KR101888101B1 - Method for inhibiting the M. tuberculosis survival and proliferation by overexpression of the protein SCOTIN - Google Patents
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Abstract
본 발명은 대식세포에서 SCOTIN 단백질 발현을 조절하여 기존 결핵균 약제와 작용기전이 다르고 부작용이 적은 결핵 예방 및 치료 방법을 밝히는 것을 목적으로 한다. 구체적으로 본 발명은 SCOTIN-V5 vector 및 형질주입을 위한 화합물질 (transfection reagent)을 이용하여 대식세포의 SCOTIN 단백질의 과발현을 유도하여 결핵균의 생존 및 증식을 억제하는 것을 특징으로 하며, 통상적인 항결핵제와 병용하여 사용하는 경우 결핵균의 억제에 더 나은 효과를 보일 수 있다.DISCLOSURE OF THE INVENTION It is an object of the present invention to provide a method for the prevention and treatment of tuberculosis by controlling the expression of SCOTIN protein in macrophages. Specifically, the present invention is characterized in that SCOTIN-V5 vector and a transfection reagent for transfection are used to induce overexpression of macrophage SCOTIN protein to inhibit the survival and proliferation of Mycobacterium tuberculosis. When used in combination, it can exert a better effect on the inhibition of Mycobacterium tuberculosis.
Description
본 발명은 전반적으로 면역학 분야에 관한 것이며, 부분적으로 결핵균의 생존 및 증식을 억제하는 방법에 관한 것이며 이를 위하여 대식세포를 활성화 시키는 방법에 관한 것이다. The present invention relates generally to the field of immunology, and in part relates to a method for inhibiting the survival and proliferation of Mycobacterium tuberculosis, and a method for activating macrophages for this purpose.
결핵은 결핵균 및 다른 마이코박테리움(Mycobacterium)종의 감염에 의해 유발되는 만성 감염성 질병이다. 결핵은 매년 약 8백만명의 신규 감염자가 발생되며 3백만명의 목숨을 앗아가는 개발도상국의 주요 질병이며, 또한 선진국에서도 문제점으로 부각되고 있다. 상당한 기간 동안 감염은 무증상일 수 있으나, 결핵은 가장 공통적인 증상으로서 폐의 급성 염증을 나타내며, 그 결과 발열 및 마른 기침(nonproductive cough)을 유발시킨다. 치료하지 않으면, 일반적으로 심각한 합병증 및 사망을 초래한다. Tuberculosis is a chronic infectious disease caused by an infection of Mycobacterium species with Mycobacterium tuberculosis. Tuberculosis is a major disease in developing countries, with nearly 8 million new infections occurring each year, and 3 million deaths, and it is also a problem in developed countries. Infection may be asymptomatic for a considerable period of time, but tuberculosis is the most common symptom of acute inflammation of the lungs, resulting in fever and nonproductive cough. Untreated, usually causes serious complications and death.
결핵은 장기간에 걸친 항생제 요법을 이용하여 치료될 수 있으나, 이러한 치료법이 결핵의 확산을 막기에는 역부족이다. 감염된 개체들은 증상을 나타내지는 아니하나, 일정 기간 보균상태(contagious)일 수 있다. 게다가 치료 섭생을 엄격하게 따르더라도 환자의 행동을 통제하는 것은 어렵다. 일부 환자들은 치료과정을 끝마치지 못하는데, 이는 효험없는 치료와 약제 내성의 발달을 초래할 수 있다. 치료의 전 과정을 끝마친다 하더라도, 결핵균 감염은 감염된 개체로부터 근절되지 아니하며 여전히 재활성화될 수 있는 잠복성 감염으로 잔존하게 된다. Tuberculosis can be treated with long-term antibiotic therapy, but these therapies are not enough to prevent the spread of tuberculosis. Infected individuals do not exhibit symptoms, but may be contagious for a period of time. In addition, it is difficult to control the patient's behavior even though the treatment regimen is strictly followed. Some patients are unable to complete the treatment process, which can lead to ineffective treatment and development of drug resistance. Even if you complete the entire course of treatment, TB infection remains a latent infection that can not be eradicated from the infected individual and still be reactivated.
결핵의 확산을 통제하기 위해서는, 상기 질병에 대한 효과적인 예방접종(vaccination) 및 정확한 초기 진단이 가장 중요하다. 현재까지는 생균(live bacteria)을 이용한 예방접종이 보호 면역을 유도하기 위한 가장 효율적인 방법이다. 상기 목적을 위해 이용되는 가장 일반적인 마이코박테리움은 바실러스 칼메트-게링(BacillusCalmette-Guerin, BCG)인데, M. bovis의 비병원성 종이다. 그러나, BCG의 안정성 및 효능은 논쟁의 대상이 되고 있으며, 미국과 같은 일부 국가에서는 상기 제제를 사용한 일반 대중의 예방접종을 실시하지 않고 있다. 결핵의 진단은 일반적으로 피부 검정법을 이용하여 수행되는데, 상기 검정법은 투베르쿨린 PPD(proteinpurified derivative)에 대한 피내 노출을 포함한다. 항원-특이 T 세포 반응은 주입후 48-72시간 까지 주입 부위에서의 측정가능한 정도 경화(induration)를 초래하는데, 이는 마이코박테리움 항원에 대한 노출을 의미한다. 그러나 상기 검정법은 민감도 및 특이성에서 문제가 있으며, BCG로 예방접종된 개체들은 감염된 개체들과 구별될 수 없다.In order to control the spread of tuberculosis, effective vaccination and precise initial diagnosis of the disease are most important. Until now, live vaccine vaccination is the most effective way to induce protective immunity. The most common Mycobacterium used for this purpose is Bacillus Calmette-Guerin (BCG), a non-pathogenic species of M. bovis . However, the safety and efficacy of BCG is controversial, and in some countries, such as the United States, the general public is not vaccinated with the formulation. Diagnosis of tuberculosis is generally performed using a skin test method, which involves intradermal exposure to tuberculin protein precursor derivative (PPD). The antigen-specific T cell response results in a measurable degree of induration at the site of injection up to 48-72 hours post-injection, which means exposure to the Mycobacterium antigens. However, the assay is problematic in sensitivity and specificity, and individuals vaccinated with BCG can not be distinguished from infected individuals.
대식세포는 자연면역이나 염증반응에서 중요한 역할을 할 뿐 아니라, 획득면역반응에서도 중요한 역할을 하는 데, 그 대표적인 기능이 T cell에 항원을 보여주는 것이다(antigen presentation). 대식세포는 식균작용으로 단백질 항원을 받아들이며, 그들을 작은 펩티드(peptide)로 분해하며(antigen processing), 분해된 펩티드(peptide)를 자신의 MHC와 결합시켜 다시 세포표면에 T cell의 활성화를 촉진할 수 있다. 또한 대식세포는 면역반응의 시작에 필요한 항원을 제시하는 기능 이외에도, 세포매개성 면역반응과 체액성 면역반응에서 면역작용을 나타내는 중요한 작용세포(effector cell)로 활동하기도 한다. T cell에 의해 활성화된 대식세포는 지연성과민반응(delayed type hypersensitivity)에서 항원을 제거하는 기능을 하며, 대식세포는 항체가 결합되어 있는 항원을 식균작용으로 제거하는 기능을 가지고 있다. Macrophages play an important role in innate immune and inflammatory responses as well as in acquired immune responses, a typical feature of which is antigen presentation in T cells. Macrophages can accept protein antigens by phagocytosis, digest them into small peptides (antigen processing), bind degraded peptides to their MHC, and then promote activation of T cells on the cell surface have. In addition, macrophages also function as effector cells that exhibit immune responses in cell-mediated immune responses and humoral immune responses in addition to their ability to present antigens necessary for the onset of the immune response. Macrophages activated by T cells function to remove antigens from delayed type hypersensitivity. Macrophages have the function of eliminating antigens bound by antibodies with phagocytosis.
본원 발명의 핵심구성요소인 SCOTIN 단백질은 세포내 소포체 또는 핵막에 존재하는 단백질로, p53 또는 Caspase에 의존적인 세포자멸사를 유도하는 유전자로 알려져 있다. 따라서, 결핵균 감염시 대식세포에서의 SCOTIN 단백질 발현은 결핵균 생존 억제에 매우 효과적인 기전으로 작용할 것으로 사료된다. The SCOTIN protein, which is a key component of the present invention, is a protein that exists in the endoplasmic reticulum or nuclear membrane and is known to induce apoptosis dependent on p53 or Caspase. Therefore, the expression of SCOTIN protein in macrophages may be a very effective mechanism to inhibit the survival of M. tuberculosis.
결핵균의 경우 병원성 인자들을 분비함으로써 대식세포(macrophage)의 활성화를 방해하는 것으로 알려져 있다. 이는 결국 대식세포의 병원균에 대한 효율적인 치료를 방해하는 문제점이 있어왔다. In the case of Mycobacterium tuberculosis, it is known to inhibit the activation of macrophages by secretion of pathogenic factors. This has led to the problem of hindering efficient treatment of macrophage pathogens.
이에 본 발명은 SCOTIN 단백질의 과발현을 사용하여, 기존 약제와 작용기전이 다르고 부작용이 상대적으로 적은 결핵 예방 및 효율적인 치료 방법을 제공하고자 한다. Accordingly, the present invention provides a method for preventing and treating tuberculosis, which uses a SCOTIN protein overexpression and has a different action mechanism and relatively fewer side effects than conventional drugs.
전술한 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 대식세포(Macrophage)의 SCOTIN 단백질 과발현을 이용한 세포 내 결핵균의 생존 및 증식을 억제하는 방법을 제공한다.To achieve the above object, the present invention provides a method for inhibiting the survival and proliferation of intracellular Mycobacterium tuberculosis using macrophage SCOTIN protein overexpression.
또한 SCOTIN 단백질 과발현을 위하여 사용하는 조성물은 진핵세포에서 발현유도를 위한 벡터에 SCOTIN 단백질 유전자가 삽입되고 형질주입을 위한 화합물질 (transfection reagent) 등에 의하여 상기 벡터를 세포 안으로 투입시키는 단계에 의하여 결핵균의 생존 및 증식을 억제하는 방법을 제공한다. In addition, a composition used for SCOTIN protein overexpression includes a SCOTIN protein gene inserted into a vector for inducing expression in eukaryotic cells, and a step of injecting the vector into a cell by a transfection reagent for transfection, And a method for inhibiting proliferation.
구체적으로 상기 SCOTIN 단백질의 과발현은 V5 vector에 SCOTIN 단백질 유전자를 삽입하는 단계 및 형질주입을 위한 화합물질 (transfection reagent)에 의하여 수행되며 상기 SCOTIN-V5 vector는 결핵균에 감염된 대식세포의 세포자멸사(apoptosis)를 유도함으로써 결핵균의 증식을 억제하는 것을 특징으로 한다. Specifically, the overexpression of the SCOTIN protein is performed by inserting a SCOTIN protein gene into a V5 vector and transfection reagent for transfection. The SCOTIN-V5 vector is used for apoptosis of macrophages infected with Mycobacterium tuberculosis, Thereby inhibiting the proliferation of Mycobacterium tuberculosis.
또한 구체적으로 SCOTIN 단백질의 과발현을 위하여 사용하는 조성물은 SCOTIN-V5 vector(0.52 μg)인 것을 특징으로 한다. Specifically, the composition used for overexpression of SCOTIN protein is SCOTIN-V5 vector (0.52 μg).
또한 형질주입을 위한 화합물질 (transfection reagent)은 리포펙타민(Lipofectamine)인 것이 바람직하다.Also, the transfection reagent for transfection is preferably Lipofectamine.
이상과 같이 본 발명에 의하면 종래 전혀 알려져 있지 않던 대식세포(macrophage) SCOTIN 단백질 발현에 의한 세포자멸사 유도를 통해 결핵균 억제효과를 증명한 것이므로, 일반적인 결핵균 뿐만 아니라 기존 약제에 대해 다약제 내성이 있는 결핵균에 대해서도 예방 및 치료효과를 기대할 수 있다.As described above, according to the present invention, since the present invention demonstrates the inhibitory effect of Mycobacterium tuberculosis through induction of apoptosis by macrophage SCOTIN protein expression, which is not known at all in the past, Prevention and treatment effects can be expected.
또한 본 발명에 의하면 세포내에 잠복하고 있는 결핵균의 생장을 억제할 수 있기 때문에 SCOTIN 단백질의 과발현을 유도할 수 있는 화합물 자극 요법을 단독으로 사용하거나 종래 항결핵 약제와 병용한다면 결핵균 및 다약제 내성이 있는 결핵균에도 더욱 효과적일 것으로 사료된다. According to the present invention, since the growth of Mycobacterium tuberculosis that is latent in a cell can be inhibited, compound stimulation therapy that can induce overexpression of SCOTIN protein alone or in combination with a conventional anti-tuberculosis drug, It is thought to be more effective against M. tuberculosis.
도 1은 마우스 유래 대식세포주 Raw264.7 세포에서 SCOTIN 단백질의 과발현을 보여주는 Western blotting에 의한 V5 단백질 발현 전기영동사진.
도 2는 SCOTIN 단백질을 과발현시킨 대식세포주 Raw264.7 세포에 결핵균을 24, 48시간동안 감염시킨 후, 세포내 결핵균의 생존을 비교한 그래프.
도 3은 결핵균 감염된 대식세포에서 SCOTIN에 의해 활성화된 Caspase-3 단백질 발현 전기영동사진과 발현 정도를 수치화 시킨 그래프.
이하 첨부된 도면을 참조하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 그러나 첨부된 도면은 본 발명의 기술적 사상의 내용과 범위를 쉽게 설명하기 위한 예시일 뿐, 이에 의해 본 발명의 기술적 범위가 한정되거나 변경되는 것은 아니다. 또한 이러한 예시에 기초하여 본 발명의 기술적 사상의 범위 안에서 다양한 변형과 변경이 가능함은 당업자에게는 당연할 것이다. FIG. 1 is an electrophoresis image of V5 protein expression by Western blotting showing overexpression of SCOTIN protein in rat-derived macrophage cell Raw264.7 cells.
FIG. 2 is a graph comparing the survival of intracellular Mycobacterium tuberculosis after infecting the macrophage cell Raw264.7 cells overexpressing SCOTIN protein for 24 hours and 48 hours.
FIG. 3 is a graph showing electrophoresis and expression level of Caspase-3 protein activated by SCOTIN in M. tuberculosis-infected macrophages.
DETAILED DESCRIPTION OF THE PREFERRED EMBODIMENTS The present invention will be described in detail with reference to the accompanying drawings. It should be understood, however, that the appended drawings illustrate only the contents and scope of technology of the present invention, and the technical scope of the present invention is not limited thereto. It will be apparent to those skilled in the art that various changes and modifications can be made within the scope of the technical idea of the present invention based on these examples.
전술한 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 대식세포(Macrophage)의 SCOTIN 단백질 과발현을 이용한 세포 내 결핵균의 생존 및 증식을 억제하는 방법을 제공한다.To achieve the above object, the present invention provides a method for inhibiting the survival and proliferation of intracellular Mycobacterium tuberculosis using macrophage SCOTIN protein overexpression.
또한 SCOTIN 단백질 과발현을 위하여 사용하는 조성물은 진핵세포에서 발현유도를 위한 벡터에 SCOTIN 단백질 유전자가 삽입되고 형질주입을 위한 화합물질 (transfection reagent) 등에 의하여 상기 벡터를 세포안으로 투입시키는 단계에 의하여 결핵균의 생존 및 증식을 억제하는 방법을 제공한다. In addition, a composition used for SCOTIN protein overexpression includes a SCOTIN protein gene inserted into a vector for inducing expression in eukaryotic cells, and a step of injecting the vector into a cell by a transfection reagent for transfection, And a method for inhibiting proliferation.
구체적으로 상기 SCOTIN 단백질의 과발현은 V5 vector에 SCOTIN 단백질 유전자를 삽입하는 단계 및 형질주입을 위한 화합물질 (transfection reagent)에 의하여 수행되며 상기 SCOTIN-V5 vector는 결핵균에 감염된 대식세포의 세포자멸사(apoptosis)를 유도함으로써 결핵균의 증식을 억제하는 것을 특징으로 한다. Specifically, the overexpression of the SCOTIN protein is performed by inserting a SCOTIN protein gene into a V5 vector and transfection reagent for transfection. The SCOTIN-V5 vector is used for apoptosis of macrophages infected with Mycobacterium tuberculosis, Thereby inhibiting the proliferation of Mycobacterium tuberculosis.
또한 구체적으로 SCOTIN 단백질의 과발현을 위하여 사용하는 조성물은 SCOTIN-V5 vector(0.52 μg)인 것을 특징으로 한다. Specifically, the composition used for overexpression of SCOTIN protein is SCOTIN-V5 vector (0.52 μg).
또한 형질주입을 위한 화합물질 (transfection reagent)은 리포펙타민(Lipofectamine)인 것이 바람직하다. Also, the transfection reagent for transfection is preferably Lipofectamine.
본원발명은 세포내 SCOTIN 단백질 발현유도를 위해 SCOTIN vector와 리포펙타민(Lipofectamine)과 같은 형질주입을 위한 화합물질 (transfection reagent)을 이용하여 SCOTIN 단백질 과발현유도방법이며, SCOTIN 발현 대식세포에 결핵균 감염시 결핵균 증식이 억제되었다는 것이 특징입니다. 과발현을 위해 가장 핵심적인 것이 SCOTIN vector이며 리포펙타민은 대식세포 내 SCOTIN 단백질 과발현을 위해서 SCOTIN vector를 형질주입하기 위해 사용하는 reagent입니다. The present invention relates to a method for inducing overexpression of SCOTIN protein using a transfection reagent such as SCOTIN vector and lipofectamine for the induction of SCOTIN protein expression in a cell, It is characterized by the suppression of mycobacterial growth. The key to overexpression is the SCOTIN vector, which is a reagent used to transduce the SCOTIN vector for overexpression of the SCOTIN protein in macrophages.
이하 본 발명에 따른 SCOTIN 단백질의 과발현을 이용한 세포 내 결핵균의 생존 및 증식 억제방법의 바람직한 실시예를 첨부한 도면을 참조로 하여 상세히 설명한다. 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있으며, 단지 본 실시예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위하여 제공되는 것이다.Hereinafter, preferred embodiments of a method for inhibiting the survival and proliferation of mycobacteria in a cell using overexpression of the SCOTIN protein according to the present invention will be described in detail with reference to the accompanying drawings. It is to be understood that the present invention is not limited to the disclosed embodiments, but may be embodied in many different forms and should not be construed as limited to the embodiments set forth herein. Rather, these embodiments are provided so that this disclosure will be thorough and complete, It is provided to inform.
실시예 1Example 1
대식세포의 SCOTIN 단백질 과발현을 위한 단계Steps for Overexpression of SCOTIN Protein in Macrophages
대식세포주 Raw264.7 세포에서 SCOTIN 단백질 과발현을 위하여 각각 500ng의 SCOTIN vector와 Empty Vector를 lipofectamine(0.75ul, 1.5ul)을 이용하여 세포내 형질주입 해주었다. 도 1은 18시간 후, vector 마커인 V5 단백질 발현정도를 Western blotting 방법으로 확인한 결과, 대식세포 내 SCOTIN 단백질의 발현을 확인할 수 있었다.For the overexpression of SCOTIN protein in macrophage Raw264.7 cells, 500 ng of SCOTIN vector and empty vector were injected intracellularly with lipofectamine (0.75 ul, 1.5 ul). FIG. 1 shows the expression of the SCOTIN protein in macrophages after 18 hours by Western blotting of the vector marker V5 protein expression.
실시예 2Example 2
SCOTIN 단백질 과발현이 결핵균 억제에 미치는 효과 확인Effect of SCOTIN overexpression on mycobacteria inhibition
도 2는 도 1에서 확인한 SCOTIN 단백질을 과발현시킨 대식세포에 결핵균 H37Rv를 MOT=1로 감염시킨 후, 세포내 결핵균 생존비율을 비교한 그래프이다. 결핵균 감염 24, 48시간 이후, 3차 증류수를 사용하여 세포에서 결핵균을 용출시키고 7H10 배지에서 14일간 배양하여 세포내 결핵균 생존율을 확인하였다. 결핵균 감염 시 SCOTIN 단백질을 과발현시킨 대식세포에서 세포내 결핵균의 생존이 억제되는 것을 확인할 수 있었다.FIG. 2 is a graph comparing survival rates of Mycobacterium tuberculosis after infecting macrophages with the SCOTIN protein overexpressed as shown in FIG. 1 with MOT = 1 of Mycobacterium tuberculosis H37Rv. Mycobacterium tuberculosis was eluted from the cells using a third distilled water at 24 and 48 hours after the infection with Mycobacterium tuberculosis and cultured in 7H10 medium for 14 days. The survival of intracellular Mycobacterium tuberculosis was inhibited in the macrophage cells overexpressing SCOTIN protein when infected with M. tuberculosis.
실시예 3.Example 3.
결핵균 생존을 억제시키는 기작에 대한 확인 Identification of mechanisms that inhibit the survival of M. tuberculosis
도 3은 결핵균 감염된 대식세포에서 SCOTIN에 의해 활성화된 Caspase-3 단백질 전기영동사진과 그 발현 정도를 수치화 시킨 그래프이다. 이는 Caspase 활성을 통해 세포자멸사를 유도함으로써 세포 내 결핵균의 생존을 억제시키는 기전으로 작용하였음을 알 수 있다. FIG. 3 is a graph showing the expression of Caspase-3 protein electrophoresis activated by SCOTIN and its expression level in macrophages infected with M. tuberculosis. This suggests that caspase activity induced apoptosis and thus inhibited the survival of intracellular M. tuberculosis.
상기 실시예에서는 대식세포에서 SCOTIN 단백질 과발현이 Caspase 의존적인 세포자멸사를 통해 결핵균의 생존을 억제시키는 데에 효과적인 기전임을 나타낸다. 본 발명은 결핵균뿐만 아니라 다양한 세포내 기생세균의 감염에 관련한 대식세포의 병원균 생존 억제 연구에 적용가능하며, SCOTIN 조절 화합물을 통한 치료제 개발에도 광범위하게 활용이 가능할 것으로 사료된다.The above example shows that overexpression of SCOTIN protein in macrophages is an effective mechanism to suppress the survival of Mycobacterium tuberculosis through Caspase-dependent apoptosis. The present invention can be applied to inhibition of pathogen viability of macrophages related to infections of various intracellular parasitic bacteria as well as to tubercle bacillus, and it can be widely used for the development of therapeutic agents through SCOTIN regulatory compounds.
Claims (5)
상기 SCOTIN 단백질의 과발현은 결핵균에 감염된 대식세포의 세포자멸사(apoptosis)를 유도함으로써 결핵균의 증식을 억제하는 것을 특징으로 하는 결핵균의 생존 및 증식을 억제하는 방법. The method according to claim 1,
Wherein the overexpression of the SCOTIN protein inhibits the proliferation of Mycobacterium tuberculosis by inducing apoptosis of macrophages infected with Mycobacterium tuberculosis.
상기 SCOTIN 단백질의 과발현은 하기의 단계에 의해 수행되는 결핵균의 생존 및 증식을 억제하는 방법 :
진핵세포에서 발현유도를 위한 벡터에 SCOTIN 단백질 유전자를 삽입하는 단계; 및
형질주입을 위한 화합물질(transfection reagent)을 첨가하는 단계.The method according to claim 1,
Wherein the overexpression of the SCOTIN protein is inhibited by the following steps:
Inserting a SCOTIN protein gene into a vector for induction of expression in eukaryotic cells; And
Adding a transfection reagent for transfection.
상기 진핵세포에서 발현유도를 위한 벡터에 SCOTIN 단백질 유전자를 삽입하는 단계는 V5 vector에 SCOTIN 단백질 유전자가 삽입된 형태로서, 농도는 0.52 μg/ml인 것을 특징으로 하는 결핵균의 생존 및 증식을 억제하는 방법. The method of claim 3,
The step of inserting the SCOTIN protein gene into the vector for induction of expression in the eukaryotic cell is characterized in that the SCOTIN protein gene is inserted into the V5 vector and the concentration is 0.52 μg / ml. In order to suppress the survival and proliferation of the Mycobacterium tuberculosis .
상기 형질주입을 위한 화합물질은 리포펙타민(Lipofectamine)인 것을 특징으로 하는 결핵균의 생존 및 증식을 억제하는 방법. The method of claim 3,
Wherein the compound for the transfusion is Lipofectamine. ≪ RTI ID = 0.0 > 8. < / RTI >
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