KR101891655B1 - Drug delivery system comprising phenylboronic acid conjugated polymer - Google Patents

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Abstract

본 발명은 소수성 약물도 수용성 용매에서 효과적으로 용해시킬 수 있고, 생체 적합성이 우수하며, 자극 반응성에 의해 종양 특이적으로 효율적인 약물전달이 가능한 약물전달체 및 이를 이용한 나노구조체에 관한 것이다. The present invention relates to a drug delivery system capable of effectively dissolving a hydrophobic drug in a water-soluble solvent, excellent in biocompatibility, and capable of drug-specific and efficient drug delivery by stimulus responsiveness, and a nanostructure using the drug delivery system.

Description

페닐보론산이 결합된 고분자를 포함하는 약물 전달체{Drug delivery system comprising phenylboronic acid conjugated polymer}BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention [0001] The present invention relates to a drug delivery system comprising a polymer bound to a phenylboronic acid,

본 발명은 페닐보론산 결합된 고분자를 활용한 약물 전달체 및 약물 전달 시스템에 관한 것이다. The present invention relates to a drug delivery system and a drug delivery system using a phenylboronic acid-bonded polymer.

최근 들어 자연에서 합성되어 존재하는 천연물을 이용한 약물 개발에 대한 연구가 활발하다. 연구의 결과로 예를 들어 살리실산(salicylic acid)과 같은 해열 및 진통제에서 파클리탁셀(paclitaxel), 빈블라스틴(vinblastine)이나 캄토테신(camptothecin)과 같은 항암제에 이르기까지 많은 약물이 상품화되어 판매되고 있다. Recently, research on the development of drugs using natural materials synthesized in nature is actively conducted. As a result of research, many drugs have been commercialized, for example, from antipyretics such as salicylic acid and analgesics to anticancer agents such as paclitaxel, vinblastine and camptothecin.

이러한 약물의 개발도 중요하나, 약물마다 각기 서로 다른 성질을 가지고 있어 약물을 투여하는 방법이나 전달하기 위한 매체의 선택도 중요하다. 특히, 소수성 항암제들은 수용성 매질에 쉽게 용해되지 않아 계면활성제나 유기 용매를 사용하여야 하는데, 이러한 가용화제(solubilizing agent)는 심각한 용혈을 유발할 수 있고 나아가 만성적인 독성의 염려가 있다. 그리하여, 소수성 항암제들의 전달 효율은 높이면서 부작용이 적은 여러 약물 전달체 및 약물 전달 시스템의 개발도 약물 개발 못지 않게 중요하다. 소수성 항암제를 전달하기 위한 전달체로 리포좀, 고분자 마이셀이나 유기 나노입자를 적용하는 등 여러 유형이 있다. 예를 들어, 한국 공개특허 제2012-0089892호나 제2001-0010393호와 같은 특허에서 소수성 약물 전달을 위한 고분자 전달체를 개시하고 있다. The development of these drugs is also important, but each drug has different properties, so it is important to select the medium to administer the drug or deliver it. Particularly, hydrophobic anticancer agents are not easily dissolved in a water-soluble medium, so surfactants or organic solvents should be used. Such solubilizing agents can cause serious hemolysis and furthermore, there is a concern about chronic toxicity. Thus, the development of various drug delivery systems and drug delivery systems that increase the delivery efficiency of hydrophobic anticancer drugs and have fewer side effects is as important as drug development. There are many types, such as liposome, macromolecule micelle and organic nanoparticles, as a delivery vehicle for delivering hydrophobic anticancer drugs. For example, Korean Patent Laid-Open Publication No. 2008-0089892 or No. 2001-0010393 discloses a polymeric carrier for hydrophobic drug delivery.

한국 공개특허 제2012-0089892호Korea Patent Publication No. 2012-0089892

본 발명은 독성 용매 등을 사용하지 않고 종양 특이적으로 소수성 천연 약물을 전달할 수 있는 전달체 및 시스템을 제공한다.The present invention provides a delivery system and a system capable of delivering a tumor-specific natural hydrophobic drug without using a toxic solvent or the like.

본 발명은 말레산 무수물 중합체에 페닐보론산이 결합되어 형성된 중합체를 포함하는 약물 전달체 및 약물 전달 시스템를 제공한다. The present invention provides a drug delivery system and a drug delivery system comprising a polymer formed by coupling phenylboronic acid to a maleic anhydride polymer.

본 발명은 말레산 무수물 중합체에 페닐보론산이 결합되어 형성된 중합체를 포함하는 약물 전달체와 약물이 결합하고, 페닐보론산 및 약물의 소수성 상호작용 의해 자가 조립(self-assembly)되어 형성되는 나노구조체를 제공한다. The present invention provides a nanostructure formed by self-assembly of a drug carrier comprising a polymer formed by coupling phenylboronic acid to a maleic anhydride polymer and a drug, and by the hydrophobic interaction of phenylboronic acid and drug do.

본 발명의 약물 전달체 및 이를 포함하는 나노구조체는 독성 용매나 촉매를 사용하지 않고 합성이 용이하다. 그리고, 본 발명의 약물 전달체 및 이를 포함하는 나노구조체는 종양 특이적으로 효율적인 약물 전달이 가능하여 암치료뿐만 아니라 면역 치료에도 유용하게 사용할 수 있다. The drug delivery system of the present invention and the nanostructure containing the drug delivery system are easily synthesized without using a toxic solvent or a catalyst. The drug delivery system of the present invention and the nanostructure including the drug delivery system of the present invention can efficiently deliver drug to the tumor, and thus can be useful not only for cancer treatment but also for immunotherapy.

도 1은 페닐보론산이 결합된 말레산 무수물 중합체인 pPBA(poly(phenylbo ronic acid-co-maleic anhydride))의 합성을 나타낸다.
도 2에서 a)는 pPBA(poly(phenylboronic acid-co-maleic anhydride)), b)는 pMAnh(Poly(methyl vinyl ether-alt-maleic anhydride), c)는 PBA-NH2의 1H NMR을 나타낸다.
도 3은 pPBA(poly(phenylboronic acid-co-maleic anhydride)), pMAnh(Poly(methyl vinyl ether-alt-maleic anhydride) 및 PBA-NH2의 FT-IR을 나타낸다.
도 4는 안드로그라폴라이드(AND), pPBA(poly(phenylboronic acid-co-maleic anhydride)), pMAnh(Poly(methyl vinyl ether-alt-maleic anhydride), PBA-NH2, 안드로그라폴라이드 몰비가 1:1인 나노구조체(pPBA-AND 1:1 complex) 및 페닐보론산과 안드로그라폴라이드 몰비가 2:1인 나노구조체(pPBA-AND 2:1 complex)의 용해 정도(a)) 및 용해도 차이(b))를 나타낸다.
도 5는 pPBA(poly(phenylboronic acid-co-maleic anhydride)), 안드로그라폴라이드 몰비가 1:1인 나노구조체(pPBA-AND 1:1 complex) 및 페닐보론산과 안드로그라폴라이드 몰비가 2:1인 나노구조체(pPBA-AND 2:1 complex)의 제타 포텐셜(a))와 pH 변화에 따른 평균 크기 변화(b) 내지 d))를 나타낸다.
도 6은 페닐보론산과 안드로그라폴라이드 몰비가 2:1인 나노구조체(pPBA-AND 2:1 complex)의 크기변화를 나타내는 것으로, a)는 pH 7.4일때이고, b)는 pH 5.0일때 이고, c)는 pH 7.5 및 5mM ATP 일때 이며, 스케일 바(scale bar)는 0.5㎛이다.
도 7은 pPBA(poly(phenylboronic acid-co-maleic anhydride)), 안드로그라폴라이드(AND), 안드로그라폴라이드 몰비가 1:1인 나노구조체(pPBA-AND 1:1 complex) 및 페닐보론산과 안드로그라폴라이드 몰비가 2:1인 나노구조체(pPBA-AND 2:1 complex)의 투여량에 따른 세포 독성을 나타내는 것으로, a)는 MCF-7 세포에서의 세포 독성이고, b)는 PC-3 세포에서의 세포독성이다.
도 8은 안드로그라폴라이드(AND) 및 페닐보론산과 안드로그라폴라이드 몰비가 2:1인 나노구조체(pPBA-AND 2:1 complex)의 컴피티션 어세이를 나타내는 것으로 a)는 MCF-7 세포에서의 어세이 결과이고, b)는 PC-3 세포에서의 어세이 결과이다.
도 9는 pPBA(poly(phenylboronic acid-co-maleic anhydride)), 안드로그라폴라이드 몰비가 1:1인 나노구조체(pPBA-AND 1:1 complex) 및 페닐보론산과 안드로그라폴라이드 몰비가 2:1인 나노구조체(pPBA-AND 2:1 complex)의 세포 유입 차이(a)) 및 CLSM 사진(b))을 나타낸다.
도 10은 pPBA(poly(phenylboronic acid-co-maleic anhydride)), 안드로그라폴라이드 몰비가 1:1인 나노구조체(pPBA-AND 1:1 complex) 및 페닐보론산과 안드로그라폴라이드 몰비가 2:1인 나노구조체(pPBA-AND 2:1 complex)의 생체내 분포를 나타낸다.
도 11는 살린(saline), pPBA(poly(phenylboronic acid-co-maleic anhydride)), 안드로그라폴라이드(AND), 페닐보론산과 안드로그라폴라이드 몰비가 1:1인 나노구조체(pPBA-AND 1:1 complex) 및 페닐보론산과 안드로그라폴라이드 몰비가 2:1인 나노구조체(pPBA-AND 2:1 complex)를 종양 이식된 마우스에 처리한 후 종양 부피 변화(a))와 마우스 몸무게 변화(b))를 나타낸다.
도 12은 살린(saline), pPBA(poly(phenylboronic acid-co-maleic anhydride)), 안드로그라폴라이드(AND), 페닐보론산과 안드로그라폴라이드 몰비가 1:1인 나노구조체(pPBA-AND 1:1 complex) 및 페닐보론산과 안드로그라폴라이드 몰비가 2:1인 나노구조체(pPBA-AND 2:1 complex)를 종양 이식된 마우스에 처리한 후 종양 무게 변화(a))와 종양의 모습(b))을 나타낸다.
도 13은 pPBA(poly(phenylboronic acid-co-maleic anhydride)), 안드로그라폴라이드(AND), 안드로그라폴라이드 몰비가 1:1인 나노구조체(pPBA-AND 1:1 complex) 및 페닐보론산과 안드로그라폴라이드 몰비가 2:1인 나노구조체(pPBA-AND 2:1 complex)의 용혈 정도를 나타낸다. Figure 1 shows the synthesis of boronic acid bound maleic anhydride polymer, p PBA (poly (phenylbo ronic acid -co-maleic anhydride)).
In Figure 2 a) is p PBA (poly (phenylboronic acid- co-maleic anhydride)), b) is pMAnh (Poly (methyl vinyl ether- alt-maleic anhydride), c) is the 1 H NMR of the PBA-NH 2 .
3 is a p PBA (poly (phenylboronic acid- co-maleic anhydride)), pMAnh (Poly ( shows the FT-IR of the methyl vinyl ether-alt-maleic anhydride ) and PBA-NH 2.
4 is androsta Gras polite (AND), p PBA (poly (phenylboronic acid-co-maleic anhydride)), pMAnh (Poly (methyl vinyl ether-alt-maleic anhydride), PBA-NH 2, androsta Gras polite molar ratio (PPBA-AND 2: 1 complex) having a molar ratio of phenylboronic acid and andrographolide of 2: 1 and a solubility (a degree of solubility) of a nanostructure (pPBA-AND 1: Difference (b)).
FIG. 5 is a graph showing the relationship between the molar ratio of phenylboronic acid and andrographolide (pPBA-AND 1: 1 complex) having a 1: 1 molar ratio of p- PBA (phenylboronic acid-co-maleic anhydride) : Zeta potential (a) of one nanostructure (pPBA-AND 2: 1 complex) and average size change (b) to d) with pH change.
FIG. 6 shows the change in the size of a nanostructure (pPBA-AND 2: 1 complex) having a molar ratio of phenylboronic acid to andrographolide of 2: 1, wherein a) is at pH 7.4, b) is at pH 5.0, c) is at pH 7.5 and 5 mM ATP, and the scale bar is 0.5 탆.
7 is a p PBA (poly (phenylboronic acid- co-maleic anhydride)), androsta Gras polite (AND), androsta Gras polite molar ratio of 1: 1 nanostructures (pPBA-AND 1: 1 complex ) , and phenylboronic (A) is the cytotoxicity in MCF-7 cells, and b) is the cytotoxicity in PC (1: 1) complexes with a 2: 1 nano structure (pPBA-AND 2: -3 < / RTI > cells.
Figure 8 shows a competition assay of a 2: 1 nano structure (pPBA-AND 2: 1 complex) with a molar ratio of andrographolide (AND) and phenylboronic acid to andrographolide, a) in MCF-7 cells , And b) is the result of assay in PC-3 cells.
FIG. 9 is a graph showing the relationship between the molar ratio of phenylboronic acid and andrographolide (pPBA-AND 1: 1 complex) having a 1: 1 molar ratio of p- PBA (phenylboronic acid-co-maleic anhydride) : Difference in cell migration (a) of a 1 nano-construct (pPBA-AND 2: 1 complex) and CLSM photograph (b).
10 is a p PBA (poly (phenylboronic acid- co-maleic anhydride)), androsta Gras polite molar ratio of 1: 1 nanostructures (pPBA-AND 1: 1 complex ) , and phenyl are acid there androsta Gras polite molar ratio 2 : 1 shows the in vivo distribution of the nanostructure (pPBA-AND 2: 1 complex).
Figure 11 is utilized (saline), p PBA (poly (phenylboronic acid-co-maleic anhydride)), androsta Gras polite (AND), phenylboronic 1 acid androsta Gras polite molar ratio: 1 nanostructures (pPBA-AND (PPBA-AND 2: 1 complex) with a 2: 1 molar ratio of phenylboronic acid and anorograpolide was administered to a tumor-transplanted mouse, and the tumor volume change (a) and mouse weight change (b)).
FIG. 12 is a graph showing the relationship between the ratio of the number of the nano-structures (pPBA-AND) of 1: 1 molar ratio of saline, p- PBA (phenylboronic acid-co-maleic anhydride), andrographolide (AND), phenylboronic acid and andrographolide (PPBA-AND 2: 1 complex) with a 2: 1 molar ratio of phenylboronic acid and a 1: 1 complex, and the tumor weight change (a) (b)).
13 is a p PBA (poly (phenylboronic acid- co-maleic anhydride)), androsta Gras polite (AND), androsta Gras polite molar ratio of 1: 1 nanostructures (pPBA-AND 1: 1 complex ) , and phenylboronic The degree of hemolysis of the 2: 1 nanostructure (pPBA-AND 2: 1 complex) with acid and andrographolide molar ratio is shown.

이하에서 본 발명에 대하여 구체적으로 설명한다. 본 발명에 대한 설명 및 도면에서는 발명의 요지를 흐릴 수 있는 공지의 내용은 기재를 생략할 수 있고, 본 발명을 이해를 돕기 위해 도면 구성의 일부는 과장 또는 생략될 수 있으며, 본 명세서 따로 정의하지 않는 용어에 대하여는 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 일반적으로 이해할 수 있는 의미로 해석되어야 할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in detail. In the description and drawings of the present invention, it is to be understood that the present invention may be practiced otherwise without departing from the spirit and scope of the present invention. For the purpose of facilitating understanding of the present invention, some of the drawings may be exaggerated or omitted, It is to be understood that the terminology used herein is to be interpreted in a general sense to a person having ordinary skill in the art to which the present invention belongs.

본 발명은 페닐보론산(phenylboronic acid)이 결합된 고분자 중합체를 이용하여 소수성 약물을 종양 특이적으로 전달하기 위한 약물 전달체 및 이를 이용한 나노구조체에 관한 것이다. The present invention relates to a drug delivery system for tumor-specific delivery of a hydrophobic drug using a polymer polymer to which phenylboronic acid is coupled, and a nanostructure using the drug delivery system.

본 발명에서 고분자는 석신산 무수물 모이어티(moiety)를 포함하고 있는 말레산 무수물 중합체가 바람직하며, 페닐보론산이 석신산 무수물 모이어티와 결합하여 약물 결합 부위를 형성할 수 있다. In the present invention, the polymer is preferably a maleic anhydride polymer containing a succinic anhydride moiety, and the phenylboronic acid may bond with a succinic anhydride moiety to form a drug-binding site.

본 발명에서 페닐보론산이 결합하는 고분자는 (Poly(methyl vinyl ether-alt-maleic anhydride), pMAnh)계열의 고분자가 바람직하나 가수분해 후 수용성이고 석신산 무수물 모이어티를 포함하고 있는 고분자라면 제한되지 않고 사용할 수 있다.In the present invention, the polymer to which phenylboronic acid binds is preferably a polymer of (poly (methyl vinyl ether-alt-maleic anhydride), pMAnh) series, but it is not limited as long as it is a polymer containing a succinic anhydride moiety after water- Can be used.

본 발명에서 페닐보론산이 결합하는 고분자의 분자량은 2kDa 내지 1000kDa, 10kDa 내지 1000kDa, 100kDa 내지 800kDa, 200kDa 내지 600kDa, 200kDa 내지 500kDa, 200kDa 내지 400kDa 바람직하게는 250kDa 내지 350kDa이나 이에 제한되지 않는다. In the present invention, the molecular weight of the polymer to which phenylboronic acid binds is not limited to 2 kDa to 1000 kDa, 10 kDa to 1000 kDa, 100 kDa to 800 kDa, 200 kDa to 600 kDa, 200 kDa to 500 kDa, 200 kDa to 400 kDa, and preferably 250 kDa to 350 kDa.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 아래 [화학식 1]로 표현되는 폴리 메틸 비닐 에터-알트-말레산 무수물(Poly(methyl vinyl ether-alt-maleic anhydride), pMAnh)에 페닐보론산이 결합하여 중합체를 합성할 수 있다.According to one embodiment of the present invention, phenylboronic acid is bonded to polymethyl vinyl ether-alt-maleic anhydride (pMAnh) represented by the following formula (1) Can be synthesized.

[화학식 1][Chemical Formula 1]

Figure 112016047074597-pat00001
Figure 112016047074597-pat00001

(n은 20 내지 5000이다.)(n is 20 to 5000).

본 발명의 일 실시예에 따르면, 말레산 무수물 모이어티를 포함하고 있는 고분자에 페닐보론산을 결합하기 위해서 아민기가 결합된 아미노 페닐보론산(aminophenyboronic acid)을 사용할 수 있다. 아미노 페닐보론산은 아래 [화학식 2]로 표현되는 3-아미노 페닐보론산이 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니다. According to one embodiment of the present invention, an aminophenyboronic acid having an amine group bonded thereto may be used to bond a phenylboronic acid to a polymer containing a maleic anhydride moiety. Aminophenylboronic acid is preferably 3-aminophenylboronic acid represented by the following formula (2), but is not limited thereto.

[화학식 2](2)

Figure 112016047074597-pat00002
Figure 112016047074597-pat00002

아미노 페닐보론산의 아미노기와 고분자에 포함된 말레산 무수물 모이어티가 가수분해를 통한 고리열림 반응(ring opeing)으로 결합할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면 [화학식 1]의 말레산 무수물 중합체에 및 [화학식 2]의 아미노 페닐보론산의 결합에 의해 [화학식 3]의 폴리 페닐보론산-말레산 무수물 중합체(poly(phenylboronic acid-co-maleic anhydride), pPBA)를 약물전달체에 포함되는 중합체로 사용할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 중합체 합성은 상온에서 다이메틸설폭사이드(dimehyl sulfoxide, DMSO)나 아세톤(acetone)과 같은 용매 내에서 단순히 말레산 무수물 중합체와 아미노 페닐보론산의 혼합을 통해 이루어질 수 있기 때문에 매우 간단하며, 합성 효율도 우수하다. The amino group of the aminophenylboronic acid and the maleic anhydride moiety contained in the polymer can be bonded by a ring opening reaction through hydrolysis. According to one embodiment of the present invention, a polyphenylboronic acid-maleic anhydride polymer (poly (phenylboronic acid)) of formula (3) is obtained by bonding an aminophenylboronic acid of formula (2) to a maleic anhydride polymer of formula acid-co-maleic anhydride, p- PBA) can be used as the polymer contained in the drug delivery system. According to one embodiment of the present invention, polymer synthesis can be accomplished by simply mixing the maleic anhydride polymer with aminophenylboronic acid in a solvent such as dimehyl sulfoxide (DMSO) or acetone at room temperature It is very simple and has excellent synthesis efficiency.

[화학식 3](3)

Figure 112016047074597-pat00003
Figure 112016047074597-pat00003

(상기 화학식 3에서 x는 20 내지 5000의 정수이고, y는 20 내지 5000의 정수이다.)(Wherein x is an integer of 20 to 5000 and y is an integer of 20 to 5000).

본 발명의 중합체는 페닐보론산이 결합되어 있어 다이올(diol) 또는 카테콜(catechol)을 포함하는 소수성 약물과 결합할 수 있다. The polymers of the present invention may be conjugated with hydrophobic drugs comprising phenylboronic acid and comprising a diol or catechol.

본 발명의 약물은 안드로그래폴라이드(andrographolide), 독소루비신(doxorubicin), 당화합물 및 배당체, 리보핵산, 폴리페놀 등으로 이루어진 군에서 선택되는 것이 바람직하나, 다이올 또는 카테콜을 포함하는 약물이라면 제한되지 않고 사용될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 안드로그래폴라이드를 결합시킨 본 발명의 중합체는 체내 종양에 매우 효율적으로 축적될 수 있다. 그리고, 단순히 안드로그라폴라이드 자체만을 처리한 경우보다 종양 성장 억제 효과가 현저히 우수하다. The drug of the present invention is preferably selected from the group consisting of andrographolide, doxorubicin, sugar compound and glycoside, ribonucleic acid, polyphenol and the like, but any drug including diol or catechol may be limited . According to one embodiment of the present invention, the polymers of the present invention conjugated with andrographolide can accumulate very efficiently in body tumors. Moreover, the tumor growth inhibitory effect is remarkably superior to that of the case where only the andrographolide itself is treated.

본 발명에 따르면, 페닐보론산에 소수성 약물이 결합한 고분자 중합체는 페닐보론산 및 소수성 약물의 소수성 상호작용에 의한 자가-결합(self-assembly)으로 약물을 포함한 100 내지 150nm 크기의 나노구조체를 형성할 수 있다. 약물을 포함한 나노구조체는 산성 조건 및 ATP의 농도 변화에 의해 약물을 효율적으로 종양에 방출할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 중성 pH나 저농도의 ATP에서는 적어도 48시간 동안은 나노구조체에서 약물이 거의 방출되지 않는 반면, 약산성 pH 및 고농도 ATP에서는 48시간 이내에 최소 70% 이상의 나노구조체가 해리되어 약물을 방출할 수 있다. 그리고, 나노구조체의 페닐보론산은 종양 세포 표면의 N-아세틸뉴라민산(N-acetylnuraminic acid)을 특이적으로 인식하여 상호작용할 수 있어, 다른 기관에 영향을 주지 않고 종양 특이적으로 약물을 축적할 수 있다.According to the present invention, a polymer polymer to which a hydrophobic drug is bound to phenylboronic acid is self-assembled by the hydrophobic interaction of phenylboronic acid and a hydrophobic drug to form a nanostructure having a size of 100 to 150 nm . The drug-containing nanostructures can release the drug efficiently into the tumor by changing the acidic conditions and the concentration of ATP. According to one embodiment of the present invention, at least 50% of the nanostructures are dissociated within 48 hours in weakly acidic pH and high concentration ATP while neutral pH or low concentration ATP hardly releases the drug in the nanostructure for at least 48 hours The drug can be released. In addition, the phenylboronic acid of the nanostructure can specifically recognize and interact with N-acetylnuraminic acid on the surface of the tumor cell, thereby accumulating the drug specifically to the tumor without affecting other organs .

본 발명의 나노구조체는 pH 5.0이하, pH 3 내지 5, pH 4 내지 5의 산성 조건 및 10 내지 100 mM의 ATP 농도에서 해리되어 약물을 전달할 수 있다. The nanostructure of the present invention can dissociate the drug at an acidic condition of pH 5.0 or less, pH 3 to 5, pH 4 to 5, and an ATP concentration of 10 to 100 mM.

본 발명의 나노구조체는 페닐보론산이 결합된 고분자 중합체의 자가 결합으로 형성되어 소수성 약물이 포함되어 있어도 매우 용해도를 가질 수 있다. 일반적으로 소수성 약물은 수용성 용매에서 용해도가 낮아 소수성 약물을 용해하거나, 약물 전달을 위한 캐리어(carrier)에 담지할 때 유기 용매, 계면활성제를 사용한다. 유기 용매나 계면활성제는 소수성 약물을 용해시키는데 유용하나, 혈액적합도가 매우 낮아 적혈구의 용혈(hemolysis)을 유발할 수 있고, 독성 물질로 작용하여 신체 전반에 만성 독성도 유발할 수 있다. 그러나, 본 발명의 중합체는 소수성 약물과 결합하여 수용성 용매에서 쉽게 용해될 수 있어 생체 독성을 유발할 수 있는 용매를 사용하지 않을 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 폴리 메틸 비닐 에터-알트-말레산 무수물에 페닐보론산을 결합한 폴리 페닐보론산-말레산 무수물 중합체(poly(phenylboronic acid-co-maleic anhydride), pPBA)로 인하여 소수성 항암제인 안드로그라폴리드가 수용성 용매에서도 쉽게 용해될 수 있다. 그리하여, 유기용매나 계면활성제를 사용하지 않아도 소수성 약물이 포함된 나노구조체를 형성할 수 있고, 용혈 현상이 거의 없어 혈액 적합성도 매우 높다. The nanostructure of the present invention is formed by self-bonding of a polymer polymer to which phenylboronic acid is bonded, and thus may have a very high solubility even when a hydrophobic drug is included. Generally, a hydrophobic drug is low in solubility in a water-soluble solvent, so that an organic solvent or a surfactant is used when the hydrophobic drug is dissolved or carried on a carrier for drug delivery. Organic solvents and surfactants are useful for dissolving hydrophobic drugs, but they can cause hemolysis of red blood cells because of their very low blood compatibility, and they can act as toxic substances and cause chronic toxicity throughout the body. However, the polymer of the present invention can be easily dissolved in a water-soluble solvent in combination with a hydrophobic drug, so that a solvent that can cause bio-toxicity may not be used. According to one embodiment of the present invention, poly (phenylboronic acid-co-maleic anhydride) ( p- PBA) having phenylboronic acid bonded to polymethylvinylether-alt- maleic anhydride Andrographol, a hydrophobic anticancer drug, can be easily dissolved in water-soluble solvents. Thus, it is possible to form a nanostructure containing a hydrophobic drug without using an organic solvent or a surfactant, and there is little hemolysis and blood compatibility is very high.

본 발명의 나노구조체에 포함된 약물과 페닐보론산의 몰비(mole ratio)를 조절하여 약물 전달 효과를 더 상승시킬 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 나노구조체에서 페닐보론산과 약물의 몰비가 1:1에 근접할수로 포함될수록 종양 특이적인 약물 전달 효과는 감소할 수 있다. 그러나, 나노구조체에 페닐보론산이 약물보다 더 많이 포함되고, 페닐보론산과 약물의 몰비가 변할수록 종양 특이적 약물 전달 효과가 보다 상승할 수 있다. 이는 나노구조체에서 약물과 결합하지 않은 페닐보론산이 증가할수록 종양 세포의 N-아세틸뉴라민산(N-acetylnuraminic acid)과 더 잘 상호작용할 수 있기 때문으로 여겨진다. 그러나, 페닐보론산이 더 많이 포함되는 경우 소수성 상호작용에 의한 나노구조체 형성이 어려울 수 있다. The drug delivery effect can be further enhanced by controlling the mole ratio between the drug contained in the nanostructure of the present invention and phenylboronic acid. According to one embodiment of the present invention, as the molar ratio of phenylboronic acid to drug in the nanostructure is close to 1: 1, the tumor-specific drug delivery effect may be reduced. However, as the nanoblock structure contains more phenylboronic acid than the drug, and the molar ratio of phenylboronic acid to the drug is changed, the tumor-specific drug delivery effect can be further enhanced. It is believed that the higher the amount of phenylboronic acid that is not bound to the drug in the nanostructure, the better it can interact with the N-acetylnuraminic acid of the tumor cells. However, when more phenylboronic acid is contained, it may be difficult to form nanostructures by hydrophobic interaction.

본 발명의 나노구조체에서 페닐보론산과 약물의 몰비는 1:1 내지 5:1, 1:1 내지 4:1이나, 2:1 내지 5:1, 2:1 내지 4:1 바람직하게는 3:1 내지 5:1 이나 이에 제한되는 것은 아니다. The molar ratio of phenylboronic acid to drug in the nanostructure of the present invention is 1: 1 to 5: 1, 1: 1 to 4: 1, 2: 1 to 5: 1, 2: 1 to 4: 1 to 5: 1, but is not limited thereto.

이하에서 본 발명을 실시하기 위한 실시예에 대하여 상세히 설명하며, 하기의 실시예는 본 발명을 실시하기 위한 바람직한 예시에 해당하는 것으로 본 발명이 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다. EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to the following examples. However, it should be understood that the present invention is not limited to the following examples.

실시예Example 1-1.  1-1. 페닐보론산이Phenylboronic acid 결합된Combined 말레산Maleic acid 무수물 중합체를 포함한 약물전달체의 합성 Synthesis of Drug Delivery Systems Including Anhydride Polymers

말레산 무수물(maleic anhydrate)로 분자량 80,000인 pMAnh(Poly(methyl vinyl ether-alt-maleic anhydride)와 아민기가 결합된 페닐보론산으로 3-아미노페닐보론산 수화물(3-aminophenylboronic acid monohydrate, PBA-NH2)을 준비하였다. 페닐보론산이 결합된 말레산 무수물 중합체는 도 1과 같은 방법으로 합성하였다. 우선, pMAnh(3.2mmol 숙신산 무수물 포함) 500mg을 DMSO(dimethyl sulfoxide)에 용해시킨 수용액을 준비하였다. 이 후, pMAnh를 용해시킨 수용액에 PBA-NH2(1mmol) 160mg을 첨가하고 실온에서 24시간 저어 주었다. 24시간 후, 0.1N NaOH 10㎖를 첨가하여 말레산 무수물 중합체의 미반응한 석신산 무수물 모이어티(moiety)의 가수분해를 촉진하고 반응을 종결하였다. 반응 종료 후, 이틀 간 투석한 후(분획분자량(MWCO = 10,000)) 동결 건조하여 페닐보론산이 결합된 말레산 무수물 중합체인 pPBA(poly(phenylboronic acid-co-maleic anhydride))를 얻었다. 수득률은 91%였고, PBA의 컨쥬게이션 비율은 1H-NMR로 계산하였다(도 2). 1H NMR (D2O, 300 MHz): 7.7-7.0 (m, Ph, 4xH); 3.8-3.5 (m, -CH-, 1H); 3.5-3.1 (m, -OCH3, 3H); 3.1-2.4 (m, CHCOO, 2H); 2.4-1.4 (m, -CH2-, 2H). 계산결과 pPBA 에서 PBA의 몰비는 513 반복단위(unit)당 156으로 나타났다(도 1). 그리고, 무수물의 C=O 피크(1830-1800 cm-1 및 1775-1740 cm-1, pMAnh)가 카복실산(1730-1700 cm-1, 가수분해된 pMAnh 반복단위(unit)) 및 아마이드(1680-1630 cm-1, pPBA 반복단위)피크로 변한 것을 통해 pMAnh에 PBA가 성공적으로 결합된 것을 확인하였다(도 3). Amino-3-aminophenylboronic acid monohydrate (PBA-NH) was prepared by reacting maleic anhydride with phenyl boronic acid having a molecular weight of 80,000 and coupled with an amine group such as poly (methyl vinyl ether-alt-maleic anhydride) 2) was prepared., was synthesized in the same way as the boronic acid is a maleic anhydride polymer is 1 binding. At first, an aqueous solution was prepared a pMAnh (3.2mmol include succinic anhydride) 500mg in DMSO (dimethyl sulfoxide). Then, 160 mg of PBA-NH 2 (1 mmol) was added to the aqueous solution of pMAnh dissolved therein, and the mixture was stirred at room temperature for 24 hours. After 24 hours, 10 mL of 0.1 N NaOH was added to remove unreacted succinic anhydride moiety was promote the hydrolysis of the (moiety) and to terminate the reaction. is after the completion of the reaction, dialysis two days (cut-off molecular weight (MWCO = 10,000)) and lyophilized phenylboronic acid bound maleic anhydride polymer p PBA ( poly (phenylboro The conjugation ratio of PBA was calculated by 1 H-NMR (Figure 2): 1 H NMR (D 2 O, 300 MHz): 7.7- 7.0 (m, Ph, 4xH) ; 3.8-3.5 (m, -CH-, 1H); 3.5-3.1 (m, -OCH 3, 3H); 3.1-2.4 (m, CHCOO, 2H); 2.4-1.4 ( m, -CH 2 -.., 2H) calculation results in a molar ratio of PBA p PBA showed a 156 per (unit) 513 repeat units (Figure 1) and, in the anhydride C = O peak (1830-1800 cm -1, and 1775-1740 cm -1 , pMAnh) was changed to a carboxylic acid (1730-1700 cm -1 , hydrolyzed pMAnh repeating unit) and amide (1680-1630 cm -1 , pPBA repeating unit) PBA was successfully combined (Fig. 3).

바이오이미징(bio-imaging)을 위해서 필요에 따라, 형광프로브로 FCR648-NH2(Sigma Aldrich)을 pMAnh에 PBA-NH2 처럼 함께 결합시켜 약물전달체를 제조하였다. FCR648-NH2를 함께 결합시킨 약물전달체 합성은 PBA-NH2 첨가시 FCR648-NH2를 함께 첨가하는 것외에는 위의 합성 과정과 동일하게 수행하였다. As necessary for bio-imaging (bio-imaging), was coupled with the FCR648-NH 2 (Sigma Aldrich) with a fluorescent probe pMAnh as PBA-NH 2 was prepared in the drug delivery system. Drug delivery system that combines with the synthetic FCR648-NH 2 is, except that the addition of the PBA-NH 2 was added during FCR648-NH 2 was carried out with the same manner as in Preparation procedure above.

실시예Example 1-2. 약물이  1-2. The drug 로딩된Loaded 나노구조체 형성 Nanostructure formation

실온에서 DMSO 수용액에 pPBA(poly(phenylboronic acid-co-maleic anhydride)) 및 약물로 안드로그라폴라이드(andrographolide, AND)를 혼합하였다. 안드로그라폴라이드와 pPBA의 페닐보론산의 결합을 통해 약물이 로딩되었다. pPBA의 페닐보론산과 안드로그라폴라이드의 결합과 함께 페닐보론산과 안드로그라폴라이의 소수성 상호작용에 의해 pPBA들의 자가 결합이 일어났다. 자가 결합에 의해 안드로그라폴라이드가 로딩된 나노 구조체가 형성된 것을 확인하였다. 안드로그라폴라이드 로딩 과정에서 pPBA와 안드로그라폴라이드 각각의 첨가량을 조절하여, 로딩된 안드로그라폴라이드의 농도 및 페닐보론산과 안드로그라폴라이드의 몰비율을 조절할 수 있었다. 250 mM 안드로그라폴라이드 DMSO 용액 20㎕에 50 mM pPBA 수용액 100㎕를 첨가한 후, DPBS 880㎕를 첨가하여 안드로그라폴라이드 최종농도가 5mM이고 페닐보론산과 안드로그라폴라이드의 몰비율이 1:1인 나노구조체를 합성할 수 있었다. 페닐보론산과 안드로그라폴라이드를 2:1의 몰비율로 포함하는 나노구조체를 100 mM pPBA를 사용한 동일한 방법으로 제조할 수 있었다. P PBA (poly (phenylboronic acid-co-maleic anhydride)) and drug andrographolide (AND) were mixed in DMSO aqueous solution at room temperature. The drug was loaded through a combination of the boronic acid of androsta Gras polite and p PBA. by phenylboronic acid androsta Gras polrayi hydrophobic interaction with a phenyl boronic acid androsta Gras combination of polite of p PBA of self p PBA occurred bond. It was confirmed that a nanogram structure with andrographolide was formed by self-bonding. Androsta Gras In polite loading process to adjust the p PBA and androsta Gras polite each addition amount, could control the concentration and the molar ratio of phenyl boronic acid androsta Gras polite of androsta Gras polite loading. 250 mM androsta Gras polite DMSO solution in 50 mM p 20㎕ After addition of PBA solution 100㎕, was added to DPBS 880㎕ androsta Gras polite final concentration of 5mM, and the phenyl boronic acid androsta Gras molar ratio of a polite 1 : 1 nano structure could be synthesized. A phenylboronic acid androsta Gras polite 2: using a 100 mM p PBA the nanostructure comprises a molar ratio of 1: 1 could be prepared in the same way.

나노구조체 형성과정에서 pPBA가 안드로그라폴라이드를 수용성 매질(5% DMSO/PBS)에 잘 녹게 하는 것을 확인하였고, 다양한 PBA와 안드로그라폴라이드 몰비를 가지는 나노구조체들도 수용성 용액에 잘 분산되어 용해되었다. 그리고, pMAnh에 PBA를 그래프팅한 것이 PBA의 용해도를 100mM까지 증가시키는 것도 확인하였다. 반면, 안드로그라폴라이드는 DMSO에서는 잘 용해되나, 수용성 매질(5% DMSO/PBS)에서는 잘 용해되지 않았고, PBA 자체의 용해도는 pMAnh에 그래프팅 된 때보다 낮았다(도 4).In the process of nanostructure formation, it was confirmed that p- PBA was able to dissolve andrographolide in a water-soluble medium (5% DMSO / PBS), and nanostructures with various PBA and andrographolide molar ratios were well dispersed in aqueous solution Lt; / RTI > It was also confirmed that the grafting of PBA to pMAnh increased the solubility of PBA to 100 mM. On the other hand, andrographolide was well soluble in DMSO but not in aqueous medium (5% DMSO / PBS) and solubility of PBA itself was lower than when grafted to pMAnh (FIG. 4).

약물을 로딩한 나노구조체의 pH 및 ATP 농도 변화에 따른 자극반응성을 확인하였다. The pH of the nanostructures loaded with the drug and the ATP concentration were monitored to determine the stimulus reactivity.

실시예 1에 따라 제조한 pPBA, 페닐보론산과 안드로그라폴라이드 몰비가 1:1인 나노구조체(pPBA-AND 1:1 complex) 및 페닐보론산과 안드로그라폴라이드 몰비가 2:1인 나노구조체(pPBA-AND 2:1 complex)를 준비하고, pH 및 ATP 농도 변화에 따른 자극반응성 확인을 위해 pH 7.4와 pH 5.0, 5 mM ATP 조건에서 동역학적 광산란 장비를(Dynamic light scattering, DLS) 이용해 평균 크기 분포를 계산하였다(도 5). pPBA는 낮은 pH에서의 수소이온 첨가(protonation)에 의한 카복실기의 소수성 성질 증가 때문에 pH 5.0에서 크기가 약간 감소하였으며 ATP 조건하에서는 PBA의 소수성 성질 감소 때문에 약간 증가하였다. pPBA-AND 1:1 complex는 산성에서 크기 분포가 넓게 나타났으며 ATP 조건에서는 약물이 석출되어 DLS상에 측정되지 않았다. pPBA-AND 2:1 complex는 pH 7.4에서 강한 보론 에스터(boronic ester) 형성 및 소수성 상호작용에 의해 가장 작은 크기가 나타났고 산성 pH(pH 5.0) 및 ATP 조건하에 크기 분포가 극적으로 변하였다. 이는 TEM 이미지로도 확인하였으며 pH 7.4와는 달리 pH 5.0과 ATP 조건하에 구조가 관찰되지 않음을 통해 나노구조체의 분해 및 안드로그라폴라이드가 방출된 것을 확인할 수 있었다(도 6). (PPBA-AND 1: 1 complex) having a 1: 1 mole ratio of p- PBA, phenylboronic acid and andrographolide molar ratio and a 2: 1 molar ratio of phenylboronic acid and andrographolide prepared in Example 1 (pPBA-AND 2: 1 complex) was prepared. The pH and ATP concentrations were measured by dynamic light scattering (DLS) at pH 7.4, pH 5.0 and 5 mM ATP The size distribution was calculated (Figure 5). p PBA decreased slightly at pH 5.0 due to the increase of the hydrophobic nature of the carboxyl group by protonation at low pH and slightly increased due to the decrease of the hydrophobic property of PBA under ATP. The pPBA-AND 1: 1 complex showed a broad size distribution in acidic form, and the drug was not precipitated on the DLS in the ATP condition. The pPBA-AND 2: 1 complex showed the smallest size due to strong boronic ester formation and hydrophobic interaction at pH 7.4, and the size distribution changed dramatically under acidic pH (pH 5.0) and ATP conditions. This was confirmed by TEM image, and the structure was not observed under conditions of pH 5.0 and ATP, unlike pH 7.4, indicating decomposition of the nanostructure and release of andrographolide (FIG. 6).

세포독성평가(cell viability assay)를 통해 약물이 담지된 나노구조체 종양 표적화 및 약물 전달 효과를 확인 하였다.The cell viability assay (cell viability assay) confirmed the drug-carrying nanostructure tumor targeting and drug delivery effects.

MCF-7 및 PC-3 세포를 96웰(well) 배양 플레이트에 8000cell/well로 분주하고 하루밤 배양하였다. 배양 후, 새 배지로 교체하고 pPBA, 안드로그라폴라이드(AND), 페닐보론산과 안드로그라폴라이드 몰비가 1:1인 나노구조체(pPBA-AND 1:1 complex) 및 페닐보론산과 안드로그라폴라이드 몰비가 2:1인 나노구조체(pPBA-AND 2:1 complex) 각각을 0 에서 100 μM 농도로 처리한 한 48시간 동안 더 배양하였다. 배양 후, MTT 어세이를 통해 세포독성을 확인하였다. MTT 어세이 결과, 가수분해된 pMAnh의 생체적합성 및 강한음전하 때문에 pPBA 는 세포독성을 나타내지 않았다. 안드로그라폴라이드만 처리했을 경우 IC50 값이 약 30 μM로 나타났고, pPBA-AND 1:1 complex도 비슷한 세포독성을 나타냈다. , pPBA-AND 2:1 complex에서는 IC50 값이 안드로그라폴라이드만 처리했을 경우보다 MCF-7 및 PC-3 세포에서 3.5~5.1배 더 낮게 나타났다(도 7). 이러한 효과는 나노구조체의 PBA 모이어티에 의한 종양 표적화 기능에 의한 것으로 보인다.MCF-7 and PC-3 cells were plated on 96-well culture plates at 8000 cells / well and cultured overnight. After cultivation, replaced with fresh medium, and p PBA, androsta Gras polite (AND), phenylboronic acid androsta Gras polite molar ratio of 1: 1 nanostructures (pPBA-AND 1: 1 complex ) , and phenylboronic acid androsta Gras Paul (PPBA-AND 2: 1 complex) at a concentration of 0: 100 μM was further cultured for 48 hours. After incubation, cytotoxicity was confirmed by MTT assay. Since MTT assay results, hydrolysis of the digested pMAnh biocompatible and strong negative charge PBA p did not show cytotoxicity. When treated with andrographolide alone, the IC 50 value was about 30 μM, and the pPBA-AND 1: 1 complex showed similar cytotoxicity. , and IC 50 values in the pPBA-AND 2: 1 complex were 3.5 to 5.1 times lower in MCF-7 and PC-3 cells than those treated with andrographolide alone (FIG. 7). This effect appears to be due to the tumor targeting function by the PBA moiety of the nanostructure.

종양 표적화 기능을 확실히 알아보기 위해 리간드 경쟁 어세이(Competition assay)를 수행하였다. pPBA, 안드로그라폴라이드(AND), 및 페닐보론산과 안드로그라폴라이드 몰비가 2:1인 나노구조체(pPBA-AND 2:1 complex)의 처리에 앞서 5mM PBA를 MCF-7 및 PC-3 각각에 미리 처리하여 30분간 배양한 것 외에는 세포독성평가와 동일한 방법으로 수행하였다. 어세이 결과, 안드로그라폴라이드만 처리한 경우 PBA를 미리 처리한 것에 큰 영향을 받지 않는 세포독성을 나타냈으나, pPBA-AND 2:1 complex에서는 안드로그라폴라이드만 처리한 경우와 유사한 정도의 세포독성을 나타냈다(도 8). 이러한 결과는 미리 처리한 PBA가 종양 세포 세포막의 N-아세틸뉴라민산 에피토프와 결합하여 나노구조체가 PBA를 통해 종양 세포에 결합하는 것을 억제하였기 때문이며, 나노구조체는 PBA를 통해 종양 표적화 기능을 가지는 것을 확인할 수 있었다. To confirm the tumor targeting function, a ligand competition assay was performed. p PBA, androsta Gras polite (AND), and phenylboronic acid androsta Gras pole fluoride molar ratio is 2: 1 nanostructures (pPBA-AND 2: 1 complex ) to 5mM PBA prior to the treatment of MCF-7 and the PC-3 The cells were treated in the same manner as in the cytotoxicity evaluation except that the cells were cultured for 30 minutes in advance. The assay showed cytotoxicity not significantly affected by pre-treatment of PBA with andrographolide alone, but similar to that of the case of only treatment with andrographolide in pPBA-AND 2: 1 complex Cytotoxicity (Fig. 8). This result is due to the fact that the pre-treated PBA binds to the N-acetylneuraminic acid epitope of the tumor cell membrane to inhibit the binding of the nanostructure to the tumor cell via PBA, and the nanostructure has a tumor targeting function through PBA I could confirm.

약물을 로딩한 나노구조체의 세포내 흡수(Intracellular uptake)를 확인하였다. Intracellular uptake of drug-loaded nanostructures was confirmed.

MCF-7 세포를 12 웰 플레이트에 20000cell/well로 분주하고 하루밤 배양하였다. 배양 후, 안드로그라폴라이드 10μM 로딩되고, 페닐보론산과 안드로그라폴라이드 몰비가 각각 1:1 및 2:1인 형광프로브인 FCR을 결합한 나노구조체(FCR-pPBA-AND complex)를 처리하고 6시간 더 배양하였다. 차가운 DPBS를 첨가하여 세포내 흡수를 중단시켰다. MCF-7 cells were plated in 12 well plates at 20,000 cells / well and cultured overnight. After culturing, a nanostructure (FCR-pPBA-AND complex), which was loaded with 10 μM of andrographolide and FCR, a fluorescent probe having a molar ratio of phenylboronic acid and andrographolide of 1: 1 and 2: 1, Lt; / RTI > The intracellular uptake was stopped by adding cold DPBS.

이 후, 유세포분석(Flow cytometry)을 위해 DPBS로 여러 번 세척하여 비특이적 결합을 제거한 후, 세포를 채취하여 DPBS 용액에 재현탁시켜 FACS Calibur(Becton Dickinson)로 분석하였다. FCR-pPBA-AND 2:1 complex는 FCR-pPBA-AND 1:1 complex 보다 2배 더 높게 세포내로 유입되었다. 반면, pPBA는 FCR-pPBA-AND 2:1 complex보다 6배 더 적게, FCR-pPBA-AND 1:1 complex보다는 3배 더 적게 새포내로 유입되었다(도 9). 이러한 결과는 안드로그라폴라이드와 같은 약물과 pPBA의 결합되고, 나노구조체를 형성하는 것이 세포내 흡수에 중요한 영향을 미치는 것을 보여준다. After this, non-specific binding was removed by washing several times with DPBS for flow cytometry. Cells were collected and resuspended in DPBS solution and analyzed by FACS Calibur (Becton Dickinson). The FCR-pPBA-AND 2: 1 complex was introduced into the cell two times higher than the FCR-pPBA-AND 1: 1 complex. On the other hand, p- PBA was 6-fold less than the FCR-pPBA-AND 2: 1 complex and 3-fold less than the FCR-pPBA-AND 1: 1 complex (Fig. These results androsta Gras coupled drug and p PBA as polite, shows that to form the nanostructures have a significant impact on the absorption cell.

공초점 주사레이저현미경 관찰은 차가운 DPBS 처리 후, 세포를 세척하고 10% NBF(neutral buffered formaline로 하루밤 고정하고, 커버글라스를 씌운 후 DAPI를 포함한 봉입제로 봉입하여 수행하였다. 관찰 결과, FCR-pPBA-AND 2:1 complex에서 가장 강한 형광 신호를 나타내었다(도 9).Confocal laser scanning microscopy was performed after cold DPBS treatment and cells were fixed and fixed overnight with 10% NBF (neutral buffered formalin, covered with a cover glass and then sealed with a sealant containing DAPI. As a result, FCR-pPBA- And showed the strongest fluorescence signal at the AND 2: 1 complex (Fig. 9).

In- vivo에서 약물을 로딩한 나노구조체의 생체내분포를 확인하였다. In vivo, the in vivo distribution of drug-loaded nanostructures was confirmed.

암컷 Balb/c-nu/nu 마우스들에 MCF-cell를 5×107 cells/mouse로 피하 주사하 접종하였다. 종양 부피가 300 mm3에 이른 후, 페닐보론산과 안드로그라폴라이드 몰비가 각각 1:1 및 2:1인 형광체인 FCR-648을 결합한 나노구조체(FCR-pPBA-AND complex)를 정맥 주사하였다(15 mg/kg 안드로그라폴라이드). 정맥 주사 24시간 후, 마우스를 죽인 후 각 기관의 형광 강도를 IVIS로 측정하였다. Female Balb / c-nu / nu mice were subcutaneously inoculated with 5 × 10 7 cells / mouse of MCF-cell. After reaching a tumor volume of 300 mm 3 , a nanostructure (FCR-pPBA-AND complex), in which phenylboronic acid and andrographolide molar ratios were 1: 1 and 2: 1, respectively, 15 mg / kg < / RTI > andrographolide). After 24 hours of intravenous injection, the mice were killed and the fluorescence intensity of each organ was measured by IVIS.

측정 결과 FCR-pPBA-AND 2:1 complex가 FCR-pPBA-AND 1:1 complex보다 1.8배 더 종양 부위에 축적되어, 약물과 결합하지 않은 잔여 PBA 모이어티가 세포 수준에서 중요한 표적 리간드로서 기능하는 것을 확인하였다. pPBA 자체는 FCR-pPBA-AND 2:1 complex 및 FCR-pPBA-AND 1:1 complex보다 더 낮게 종양 부위에 축적되어, 종양 부위에서 투과 및 유지효과를 가지기 위해서는 적합한 나노구조체 형성이 중요한 것을 확인하였다(도 10). As a result, the FCR- p PBA-AND 2: 1 complex accumulates 1.8 times more in the tumor site than the FCR- p PBA-AND 1: 1 complex, and the remaining PBA moiety not bound to the drug is an important target ligand at the cellular level Function. p PBA itself accumulates in the tumor site lower than the FCR- p PBA-AND 2: 1 complex and the FCR- p PBA-AND 1: 1 complex. In order to have a permeation and maintenance effect at the tumor site, proper nanostructure formation is important (Fig. 10).

In- vivo에서 약물을 로딩한 나노구조체의 종양 성장 억제를 확인하였다. In vivo , inhibition of tumor growth of drug-loaded nanostructures was confirmed.

암컷 Balb/c-nu/nu 마우스들에 MCF-cell를 5×107 cells/mouse로 피하 주사하 접종하였다. 종양 부피가 100 mm3에 이른 후, 마우스들을 5마리당 한 그룹으로 하여 5개의 그룹으로 나누었다. 5 그룹의 각각의 마우스들에 1) 식염수(saline), 2) pPBA, 3) 안드로그라폴라이드가 용해된 수용액, 4) 페닐보론산과 안드로그라폴라이드 몰비가 1:1인 나노구조체(pPBA-AND 1:1 complex) 및 5) 페닐보론산과 안드로그라폴라이드 몰비가 2:1인 나노구조체(pPBA-AND 2:1 complex) 200㎕를 주사하였다(30 mg/kg 안드로그라폴라이드). 이 후, 2일마다 종양 부피, 종양 무게 및 마우스의 체중을 기록하였다. 종양 부피는 종양 부피 = ab2/2(a는 길이, b는 폭) 공식에 따라 기록하였다. 그 결과, 살린을 처리한 그룹과 pPBA를 처리한 그룹에서는 종양 부피 및 종양 무게가 비슷하였다. 그리고, 안드로그라폴라이드 처리한 그룹과 페닐보론산과 안드로그라폴라이드 몰비가 1:1인 나노구조체(pPBA-AND 1:1 complex)를 처리한 그룹에서 종양 부피 및 종양 무게가 비슷하였다. 페닐보론산과 안드로그라폴라이드 몰비가 2:1인 나노구조체(pPBA-AND 2:1 complex)는 종양 부피 및 종양 무게가 가장 낮게 나타났다(도 11 및 12). 이를 통해 나노구조체에서 안드로그라폴라이드가 결합하지 않은 페닐보론산이 존재하는 경우, 페닐보론산에 의해 종양 특이적으로 안드로그라폴라이드를 매우 높은 효율로 전달할 수 있음을 알 수 있었다. Female Balb / c-nu / nu mice were subcutaneously inoculated with 5 × 10 7 cells / mouse of MCF-cell. After the tumor volume reached 100 mm 3 , the mice were divided into 5 groups of 5 mice per group. 1 to each of the mice of the 5 groups), aqueous sodium chloride (saline), 2) p PBA, 3) androsta Gras Paul the fluoride is dissolved in an aqueous solution, 4) phenylboronic acid androsta Gras polite molar ratio of 1: 1 nanostructures (pPBA -AND 1: 1 complex) and 5) 200 μl of a 2: 1 molar ratio of phenylboronic acid and andrographolide (pPBA-AND 2: 1 complex) (30 mg / kg andrographolide). Thereafter, tumor volume, tumor weight and mouse body weight were recorded every two days. Tumor volume Tumor volume = ab 2/2 were recorded in accordance with (a length, b is the width) of the formula. As a result, tumor volume and tumor weight were similar in saline treated group and p- PBA treated group. Tumor volume and tumor weight were similar in the group treated with androglucuronide treated with a 1: 1 nano-structure (pPBA-AND 1: 1 complex) in which the molar ratio of phenylboronic acid and andrographolide was 1: 1. A 2: 1 mole ratio of phenylboronic acid to andrographolide (pPBA-AND 2: 1 complex) showed the lowest tumor volume and tumor weight (FIGS. 11 and 12). As a result, it was found that phenylboronic acid, which is not bound with androglucoside in the nanostructure, can deliver tumor-specific andrographolide with phenylboronic acid at a very high efficiency.

혈액 적합성을 확인하기 위해 적혈구 용혈 실험(hemolysis assay)을 수행하였다. Hemolysis assay was performed to confirm hematologic fitness.

쥐의 신선한 혈액을 헤파린 튜브에 준비한다. 이들을 생리식염수로 10배 희석 한 이후 2000 rpm 에서 15분간 원심분리 한다. 450㎕ 의 이 용액에 각각의 샘플을 0.5 mM 안드로그라폴라이드 기준으로 맞춘 용액을 50㎕ 넣은 후 37 oC에서 6시간 둔다. 이 후 다시 용액을 2000 rpm 에서 15분간 원심분리 한 이후 541 nm 의 흡광도를 측정하여 용혈(hemolysis) 정도를 계산한다. 이 때 100% 용혈은 1X lysis buffer 를 처리한 용액을 기준으로 한다. Prepare fresh blood of rats in heparin tubes. They are diluted 10 times with physiological saline and then centrifuged at 2000 rpm for 15 minutes. Add 50 μl of a solution of each sample to 450 μl of this solution, based on 0.5 mM andrographolide, and incubate at 37 ° C for 6 hours. After centrifuging the solution at 2000 rpm for 15 minutes, the absorbance at 541 nm is measured and the degree of hemolysis is calculated. 100% hemolysis is based on 1X lysis buffer solution.

어세이 결과, 안드로그라폴라이드의 낮은 용해도 때문에, 5mM 안드로그라폴라이드를 수용성 매질에 용해하기 위해서는 10% 이상의 DMSO가 필요하고 이를 혈액에 가한 경우 심한 용혈 현상이 발생했다. 즉, 안드로그라폴라이드 수용액만을 혈액에 투여하는 경우 심각한 빈혈이 발생하고, 이로 인한 몸 전체에 문제가 생길 수 있다. 반면, pPBA 및 안드로그라폴라이드가 로딩된 나노구조체(pPBA-AND complex)는 높은 용해도를 가져, 최소한의 유기 용매에서 나노구조체를 형성 및 유지할 수 있기 때문에 헤모글로빈의 손실이 적었다(도 13). 이러한 결과는 안드로그라폴라이드와 같이 혈액에 투여하기 어려운 약물의 경우에도 pPBA와 결합 및 나노구조체 형성을 통한 혈액 투여 가능성을 보여준다. As a result of the assay, due to the low solubility of andrographolide, more than 10% of DMSO was required to dissolve 5 mM androglucoside in a water-soluble medium and severe hemolysis occurred when added to blood. That is, when only an aqueous solution of andrographolide is administered to the blood, serious anemia occurs, and the whole body can be brought into trouble. On the other hand, p- PBA and andrographolide-loaded nanostructures ( p- PBA-AND complexes) had a low solubility in hemoglobin due to their ability to form and maintain nanostructures in minimal organic solvents (Fig. 13) . These results suggest the possibility of administering blood through the coupling and nanostructure formation and p PBA in the case of a difficult drug administration to the blood, such as androsta Gras polite.

Claims (12)

말레산 무수물 중합체와 아미노 페닐보론산이 고리열림 반응으로 결합되어 형성된 중합체를 포함하는 약물전달체로, 상기 약물은 다이올 또는 카테콜을 포함하는 약물인 약물전달체.
A drug delivery system comprising a polymer formed by a maleic anhydride polymer and aminophenylboronic acid coupled in a ring opening reaction, wherein the drug is a drug comprising a diol or catechol.
제1항에 있어서,
상기 페닐보론산의 결합은 말레산 무수물 중합체의 석신산 무수물 모이어티(moiety)와 아민이 결합된 페닐보론산의 반응으로 형성되는 약물전달체.
The method according to claim 1,
Wherein the bond of the phenylboronic acid is formed by the reaction of a succinic anhydride moiety of the maleic anhydride polymer with an amine-bound phenylboronic acid.
제1항에 있어서,
상기 말레산 무수물 중합체는 하기 [화학식 1]의 구조를 가지는 중합체인 약물전달체.
[화학식 1]
Figure 112016047074597-pat00004

(n은 20 내지 5000이다.)
The method according to claim 1,
Wherein the maleic anhydride polymer is a polymer having a structure represented by the following formula (1).
[Chemical Formula 1]
Figure 112016047074597-pat00004

(n is 20 to 5000).
제2항에 있어서,
상기 말레산 무수물 중합체는 하기 [화학식 1]의 구조를 가지고, 상기 아민이 결합된 페닐보론산은 하기 [화학식 2]의 구조를 가지는 약물전달체.
[화학식 1]
Figure 112016047074597-pat00005

(n은 20 내지 5000이다.)
[화학식 2]
Figure 112016047074597-pat00006

3. The method of claim 2,
Wherein the maleic anhydride polymer has a structure represented by the following formula (1), and the amine-bonded phenylboronic acid has a structure represented by the following formula (2).
[Chemical Formula 1]
Figure 112016047074597-pat00005

(n is 20 to 5000).
(2)
Figure 112016047074597-pat00006

 제4항에 있어서,
상기 [화학식 1] 및 [화학식 2]의 결합에 의해 생성된, 하기 [화학식 3]의 구조를 가지는 중합체를 포함하는 약물전달체.
[화학식 3]
Figure 112016047074597-pat00007

(상기 화학식 3에서 x는 20 내지 5000의 정수이고, y는 20 내지 5000의 정수이다.)
5. The method of claim 4,
A drug carrier comprising a polymer having a structure represented by the following formula (3), which is formed by a combination of the above-mentioned formulas (1) and (2).
(3)
Figure 112016047074597-pat00007

(Wherein x is an integer of 20 to 5000 and y is an integer of 20 to 5000).
삭제delete 제1항에 있어서,
상기 약물전달체에 의한 약물 전달은 세포 내의 산성조건 및 ATP 농도 변화에 의한 것인 약물전달체.
The method according to claim 1,
Wherein the drug delivery by the drug delivery system is by acidic conditions in the cell and ATP concentration change.
제7항에 있어서,
상기 산성조건은 pH가 3.0 내지 5.0인 약물전달체.
8. The method of claim 7,
Wherein the acidic condition is pH 3.0 to 5.0.
제1항의 약물전달체의 페닐보론산에 다이올(diol) 또는 카테콜(catechol)을 포함하는 약물이 결합하고, 페닐보론산 및 약물의 소수성 상호작용에 의한 자가 조립(self-assembly)으로 형성되는 나노구조체.
A drug comprising a diol or a catechol is bound to a phenylboronic acid of the drug delivery system of claim 1 and is formed by self-assembly by the hydrophobic interaction of the phenylboronic acid and the drug Nanostructures.
제9항에 있어서,
상기 약물전달체는 하기 [화학식 3]의 구조의 중합체를 포함하는 나노구조체.
[화학식 3]
Figure 112016047074597-pat00008

(상기 화학식 3에서 x는 20 내지 5000의 정수이고, y는 20 내지 5000의 정수이다.)
10. The method of claim 9,
Wherein the drug delivery vehicle comprises a polymer having a structure represented by the following formula (3).
(3)
Figure 112016047074597-pat00008

(Wherein x is an integer of 20 to 5000 and y is an integer of 20 to 5000).
제9항에 있어서,
상기 약물은 안드로그라폴라이드(andrographolide)인 나노구조체.
10. The method of claim 9,
Wherein said drug is andrographolide.
제11항에 있어서,
상기 나노구조체에 포함된 페닐보론산과 안드로그라폴라이드의 몰비는 1:1 내지 4:1인 나노구조체.
12. The method of claim 11,
Wherein the molar ratio of phenylboronic acid and andrographolide contained in the nanostructure is 1: 1 to 4: 1.
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