KR101879392B1

KR101879392B1 - 대장암의 림프절 전이를 진단하기 위한 miRNA 분별자 및 이를 이용한 대장암에서 림프절 전이 진단 방법

Info

Publication number: KR101879392B1
Application number: KR1020160115056A
Authority: KR
Inventors: 정연준; 정찬권; 정승현
Original assignee: 가톨릭대학교산학협력단
Priority date: 2016-09-07
Filing date: 2016-09-07
Publication date: 2018-07-18
Also published as: KR20180027863A

Abstract

본 발명은 대장암의 림프절 전이를 진단하기 위한 miRNA 분별자로서 miR-342-3p, miR-3621 및 miR361-3p의 3-miRNA 분별자를 제공하는 것이며, 또한 이를 이용하여 대장암에서 림프절 전이 여부를 판단하는 방법에 관한 것으로, 본 발명에서 확인한 3-miRNA 분별자 중 miR-342-3p 및 miR-361-3p는 LNM 양성의 CRC에서 LNM 음성에 비해 하향 조절되며, miR-3621는 림프절전이 양성의 CRC에서 림프절전이 음성에 비해 상향 조절되어, 이를 대장암에서 림프절전이 여부를 판단하기 위한 바이오마커로 사용할 수 있다. 또한, 상기 miR-342-3p, miR-361-3p 또는 miR-3621의 타겟 유전자로부터 발현되는 단백질인 E2F1, RAP2B, FOXM1, PIK3R3, AKT1 및 WINT5A 역시 림프절전이 양성의 CRC에서 유의적으로 발현 증가하므로, 대장암에서 림프절전이 여부를 판단하기 위한 바이오마커로 사용될 수 있다.
본 발명의 3-miRNA 분별자 및 이의 타겟 유전자로부터 발현되는 단백질을 바이오마커로 사용하는 경우, 초기 대장암에서 림프절 전이가 일어났는지의 여부를 보다 정확하고 신속하게 판단할 수 있어, 만일 내시경으로 절제할 수 있는 T1-기 CRC에 대하여 불필요한 추가 수술의 횟수가 감소할 수 있을 것으로 기대할 수 있어, 효과적이다.

Description

대장암의 림프절 전이를 진단하기 위한 miRNA 분별자 및 이를 이용한 대장암에서 림프절 전이 진단 방법{miRNA classifier for for the diagnosis of lymph node metastasis of colorectal cancer and a method for diagnosis using the same as}

본 발명은 대장암의 림프절 전이를 진단하기 위한 miRNA 분별자로서 miR-342-3p, miR-3621 및 miR361-3p의 3-miRNA 분별자를 제공하는 것이며, 또한 이를 이용하여 대장암에서 림프절 전이 여부를 판단하는 방법에 관한 것이다.

대장암(colorectal cancer, CRC) 스크리닝 프로그램의 발전은 초기 단계에서 악성 용종(malignant polyps)을 확인할 수 있는 기회의 증가를 제공하고 있다. 이러한 초기 단계로 진단되는 대부분의 CRC는 치료 가능한 것으로 알려져 있다(비특허문헌 1). 최근들어, 내시경적 점막 절제술(EMR: Endoscopic Mucosal Resection) 및 내시경적 점막절개박리술 Endoscopic submucosal dissection : ESD)이 T1-기(점막하 침입;점막하 침입)단계의 CRC 환자의 치료에서 넓게 사용되고 있다(비특허문헌 2, 비특허문헌 3). 비록 내시경 치료가 T1-기 CRC를 가지는 환자에서 수술한 것과 병리학적으로 낮은 위험도 및 완전한 절제연 면에서 동일한 결과를 가져 온다고 하더라도, T1-기 CRC의 내시경적 절제술(endoscopic resection) 후의 생존률 대비 이후 수술에 대한 가이드라인의 유효성은 여전히 많은 논란을 가진다.

림프절 전이(lymph node metastasis, LNM)는 점막하 침윤 깊이, 림프관 침범, 조직학적 등급 및 종양 발아(tumor budding)와 같은 병리학적인 소견과 연관되어있음이 알려져 있다(비특허문헌 2, 비특허문헌 3, 비특허문헌 4, 비특허문헌 5). 그러나, 이러한 요소를 가지지 않는 T1-기 CRC의 저-위험도 케이스의 약 1.2%에서 국소 부위의 림프절 전이가 발생하므로 이러한 병리학적 위험 인자만으로는 LNM의 예측에 충분하지 않음을 나타난다(비특허문헌 2).

결과적으로, 국소 부위의 종양 재발 및 림프절 전이에 대한 우려로 인해 T1-기 CRC으로 인해 내시경적 절제술을 받은 환자의 약 80%는 불필요한 추가적인 수술을 받게 된다(비특허문헌 6). 따라서, 만일 내시경으로 절제할 수 있는 T1-기 CRC에 대하여 보다 정확하게 국소부위의 림프절 전이의 가능성을 예측할 수 있다면, 불필요한 추가 수술의 빈도가 감소할 수 있을 것으로 기대되고 있다. 이를 위하여, T1-기 CRC의 내시경적 절제술 이후 림프절 전이를 정확히 예측할 수 있도록 하는 새로운 마커를 발견하는 것이 매우 중요하게 되었다.

초기 CRC에서 림프절 전이의 진단을 위하여 분자 유전학적 생물마커를 발굴하기 위하여 많은 연구가 진행된 바 있다(비특허문헌 7). 이러한 바이오 마커 중 하나는 마이크로 RNA(microRNA, miRNA)이다. miRNA는 길이 19-25 뉴클레오티드를 포함하는 비-암호화 단일 가닥 RNA이며, 전사 후 유전자 발현을 조절하는 역할을 가진다. 수많은 연구들에서 miRNA가 대장 샘종 및 대장암에서 miRNA의 발현 수준이 변화하며, 정상 수준을 벗어난 miRNA의 발현은 종양 세포의 생장, 침윤 및 CRC의 전이와 관련됨이 보고된 바 있다. 따라서, miRNA는 CRC의 수술 및 치료 결과를 위한 예후 또는 진단용 마커로 사용될 수 있음이 제시되고 있다(비특허문헌 8, 비특허문헌 9). 이 외에도 miRNA를 이용하여 유방암의 발병 여부 또는 과민성 대장 증후군을 진단하거나(특허문헌 1, 특허문헌 2), 림프절 전이 여부를 외과적 시술 없이 감별할 수 있는 진단 마커로서 혈청 내 miRNA 발현 수준을 확인하는 방법이 보고된 바 있다(특허문헌 3).

CRC에서 발현 수준이 변화하는 miRNA에 대하여도 일부 연구가 진행된 바 있다. miR-99b, miR-139, miR-195, miR-199b 및 miR-342의 miRNA가 CRC에서 림프절 전이에 관여할 수 있는 것으로서 보고된 바 있으며(비특허문헌 14), miR-324는 모든 단계의 CRC에서 하향 조절되어 있고 miR-140 또한 CRC에서 하향 조절됨이 보고된 바 있으나(비특허문헌 10, 비특허문헌 18), 아직까지 보다 효과적이고 정확하게 대장암에서 림프절 전이 여부를 판단할 수 있는 miRNA에 대하여 연구되지 않아 이를 발굴하고자 연구가 진행되고 있다.

이에, 본 발명자들은 조기 대장암(CRC)에서 림프절 전이 여부를 판단할 수 있는 마커를 발굴하여 내시경적 절제술 이전 또는 이후 불필요한 추가 수술을 방지할 수 있는 진단 방법을 개발하고자 노력한 결과, CRC 환자의 조직 시료로부터 LNM 여부에 따라 발현 양상이 달라지는 miRNA를 스크리닝하였고, 이 중에서 miRNA 분별자(classifier)로서 신뢰도가 높은 miRNA를 선별한 결과, 림프절 전이가 있는 그룹에서 하향 조절되는 miR-342-3p 및 miR-361-3p; 및 상향 조절되는 miR-3621로 이루어진 3 개의 miRNA으로 구성된 분별자(3-miRNA 분별자)를 최종 선별하였다. 또한, 상기 3-miRNA 분별자의 타겟 유전자로부터 발현되는 단백질과도 림프절 전이 여부가 연관 관계를 가져, 림프절 전이를 보인 CRC 시료에서 E2F1, RAP2B, FOXM1, PIK3R3, AKT1 및 WINT5A 발현이 유의적으로 증가하므로, 상기 3-miRNA 분별자 및 이의 타겟 유전자로부터 발현되는 단백질이 초기 대장암에서 림프절 전이 여부를 판단할 수 있는 바이오마커로 사용할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

KR 10-1596166 B1 US 2016-0153041 A1 KR 10-1381894 B1

Shin, Aesun, et al. "Increasing trend of colorectal cancer incidence in Korea, 1999-2009." Cancer Research and Treatment 44.4 (2012): 219-226. Ryu, Han Suk, et al. "Combined morphologic and molecular classification for predicting lymph node metastasis in early-stage colorectal adenocarcinoma." Annals of surgical oncology 21.6 (2014): 1809-1816. Ikematsu, Hiroaki, et al. "Long-term outcomes after resection for submucosal invasive colorectal cancers." Gastroenterology 144.3 (2013): 551-559. Watanabe, Toshiaki, et al. "Japanese Society for Cancer of the Colon and Rectum (JSCCR) guidelines 2010 for the treatment of colorectal cancer." International journal of clinical oncology 17.1 (2012): 1-29. Tanaka, Shinji, et al. "Towards safer and appropriate application of endoscopic submucosal dissection for T1 colorectal carcinoma as total excisional biopsy: Future perspectives." Digestive Endoscopy 27.2 (2015): 216-222. Goncalves, Bruno Moreira, et al. "Oncological outcomes after endoscopic removal of malignant colorectal polyps." (2013). Julie Bogaert and Hans Prenen. "Molecular genetics of colorectal cancer" Ann Gastroenterol. 2014; 27(1): 9-14. Yang, Linda, Narasimhaswamy Belaguli, and David H. Berger. "MicroRNA and colorectal cancer." World journal of surgery 33.4 (2009): 638-646. Schetter, Aaron J., Hirokazu Okayama, and Curtis C. Harris. "The role of microRNAs in colorectal cancer." Cancer journal (Sudbury, Mass.) 18.3 (2012): 244. Wang, Hui, et al. "MicroRNA-342 inhibits colorectal cancer cell proliferation and invasion by directly targeting DNA methyltransferase 1." Carcinogenesis 32.7 (2011): 1033-1042. Ma, Fei, et al. "MiR-361-5p inhibits colorectal and gastric cancer growth and metastasis by targeting staphylococcal nuclease domain containing-1." Oncotarget 6.19 (2015): 17404-17416. Liu, Dachuang, et al. "MiR-361-5p acts as a tumor suppressor in prostate cancer by targeting signal transducer and activator of transcription-6 (STAT6)." Biochemical and biophysical research communications 445.1 (2014): 151-156. Roth, Carina, et al. "Low levels of cell-free circulating miR-361-3p and miR-625* as blood-based markers for discriminating malignant from benign lung tumors." PLoS One 7.6 (2012): e38248. Wang, Xueqing, et al. "Downregulation of miR-195 correlates with lymph node metastasis and poor prognosis in colorectal cancer." Medical oncology 29.2 (2012): 919-927. Feng, Junlan, et al. "miR-150 functions as a tumour suppressor in human colorectal cancer by targeting c-Myb." Journal of cellular and molecular medicine 18.10 (2014): 2125-2134. Ma, Yanlei, et al. "miR-150 as a potential biomarker associated with prognosis and therapeutic outcome in colorectal cancer." Gut (2011): gutjnl-2011. Pizzini, Silvia, et al. "Impact of microRNAs on regulatory networks and pathways in human colorectal carcinogenesis and development of metastasis." BMC genomics 14.1 (2013): 589. Song, Bo, et al. "Mechanism of chemoresistance mediated by miR-140 in human osteosarcoma and colon cancer cells." Oncogene 28.46 (2009): 4065-4074. Bosman, Fred T., et al. WHO classification of tumours of the digestive system. No. Ed. 4. World Health Organization, 2010. Jung, Seung-Hyun, et al. "Genome-Wide Copy Number Variation Analysis Identifies Deletion Variants Associated With Ankylosing Spondylitis." Arthritis & rheumatology 66.8 (2014): 2103-2112.

이에, 본 발명자들은 초기 대장암(CRC)에서 림프절 전이(LNM) 여부에 따라 발현 양상의 차이를 나타내는 miRNA를 확인하여 림프절 전이가 있는 그룹에서 하향 조절되는 miR-342-3p 및 miR-361-3p; 및 상향 조절되는 miR-3621로 이루어진 3 개의 miRNA으로 구성된 분별자(3-miRNA 분별자)를 최종 선별하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 초기 대장암 환자에서 내시경 절제 이전 또는 이후 불필요한 수술을 방지할 수 있도록 하기 위한, 대장암(colorectal cancers, CRC)의 림프절 전이(lymph node metastasis, LNM) 진단용 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 또다른 목적은 상기 대장암의 림프절 전이 진단용 조성물을 포함하는 키트를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 또다른 목적은 대장암 환자에서 림프절 전이 여부를 판단할 수 있는 진단 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 miR-342-3p, miR-195-5p, miR-150-5p, miR-140-3p, miR-361-3p, miR-192-3p, miR-200b-5p, miR-185-5p, miR-3621, miR-1287 및 miR-3132로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA 발현 수준을 측정하기 위한 제제를 포함하는, 대장암(colorectal cancers, CRC)의 림프절 전이(lymph node metastasis, LNM) 진단용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 대장암의 림프절 전이 진단용 키트를 제공한다.

본 발명의 바람직한 일실시예에서, 상기 제제는 상기 miRNA에 특이적으로 결합하는 물질일 수 있으며, 상기 물질은 상기 miRNA 또는 이의 상보적 염기서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에서, 상기 제제는 상기 miRNA의 타겟 유전자로부터 발현되는 단백질에 특이적으로 결합하는 물질일 수 있으며, 상기 단백질은 E2F1, RAP2B, FOXM1, PIK3R3, AKT1 또는 WINT5A 중 어느 하나인 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에서, 상기 대장암은 T1-기(T1-phase)의 조기 대장암일 수 있다.

또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 대장암에서 림프절 전이 여부의 정보를 제공하기 위한 시료 내 miRNA의 측정 방법을 제공한다:

i) 대조군으로서, 림프절 전이(LNM) 음성의 대장암 개체로부터 유래된 시료에서 miR-342-3p, miR-195-5p, miR-150-5p, miR-140-3p, miR-361-3p, miR-192-3p, miR-200b-5p, miR-185-5p, miR-3621, miR-1287 및 miR-3132로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA 발현 수준을 확인하는 단계;

ii) 실험군으로서, 대장암 개체로부터 유래된 시료에서 miR-342-3p, miR-195-5p, miR-150-5p, miR-140-3p, miR-361-3p, miR-192-3p, miR-200b-5p, miR-185-5p, miR-3621, miR-1287 및 miR-3132로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA 발현 수준을 확인하는 단계; 및

iii) 상기 단계 ii)에서 확인한 실험군의 miRNA 발현 수준을 상기 단계 i)에서 확인한 대조군의 miRNA 발현 수준과 비교하는 단계.

본 발명의 바람직한 일실시예에서, 상기 단계 iii)에서 비교한 결과가 하기 a) 내지 c) 중 어느 하나 이상에 해당하는 경우, 림프절 전이 양성으로 판단하는 단계;를 추가로 포함할 수 있다:

a) miR-342-3p 발현 수준의 하향 조절;

b) miR-195-5p 발현 수준의 하향 조절;

c) miR-150-5p 발현 수준의 하향 조절;

d) miR-140-3p 발현 수준의 하향 조절;

e) miR-361-3p 발현 수준의 하향 조절;

f) miR-192-3p 발현 수준의 하향 조절;

g) miR-200b-5p 발현 수준의 하향 조절;

h) miR-185-5p 발현 수준의 하향 조절;

i) miR-30a-5p 발현 수준의 하향 조절;

j) miR-28-5p 발현 수준의 하향 조절;

k) miR-3621 발현 수준의 상향 조절;

l) miR-1287 발현 수준의 상향 조절; 및

m) miR-3132 발현 수준의 상향 조절.

또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 대장암에서 림프절 전이 여부의 정보를 제공하기 위한 시료 내 단백질의 측정 방법을 제공한다:

i) 대조군으로서, 림프절 전이(LNM) 음성의 대장암 개체로부터 유래된 시료에서 miR-342-3p, miR-195-5p, miR-150-5p, miR-140-3p, miR-361-3p, miR-192-3p, miR-200b-5p, miR-185-5p, miR-3621, miR-1287 및 miR-3132로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA의 타겟 유전자로 암호화되는 단백질의 발현 수준을 확인하는 단계;

ii) 실험군으로서, 대장암 개체로부터 유래된 시료에서 miR-342-3p, miR-195-5p, miR-150-5p, miR-140-3p, miR-361-3p, miR-192-3p, miR-200b-5p, miR-185-5p, miR-3621, miR-1287 및 miR-3132로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA의 타겟 유전자로 암호화되는 단백질의 발현 수준을 확인하는 단계; 및

iii) 상기 단계 ii)에서 확인한 실험군의 단백질의 발현 수준을 상기 단계 i)에서 확인한 대조군의 단백질의 발현 수준과 비교하는 단계.

본 발명의 바람직한 일실시예에서, 상기 단계 i)의 단백질 및 상기 단계 ii)의 단백질은 E2F1, RAP2B, FOXM1, PIK3R3, AKT1 또는 WINT5A 중 어느 하나일 수 있다.

본 발명의 또다른 바람직한 일실시예에서, 상기 단계 iii)에서 비교한 결과가 하기 a) 내지 c) 중 어느 하나 이상에 해당하는 경우, 림프절 전이 양성으로 판단하는 단계;를 추가로 포함할 수 있다:

a) E2F1 발현 수준 증가;

b) RAP2B 발현 수준 증가;

c) FOXM1 발현 수준 증가;

d) PIK3R3 발현 수준 증가;

e) AKT1 발현 수준 증가; 및

f) WINT5A 발현 수준 증가.

따라서, 본 발명은 초기 대장암 환자에서 내시경 절제 이전 또는 이후 불필요한 추가 수술을 방지할 수 있도록 하기 위한, 대장암(colorectal cancers, CRC)의 림프절 전이(lymph node metastasis, LNM) 진단용 조성물 및 진단 방법을 제공한다.

본 발명에서 확인한 3-miRNA 분별자 중 miR-342-3p 및 miR-361-3p는 림프절 전이 양성의 CRC에서 림프절 전이 음성에 비해 하향 조절되며, miR-3621는 림프절 전이 양성의 CRC에서 림프절 전이 음성에 비해 상향 조절되어, 이를 대장암에서 LNM 여부를 판단하기 위한 바이오마커로 사용할 수 있다. 또한, 상기 miR-342-3p, miR-361-3p 또는 miR-3621의 타겟 유전자로부터 발현되는 단백질인 E2F1, RAP2B, FOXM1, PIK3R3, AKT1 및 WINT5A 역시 림프절 전이 양성의 CRC에서 유의적으로 발현 증가하므로, 대장암에서 림프절 전이 여부를 판단하기 위한 바이오마커로 사용될 수 있다.

본 발명의 3-miRNA 분별자 및 이의 타겟 유전자로부터 발현되는 단백질을 바이오마커로 사용하는 경우, 초기 대장암에서 림프절 전이가 일어났는지의 여부를 보다 정확하고 신속하게 판단할 수 있어, 만일 내시경으로 절제할 수 있는 T1-기 CRC에 대하여 불필요한 추가 수술의 횟수가 감소할 수 있을 것으로 기대할 수 있어, 효과적이다.

도 1은 본 발명의 대장암(CRC)의 림프절 전이(LNM) 여부를 판단하기 위한 3-miRNA 분별자(classifier)를 선별하는 과정을 나타낸 모식도이다.
도 2는 계층적 클러스터링 분석을 통해서 확인한 림프절 전이 유무에 따라 T1-기의 CRC 환자 유래 miRNA 발현 양상의 차이를 나타낸다.
도 3은 CRC 환자 유래 조직에서 림프절 전이 양성 및 음성에 따른 miRNA 분별자 후보군의 발현 수준 차이를 나타낸다.
도 4는 miRNA 분별자 후보군의 림프절 전이 여부 진단 신뢰도 확인을 위한 ROC(receiver operating characteristic) 곡선 분석을 나타낸다:
도 4a는 분별자 구성 세트-I 및 분별자 구성 세트-II의 조합을 대상으로 하여 ROC 곡선 분석한 결과이며; 및
도 4b는 상기 분별자 구성 세트와 독립적인 CRC 환자군을 대상으로 하여 ROC 곡선 분석한 결과이다.
도 5는 림프절 전이 진단을 위한 3-miRNA 분별자의 타겟 유전자에 대한 유전자 온톨로지(ontology) 및 신호전달 경로의 확인을 나타낸다.
도 6은 본 발명의 3-miRNA 분별자의 타겟 유전자로부터 발현되는 단백질인 E2F1, RAP2B, FOXM1, PIK3R3, AKT1 및 WINT5A의 대장암 조직 내 발현 수준을 확인한 조직면역화학염색 결과이다.
도 7은 본 발명의 3-miRNA 분별자 및 이의 타겟 유전자로부터 발현된 단백질의 발현 간의 상관 관계를 나타낸 분석 결과이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

상술한 바와 같이, 초기 대장암에서 림프절 전이의 여부를 신속하고 정확하게 판단할 수 있는 진단 방법이 개발되지 않아, 내시경으로 절제할 수 있는 초기 대장암에서도 이후 전이 또는 재발의 우려로 불필요한 수술이 진행되는 경우가 많았다.

본 발명에서 확인한 3-miRNA 분별자 중 miR-342-3p 및 miR-361-3p는 림프절 전이 양성의 CRC에서 림프절 전이 음성에 비해 하향 조절되며, miR-3621는 림프절 전이 양성의 CRC에서 림프절 전이 음성에 비해 상향 조절되어, 이를 대장암에서 림프절 전이 여부를 판단하기 위한 바이오마커로 사용할 수 있다. 또한, 상기 miR-342-3p, miR-361-3p 또는 miR-3621의 타겟 유전자로부터 발현되는 단백질인 E2F1, RAP2B, FOXM1, PIK3R3, AKT1 및 WINT5A 역시 림프절 전이 양성의 CRC에서 유의적으로 발현 증가하므로, 대장암에서 림프절 전이 여부를 판단하기 위한 바이오마커로 사용될 수 있다.

따라서, 본 발명은 miR-342-3p, miR-195-5p, miR-150-5p, miR-140-3p, miR-361-3p, miR-192-3p, miR-200b-5p, miR-185-5p, miR-3621, miR-1287 및 miR-3132로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA 발현 수준을 측정하기 위한 제제를 포함하는, 대장암(colorectal cancers, CRC)의 림프절 전이(lymph node metastasis, LNM) 진단용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 진단용 조성물을 포함하는, 대장암의 림프절 전이 진단용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 miR-342-3p, miR-361-3p 및 miR-3621로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA 발현 수준을 측정하기 위한 제제를 포함하는, 대장암(colorectal cancers, CRC)의 림프절 전이(lymph node metastasis, LNM) 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명의 “제제”는 miR-342-3p, miR-195-5p, miR-150-5p, miR-140-3p, miR-361-3p, miR-192-3p, miR-200b-5p, miR-185-5p, miR-3621, miR-1287 및 miR-3132로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA에 특이적으로 결합하는 물질인 것이 바람직하며, 구체적으로 상기 물질은 상기 miRNA 또는 이의 상보적 염기서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브인 것이 보다 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 프라이머는 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 갖는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성이 개시될 수 있다. 본 발명에서는 위 하나 이상의 miRNA에 특이적으로 결합하는 센스 및 안티센스 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 실시하여 발현 수준을 확인함으로써 대장암의 림프절로의 전이 여부를 진단할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.

프로브는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수십 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링 되어 있다. 프로브는 올리고뉴클로타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 본 발명에서는 위 하나 이상의 miRNA와 상보적인 프로브를 이용하여 혼성화를 실시하여 발현 수준을 확인함으로써 대장암의 림프절로의 전이 여부를 진단할 수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.

본 발명의 “제제”는 miR-342-3p, miR-195-5p, miR-150-5p, miR-140-3p, miR-361-3p, miR-192-3p, miR-200b-5p, miR-185-5p, miR-3621, miR-1287 및 miR-3132로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA의 타겟 유전자로부터 발현되는 단백질에 특이적으로 결합하는 물질인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 단백질은 E2F1, RAP2B, FOXM1, PIK3R3, AKT1 또는 WINT5A 중 어느 하나인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

구체적으로, miR-342-3p의 타겟 유전자로부터 발현되는 단백질은 E2F1, RAP2B AKT1 또는 FOXM1이고, miR-361-3p의 타겟 유전자로부터 발현되는 단백질은 PIK3R3 또는 AKT1이며, miR-3621의 타겟 유전자로부터 발현되는 단백질은 RAB2B 또는 WINT5A이고, 보다 구체적으로, 상기 miR-342-3p의 타겟 유전자로부터 발현되는 단백질은 E2F1, RAP2B 또는 AKT1 이고, miR-361-3p의 타겟 유전자로부터 발현되는 단백질은 E2F1 이며, miR-3621의 타겟 유전자로부터 발현되는 단백질은 RAB2B인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 “대장암”은 T1-기(T1-phase)의 조기 대장암인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 그러나, 조기 대장암에서 림프절 전이를 판단하는 것은 내시경 절제 이후 치료 목적의 수술에 있어서 불필요한 수술 횟수를 감소시킬 수 있기 때문에, 본 발명의 대장암이 조기 대장암인 것이 보다 바람직하다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 림프절 전이 양성 또는 음성의 CRC 환자군을 분별자 구성 세트-I 및 분별자 구성 세트-II로 나누어(표 1), 이 중 분별자 구성 세트-I 환자군 유래의 CRC 조직으로부터 miRNA 마이크로어레이 분석을 수행하여 림프절 전이 양성군과 림프절 전이 음성군에서 발현 양상의 차이를 나타내는 miRNA를 선별하였고([표 3] 및 도 2), 이 중 발현 양상의 차이를 높은 수준으로 나타내는 miRNA를 선별하여 분별자 구성 세트-I 및 분별자 구성 세트-II 환자군 유래의 CRC으로부터 추출한 RNA로 다시 qRT-PCR 분석하여 최종적으로 miR-342-3p, miR-361-3p 및 miR-3621의 3-miRNA 분별자를 선별하였다([표 4], [표 5], 도 3 및 도 4a).

상기 3-miRNA 분별자 중 miR-342-3p 및 miR-361-3p는 림프절 전이 양성의 CRC에서 림프절 전이 음성에 비해 하향 조절되며, miR-3621는 림프절 전이 양성의 CRC에서 림프절 전이 음성에 비해 상향 조절되며, 본 발명자들은 상기 분별자 구성 세트-I 및 분별자 구성 세트-II 외의 독립적인 환자군을 재선별하여([표 2]), 상기 3-miRNA 분별자의 발현 양상을 확인하여 높은 신뢰도를 가지는 것을 확인하였다(도 4b).

또한, 본 발명자들은 3-miRNA 분별자인 miR-342-3p, miR-361-3p 및 miR-3621이 각각 가지는 분자유전적 기능을 확인한 결과, 이들은 종양의 형성, 종양의 진행 및 암 재발과 관련된 신호전달경로에 관여하는 것을 확인하였다([표 6] 및 [표 7]). 이에, 3-miRNA 분별자의 타겟 유전자를 선별하여 유전자의 전사 조절 여부를 확인한 결과, E2F1, RAP2B, 및 AKT1의 대장암 조직 내 단백질 발현 수준에 있어서 림프절 전이-음성에 비해 림프절 전이-양성에서 유의적으로 높은 수준으로 나타나는 것을 확인하였다(도 6).

따라서, 본 발명에서 확인한 3-miRNA 분별자 중 miR-342-3p 및 miR-361-3p는 림프절 전이 양성의 CRC에서 림프절 전이 음성에 비해 하향 조절되며, miR-3621는 림프절 전이 양성의 CRC에서 림프절 전이 음성에 비해 상향 조절되어, 이를 대장암에서 림프절 전이 여부를 판단하기 위한 바이오마커로 사용할 수 있다. 또한, 상기 miR-342-3p, miR-361-3p 또는 miR-3621의 타겟 유전자로부터 발현되는 단백질인 E2F1, RAP2B, FOXM1, PIK3R3, AKT1 및 WINT5A 역시 림프절 전이 양성의 CRC에서 유의적으로 발현 증가하므로, 대장암에서 림프절 전이 여부를 판단하기 위한 바이오마커로 사용될 수 있다.

본 발명의 “시료 내 miRNA의 측정 방법”에 있어서, 상기 단계 iii)에서 비교한 결과가 하기 a) 내지 m) 중 어느 하나 이상에 해당하는 경우, 림프절 전이 양성으로 판단하는 단계를 추가로 포함할 수 있다:

a) miR-342-3p 발현 수준의 하향 조절 (cut-off value: 0.54, Sensitivity: 80%, Specificity: 75%);

b) miR-195-5p 발현 수준의 하향 조절(cut-off value: 0.18, Sensitivity: 80%, Specificity: 69%);

c) miR-150-5p 발현 수준의 하향 조절(cut-off value: 0.30, Sensitivity: 75%, Specificity: 81%);

d) miR-140-3p 발현 수준의 하향 조절(cut-off value: 0.43, Sensitivity: 90%, Specificity: 69%);

e) miR-361-3p 발현 수준의 하향 조절(cut-off value: 0.61, Sensitivity: 85%, Specificity: 69%);

f) miR-192-3p 발현 수준의 하향 조절(cut-off value: 0.45, Sensitivity: 70%, Specificity: 75%);

g) miR-200b-5p 발현 수준의 하향 조절(cut-off value: 0.70, Sensitivity: 65%, Specificity: 63%);

h) miR-185-5p 발현 수준의 하향 조절(cut-off value: 0.71, Sensitivity: 75%, Specificity: 75%);

i) miR-30a-5p 발현 수준의 하향 조절(cut-off value: 0.41, Sensitivity: 70%, Specificity: 63%);

j) miR-28-5p 발현 수준의 하향 조절(cut-off value: 0.52, Sensitivity: 70%, Specificity: 69%);

k) miR-3621 발현 수준의 상향 조절(cut-off value: 0.40, Sensitivity: 88%, Specificity: 60%);

l) miR-1287 발현 수준의 상향 조절(cut-off value: 0.35, Sensitivity: 81%, Specificity: 60%); 및

m) miR-3132 발현 수준의 상향 조절(cut-off value: 1.57, Sensitivity: 81%, Specificity: 60%).

i) 대조군으로서, 림프절 전이(LNM) 음성의 대장암 개체로부터 유래된 시료에서 miR-342-3p, miR-3621 및 miR-361-3p로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA 발현 수준을 확인하는 단계;

ii) 실험군으로서, 대장암 개체로부터 유래된 시료에서 miR-342-3p, miR-3621 및 miR-361-3p로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA 발현 수준을 확인하는 단계; 및

본 발명의 “시료 내 miRNA의 측정 방법”에 있어서, 상기 단계 iii)에서 비교한 결과가 하기 a) 내지 c) 중 어느 하나 이상에 해당하는 경우, 림프절 전이 양성으로 판단하는 단계를 추가로 포함할 수 있다:

a) miR-342-3p 발현 수준의 하향 조절;

b) miR-361-3p 발현 수준의 하향 조절; 및

c) miR-3621 발현 수준의 상향 조절.

상기 miR-342-3p, miR-361-3p 및 miR-3621 발현 수준의 조절에 있어서, 절단값(cut-off value)이 -0.54, 민감도(sensiticity)가 94%, 및 정확도(Specificity)는 85%인 것이 바람직하다. 본 발명의 “시료 내 miRNA의 측정 방법”에 있어서, miRNA의 발현 수준은 바이오 키트 분야에서 통상 사용되는 방법에 따라 측정될 수 있는데, 예컨대 역전사효소 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사효소 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사효소 중합효소반응 (Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting) 또는 유전자 칩 등이 포함되며 이들로 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 “시료 내 miRNA의 측정 방법”에 있어서, 대장암 개체로부터 유래한 시료는 내시경 절제술로 절제 분리한 장점막하 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않으며, 신속하고 정확한 진단을 위해 혈액 또는 장점막하 조직을 사용하는 것이 보다 바람직하다.

또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 대장암에서 LNM 여부의 정보를 제공하기 위한 시료 내 단백질의 측정 방법을 제공한다:

구체적으로, miR-342-3p의 타겟 유전자로부터 발현되는 단백질은 E2F1 RAP2B, AKT1 또는 FOXM1이고, miR-361-3p의 타겟 유전자로부터 발현되는 단백질은 E2F1, PIK3R3 또는 AKT1이며, miR-3621의 타겟 유전자로부터 발현되는 단백질은 RAB2B 또는 WINT5A이다.

보다 구체적으로, 상기 miR-342-3p의 타겟 유전자로부터 발현되는 단백질은 E2F1, RAP2B 또는 AKT1 이고, miR-361-3p의 타겟 유전자로부터 발현되는 단백질은 E2F1 이며, miR-3621의 타겟 유전자로부터 발현되는 단백질은 RAB2B인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 “시료 내 단백질의 측정 방법”에 있어서, 상기 단계 iii)에서 비교한 결과가 하기 a) 내지 c) 중 어느 하나 이상에 해당하는 경우, 림프절 전이 양성으로 판단하는 단계를 추가로 포함할 수 있다:

a) E2F1 발현 수준 증가;

b) RAP2B 발현 수준 증가;

c) FOXM1 발현 수준 증가;

d) PIK3R3 발현 수준 증가;

e) AKT1 발현 수준 증가; 및

f) WINT5A 발현 수준 증가.

본 발명의 “시료 내 단백질의 측정 방법”에 있어서, 대장암 개체로부터 유래한 시료는 내시경 절제술로 절제 분리한 장점막하 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않으며, 신속하고 정확한 진단을 위해 혈액 또는 장점막하 조직을 사용하는 것이 보다 바람직하다.

본 발명의 “시료 내 단백질의 측정 방법”에 있어서, 시료 내 단백질의 발현을 확인하기 위한 제제로 저분자 화합물, 리간드(ligand), 앱타머(aptamer), 펩티드(peptide), 폴리펩티드(polypeptide), 특이적 결합 단백질, 고분자 물질 및 항체 등으로 이루어진 군으로부터 선택되는 제제와 같이 시료 내 단백질을 검출함에 있어서, E2F1, RAP2B, FOXM1, PIK3R3, AKT1 또는 WINT5A 중 어느 하나에 특이적으로 결합할 수 있는 물질이면 무엇이든 사용 가능하며, 항체 또는 앱타머를 사용하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

림프절 전이(lymph node metastasis, LNM ) 여부에 따른 T1-기의 대장암(colorectal cancers, CRC ) 환자 대상군의 선정

<1-1> 대상 환자의 선별

T1-기의 CRC 환자에서 LNM 여부에 따른 분별자(clasiffier)를 확인하기 위해서, LNM 유무의 T1-기 CRC 환자를 선별하였다.

구체적으로, 2007년 1월부터 2012년 12월 사이 기간 동안, 한국 가톨릭대학교 서울 성모 병원에서 1차 또는 2차 치료로서 림프절 전개의 치료를 위한 외과 수술 적출(surgical resection)을 받은 T1-기 CRC 환자 기록을 검토하여 대상 환자를 선별하였다. 선별 대상은 점막근판(muscularis mucosa)으로부터 4,000 μm 미만의 점막하 침입을 가지거나 및 점막하층(submucosa)의 2/3 미만으로 점막하 침입을 가지는 T1-CRC 환자로 하였다. 또한, 점막하층 2/3 이상이 침윤된 경우; CRC 또는 다른 악성 종양이 동시에 발병한 경우; 국소부위의 림프절을 수술법으로 제거하지 않은 경우 중 어느 하나에라도 부합하는 환자는 본 발명의 대상에서 제외하였다. 또한, 수술전에 화학치료요법 또는 방사선 치료를 받은 환자는 대상으로 포함되지 않았다. 모든 환자의 선별 및 이후 절차는 가톨릭대학교 의과대학 기관윤리위원회에서 승인한 바에 따라 연구를 수행하였다(MC13SNS10023).

이에 따라, 하기 [표 1]에서 나타난 바와 같이 점막하침윤암(submucosal invasive CRC)를 가지는 총 36 명의 환자를 본 발명의 최종 대상으로 선정하였다(표 1). 상기 환자들 중에서, 19 명은 초기에 내시경 절제를 통해 치료한 후 추가적인 대장 절제 및 림프절 절제술을 받은 환자이며, 17 명은 처음부터 대장 절제 및 림프절 절제술을 시행 받은 환자이다. 총 36명의 환자를 무작위로 나누어, 16 명의 환자를 분별자 도출 세트-I(classifier construction set-I)로 구분하고, 20 명의 환자를 분별자 도출 세트-II(classifier construction set-II)로 구분하였다. 분별자 도출 세트-I는 7 명의 림프절전이-양성 및 9 명의 림프절전이-음성 CRC 환자로 구성되었으며, 독립적인 분별자 도출 세트-II는 9 명의 림프절전이 양성 및 11 명의 림프절전이 음성 CRC 환자로 구성되었다.

<1-2> 선발된 CRC 환자의 병리임상적 특징 확인

상기 실시예 <1-1>에서 구성된 CRC 환자군이 나타내는 병리임상적인 특징을 확인하였다.

구체적으로, CRC의 육안 형태(gross appearances)는 돌출된 유경(protruded pedunculated), 돌출된 무경(protruded sessile), 평평하고 높은 것(flat elevated) 및 평평하게 함몰된 것(flat depressed)으로 분류하였다. 조직학적인 진단(Histologic diagnosis) 및 등급 평가는 세계보건기구(WHO)의 기준에 따라 수행하였다(Bosman, Fred T., et al. WHO classification of tumours of the digestive system. No. Ed. 4. World Health Organization, 2010). 점막하 침윤 깊이는 2010년 일본에서 발표한 가이드라인을 따라 측정을 수행하였다(Watanabe, Toshiaki, et al. International journal of clinical oncology 17.1 (2012): 1-29.). 점막근판(muscularis mucosa)이 뚜렷이 확인되거나 어렴풋이 보이는 경우에는 점막하침윤 깊이를 종양의 육안 형태와 관계없이 점막근판의 가장 낮은 경계면으로부터 가장 깊게 침습된 면까지의 길이를 깊이로서 측정하였다. 종양의 침윤에 의해 점막하근판이 보이지 않는 경우에는 육안 형태에 관계없이 종양 표면에서부터 종양이 가장 깊이 침윤한 면까지의 최단 거리를 깊이로서 측정하였다. 돌출된 형태의 폴립(pedunculated polyps)에서, 점막하침윤이 종양의 머리와 자루(stalk) 사이의 기저선 아래에서 점막하침윤이 발견되어 복잡하게 점막하 침윤이 나타나는 경우, 점막하 침윤 거리는 가상의 기저선으로부터 측정하였다. 점막하 침윤이 돌출된 형태의 폴립 머리부분내에 국한된 경우에는, 점막하침윤의 거리를 0 um인 것으로 판단하였다. 또한 점막하층에서 종양 침윤의 정도에 따라 1/3까지(sm1), 2/3까지(sm2) 및 2/3이상(sm3) 침윤된 3 그룹으로 나누어 분석을 수행하였다.

내시경으로 절제한 시료(specimen)는 점막하 조직 전체를 포함하고 있는 것은 아니기 때문에, 내시경으로 절제된 시료에서 점막하 침윤의 정도를 파악하기 위해서는 내시경 절제 및 수술 조직 모두 종합하여 조직학적으로 분석한 후 결정하였다.

종양의 발아(Tumor budding)는 분리된 세포 또는 암이 침습된 면에서 1 내지 4 세포를 포함하는 종양 세포 군집이 존재하는 것으로서 정의하였다. 종양발아는 200 배 현미경 시야에서 발아된 종양의 수를 계수하여, 1-4 부위에서 보이면 낮은 등급으로 판단하고, 5 곳 또는 그 이상에서 발견되면 높은 등급으로 판단하여 발아 정도를 확인하였다.

그 결과, 상기 [표 1]에서 나타난 바와 같이, 림프절전이-양성 및 림프절전이-음성 환자의 평균 연령은 각각 61 세와 56 세이며, 모든 림프절전이-양성 종양(16/16) 및 55%의 림프절전이-음성 종양은 점막하 침윤 ≥1,000 μm을 가지고 있음을 확인하였다. 림프절전이-양성 종양(8/16) 중 절반에 해당하는 종양 및 림프절전이-음성 종양 중 15%(3/20)은 림프절 전이를 가지고 있었다. 림프관 침습(lymphatic invasion)은 림프절전이-양성 환자에서 함께 높은 수준으로 나타났으나(P=0.034), 림프관 침습 이외의 임상병리학적인 다른 차이는 나타나지 않았다(표 1).

<1-3> miRNA 분별자의 타당성 검증(validation)을 위한 CRC 대상군 선정

miRNA 분별자를 구성한 후 miRNA 분별자의 타당성 검증을 수행하여 본 발명의 miRNA 분별자에 대한 신뢰도를 확인하고자, 상기 분별자 도출 세트-I 및 분별자 도출 세트-II 외에 독립적인 CRC 환자군을 선별하여, 이로부터 miRNA 분별자 타당성 검증을 수행하고자 하였다.

구체적으로, 2013년 1월에서 2014년 12월 사이에 서울성모병원에서 내시경 절제 및 수술을 시행받은 환자 중, 림프절전이 양성인 T1-기 CRC 환자 6 명 및 림프절전이 음성인 T1-기 CRC 환자 14 명의, 총 20 명의 CRC 환자를 선별하였다. 선별을 위한 과정 및 병리임상학적 특징 확인은 상기 실시예 <1-1> 및 <1-2>와 동일한 방법을 수행하여 확인하였다.

그 결과, 하기 [표 2]에서 나타난 바와 같은 임상병리학적 특징을 가지는 환자군을 선별하였다(표 2).

CRC 환자에서 림프절 전이 여부에 따른 miRNA 발현 양상 차이의 비교

분별자 도출 세트-I으로서 선별한 CRC 환자 유래의 조직에서, 림프절전이의 유무에 따라 발현 양상이 변화하는 miRNA를 확인하였다.

<2-1> 조직 시료로부터 RNA의 분리

구체적으로, 분별자 구성 세트-I에 속하는 총 16 명의 환자로부터 내시경으로 절제한 점막 시료(specimen)를 수득한 다음, 포르말린으로 고정하고 파라핀으로 포매하여 조직 시료(Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded; FFPE)를 제조하였다. 두께 15 um의 FFPE 조직 절편은 자일렌으로 탈파라핀화하고, 에탄올로 세척한 다음 건조하였다. 그런 다음, 조직 내에서 70% 이상이 종양 세포인, 종양 세포가 풍부한 영역을 선별하여 현미경 관찰 하에서 종양조직만 미세절제(microdissection)하였다. 절제된 조직은 FFPE 용 RecoverAll™ Total 핵산 추출 키트(Life technologies, Carlsbad, CA)를 사용하여 전체 RNA를 추출하였다. 시표 내 추출한 총 RNA의 농도는 NanoDrop ND-1000 분광광도계(Thermo Scientific, Wilmington, DE)를 사용하여 측정하였다. RNA의 정량은 Agilent RNA 6000 나노 키트를 사용하여 Agilent 2100 생물분석기(Agilent Technologies, Santa Clara, CA)에서 측정하여 확인하였다.

<2-2> 추출된 RNA 내 miRNA 발현 양상 확인

1,205 종류의 인간 miRNA 및 144 종류의 인간 바이러스 miRNA를 인식할 수 있는 프로브를 포함하고 있는, Agilent 인간 miRNA 마이크로어레이 키트(Release 16.0, Agilent technologies)를 사용하여 miRNA 발현 양상을 확인하였다.

구체적으로, 상기 실시예 <2-1>에서 제조한 FFPE 조직 시료로부터 추출한 총 RNA 10 ng을 탈인산화(dephosphorylation)하고 pCp-Cy3 염료와 결합하였다. 그런 다음, Micro Bio-Spin 6 컬럼(Bio-Rad, Hercules, CA)을 사용하여 표지화한 RNA를 정제하고, 표지화한 RNA를 혼성화 완충용액과 함께 miRNA 어레이에 가하였다. 어레이 슬라이드를 55 ℃에서 약 20 시간 동안 배양한 후, 세척하고 어레이를 스캔하여, Feature Extraction 10.7.3.1 소프트웨어(Agilent technologies)로 영상화하였다. 결과의 품질은 Agilent's microRNA Spike-In 키트를 사용하여 측정한 다음 모든 시료를 상기 키트에서 제시하는 바와 같이 Spike-In QC 기준으로 판단하였다(LabelingSpike-InSignal > 2.5 및 HybSpike-InSignal > 2.5).

<2-3> miRNA 마이크로어레이 결과값의 분석

miRNA 어레이 결과는 분위 평준화(quantile normalization)하고 log2 전환(log2 transformation)하였다. 이렇게 계산한 결과를 Agilent's Feature Extraction 소프트웨어로 나타내어, 점으로 나타난 결과를 존재하지 않음(absent)으로 판단하여, 결과값에서 제하였다. 림프절전이 양성의 CRC 시료 및 림프절전이 음성의 CRC 시료 간에 miRNA 발현 양상에서 유의적인 차이를 확인하기 위해서, unpaired Mann Whitney 검정을 수행하였고, Benjamini-Hochberg의 오유 발견율(false discovery rate) 분석법을 사용하여 다중의 비교 보정(multiple comparison correction)하였다. FDR<0.1 및 log 배수 >3 분석값을 가지는 miRNA를 유의적인 후보군으로 선별하였다. 모든 결과 분석 과정은 GeneSpring 12.6 소프트웨어(Agilent technologies)를 사용하여 수행하였다.

CRC 환자 유래 조직 시료에서 림프절전이 유무에 따른 miRNA 발현 양상의 차이를 보다 가시적으로 확인하고자, 비감독의 계층적 클러스터링 분석(Unsupervised hierarchical clustering analysis)을 수행하였다.

그 결과, 하기 [표 3]에서 나타난 바와 같이, 림프절전이 양성의 CRC 환자 및 림프절전이 음성의 CRC 환자로부터 각각 유래된 조직 시료에서 RNA를 추출하여 miRNA 발현 양상을 확인하였을 때, 림프절전이 유무에 따라 총 66 개의 miRNA 발현이 차이를 나타내는 것을 확인하였다(표 3). 총 66 개의 miRNA 중에서, 림프절전이 음성 CRC 환자 유래의 조직에 비해 림프절전이 양성 CRC 환자 유래의 조직에서 36 개의 miRNA가 상향 조절(upregulation)되었으며, 30 개의 miRNA가 하향 조절(downregulation)되었음을 확인하였다. 또한, 도 2에서 나타난 바와 같이, 계층적 클러스터링 분석을 통해서도 림프절전이 유무에 따라 T1-기의 CRC 환자 유래 miRNA 발현 양상이 확연한 차이를 나타내는 것을 확인하였다(도 2).

qRT - PCR을 통한 miRNA 분별자 후보군의 선별 및 입증(validation)

림프절전이 여부에 따라 CRC 환자에서 발현 양상의 차이를 나타내는 것으로 확인한 miRNA 중에서, 림프절전이 유무에 따라 50 배 이상 발현 수준의 차이를 나타내며 림프절전이와 상관 관계가 있는 것으로 알려진 13 개의 miRNA를 분별자 후보군으로서 선정하고, 분별자 도출 세트-I 및 분별자 도출 세트-II를 대상으로 정량적-역전사 PCR(qRT-PCR)을 수행하여 miRNA 분별자 후보군의 발현 양상을 확인하였다.

구체적으로, 상기 실시예 <1-1>에서 구분한 분별자 도출 세트-I 및 분별자 도출 세트-II에 해당하는 환자로부터 총 RNA를 추출하고, 총 RNA 10 ng을 주형으로 하여 TaqMan MicroRNA 역전자 키트(#4366596, Life Technologies) 및 miRNA 특이적 프라이머를 사용하여 제 1차 주형 cDNA로 전환한 다음, TaqMan 프로브를 사용하여 실시간 PCR을 수행하여 각각의 miRNA 서열을 가지는 cDNA를 증폭하였다.

그런 다음, 상기 증폭한 cDNA를 시료로 하여, 제조사의 제공하는 프로토콜에 따라 TaqMan MicroRNA 어세이 및 ViiA7 시스템(Life Technologies)을 수행하여 qRT-PCR 하였다. 각각의 miRNA 분석을 위한 TaqMan MicroRNA 어세이 키트는 다음의 제품을 구입한 것을 사용하였다: (miR-342-3p, #002260; miR-195-5p, #000494; miR-150-5p, #000473; miR-140-3p, #002234; miR-361-3p, #002116; miR-192-3p, #002272; miR-200b-5p, #002274; miR-185-5p, #002271; miR-30a-5p, #000417; miR-28-5p, #000411; miR-3621, #463091_mat; miR-1287, #002828; miR-3132, #243376_mat; 및 RNU6B, #001093). 정상 대장 조직(#AM7986, Life Technologies)으로부터 상술한 방법을 동일하게 사용하여 RNA를 추출하고 miRNA 발현 수준을 확인하여 교정 시료(calibrator)로 사용하였다.

각각의 miRNA 발현 수준은 2^- ^ΔΔCt로 계산하여 정의하였다. 여기에서, ΔCt는 대상 시료에 대한 Ct값(threshold cycles)의 차이를 나타나며, 당업계에 공지된 바를 따라 내생적 유전자(endogenous gene)인 RNU6B에 대하여 평준화하고, 교정화(각각의 시료에서 나타난 결과값/ 교정 시료의 결과값)를 통해 수득한 값으로 각각 나타내었다. 각각의 시료에 대한 모든 PCR 반응을 3 회 반복수행하여 평균값으로 나타내었다.

그 결과, 하기 [표 4]에서 나타난 바와 같이 총 13 개로 선별되 miRNA 분별자 후보군은 림프절전이 여부에 따라 발현 수준에서 차이가 있음을 확인하였으며, 이 중 10 개의 miRNA는 림프절전이 양성의 T1-기 CRC 조직에서 하향 조절되며, 3 개의 miRNA는 상향 조절됨을 확인하였다(표 4). 분별자 구성 세트-I에서의 결과가 동일하게 나타나는지 확인하기 위해 분별자 구성 세트-II의 환자군 유래의 조직에서부터 miRNA 발현 양상을 확인하였을 때, 13 miRNA 후보군 중 12 개가 분별자 구성 세트-I의 miRNA 어레이 분석 및 qRT-PCR 결과와 동일한 양상으로 상향 조절 및 하향 조절되는 것을 확인하였다(표 4).

이를 조합하였을 때, 36 개의 T1-기 CRC 조직으로부터 11 개 miRNA의 발현 양상이 일관적으로 차이를 나타냄을 확인하였으며, 이 중 miR-342-3p, miR-140-3p, miR-200b-5p, miR-150-5p, miR185-5p, miR-361-3p, miR-192-3p 및 miR-195-5p (총 8 개)는 림프절전이 양성의 CRC 조직에서 하향 조절되며, miR-3621, miR-1287 및 miR-3132 (총 3 개)는 림프절전이 음성의 CRC 조직에서 상향 조절됨을 확인하였다. 이들의 분석 값을 이용하여 유의성 수준을 판단한 결과, miR-342-3p에서 P 값이 4.3×10^-4로 가장 높은 수준임을 확인하였다.

(상기 표에서, Event*는 발현 수준 변화를 나타내며, Down은 림프절전이 음성군에 비해서 림프절전이 양성군에서 발현 수준이 감소한 경우이고, Up은 림프절전이 음성군에 비해서 발현 수준이 증가한 경우를 나타낸다.)

대장암 환자에서 림프절전이 여부를 진단하기 위한 miRNA 분별자 최종 선정 및 신뢰도 확인

<4-1> 림프절전이 여부에 따른 miRNA 발현 양상 차이를 나타내는 상위 후보군의 선정

T1-기 CRC에서 림프절전이을 진단할 때에 miRNA 분별자를 적용하기 위한 신뢰도를 향상시키기 위해, 상기 <실시예 3>에서 선별한 11 개의 miRNA 분별자 후보군 중에서 림프절전이 여부에 따른 발현 양상의 차이가 큰 상위의 miRNA 6 개를 선별하였다. 선별한 miRNA는 림프절전이 양성에서 하향 조절되는 miR-342-3p, miR-195-5p, miR-150-5p, miR140-3p 및 miR-361-3p; 및 림프절전이 양성에서 상향 조절되는 miR-3621로 하였다. 분별자 구성 세트-I 및 분별자 구성 세트-II 유래의 CRC 조직에서 추출한 RNA 시료를 대상으로 하여, 상기 <실시예 3>에서 수행한 바와 동일한 방법으로 Mann Whitney U 검정을 수행하여 분석하였다.

그 결과, 도 3에서 나타난 바와 같이 림프절전이 음성 CRC 시료에 비해 림프절전이 양성 CRC 시료에서 miR-342-3p, miR-195-5p, miR-150-5p, miR140-3p 및 miR-361-3p의 발현이 하향 조절되고, miR-3621의 발현이 상향 조절됨을 확인하였다(도 3).

<4-2> miRNA 분별자 후보군의 림프절전이 여부 진단 신뢰도 확인(통계학적 분석)

상기 실시예 <4-1>에서 확인한 바와 같이 CRC 환자에서 림프절전이 여부에 따라 발현 양상의 차이를 나타내는 miRNA 분별자를 선별하였으므로, 이들이 miRNA 분별자로서 림프절전이를 진단하는데 신뢰도를 가질 수 있는지 여부를 통계분석을 통해 확인하였다.

구체적으로, 피어슨의 카이-제곱 검정(pearson's chi-squared test) 또는 피셔의 정확검정(Fisher's exact test)은 절대적인 임상병리학적 변수 간의 연관성을 분석하기 위해 수행하였다. 만-휘트니 U검증(Mann-Whitney U test) 또는 크러스칼-왈리스 검정(Kruskal-Wallis test)은 지속적인 임상병리학적 변수를 확인하기 위해 수행하였다. 스피어만의 순위상관계수(Spearman's rank correlation coefficient)는 miRNA 발현 수준 및 miRNA의 타겟인 단백질의 발현 수준 간의 관계 강도를 확인하기 위해 사용하였다. ROC(receiver operating characteristic) 곡선 및 그래프의 면적(area under curve, AUC)은 림프절전이에 대한 miRNA 마커의 예측 정도를 확인하기 위해 사용하였다. 복합적 로지스틱 회기 분석은 miRNA 분별자를 생성하기 위해 사용되었다. 통계학적 분석은 SPSS(version 21, Chicago, IL)을 사용하여 수행되었다. 그래프를 그리기 위해서는 GraphPad Prism 소프트웨어(version 6, La Jolla, CA)를 사용하였다. 모든 통계학적 분석에서, P values가 0.05 미만인 경우에 유의성 있는 검사 결과로서 판단하였다.

그 결과, 하기 [표 5] 및 도 4a에서 나타난 바와 같이, ROC 곡선 분석을 통한 AUC 값은 miR-342-3p, miR-195-5p, miR-150-5p, miR3621, miR140-3p 및 miR-361-3p에 대하여 각각 0.845, 0.806, 0.791, 0.784, 0.778 및 0.778임을 확인하였다(표 5). 진단 효율을 높히기 위해 후진 제거법(backward selection)으로 로지스틱 회귀 분석을 수행한 결과, 림프절전이 양성에서 하향 조절되는 miR-342-3p 및 miR-361-3p; 및 상향 조절되는 miR-3621로 이루어진 3 개의 miRNA으로 구성된 분별자(3-miRNA 분별자)를 최종 선별하였다. 3-miRNA 분별자의 Logit(P) 값은 다음 식으로 결정하였다: Logit(P) = 7.37 -(9.95*miR-342-3p) +(4.241*miR-3621) -(8.135*miR361-3p). 3-miRNA 분별자는 각각의 개별적인 miRNA 분별자 후보군에 비해서 높은 수준의 민감도 및 정확성을 나타내어, 0.947의 AUC 값(95% 신뢰 구간: 0.872 내지 1.000), 94%의 민감도(sensitivity), 85%의 특이성(specificity) 및 89%의 정확성(accuracy)을 나타내는 것을 확인하였다(표 5 및 도 4a).

miRNA	AUC	95% CI	Sensitivity	Specificity	Accuracy
miR-342-3p	0.845	0.711-0.979	90%	69%	78%
miR-195-5p	0.806	0.655-0.958	75%	81%	78%
miR-150-5p	0.791	0.643-0.938	75%	81%	78%
miR-3621	0.784	0.634-0.934	88%	60%	72%
miR-140-3p	0.778	0.617-0.939	90%	69%	78%
miR-361-3p	0.778	0.615-0.942	85%	69%	76%
3-miRNA classifier (miR-342-3p, miR-3621 and miR-361-3p)	0.947	0.872-1.000	94%	85%	89%

독립적인 CRC 대상군에서 miRNA 분별자의 타당성 검증(validation)

본 발명에서 최종적으로 CRC에서 림프절전이의 진단을 위한 분별자로서 선별한 3-miRNA 분별자가 실제로 CRC 환자에서 림프절전이 여부를 정확하게 판단할 수 있는지 확인하기 위하여, <실시예2> 내지 <실시예 4>에서 대상으로 하지 않은 독립적인 CRC 대상군에서 림프절전이 여부를 확인하였다.

구체적으로, 상기 실시예 <1-3>에서 선별한 6 명의 림프절전이 양성의 CRC 환자 및 14 명의 림프절전이 음성의 CRC 환자, 총 20 명을 대상으로 하여 T1-기 CRC 환자에서 3-miRNA 분별자의 발현을 확인하여 ROC 분석을 수행하였다.

그 결과, 도 4B에서 나타난 바와 같이 miR-342-3p, miR-3621 및 miR361-3p의 3-miRNA 분별자는 독립적인 CRC 대상군에서도 림프절전이 여부를 판단하기에 유의적인 신뢰성을 가져, 0.845의 AUC 값(95% 신뢰구간: 0.670 내지 1.000), 83% 민감도, 64% 특이성 및 70% 정확성을 나타내는 것을 확인하였다(도 4b).

림프절전이 진단을 위한 3- miRNA 분별자의 타겟 유전자에 대한 유전자 온톨로지(ontology) 및 신호전달 경로의 확인

CRC 환자에서 림프절전이 여부를 판단할 수 있을 것으로 최종 선별한 3-miRNA 분별자인 miR-342-3p, miR-3621 및 miR361-3p이 가지는 기능을 판단하기 위해, 이들이 발현 조절하는 타겟 유전자로서 알려진 유전자들을 확인하여 영향을 받는 신호 전달 경로를 확인하였다.

구체적으로, miR-342-3p, miR-3621 및 miR361-3p의 타겟 유전자는 각각 miRWalk 데이터베이스(http://zmf.umm.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk2/index.html)를 통해 예측하였다. 그런 다음, DAVID(database for annotation, visualization and integrated discovery) v6.7 생물정보학 툴(http://david.abcc.ncifcrf.gov/)을 이용하여 miRNA의 타겟 유전자가 신호 전달 경로의 활성화 수준과 가지는 관계를 확인하였다. DAVID 분석의 KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) 경로에 따라 가능할 것으로 예측되는 타겟 유전자를 선별하고, 이들 유전자가 유의적으로 관여하는 신호전달 경로를 확인하여 분석을 수행하였다.

그 결과, 하기 [표 6]에서 나타난 바와 같이 DAVID 분석을 통해 miR-342-3p, miR-3621 및 miR361-3p의 타겟 유전자가 종양의 형성 및 전이와 관련된 주요 대사 경로와 연관되어있음을 확인하였다(표 6). 구체적으로, 이들 대사 경로는 '암 경로(Pathways in cancer)', '국소 접착(Focal adhesion)', 'Wnt 경로(Wnt signaling)', 'MAPK 경로(MAPK signaling)' 및 '대장암'를 포함하며, 이들 경로는 종양의 형성, 종양 진행 및 암 재발에 관여하는 것으로 알려져 있음을 확인하였다. 또한,mTOR 신호전달 경로는 miR-342-3p 및 miR-361-3p에서 유의적으로 증가되었고, 세포사멸(apoptosis) 경로는 miR361-3p 및 miR-3621에서 유의적으로 증가하였다.

(상기 표에서, *PathFg는 주어진 경로에서 예상되는 타겟으로서 추축되는 유전자의 수을 나타내며, **PathBg는 주어진 경로 내의 유전자 수를 나타낸다.)

또한, 도 5 및 하기 [표 7]에서 나타난 바와 같이 유전자 온톨로지 분석을 통해 또한 본 발명의 3-miRNA 분별자가 종양 형성 및 종양 전이와 관련된 온톨로지들의 전사 활성을 조절할 수 있음을 확인하였다(도 5 및 표 7).

(상기 표에서, *PathFg는 주어진 경로에서 예상되는 타겟으로서 추축되는 유전자의 수을 나타내며, **PathBg는 주어진 경로 내의 유전자 수를 나타낸다.

또한, 카테고리#에서; BP: 생물학적 반응(biological process); CC: 세포구성 요소(cellular component); 및 MF: 분자적 기능(molecular function);을 나타낸다.)

3- miRNA 분별자의 타겟 유전자 전사 조절 여부의 확인

3-miRNA 분별자를 통한 LNM 여부를 진단함에 있어서, 3-miRNA의 타겟 유전자가 림프절전이 여부에 따라 전사 활성의 수준이 달라져 이로인한 단백질 발현 수준의 차이를 확인할 수 있는지 여부를 확인하였다.

구체적으로, miR-342-3p, miR-361-3p 및 miR-3621의 타겟 유전자는, 공지된 방법의 miRNA 진단 알고리즘을 통한 분석에 기반하여 miRWalk 데이터베이스를 통해 총 6 개의 유전자(E2F1, RAP2B, FOXM1, PIK3R3, AKT1 및 WINT5A)를 선별하였다. 내시경으로 절제한 점막 시료를 수득한 다음, 포르말린으로 고정하고 파라핀으로 포매하여 조직 시료를 제조하였다. 두께 15 um의 FFPE 조직 절편은 자일렌으로 탈파라핀화하고, 에탄올로 탈수하였다. 탈수 후 건조한 조직 절편을 0.01 M 시트르산 나트륨 완출용액(pH 6.0)에 담구어, 전기 압력솥(electric pressure cooker; Couisinart 사, Cell Marque, Rocklin, CA)을 사용해 고압에서 20 분 동안 멸균하여 항원을 제거하였다. 그런 다음, 항원을 제거한 조직 절편을 3% 과산화수소를 포함하는 메탄올 용액에 15 분 동안 담가 내인성의 퍼옥시다아제(peroxidase)의 활성을 억제하여, 면역조직화학 분석을 위한 조직 절편을 준비하였다. 준비된 조직 절편에 1차 항체를 처리하고 1 시간 동안 실온에서 배양하였다. 1차 항체로는 다음의 항체를 각각 사용하였다: 항-E2F1 항체(1:50 희석; mouse monoclonal; SantaCruz, Dallas, TX), 항-RAP2B 항체(1:50 희석; mouse monoclonal; Abcam; Cambridge, MA), 항-AKT1 항체(1:100 희석; rabbit polyclonal; Novus, Littleton, CO), 항-FOXM1 항체(1:50 희석; rabbit polyclonal; Abcam), 항-PIK3R2 항체(1:20 희석; rabbit polyclonal; Novus) 및 항-WINT5A 항체(1:50 희석; rabbit polyclonal; Novus). 음성 대조군은 마우스 또는 토끼 혈청에 동일한 농도의 1차 항체를 처리하여 조직면역화학 분석을 수행하였다. 1차 항체를 처리하여 배양한 후, Broad Spectrum(GBI Labs, Mukilteo, WA, USA)을 장착한 Polink-1 HRP 검출 시스템을 사용하여 면역 반응을 증폭한 다음, 3,3`-디아미노벤지딘(3,3'-diaminobenzidine, DAB)으로 시각화하였다. 모든 조직 슬라이드는 헤마토옥실린(hematoxylin)으로 염색하여 세포 계수하였다. 면역조직화학 염색 후, 염색 강도를 점수화하여 0, 없음; 1, 약함; 2, 보통; 또는 3, 강함의 총 4 단계로 구분하였으며, 염색된 종양 세포의 비율은 0, 0%; 1, 1-10%; 2, 11-25%; 3, 26-50%; 4, 51-75%; 5, 76-90%; 및 6, 91-100%의 총 7 단계로 구분하여 점수화하였다.

그 결과, 도 6 및 도 7에서 나타난 바와 같이 E2F1, RAP2B, 및 AKT1의 면역조직화학염색 결과는 림프절전이-음성의 T1-기 CRC에 비해 림프절전이-양성의 T1-기 CRC에서 높은 수준으로 나타난 반면, FOXM1, PIK3R3, 및 WINT5A의 발현은 림프절전이 유무에 따른 유의적인 차이를 나타내지 않는 것을 확인하였다(도 6). 또한, 면역조직화학염색을 통한 단백질 발현 수준을 확인한 결과를 miRNA 발현 수준과 비교하여 상관 관계를 분석한 결과, miR-342-3p의 발현 수준은 E2F1(r=-0.559; P=0.008), RAP2B(r=-0.497; P=0.022) 및 AKT1(r=-0.518; P=0.016)의 발현 수준과 반비례하고, miR-361-3p은 E2F1 발현(r=-0.595; P=0.004)과 반비례 관계를 가지며, miR-3621은 RAP2B 발현(r=0.527; P=0.014)과 비례 관계를 가지는 것을 확인하였다(도 7).

Claims

miR-342-3p, miR-195-5p, miR-150-5p, miR-140-3p, miR-361-3p, miR-192-3p, miR-200b-5p, miR-185-5p, miR-3621, miR-1287 및 miR-3132로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA 발현 수준을 측정하기 위한 제제를 포함하는, T1-기(T1-phase)의 조기 대장암(colorectal cancers, CRC)의 림프절 전이(lymph node metastasis, LNM) 진단용 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 제제는 상기 miRNA에 특이적으로 결합하는 물질인 것을 특징으로 하는, 조성물.
제 2항에 있어서, 상기 물질은 상기 miRNA 또는 이의 상보적 염기서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브인 것을 특징으로 하는, 조성물.
삭제
삭제
삭제
제 1항의 조성물을 포함하는 T1-기(T1-phase)의 조기 대장암의 림프절 전이 진단용 키트.
삭제
i) 대조군으로서, 림프절 전이(LNM) 음성의 대장암 개체로부터 유래된 시료에서 miR-342-3p, miR-195-5p, miR-150-5p, miR-140-3p, miR-361-3p, miR-192-3p, miR-200b-5p, miR-185-5p, miR-3621, miR-1287 및 miR-3132로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA 발현 수준을 확인하는 단계;
ii) 실험군으로서, 대장암 개체로부터 유래된 시료에서 miR-342-3p, miR-195-5p, miR-150-5p, miR-140-3p, miR-361-3p, miR-192-3p, miR-200b-5p, miR-185-5p, miR-3621, miR-1287 및 miR-3132로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA 발현 수준을 확인하는 단계; 및
iii) 상기 단계 ii)에서 확인한 실험군의 miRNA 발현 수준을 상기 단계 i)에서 확인한 대조군의 miRNA 발현 수준과 비교하는 단계;를 포함하는, T1-기(T1-phase)의 조기 대장암에서 LNM 여부의 정보를 제공하기 위한 시료 내 miRNA의 측정 방법.
제 9항에 있어서, 상기 단계 iii)에서 비교한 결과가 하기 a) 내지 k) 중 어느 하나 이상에 해당하는 경우, 림프절 전이 양성으로 판단하는 단계;를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 대장암에서 LNM 여부의 정보를 제공하기 위한 시료 내 miRNA의 측정 방법:
a) miR-342-3p 발현 수준의 하향 조절;
b) miR-195-5p 발현 수준의 하향 조절;
c) miR-150-5p 발현 수준의 하향 조절;
d) miR-140-3p 발현 수준의 하향 조절;
e) miR-361-3p 발현 수준의 하향 조절;
f) miR-192-3p 발현 수준의 하향 조절;
g) miR-200b-5p 발현 수준의 하향 조절;
h) miR-185-5p 발현 수준의 하향 조절;
i) miR-3621 발현 수준의 상향 조절;
j) miR-1287 발현 수준의 상향 조절; 및
k) miR-3132 발현 수준의 상향 조절.
삭제
삭제
삭제