 and 26). Decreased expression of CD105 may be a general feature of the differentiation of adipose derived stem cells (ADSC) and mesenchymal stem cells (MSC).

본 발명에서 "전기장(E)"은 공간상에서 전하를 움직이는 힘이 미치는 범위와 그 분포에 관한 것으로, 의학 분야의 연구와 함께 최근 미세 전자 기계 시스템 기술이 발전함에 따라 전기장을 이용한 의학 분야의 다양한 세포 분리 장치에 관한 연구가 이루어지고 있다. 특히, 전기장을 활용한 유전 영동(di-electrophoresis) 세포 분리 방법은 세포 자체의 전도도, 유전율 등의 특성 차이를 이용하여 세포를 분리할 수 있어 대상 세포의 손상을 피할 수 있는 장점이 있다. 한편, 전기 자극에 의한 세포 이동은 광학 현미경과 연계하여 분석하는 방법이 개발되고 있다(특허문헌 2). 본 발명에 있어서, 전기장을 적용하는 것은 전기장을 세포에게 인가하여 세포가 전기장의 영향 범위 안에 놓이는 것을 의미하며, 전기장을 적용하는 전류 발생부는 전하를 통하여 전기적인 힘을 발생하여 세포 배양부에 전기장을 형성하여 세포 배양부에 존재하는 세포에 전기력 또는 전기장을 인가 또는 적용하는 것을 의미한다.In the present invention, the term "electric field (E)" relates to the range and distribution of the force of electric charge moving in the space, and as the microelectromechanical system technology has recently developed along with the medical field, Separation devices are being studied. In particular, the di-electrophoresis cell separation method using an electric field has an advantage in that the cell can be separated using the difference in characteristics of the cell itself such as conductivity and permittivity, thereby avoiding damage to the target cell. On the other hand, a method of analyzing cell migration by electrical stimulation in conjunction with an optical microscope has been developed (Patent Document 2). In the present invention, application of an electric field means that an electric field is applied to a cell to place the cell in the influence range of the electric field. The electric current generating part applying the electric field generates an electric force through the electric charge, And applying or applying an electric or electric field to the cells present in the cell culture section.

본 발명에 따른 방법을 사용하여 줄기세포 시료에 전기장을 적용하여 미분화 상태의 줄기세포 및 분화된 줄기세포를 간편하게 판별하여 줄기세포 시료에 대한 품질을 판단할 수 있다. 특히, 지방유래 줄기세포 시료에 대하여 직류에 의해 형성되는 전기장을 적용하여 미분화 상태의 지방유래 줄기세포 및 골세포 분화된 줄기세포를 간편하고 효과적으로 판별할 수 있다.By using the method according to the present invention, it is possible to easily discriminate undifferentiated stem cells and differentiated stem cells by applying an electric field to the stem cell samples, thereby judging the quality of the stem cell samples. In particular, by applying an electric field formed by DC to an adipose-derived stem cell sample, it is possible to easily and effectively discriminate undifferentiated adipose-derived stem cells and osteocyte-differentiated stem cells.

도 1은 본 발명에 따른 줄기세포의 품질 관리 장치에 관한 것이다.
도 2는 본 발명에서 지방유래 줄기세포(ADSC) 및 골분화 과정의 지방유래 줄기세포(ADSC)의 면역형광 이미지에 관한 것이다.
도 3은 본 발명에서 전류 세기에 따른 중간엽 줄기세포(MSC)의 이동 방향 변화에 관한 것이다.
도 4는 본 발명에서 미분화 상태의 중간엽 줄기세포 및 골분화 과정의 중간엽 줄기세포의 전기장 적용시 이동 결과에 관한 것이다.
도 5는 본 발명에서 분화 유도 후 3 day, 7 day 및 14day에서 ADSC 및 골분화 과정의 ADSC에 대한 면역 형광 이미지에 관한 것이다.
도 6은 본 발명에서 분화 유도 후 3 day에서 ADSC 및 골분화 과정의 ADSC 혼합물에 대한 이동 히스토그램에 관한 것이다.
도 7은 본 발명에서 분화 유도 후 7 day에서 ADSC 및 골분화 과정의 ADSC 혼합물에 대한 이동 히스토그램에 관한 것이다.
도 8은 본 발명에서 분화 유도 후 14 day에서 ADSC 및 골분화 과정의 ADSC 혼합물에 대한 이동 히스토그램에 관한 것이다.FIG. 1 is a block diagram of an apparatus for quality control of a stem cell according to the present invention.
Fig. 2 relates to an immunofluorescence image of adipose derived stem cells (ADSC) and osteogenic differentiation-derived adipose stem cells (ADSC) in the present invention.
FIG. 3 is a graph showing changes in the direction of movement of mesenchymal stem cells (MSCs) according to current intensity in the present invention.
FIG. 4 is a graph showing the results of migration of mesenchymal stem cells in an undifferentiated state and mesenchymal stem cells in an osteogenic differentiation according to the present invention.
FIG. 5 relates to immunofluorescence images of ADSCs and ADSCs of bone differentiation processes at 3 days, 7 days, and 14 days after induction of differentiation in the present invention.
FIG. 6 relates to a moving histogram for the ADSC and the ADSC mixture of the bone differentiation process at 3 days after induction of differentiation in the present invention.
FIG. 7 relates to a moving histogram for the ADSC and the ADSC mixture of the bone differentiation process at 7 days after induction of differentiation in the present invention.
Figure 8 relates to a moving histogram for ADSC and ADSC mixture of bone differentiation process at 14 days after induction of differentiation in the present invention.

이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to the following examples. However, the following examples are illustrative of the present invention, and the contents of the present invention are not limited by the following examples.

본 발명에 따른 줄기세포의 품질 관리 장치는 줄기세포 시료 내 미분화 줄기세포 및 분화과정의 줄기세포를 판별 및/또는 분리하는 장치로서, 줄기세포 시료를 배양하고 줄기세포의 이동이 가능한 세포 배양부, 세포 배양부 외부에 장착되어 있고 줄기세포 시료 내 줄기세포에 대하여 전기장을 적용하는 전류 발생부 및 상기 세포 배양부 하단에서 줄기세포 이동의 관찰을 위한 세포 관찰부를 포함하는 분리 장치이다. 상기 전류 발생부에 의해 직류 전류를 가하면, 세포 배양부에서 줄기세포 시료 내 미분화 상태의 줄기세포 및 분화과정의 줄기세포의 방향성 및 이동 속도의 차이가 생겨 두 종류의 세포를 혼합 비율에 근접하게 판별할 수 있다. The apparatus for quality control of stem cells according to the present invention is an apparatus for discriminating and / or separating undifferentiated stem cells and differentiated stem cells in a stem cell sample. The apparatus includes a cell culture unit for culturing a stem cell sample, A current generator installed outside the cell culture unit for applying an electric field to the stem cells in the stem cell sample and a cell observing unit for observing stem cell migration at the bottom of the cell culture unit. When a direct current is applied by the current generating unit, the direction and speed of migration of undifferentiated stem cells and differentiated stem cells in the stem cell sample are differentiated in the cell culture section, and the two kinds of cells are discriminated in proximity to the mixing ratio can do.

본 발명에서 줄기세포는 성체 줄기세포로서 뇌, 골수, 말초혈액, 혈관, 근육, 피부 및 간을 포함하는 신체의 다양한 기관에서 추출한 줄기세포이고, 조혈모세포, 중간엽 줄기세포, 신경줄기세포, 지방줄기세포 중 어느 하나의 줄기세포일 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.In the present invention, stem cells are adult stem cells extracted from various organs of the body including brain, bone marrow, peripheral blood, blood vessels, muscles, skin and liver, and are stem cells derived from hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, But not limited to, a stem cell of any one of the cells.

세포 배양Cell culture

지방유래 줄기세포(ADSC, Adipose Derived Stem Cell, Lonza, Basel, Switzerland)는 지방유래 줄기세포 배양 배지(ADSCGM, Lonza)에서 배양하였다. 중간엽 줄기세포(hMSC, Human Mesenchymal Stem Cell, Lonza)는 줄기세포 배양 배지(MSCGM,Lonza)에서 배양하였다. 세포는 5% CO2 및 37℃에서 배양하였다. 그리고 이하 모든 실험에서 계대배양 7 내지 9번째의 줄기세포를 사용하였다.(ADSC, Adipose Derived Stem Cell, Lonza, Basel, Switzerland) were cultured in adipose-derived stem cell culture medium (ADSCGM, Lonza). Human mesenchymal stem cells (hMSCs) were cultured in a stem cell culture medium (MSCGM, Lonza). Cells were cultured at 37 ° C and 5% CO 2 . In all the experiments below, stem cells from the seventh to the ninth subculture were used.

면역형광Immunofluorescence 관찰 observe

지방유래 줄기세포(ADSC) 및 골세포 분화는 면역형광 염색에 의해 관찰하였다. ADSC 및 골세포 분화된 ADSC는 4% 포름알데히드를 사용하여 상온에서 30분 동안 고정시켰고 이후에 인산 완충 식염수(PBS)를 사용하여 3회 세척하였다. 0.1% Triton X-100(용매 PBS)를 상온에서 5분 동안 세포를 처리하여 투과성을 부여하였고, PBS로 3회 세척하였다. 3% 소 혈청 알부민(BSA, Bovine Serum Albumin)을 상온에서 30분 처리하여 비특이적 결합을 억제하였고, 이후에 RUNX2 1차 항체(1:100 희석, BD Transduction Laboratories TM, BD Biosciences, CA, USA)를 사용하여 4℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 이후에 세포는 PBS를 사용하여 최소한 3회 이상 세척하였고 CD-105 1차 항체(1:100 희석, BD Transduction Laboratories TM, BD Biosciences, CA, USA)를 1시간 동안 처리하였다. PBS를 사용하여 3회 세척한 후, RUNX2에 대하여 Alexa(488)(5U/ml, Invitrogen, Carsbad, CA), CD105에 대하여 염소 항-마우스 IgG 결합된 Texas Red(희석도 1:50, Santa Cruz, CA, USA)를 상온의 암 조건에서 1시간 동안 처리하였다. PBS 세척 후에, 세포는 상온의 암 조건에서 Hoechst#33258(Sigma, St, Louis, MO, USA)를 5분간 처리하였다. 이후에 슬라이드 글라스에 시딩된 세포는 형광-역상 현미경(LSM700, CarlZeiss, New York, USA) 상에 설치하여 관찰하였다.Adipogenic stem cell (ADSC) and bone cell differentiation were observed by immunofluorescence staining. ADSCs and osteoclast differentiated ADSCs were fixed with 4% formaldehyde at room temperature for 30 minutes and then washed three times with phosphate buffered saline (PBS). The cells were treated with 0.1% Triton X-100 (solvent PBS) for 5 minutes at room temperature to give permeability and washed three times with PBS. (1: 100 dilution, BD Transduction Laboratories ™, BD Biosciences, CA, USA) was used to inhibit nonspecific binding after 30 minutes of treatment with 3% bovine serum albumin (BSA) 0.0 > 4 C < / RTI > overnight. Cells were then washed at least 3 times with PBS and treated with CD-105 primary antibody (1: 100 dilution, BD Transduction Laboratories, BD Biosciences, CA, USA) for 1 hour. After washing three times with PBS, Alexa 488 (5 U / ml, Invitrogen, Carsbad, CA) was added to RUNX2, Texas Red (diluted 1:50, Santa Cruz , CA, USA) at room temperature for 1 hour. After washing with PBS, the cells were treated with Hoechst # 33258 (Sigma, St. Louis, Mo., USA) for 5 minutes at room temperature. Cells seeded on slide glass were then observed on a fluorescence-reversed-phase microscope (LSM700, Carl Zeiss, New York, USA).

골세포 분화Bone cell differentiation

지방유래 줄기세포의 골세포 분화는 정해진 계대 배양 시기(3회-5회)에서 실시하였다. 골세포 분화를 촉진하기 위해, 세포는 cm2 당 3.1x103 밀도로 75T 플라스크에 시딩하였고, ADSCGM(Lonza, Basel, Switzerland)에서 70% 내지 80%의 컨플루언스(confluence)에 도달할 때까지 배양하였다. ADSC가 서브컨플루언스에 도달했을 때, 골세포 분화를 2주 동안 실시하였고, 1주에 2회 골세포 유도 배지(Lonza, Basel, Switzerland)로 교환하였다. 음성대조군 세포는 ADSCGM에서 보존하였다. The osteocyte differentiation of adipose derived stem cells was carried out at a fixed subculture time (3 times - 5 times). To facilitate osteoclast differentiation, the cells were seeded in a 75T flask at a density of 3.1x10 3 cells per cm 2 and were maintained in ADSCGM (Lonza, Basel, Switzerland) until confluence of 70% to 80% was reached Lt; / RTI > When ADSCs reached subconfluent, osteoclast differentiation was performed for 2 weeks and replaced with bone cell induction medium (Lonza, Basel, Switzerland) twice a week. Negative control cells were preserved in ADSCGM.

골세포 분화는 면역형광 염색에 의해 줄기세포 마커(CD-105) 및 골형성 분화 마커(RUNX2)를 탐지하여 확인하였다(도 2). CD-105는 0 day 및 3 day에서 강하게 탐지되지만 RUNX2는 상기 기간(0 day 내지 3 day)에 탐지되지 않았다. RUNX2는 7 day에 탐지되었고 CD-105의 형광세기는 7 day에 감소하였다. 골세포 분화 14 day에서, RUNX2의 형광 세기는 증가하였지만 CD-105는 탐지되지 않았다. 상기 결과들을 통하여, 지방유래 줄기세포를 골형성 분화 배지를 사용하여 분화를 유도하면 7 day를 전후하여 분화가 진행되기 시작하며 14 day에 완전히 분화됨을 확인하였다.Bone cell differentiation was confirmed by immunofluorescence staining to detect stem cell markers (CD-105) and osteogenic differentiation markers (RUNX2) (FIG. 2). CD-105 was strongly detected at 0 day and 3 day, but RUNX2 was not detected during this period (0 day to 3 day). RUNX2 was detected at 7 days and the fluorescence intensity of CD-105 was decreased to 7 days. At 14 days of bone cell differentiation, the fluorescence intensity of RUNX2 increased but CD-105 was not detected. From the above results, it was confirmed that when the adipogenic stem cells were induced to differentiate using the osteogenic differentiation medium, the differentiation began to progress around 7 days and completely differentiated to 14 days.

전기 주성(Electrostatics ( ElectrotaxisElectrotaxis ))

지방유래 줄기세포 또는 골세포 분화된 지방유래 줄기세포에 직류식 전류를 적용하기 위해, 아가솔트(agarsalt) 전기주성 배양기 및 챔버 시스템을 사용하였다. 배양기 시스템에 현미경을 설치하여 세포를 실시간으로 관찰하였고, 전기주성 챔버는 세포에 직류식 전류를 부여하였다. 적절한 성장 환경(CO2 5%, 37℃)을 유지하는 배양기는 온도 및 기체 조성-조절 프로그램(CCP ver 3.8, Live Cell Instrument, Seoul, Korea)에 의해 조절하였다. 세포를 시딩한 슬라이드 글라스는 챔버 바닥에 고정하였고, 챔버 상단 및 실리콘 개스킷은 슬라이드 상단에 배치하였다. 챔버 상단의 말단부는 2% 아가-염 다리(agar-salt bridge)와 연결하였다. 챔버를 살균하기 위해, 챔버는 70% 에탄올에 담그고, 증류수(DW, Distilled Water)를 사용하여 3회 세척하였다. 세포는 3x103 밀도로 실리콘 O-ring(내부 반지름 16mm)을 설치한 슬라이드 글라스 상에 시딩하였고 CO2 배양기에서 16 내지 24시간 동안 배양하였다.Agarose electrophoresis and chamber systems were used to apply DC currents to adipose-derived stem cells or osteoblast-differentiated adipose-derived stem cells. A microscope was set up in the incubator system to observe the cells in real time, and the electroactive chamber gave a DC current to the cells. The incubator maintained the appropriate growth environment (CO 2 5%, 37 ° C) was controlled by temperature and gas composition-control program (CCP ver 3.8, Live Cell Instrument, Seoul, Korea). The cell-seeded slide glass was fixed to the bottom of the chamber, and the top of the chamber and the silicon gasket were placed on top of the slide. The distal end of the chamber top was connected with a 2% agar-salt bridge. To sterilize the chamber, the chamber was immersed in 70% ethanol and washed three times with distilled water (DW, Distilled Water). Cells were seeded onto a slide glass fitted with a silicone O-ring (inner radius 16 mm) at a density of 3 × 10 3 and cultured in a CO 2 incubator for 16-24 hours.

세포 이동 분석Cell migration assay

주문 제작한 아가염 전기주성 챔버(agarsalt electrotaxis chamber)를 현미경 상에 배치하였다. 세포 이미지는 역상 현미경(Olympus Optical Co., Ktd., Tokyo, Japan)에 부착된 CCD(Charge-coupled device) 카메라(Electric Biomedical Co. Ltd., Osaka, Japan)를 사용하여 5분마다 저장하였다. 이미지는 토모로(Tomoro) 이미지 캡쳐 프로그램을 사용하여 컴퓨터에 JPEG 파일 형태로 저장하였다. 저장된 이미지는 ImageJ 프로그램(Image J 1.37v by W.Rusband, National Institutes of Health, Betheda, MD, USA)으로 옮겼다. 이미지 분석은 매뉴얼 트래킹 및 전기주성 도구 플러그-인(v. 1.01, distributed by ibidi GmbH, Munchen, Germany)에 따라 실시하였다. 본 발명자들은 수동 추적(manuAl tracking)에 의해 XY 좌표를 획득하였다. 이후에 결과를 전기주성 플러그-인에 전달하였다. 이 도구는 세포 이동 속도의 계산에 사용하였고, x 방향성 및 세포 이동 속도를 사용하여 세포 이동 경로를 구획화(plot)하였다. 이동 속도는 세포가 자극에 대한 반응으로 얼마나 빠르게 이동하는지를 나타내는 것으로, 이동 경로의 전체 길이를 전체 관찰 시간으로 나누어서 계산하였다(비특허문헌 7 및 비특허문헌 13). 세포의 x 방향성은 세포의 시작 위치와 종료 위치 사이의 직선 길이에 의해 나눈 시작 지점과 종료 지점 사이의 x-축에 따른 직선 거리로서 정의하였다. 우측(전류의 방향)으로 직접 이동하는 세포는 1의 x-방향성을 갖는다; 좌측(전류의 반대 방향)으로 이동하는 세포는 -1의 x-방향성을 갖는다. 0에 가까운 수치는 무작위적인 세포 이동을 나타낸다. 따라서, 세포군의 평균 방향성은 세포가 어떠한 방향성으로 이동하는지에 대한 객관적인 정량결과를 제공하였다.A custom agarose electrotaxis chamber was placed on the microscope. Cell images were stored every 5 minutes using a CCD (Charge-coupled device) camera (Electric Biomedical Co. Ltd., Osaka, Japan) attached to a reversed-phase microscope (Olympus Optical Co., Ktd. The images were saved as JPEG files on a computer using the Tomoro image capture program. The stored images were transferred to the ImageJ program (Image J 1.37v by W. Rustband, National Institutes of Health, Betheda, MD, USA). Image analysis was performed according to the manual tracking and electro-optic tool plug-in (v. 1.01, distributed by ibidi GmbH, Munchen, Germany). The present inventors have obtained XY coordinates by manual tracking (manuAl tracking). The result was then passed on to the electro-active plug-in. The tool was used to calculate the cell migration rate, and the cell migration pathway was plotted using x directionality and cell migration rate. The rate of movement represents how fast the cells migrate in response to stimulation and is calculated by dividing the total length of the migration path by the total observation time (Non-Patent Document 7 and Non-Patent Document 13). The x-directionality of the cell was defined as the linear distance along the x-axis between the start and end points divided by the linear length between the cell's start and end positions. Cells moving directly to the right (direction of current) have an x-directionality of 1; Cells moving to the left (in the opposite direction of the current) have an x-directionality of -1. Numerical values near zero indicate random cell migration. Thus, the average orientation of the cell group provided an objective quantitative result as to which direction the cell migrated.

전류에 의해 유도되는 미분화 줄기세포 및 분화된 줄기세포의 지향성 이동Current-induced directional migration of undifferentiated stem cells and differentiated stem cells

본 발명자들은 전기 주성을 사용하여 미분화 hMSC 및 골세포 분화된 hMSC의 이동 패턴 변화를 분석하였다.The present inventors analyzed electrophysiological changes in migration patterns of undifferentiated hMSCs and osteoclast differentiated hMSCs.

우선, hMSC의 이동방향 설정에 적절한 세기의 전류를 설정하기 위해 다양한 직류 전류를 적용하여 방향성 및 이동 속도의 변화를 관찰하였다. 전류의 크기에 따른 세포의 이동 속도에는 변화가 없었지만, 1000 μA 및 1200 μA에서 양극(+)쪽으로의 방향성을 갖는 것을 확인하였다(도 3). 그러나 1200 μA의 전류를 계속 사용하게 되면 3시간이 지난 후에 hMSC가 전류의 방향과 직각방향으로 재배열되는 것을 확인하였다(도 3B). 상기 결과를 통하여, 단순히 직류 전류를 흘려주는 것 만으로는 세포를 분류할 수 없으며, 적절한 크기의 직류 전류를 이용하여야 줄기세포의 이동방향을 설정할 수 있다는 것을 확인하였으며, 또한, 이후 실험에는 hMSC가 양극 쪽으로 지속적인 방향성을 갖는 전류의 세기인 1000 μA를 사용하여 실험을 진행하였다. First, various direct currents were applied to set the current of the intensity appropriate to the direction of movement of the hMSC to observe the change of the directionality and the moving speed. There was no change in the cell migration rate according to the magnitude of the current, but it was confirmed that the cell had a direction toward the positive (+) side at 1000 μA and 1200 μA (FIG. 3). However, when the current of 1200 μA was continuously used, it was confirmed that the hMSC was rearranged at a right angle to the direction of the current after 3 hours (FIG. 3B). From the above results, it was confirmed that the cell can not be classified simply by flowing a DC current, and it is confirmed that the direction of movement of the stem cell can be set by using a DC current of an appropriate size. Further, in the following experiment, Experiments were carried out using 1000 μA, which is the intensity of current with constant directionality.

도 4A는 0 또는 1000 μA를 3시간 적용하여 hMSC(0 day) 및 골세포 분화된 hMSC(3 day, 7 day 및 14 day)를 추적한 결과를 나타낸 것이다. hMSC는 전류가 없으면 지향성 이동을 나타내지 않지만, 1000 μA의 전류를 적용하면 양극 방향으로 이동하였다(도 4A). 이동 속도는 hMSC에 비해 7 day 및 14 day의 골세포 분화된 hMSC에서 크게 감소하였는데, 이동 속도는 전류의 영향을 받지 않았다(도 4B). 도 4C는 전류를 처리한 그룹의 x 방향성이 전류를 처리하지 않은 미분화 상태의 0 day에 비해 크게 증가함을 나타내고 있다. 14 day에서, x 방향성은 1000 μA의 미분화 상태(0 day)에 비해 증가하였다(도 4C). 이러한 결과는 hMSC의 골세포 분화가 진행됨에 따라 전기장 내 방향성을 갖게 된다는 것을 확인하였다. 하지만, 직류 전류에 의한 이동속도의 변화는 관찰되지 않았다.FIG. 4A shows the results of hMSC (0 day) and osteoclast differentiated hMSC (3 days, 7 days and 14 days) by applying 0 or 1000 μA for 3 hours. The hMSC showed no directional movement without current, but shifted toward the anode when a current of 1000 μA was applied (FIG. 4A). The migration rate was significantly reduced in the osteoclast differentiated hMSCs of 7 days and 14 days compared to the hMSC, and the migration rate was not influenced by the current (Fig. 4B). FIG. 4C shows that the x directionality of the current-processed group is greatly increased compared to 0 day in the undifferentiated state in which the current is not processed. At 14 days, the x directionality increased compared to the undifferentiated state (0 day) of 1000 μA (FIG. 4C). These results confirmed that the osteoblast differentiation of hMSC leads to the directionality in the electric field. However, no change in the moving speed due to the direct current was observed.

전기 주성 분석에 의한 지방줄기세포(Electrophoretic analysis of adipose stem cells ( ADSCADSC ) 및 분화된 지방줄기세포() And differentiated adipose stem cells ( ADSCADSC )의 구분) Classification

골세포 분화된 ADSC의 세포군을 구분하기 위해, 미분화 ADSC 및 골세포 분화된 ADSC를 10:0, 7:3, 5:5, 3:7, 및 0:10의 비율로 혼합하였다. 도 5는 상기 혼합된 세포군 내 골세포 분화된 ADSC 세포의 형광 이미지를 나타낸 것이다. 혼합물의 이질성은 분화 3 day에서는 관찰되지 않지만, 골세포 분화된 ADSC는 7 day 및 14 day에 RUNX2(녹색) 및 CD-105 마커에 의해 탐지되었다(도 5). In order to distinguish the cell groups of osteoclast differentiated ADSCs, undifferentiated ADSCs and osteoclast differentiated ADSCs were mixed at a ratio of 10: 0, 7: 3, 5: 5, 3: 7, and 0:10. FIG. 5 shows fluorescence images of osteoclast differentiated ADSC cells in the mixed cell group. The heterogeneity of the mixture was not observed at 3 days of differentiation, but osteoclast differentiated ADSCs were detected by RUNX2 (green) and CD-105 markers at 7 days and 14 days (FIG. 5).

ADSC의 분화된 세포군의 전기장 내 방향성에 대한 특징을 분석하기 위해 이동 속도의 히스토그램을 사용하였다. 미분화 ADSC와 골분화 과정의 ADSC를 일정한 비율로 혼합하여 직류 전기장 내에서의 이동 변화를 분석한 결과, 세포의 조합(미분화 ADSC 및 골분화 과정의 ADSC의 비율)과 직류 전기장 내에서 이동 비율이 일치함을 관찰하였고, 이를 이용해 미분화 ADSC와 골분화 과정의 ADSC의 population을 분석할 수 있는 가능성을 확인하였다.A histogram of the migration rate was used to characterize the intramolecular directionality of the differentiated cell populations of ADSCs. The undifferentiated ADSCs and the ADSCs of the bone differentiation process were mixed at a constant ratio and the migration changes in the DC electric field were analyzed. As a result, the combination of cells (proportion of undifferentiated ADSCs and osteogenic differentiation of ADSCs) And the possibility of analyzing the population of undifferentiated ADSCs and of the ADSCs of bone differentiation process was confirmed.

상기 결과에 대하여 자세히 설명하면, 미분화 줄기세포(ADSC)와 골분화 과정의 줄기세포(ADSC)의 이동에 대한 히스토그램을 분석할 때 계급 구간(x 축)은 하기와 같이 설정하였다.Describing the above results in detail, when analyzing histograms of migration of undifferentiated stem cells (ADSC) and stem cell (ADSC) in bone differentiation process, the class interval (x axis) was set as follows.

계급구간={최대 이동 속도(Max speed)-최소 이동 속도(Min speed)}/총 세포 수(total cell number)Rank section = {Max speed - Min speed} / total cell number

공백(Gap) 구간은 세포 빈도(frequency)가 '0'인 계급 구간이 전체 계급 구간의 5% 이상 연속적으로 나타나는 구간을 의미하며, 이러한 구간이 여러 개일 경우 전체 세포의 이동 속도의 평균 값과 가장 가까운 공백 구간을 선택하고, 선택된 공백 구간의 평균 계급 구간과 가장 가까운 계급구간을 컷오프(cut off) 구간으로 설정하였다. 컷오프 구간을 기준으로 우측(이동 속도가 상대적으로 빠른 구간) 구역이 미분화된 줄기세포이고 좌측 구역이 골세포 분화과정의 줄기세포에 관한 것이다.Gap interval refers to a period in which a class interval with a frequency of '0' continuously occurs at 5% or more of the entire class interval, and when there are several intervals, A near blank interval is selected and the closest class interval to the average class interval of the selected blank interval is set as a cut off interval. On the basis of the cutoff region, the right side (region with a relatively high speed of movement) is a undifferentiated stem cell, and the left side is about a stem cell of bone cell differentiation process.

도 6은 3 day에서 ADSC 및 골세포 분화된 ADSC 혼합물의 히스토그램을 나타내었다. 도 6에 나타난 바와 같이, 적색으로 표시된 공백(gap) 구간을 기준으로 세포를 분류하여 보면 7:3으로 혼합한 경우 미분화된 ADSC는 0 μA에서 40%, 1,000 μA에서 5%, 5:5로 혼합한 경우에는 전류에 따라 각각 15%, 5%, 3:7로 혼합한 경우에는 5%, 및 20%로 세포가 분류되는 것을 확인할 수 있고, 이를 통하여 각 조건에서 히스토그램 내 골세포 분화된 세포의 비율은 혼합 비율과 일치하지 않는 것을 확인하였다(도 6). 하지만, 7 day 및 14 day 골분화 ADSC의 경우에는 1000 μA 그룹에서 공백 구간으로 구분되는 세포의 분포가 골분화 ADSC의 분포(혼합 비율)과 유사한 것을 확인하였다 (도 7 - 7 day, 도 8 - 14 day). 특별히 7 day 골분화 ADSC의 경우에는 1000 μA의 전류를 흘려주었을 때 높은 정확도를 가지고 미분화 줄기세포와 분화 단계의 줄기세포로 분류되는 것을 확인할 수 있었다. 상기 결과들을 통하여, 분화상태의 세포가 없는 3 day에서는 세포의 분류가 이루어지지 않았지만, 7 day 이상의 분화가 진행된 세포에서는 분류가 가능하다는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 전기장을 이용하여 줄기세포의 이동 분석에 의해 ADSC와 골세포 분화된 ADSC의 구분이 가능함을 제시하였다. Figure 6 shows the histogram of ADSC and osteoclast differentiated ADSC mixture at 3 days. As shown in FIG. 6, when the cells were classified based on the red gap, when the cells were mixed at 7: 3, the undifferentiated ADSC was 40% at 0 μA, 5% at 1,000 μA, and 5: 5 In the case of mixing, the cells were classified into 15%, 5%, and 5% and 20%, respectively, when they were mixed at currents of 3: 7 and 15%, respectively. Was not consistent with the blending ratio (Fig. 6). However, in 7 day and 14 day bone marrow-derived ADSCs, it was confirmed that the distribution of cells classified as blank intervals in the 1000 μA group was similar to that of bone-differentiated ADSCs (FIG. 7 - 7 day, 14 day). Especially, in the case of ADSC of 7 day bone morphogenesis, it was confirmed that stem cells were classified into undifferentiated stem cells and differentiated stem cells with high accuracy when a current of 1000 μA was flowed. From the above results, it was confirmed that the cells could not be classified in the 3 days without the differentiated cells but in the cells differentiated more than 7 days. These results suggest that it is possible to distinguish ADSCs from osteoclast differentiated ADSCs by analyzing the migration of stem cells using electric fields.

통계 분석Statistical analysis

실험 결과는 평균±표준 편차(SEM)로 나타내었다. 평균은 스튜던트 테스트(student's t test)의 1원 분석을 사용하여 비교하였다. P<0.05인 값은 통계적으로 유의한 것으로 판단하였다.The experimental results are expressed as mean ± standard deviation (SEM). The averages were compared using a one-way analysis of student's t test. P <0.05 was considered statistically significant.

본 명세서에서 인용한 모든 참조문헌, 기사, 공보 및 특허 및 특허 출원이 온전히 본 명세서에 참조로 병합되어 있다. 따라서, 하기 청구의 범위의 진의 및 범주는 상기한 바람직한 실시형태의 설명에 제한되어서는 안 된다.All references, articles, publications and patents and patent applications cited herein are hereby incorporated by reference in their entirety. Accordingly, the spirit and scope of the following claims should not be limited to the description of the preferred embodiments described above.

①: 세포 배양부
②: Agar-salt bridge가 연결된 전류 발생부
③: 세포 관찰부①: Cell culture section
②: Current generating part connected with agar-salt bridge
③: Cell observation section

Claims (18)

(a) 줄기세포 시료에 직류에 의해 형성된 전기장을 적용하는 단계; 및
(b) 상기 전기장에 의한 줄기세포의 이동 속도 및 방향성의 차이에 의해 줄기세포를 판별하는 단계를 포함하며,
여기서
상기 판별은
(i) 줄기세포의 최대 이동 속도(maximum speed)와 최소 이동 속도(minimum speed)의 차를 총 세포 수(total cell number)로 나누어 계급 구간을 설정하는 단계;
(ii) 상기 계급 구간 중 세포 빈도(frequency)가 "0"인 계급 구간이 총 계급 구간의 5% 이상 연속적으로 나타나는 구간을 공백(gap) 구간으로 설정하는 단계; 및
(iii) 상기 공백 구간 내에서 줄기세포 이동 속도의 평균 값과 가장 가까운 계급 구간을 컷오프(cut off)로 설정하는 단계를 포함하는, 줄기세포의 품질 관리(quality control) 방법.
(a) applying an electric field formed by direct current to a stem cell sample; And
(b) determining the stem cell by the difference in the moving speed and direction of the stem cell by the electric field,
here
The above-
(i) setting a class interval by dividing a difference between a maximum speed and a minimum speed of a stem cell by a total cell number;
(ii) setting a period in which a class interval in which the frequency of a cell frequency is 0 in the class interval continuously occurs by 5% or more of the total class interval as a gap interval; And
(iii) setting a cutoff period that is closest to an average value of the stem cell migration rate within the blank interval as a cut off.
제 1항에 있어서,
상기 판별은 미분화 상태의 줄기세포 및 분화 과정의 줄기세포를 판별하는 것을 특징으로 하는, 줄기세포의 품질 관리 방법.
The method according to claim 1,
Wherein said discrimination discriminates stem cells in an undifferentiated state and stem cells in a differentiation process.
제 2항에 있어서,
상기 줄기세포는 배아 줄기세포, 조혈모세포, 중간엽 줄기세포, 신경줄기세포, 및 지방줄기세포를 포함하는 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 줄기세포의 품질 관리 방법.
3. The method of claim 2,
Wherein the stem cell is any one selected from the group consisting of embryonic stem cells, hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, neural stem cells, and adipose stem cells.
제 1항에 있어서,
단계 (iii) 후에, (iv) 상기 컷오프 값보다 빠른 속도 구간 내의 줄기세포는 미분화 상태의 줄기세포로, 느린 속도 구간 내의 줄기세포는 분화 과정의 줄기세포로 판별하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 줄기세포의 품질 관리(quality control) 방법.
The method according to claim 1,
And (iv) after step (iii), (iv) the stem cell in the velocity section earlier than the cutoff value is a stem cell in undifferentiated state, and the stem cell in the slow speed section is a stem cell in differentiation process , A method of quality control of stem cells.
제 1항에 있어서,
상기 방향성은 분화 과정의 줄기세포가 미분화 상태의 줄기세포에 비해 더 높은 것을 특징으로 하는, 줄기세포의 품질 관리 방법.
The method according to claim 1,
Wherein the directionality is higher in the stem cells of the differentiation process than in the undifferentiated stem cells.
제 5항에 있어서,
상기 방향성은 양극(cathode) 방향인 것을 특징으로 하는, 줄기세포의 품질 관리 방법.
6. The method of claim 5,
Wherein said directionality is in the direction of the cathode.
제 1항에 있어서,
상기 직류는 900 μA 내지 1100 μA 인 것을 특징으로 하는, 줄기세포의 품질 관리 방법.
The method according to claim 1,
Wherein the direct current is 900 μA to 1100 μA.
제 2항에 있어서,
상기 분화 과정의 줄기세포의 이동 속도는 분화가 진행됨에 따라 감소하는 것을 특징으로 하는, 줄기세포의 품질 관리 방법.
3. The method of claim 2,
Wherein the rate of migration of the stem cells in the differentiation process is decreased as the differentiation progresses.
미분화 줄기세포 및 분화과정의 줄기세포를 포함하는 줄기세포 시료를 배양하고 줄기세포의 이동이 가능한 세포 배양부;
상기 세포 배양부 외부에 장착되어 있고 줄기세포 시료 내 줄기세포에 전기장을 적용하는 전류 발생부; 및
상기 세포 배양부 하단에서 줄기세포 이동의 관찰을 위한 세포 관찰부를 포함하는 줄기세포의 품질 관리 장치로서,
상기 장치는 줄기세포의 방향성 및 이동 속도에 의해 형성되는 공백 구간 내 컷오프 구간을 기준으로 줄기세포를 판별하고,
상기 공백 구간은 세포 빈도(frequency)가 0인 계급 구간이 전체 계급 구간 내 5% 이상 연속으로 나타나는 구간이며 상기 컷오프는 상기 공백 구간 내에서 전체 줄기세포 이동 속도의 평균 값과 가까운 계급 구간인 것을 특징으로 하는, 줄기세포의 품질 관리 장치.
A cell culture unit capable of culturing a stem cell sample containing undifferentiated stem cells and differentiation stem cells and capable of stem cell migration;
A current generator installed outside the cell culture unit and applying an electric field to the stem cells in the stem cell sample; And
And a cell observation unit for observing stem cell migration at the lower end of the cell culture unit,
The apparatus identifies stem cells based on the cutoff interval in the blank section formed by the directionality and the moving speed of the stem cells,
Wherein the empty interval is a period in which a class interval in which the frequency of the cell is 0 is continuously in a range of 5% or more in the entire class interval and the cutoff is a class interval close to the average value of the total stem cell movement rate in the blank interval Wherein the stem cell is a stem cell.
제 9항에 있어서,
상기 장치는 줄기세포의 방향성 및 이동 속도에 의해 형성되는 공백 구간 내 컷오프 구간을 기준으로 줄기세포를 판별하는 것을 특징으로 하는, 줄기세포의 품질 관리 장치.
10. The method of claim 9,
Wherein the apparatus identifies stem cells based on a cut-off interval in a blank section formed by the direction and the moving speed of the stem cell.
삭제delete 제9항에 있어서,
상기 계급 구간은 세포의 이동 속도 중 가장 빠른 속도와 가장 느린 속도의 차이를 총 세포수로 나누어서 설정하는 것을 특징으로 하는, 줄기세포의 품질 관리 장치.
10. The method of claim 9,
Wherein the class interval is set by dividing the difference between the fastest and slowest speeds of the cell moving speed by the total number of cells.
제 10 항에 있어서,
상기 판별은 상기 컷오프 구간보다 이동 속도가 빠른 줄기세포는 미분화 줄기세포로 판별하고 이동 속도가 느린 줄기세포는 분화 과정의 줄기세포로 판별하는 것을 특징으로 하는, 줄기세포의 품질 관리 장치.
11. The method of claim 10,
Wherein the discriminating step determines that the stem cell having a faster moving speed than the cutoff section is an undifferentiated stem cell and the stem cell having a slow moving speed is a stem cell of a differentiation process.
제 9항에 있어서,
상기 줄기세포는 배아줄기세포, 조혈모세포, 중간엽 줄기세포, 신경줄기세포, 및 지방줄기세포를 포함하는 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 줄기세포의 품질 관리 장치.
10. The method of claim 9,
Wherein the stem cell is any one selected from the group consisting of embryonic stem cells, hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, neural stem cells, and adipose stem cells.
제 10항에 있어서,
상기 방향성은 분화 과정의 줄기세포가 미분화 상태의 줄기세포에 비해 더 높은 것을 특징으로 하는, 줄기세포의 품질 관리 장치.
11. The method of claim 10,
Wherein the directionality of the stem cell of the differentiation process is higher than that of the undifferentiated stem cell.
제 15항에 있어서,
상기 방향성은 양극 방향인 것을 특징으로 하는, 줄기세포의 품질 관리 장치.
16. The method of claim 15,
Wherein the directionality is an anode direction.
제 9항에 있어서,
상기 전류는 900 μA 내지 1100 μA의 직류인 것을 특징으로 하는, 줄기세포의 품질 관리 장치.
10. The method of claim 9,
Wherein the current is a direct current of 900 μA to 1100 μA.
제 9항에 있어서,
상기 분화 과정의 줄기세포의 이동 속도는 분화가 진행됨에 따라 감소하는 것을 특징으로 하는, 줄기세포의 품질 관리 장치.10. The method of claim 9,
Wherein the rate of migration of the stem cells in the differentiation process decreases as the differentiation progresses.
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