KR101876724B1 - The personalized anti-cancer agent screening system and process for EGFR-TKI resistant patients using the circulating tumor cells derived on patients with the lung cancer - Google Patents
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Abstract
본 발명은 폐암 환자의 혈중 순환 종양세포(CTCs; circulating tumor cells)를 활용한 상피세포 성장인자 수용체 티로신 키나아제 저해제(EGFR-TKI; epidermal growth factor receptor-tyrosin kinase inhibitor) 내성 환자의 맞춤형 항암제 선별시스템 및 선별방법에 관한 기술로서, 더욱 상세하게는 희소 세포 분리장치를 활용하여 상피세포 성장인자 수용체 티로신 키나아제 저해제 내성 환자의 혈액으로부터 혈중 순환 종양세포를 분리한 후, 항암제 반응 검사를 통하여 다양한 후보 항암제 중에서 최적의 개인 맞춤형 항암제를 선별하는 시스템 및 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a customized anticancer agent screening system for patients with epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor (EGFR-TKI) resistance using blood circulating tumor cells (CTCs) As a technique relating to screening methods, more specifically, a rare cell separating apparatus is used to isolate blood circulating tumor cells from the blood of a patient suffering from epithelial growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor, and then, through an anticancer drug test, The present invention relates to a system and a method for selecting a personalized anticancer agent.
Description
본 발명은 폐암 환자의 혈중 순환 종양세포(CTCs; circulating tumor cells)를 활용한 상피세포 성장인자 수용체 티로신 키나아제 저해제(EGFR-TKI; epidermal growth factor receptor-tyrosin kinase inhibitor) 내성 환자의 맞춤형 항암제 선별시스템 및 선별방법에 관한 기술로서, 더욱 상세하게는 희소 세포 분리장치를 활용하여 상피세포 성장인자 수용체 티로신 키나아제 저해제 내성 환자의 혈액으로부터 혈중 순환 종양세포를 분리한 후, 항암제 반응 검사를 통하여 다양한 후보 항암제 중에서 최적의 개인 맞춤형 항암제를 선별하는 시스템 및 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a customized anticancer agent screening system for patients with epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor (EGFR-TKI) resistance using blood circulating tumor cells (CTCs) As a technique relating to screening methods, more specifically, a rare cell separating apparatus is used to isolate blood circulating tumor cells from the blood of a patient suffering from epithelial growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor, and then, through an anticancer drug test, The present invention relates to a system and a method for selecting a personalized anticancer agent.
우리나라에서 폐암에 의한 사망률은 전체 암 중 1위를 차지할 만큼 가장 심각한 질병 중 하나이다. 폐암은 최근 수십 년간 그 발생 빈도가 급속히 증가하여 남자에서는 위암 다음으로 많은 악성종양이며, 최근에는 여성에게서도 그 빈도가 증가하고 있다. 폐암은 증상이 없이 정기검진이나 다른 질환의 검사 시에 우연히 발견되는 경우가 많고, 폐암의 양상에 따라 다양하게 나타날 수 있어 조기발견에 어려움이 있다.In Korea, the mortality rate from lung cancer is one of the most serious diseases that constitute the largest cancer among all cancers. The incidence of lung cancer has rapidly increased in recent decades, and malignant tumors are the second most common malignancy in males after stomach cancer. Lung cancer is often found incidentally at the time of regular examination or other diseases without symptoms, and it may be difficult to detect early because it may vary according to the pattern of lung cancer.
흡연에 의해 야기되는 폐암의 91%는 중 약 87%가 나타내는 비소세포 폐암 (NSCLC; non-small cell lung cancer)이며, 나머지 13%는 소세포 폐암(SCLC)이다. 소세포 폐암은 드물게 발생하지만, 급속하게 진행(rapidly fatal)되어 조기 발견에 대한 기회가 적다. 폐암은 1기부터 4기까지로 구분되는데, 1기는 암이 폐실질에 국한되어 있고 3cm 이하인 경우, 2기는 암이 주위의 림프절에 퍼져있고 늑막까지 퍼져있는 경우, 3A기는 암이 흉벽과 횡경막까지 퍼져 있고 수술이 가능한 경우, 3B기는 종격동의 혈관, 식도, 기관 등에 침범하여 수술이 불가능 경우, 4기는 암이 타 장기(간, 뼈, 뇌, 골수)까지 퍼진 경우를 말한다.About 91% of lung cancer caused by smoking is represented by non-small cell lung cancer (NSCLC) of about 87%, and the remaining 13% is small cell lung cancer (SCLC). Small cell lung cancer occurs infrequently, but is rapidly fatal and has little chance of early detection. Lung cancer is divided into
폐암의 진단에 가장 중요하고 간편한 검사방법은 흉부 X선 촬영으로 폐의 종괴를 발견할 수 있으며, 객담 내 세포검사, 기관지 내시경 및 조직생검에 의해 조직학적으로 폐암을 진단할 수 있다. 그러나 조직생검은 폐암 환자로부터의 반복적인 채취가 어렵고, 한 번의 조직생검 후 일정시간의 회복기간을 필요로 하기 때문에 환자에게도 육체적인 부담을 줄 뿐만 아니라 조직 생검을 하기 전 다양한 검사로 인해 효율적이지 못한 문제점들이 있다. 따라서, 조직생검이 불가능한 환자 또는 반복적인 조직생검을 필요로 하는 환자를 위해 간단한 방법으로 폐암 진단을 가능하게 하는 검사 방법에 대한 연구가 필요한 실정이다. The most important and simple method for the diagnosis of lung cancer is chest X - ray, which can detect a lung mass. Histopathologically, lung cancer can be diagnosed by sputum cytology, bronchoscopy and histological biopsy. However, histologic biopsy is difficult to obtain repeatedly from patients with lung cancer and requires a certain period of recovery time after a single biopsy, which not only impairs the physical burden on the patient, There are problems. Therefore, it is necessary to study the test methods that enable the diagnosis of lung cancer by a simple method for patients who can not be biopsied or who need repetitive biopsy.
폐암의 치료법은 수술, 방사선 요법, 화학요법 및 표적화 요법을 포함한다. 표적화 요법은 EGFR-TKI 제제인 엘로티닙 또는 제피티닙, ALK(anaplastic lymphoma kinase, 악성 림프종 키나아제) 및 ROS1(c-ros 암 유전자, 수용체 티로신 키나아제)의 억제제인 크리조티닙 등을 포함한다.The treatment of lung cancer includes surgery, radiation therapy, chemotherapy, and targeting therapy. Targeting regimens include EGFR-TKI preparations such as erotinib or zetitibem, anaplastic lymphoma kinase (ALK), and clozotinib, an inhibitor of ROS1 (c-ros cancer gene, receptor tyrosine kinase).
엘로티닙(erlotinib) 또는 제피티닙(gefitinib)은 EGFR-TKI 제제로 폐암 및 기타 다른 암의 치료에 사용되는 항암제이다. EGFR-TKI 제제는 표적 세포에서 EGFR을 통한 신호전달을 억제하는 역할을 하여, 변이(mutation)되어 과발현된 EGFR을 갖는 암 치료에 효과적이다.Erlotinib or gefitinib are EGFR-TKI preparations and are anticancer drugs used in the treatment of lung cancer and other cancers. The EGFR-TKI preparation inhibits signal transduction through EGFR in target cells, and is effective in treating cancer with mutation and overexpression of EGFR.
상기 EGFR-TKI 제제는 활성화 변이 EGFR을 갖는 폐암, 특히 비소세포성 폐암의 치료에 효과적인 것으로 알려져 있다. EGFR 활성화 변이가 있는 폐암은 상기 EGFR-TKI에 70% 이상의 반응을 보이지만, EGFR 활성화 변이가 없는 폐암은 1% 미만의 반응을 보인다. 폐암 환자군에서 EGFR 활성화 변이가 있는 폐암 환자들은 주로 여성, 비흡연자 및 아시아인에서 많은 반면, EGFR 활성화 변이가 없는 폐암 환자들은 남성, 흡연자, 서양인에서 많은 것으로 알려져 있다.The EGFR-TKI preparation is known to be effective in the treatment of lung cancer with activated mutation EGFR, particularly non-small cell lung cancer. Lung cancer with EGFR-activated mutations exhibits more than 70% response to EGFR-TKI but less than 1% of lung cancer without EGFR activation mutations. In lung cancer patients, lung cancer patients with EGFR-activated mutations are predominantly in women, non-smokers and Asians, while lung cancer patients without EGFR activation mutations are known to be more common in men, smokers, and westerners.
따라서, EGFR-TKI 제제는 폐암 치료제로서 매우 중요한 약물이다. 그러나, EGFR 활성화 변이가 있는 폐암 환자에서 EGFR-TKI 제제를 사용할 경우, 매우 효과적이지만 거의 모든 환자에서 평균 6-8 개월 후에 획득내성(obtained resistance)이 생기게 된다. 획득 내성이 생긴 EGFR 활성화 변이 폐암 환자는 다른 마땅한 화학요법제도 없고 방사선 요법도 효과가 없어 환자에 대한 효과적인 치료법은 현재까지 거의 없다. 현재까지 획득내성의 기전으로 밝혀진 것은 EGFR T790 변이(EGFR T790 gatekeeper mutation)와 MET 유전자의 증가(MET oncogene amplification)가 있다. EGFR 활성화 변이가 있는 폐암에서의 상기 내성의 획득은 매우 치명적이므로, EGFR-TKI 내성 획득 폐암을 치료하는 방법이 매우 절실한 상황이다.Therefore, EGFR-TKI preparations are very important drugs for treating lung cancer. However, the use of EGFR-TKI preparations in lung cancer patients with EGFR-activated mutations is highly effective, but virtually all patients will have acquired resistance after an average of 6-8 months. EGFR-activated mutated lung cancer patients with acquiring resistance have no other chemotherapy regimen, and radiation therapy is ineffective and there is little effective treatment for patients. The EGFR T790 mutation (EGFR T790 gatekeeper mutation) and MET oncogene amplification are known to be the mechanism of acquisition resistance to date. Since the acquisition of this resistance in lung cancer with EGFR-activated mutations is very lethal, a method for treating EGFR-TKI resistant lung cancer is extremely urgent.
이와 관련하여 국제특허 제 201443855호 (발명의 명칭: 마이크로RNA 및 EGFR-TKI 억제제를 이용한 조합 암 치료, 이하 종래기술 1이라고 한다.)는 EGFR-TKI 제제 및 마이크로 RNA를 사용하여 피험체 내 암세포를 치료하기 위한 방법 및 조성물을 개시하고 있다. In this regard, international patent application No. 201443855 entitled Combination Cancer Treatment Using MicroRNA and EGFR-TKI Inhibitor, hereinafter referred to as
상기 종래기술 1은 EGFR-TKI 제제 및 마이크로 RNA를 사용하여 피험체 내 암세포를 치료하기 위한 방법 및 조성물을 개시하고 있으나, 폐암 환자의 순환 종양세포를 활용하여 EGFR-TKI 내성 환자의 맞춤형 항암제 선별방법에 관한 방법은 개시되어 있지 않다.The above-mentioned
따라서 종래기술의 문제점을 해소하고자 안출된 본 발명은 희소 세포 분리장치인 사이즈 선택성을 가지는 칩을 활용하여 EGFR-TKI 내성 환자의 혈액으로부터 혈중 순환 종양세포를 분리하여 단기배양한 후, 항암제 반응 검사를 통하여 다양한 후보 항암제 중에서 최적의 개인 맞춤 항암제를 선별하는 시스템 및 방법에 관한 기술을 제공하고자 한다.Therefore, the present invention, which is devised to overcome the problems of the prior art, utilizes a chip having size selectivity, which is a rare cell separator, to isolate blood circulating tumor cells from the blood of an EGFR-TKI resistant patient and short- The present invention provides a system and method for selecting an optimal personalized cancer drug from among various candidate cancer drugs.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 기술적 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.It is to be understood that both the foregoing general description and the following detailed description are exemplary and explanatory and are not intended to limit the invention to the precise form disclosed. There will be.
상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명의 일실시예는 희소 세포 분리장치인 사이즈 선택성을 가지는 칩을 활용하여 EGFR-TKI 내성 환자의 혈액으로부터 혈중 순환 종양세포를 분리하여 단기배양한 후, 항암제 반응 검사를 통하여 다양한 후보 항암제 중에서 최적의 개인 맞춤 항암제를 선별하는 시스템 및 방법에 관한 기술을 제공한다.In order to accomplish the above object, an embodiment of the present invention is a method for separating blood circulating tumor cells from blood of an EGFR-TKI resistant patient using a chip having size selectivity, which is a rare cell separating apparatus, The present invention provides a system and method for selecting an optimal personalized anti-cancer agent from among various candidate cancer drugs through testing.
본 발명의 실시예에 있어서, EGFR-TKI 내성 환자의 맞춤형 항암제 선별방법은 i) EGFR-TKI(epidermal growth factor receptor-tyrosin kinase inhibitor) 내성 환자의 혈액을 추출하는 단계, ii) 혈액으로부터 혈중 순환 종양세포(CTC circulating tumor cells)를 분리하는 단계, iii) 분리된 혈중 순환 종양세포를 단기 배양하는 단계, iv) 단기 배양된 혈중 순환 종양세포에 후보 항암제를 반응시키는 단계, v) 후보 항암제 반응을 분석하는 단계 및 vi) 분석된 후보 항암제 반응 정보를 활용하여 개인별 맞춤형 항암제를 선별하는 단계일 수 있다.In a preferred embodiment of the present invention, a method for screening a patient for EGFR-TKI resistance comprises the steps of: i) extracting blood from an EGFR-TKI resistant patient; ii) (CTC) circulating tumor cells, iii) short-term culturing the isolated blood circulating tumor cells, iv) reacting the candidate anticancer agent to the short-term cultured blood circulating tumor cells, v) analyzing the candidate anticancer agent response And vi) selecting the customized anticancer agent based on the analyzed candidate anticancer drug response information.
본 발명의 실시예에 있어서, 상기 (iii) 단계에서의 단기 배양 기간은 7일 내지 14일일 수 있다.In an embodiment of the present invention, the short-term culture period in the step (iii) may be 7 days to 14 days.
본 발명의 실시예에 있어서, 상기 (iv) 단계에서의 후보 항암제는 암의 유전적 정보를 이용하여 선별되는 것일 수 있다.In an embodiment of the present invention, the candidate anticancer agent in the step (iv) may be selected using genetic information of the cancer.
본 발명의 실시예에 있어서, 암의 유전적 정보는 암 특이적 SNP 분석결과, 암 특이적 일배체형(haplotype) 분석결과, 암 특이적 돌연변이 분석결과 및 암 특이적 유전자 마커(marker) 분석결과에서 선택된 하나 이상의 유전적 정보인 것일 수 있다.In the examples of the present invention, the genetic information of cancer is obtained from the results of cancer-specific SNP analysis, cancer-specific haplotype analysis, cancer-specific mutation analysis and cancer-specific gene marker analysis And may be one or more genetic information selected.
본 발명의 실시예에 있어서, 상기 (v) 단계는 (v-1) 혈중 순환 종양세포의 유전정보와 후보 항암제 반응정보를 분석하는 단계, (v-2) 상기 (v-1) 단계에서의 정보를 활용하여 정보 클러스터를 구축하는 단계, (v-3) 정보 클러스터를 데이터 마이닝 하는 단계 및 (v-4) 데이터 마이닝한 정보를 기초로 개인별 반응효과에 대한 알고리즘을 구축하는 단계일 수 있다.(V-1) analyzing the genomic information of the blood circulating tumor cells and the candidate anticancer drug response information, (v-2) (V-3) data mining the information cluster, and (v-4) constructing an algorithm for individual reaction effects based on the data mining information.
상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명의 또 다른 실시예는 맞춤형 항암제 선별 시스템으로서, EGFR-TKI 내성 환자의 혈액으로부터 분리된 말초혈액 단핵세포로부터 혈중 순환 종양세포를 분리하는 분리장치, 분리된 혈중 순환 종양세포를 배양하는 배양장치, 배양된 혈중 순환 종양세포에 후보 항암제를 반응시키는 반응검사 장치, 반응검사 장치의 검사결과를 분석하는 분석장치 및 분석장치에 의해 분석된 결과에 따라 맞춤형 항암제를 선별하는 선별장치일 수 있다.In order to achieve the above object, another embodiment of the present invention is a customized anti-cancer agent screening system comprising: a separation device for separating blood circulating tumor cells from peripheral blood mononuclear cells isolated from the blood of an EGFR-TKI resistant patient; A culture apparatus for culturing circulating tumor cells, a reaction test apparatus for reacting a candidate anticancer drug to the cultured blood circulating tumor cells, an analysis apparatus for analyzing test results of the reaction test apparatus, and an analyzing apparatus, Or the like.
본 발명의 실시예에 있어서, 분석장치는 정량적 중합효소 연쇄반응 기기(q-PCR machine), 플레이트 리더기(plate reader), 멀티플렉스 리더기(multiplex reader) 및 공초점 현미경(confocal microscope) 중에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.In an embodiment of the present invention, the analyzer may be a Q-PCR machine, a plate reader, a multiplex reader, or a confocal microscope. It can be more than one.
본 발명의 실시예에 있어서, 분리장치는 혈중 순환 종양세포를 선택적으로 분리하는 기능을 가지는 사이즈 선택성 칩(chip)을 포함하는 것일 수 있다.In an embodiment of the present invention, the separation device may include a size-selective chip having a function of selectively separating blood circulating tumor cells.
본 발명의 실시예에 있어서, 사이즈 선택성 칩은 혈액으로부터 분리된 말초혈액 단핵세포를 주입하는 주입구, 말초혈액 단핵세포를 수송하는 제 1 도관, 제 1 도관의 내측에 장착되어 있고, 복수의 기공(pore)을 갖는 여과 망, 말초혈액 단핵세포 중 여과 망을 통과하여 혈중 순환 종양세포를 제외한 세포가 배출되는 제 2 도관 및 제 2 도관을 통과한 혈중 순환 종양세포를 제외한 세포를 수집하는 실린더를 포함하는 것일 수 있다.In an embodiment of the present invention, the size-selectable chip comprises an inlet for injecting peripheral blood mononuclear cells isolated from blood, a first conduit for transporting peripheral blood mononuclear cells, a first conduit for receiving peripheral blood mononuclear cells, pore), a peripheral blood mononuclear cell passing through a filter network, a second conduit through which cells except for circulating tumor cells are discharged, and a cylinder for collecting cells other than blood circulating tumor cells passing through the second conduit .
본 발명의 실시예에 있어서, 복수의 기공의 각각의 모양은 다각형 또는 원형 중 어느 하나 이상일 수 있다.In the embodiment of the present invention, the shape of each of the plurality of pores may be any one of polygonal or circular.
본 발명의 실시예에 있어서, 복수의 기공의 각각의 사이즈는 5.5 내지 8.5μm일 수 있다.In an embodiment of the present invention, the size of each of the plurality of pores may be 5.5 to 8.5 mu m.
본 발명의 실시예에 따르면, 희소 세포 분리장치인 사이즈 선택성을 가지는 칩을 활용하여 폐암 환자의 혈액으로부터 혈중 순환 종양세포를 분리한다는 제 1효과, 기존 조직생검에서 활용되지 못하거나 시행하지 못하였던 반복적이고 비침습적인 방법으로 개인 맞춤형 항암제 반응 검사를 가능하게 한다는 제 2효과, 기존 조직생검을 위해 요구되었던 다양한 검사 및 시술을 대체함으로써 비용절감 뿐만 아니라 환자의 몸 상태에 대한 부담을 덜어준다는 제 3효과, 내성을 가지는 폐암 환자에게 다양한 후보 항암제 중에서 최적의 개인 맞춤형 항암제를 선별함으로써 민감도 및 특이도를 향상시켜 폐암 치료율을 증가시킨다는 제 4효과, 체내에 선별 항암제 투여 시 치료반응을 모니터링 할 수 있으며, 치료 시 수반되는 시행착오와 위험성을 감소시킬 수 있다는 제 5효과, 폐암에 특이적인 항암제 반응 시 혈중 순환 종양세포의 강도를 통하여 항암제 반응 분석에 응용이 가능하다는 제 6효과를 갖는다.According to an embodiment of the present invention, a first effect of separating blood circulating tumor cells from the blood of lung cancer patients using a chip having size selectivity, which is a rare cell separator, A second effect of enabling a personalized anticancer drug response test in a non-invasive way is to replace the various tests and treatments required for conventional biopsy, thereby reducing the burden on the patient's body condition as well as cost reduction. The fourth effect of increasing the sensitivity and specificity of lung cancer patients by selecting the best individual chemotherapeutic agents among various candidate chemotherapeutic agents for lung cancer patients with tolerance, can be used to monitor the therapeutic response when administering a selective chemotherapeutic agent to the body, To reduce the risk involved with trial and error That the fifth effect, and has a sixth effect that application is possible to analyze cancer reaction through the strength of the blood circulating tumor cells during specific anticancer responses in lung cancer.
본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 특허청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.It should be understood that the effects of the present invention are not limited to the above effects and include all effects that can be deduced from the detailed description of the present invention or the configuration of the invention described in the claims.
도 1은 EGFR-TKI 내성 환자를 위한 개인 맞춤형 항암제 선별방법을 보여주는 도면이다.
도 2는 EGFR-TKI 내성 환자의 유전정보를 이용한 개인 맞춤형 항암제 선별방법을 보여주는 도면이다.
도 3은 맞춤형 항암제 선별 시스템을 보여주는 도면이다.
도 4는 맞춤형 항암제 선별 시스템의 분리장치 중 사이즈 선택성 칩을 나타낸 도면이다.
도 5는 폐함 환자의 혈액으로부터 분리한 혈중 순환 종양세포가 암 세포임을 확인하기 위한 형광 염색 사진이다.Brief Description of the Drawings Fig. 1 is a diagram showing a method of selecting a customized anticancer agent for patients with EGFR-TKI resistance.
FIG. 2 is a diagram showing a method for selecting a customized anticancer agent using genetic information of an EGFR-TKI resistant patient. FIG.
3 is a view showing a customized anti-cancer agent screening system.
4 is a view showing a size selectivity chip among separation apparatuses of a customized anticancer agent sorting system.
FIG. 5 is a fluorescence staining image for confirming that blood circulating tumor cells isolated from the blood of patients with lung cancer are cancer cells.
이하에서는 화학식, 반응식, 구체적인 실시예 및 실험예를 참조하여 본 발명을 설명하기로 한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며, 따라서 여기에서 설명하는 실시예로 한정되는 것은 아니다. Hereinafter, the present invention will be described with reference to chemical formulas, reaction formulas, specific examples and experimental examples. The present invention may, however, be embodied in many different forms and should not be construed as limited to the embodiments set forth herein.
명세서 전체에서, 어떤 부분이 다른 부분과 "연결 (접속, 접촉, 결합)"되어 있다고 할 때, 이는 "직접적으로 연결"되어 있는 경우뿐 아니라, 그 중간에 다른 부재를 사이에 두고 "간접적으로 연결"되어 있는 경우도 포함한다. 또한 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 구비할 수 있다는 것을 의미한다.Throughout the specification, when a part is referred to as being "connected" (connected, connected, coupled) with another part, it is not only the case where it is "directly connected" "Is included. Also, when an element is referred to as "comprising ", it means that it can include other elements, not excluding other elements unless specifically stated otherwise.
본 명세서에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.The terminology used herein is for the purpose of describing particular embodiments only and is not intended to be limiting of the invention. The singular expressions include plural expressions unless the context clearly dictates otherwise. In this specification, the terms "comprises" or "having" and the like refer to the presence of stated features, integers, steps, operations, elements, components, or combinations thereof, But do not preclude the presence or addition of one or more other features, integers, steps, operations, elements, components, or combinations thereof.
본 발명의 실시예에서 EGFR-TKI 내성 환자의 맞춤형 항암제 선별방법은 i) EGFR-TKI(epidermal growth factor receptor-tyrosin kinase inhibitor) 내성 환자의 혈액을 추출하는 단계, ii) 상기 혈액으로부터 혈중 순환 종양세포(CTC circulating tumor cells)를 분리하는 단계, iii) 상기 분리된 혈중 순환 종양세포를 단기 배양하는 단계, iv) 상기 단기 배양된 혈중 순환 종양세포에 후보 항암제를 반응시키는 단계, v) 상기 후보 항암제 반응을 분석하는 단계 및 vi) 상기 분석된 후보 항암제 반응 정보를 활용하여 개인별 맞춤형 항암제를 선별하는 단계일 수 있다.In a preferred embodiment of the present invention, a method for screening a patient for EGFR-TKI resistance comprises the steps of: i) extracting blood from a patient suffering from epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor (EGFR-TKI) (CTC) circulating tumor cells, iii) short-term culturing the isolated blood circulating tumor cells, iv) reacting the short-term cultured blood circulating tumor cells with a candidate anticancer agent, v) And vi) selecting individualized anticancer drugs based on the analyzed candidate anticancer drug response information.
도 1은 EGFR-TKI 내성 환자를 위한 개인 맞춤형 항암제 선별방법을 보여주는 도면이다. 도 1을 참조하여 보면, 맞춤형 항암제 선별을 하기 위해 우선, 암 환자로부터 혈액을 추출하는 단계(S10)를 실시한다. 채혈을 이용하여 질병을 진단하는 방법은 반복적이고 비침습적인 방법으로 조직생검 보다 간편하며, 기존 조직생검을 위해 요구되었던 다양한 검사 및 시술을 대체함으로써 비용절감뿐만 아니라 환자의 몸 상태에 대한 부담을 덜어준다는 시간적, 경제적 이점이 있다. 또한 채혈은 주사기 등을 이용하여 팔 또는 손등 등 채혈이 가능한 부위에서 정맥이 짚이는 부분(주정증피정맥, 요추피정맥, 척추피정맥 등)에 쉽게 채혈이 가능하므로, 1일 내지 30일 혹은 채혈한 당일에도 반복적인 채혈이 가능하다. 반복적이고 비침습적인 채혈은 혈액으로부터 혈중 순환 종양세포를 분리하는 과정이나 배양하는 과정에서 후보 항암제 반응검사를 실시하기에 충분한 개수의 혈중 순환 종양세포를 획득하지 못한 경우나 선별된 후보 항암제의 효과가 예상보다 좋지 않은 경우, 신속하게 다음 채혈을 통해 혈중 순환 종양세포를 획득하여 빠른 시간 내에 반복적인 후보 항암제 반응검사를 실시할 수 있는 이점이 있다.Brief Description of the Drawings Fig. 1 is a diagram showing a method of selecting a customized anticancer agent for patients with EGFR-TKI resistance. Referring to FIG. 1, in order to select a customized anti-cancer agent, step (S10) of extracting blood from a cancer patient is performed. Diagnosis of disease using blood sampling is simpler than tissue biopsy by repeated and noninvasive methods, and it replaces the various tests and procedures required for conventional biopsy to reduce costs and reduce the burden on the patient There is a time and economic advantage to give. In addition, the blood collection can be easily performed in a portion where the vein is stolen (such as a spermatheque vein, a lumbar vein, or a vertebra vein) at a site where blood or the like can be collected using a syringe or the like. Repeated blood sampling is possible on the day of blood collection. Repeated, non-invasive blood sampling may be useful in cases where a sufficient number of blood-circulating tumor cells have not been obtained to perform a candidate anticancer drug test in the process of isolating blood circulating tumor cells from the blood or in the course of culturing, If it is worse than expected, it is advantageous to rapidly obtain the blood circulating tumor cells through the next blood collection and to perform the repeated candidate cancer drug reaction test within a short time.
혈액으로부터 혈중 순환 종양세포를 분리하는 단계(S11)는 일정한 비중을 가지는 피콜(ficoll) 용액을 사용하는데, 이 피콜 용액은 부유 밀도 구배 원심분리 방법에 의해 혈액으로부터 적혈구(RBC; red blood cell)와 백혈구(WBC; white blood cell)가 제거된 말초혈액 단핵세포를 분리한다. 상기 말초혈액 단핵세포 중 혈중 순환 종양세포만을 선택적으로 분리하는 기능을 가지는 사이즈 선택성 칩을 활용하여 혈중 순환 종양세포를 분리할 수 있다.A step (S11) of separating the blood circulating tumor cells from the blood uses a ficoll solution having a specific gravity, which is obtained by centrifugation by a floating density gradient centrifuge to remove red blood cells (RBC) Peripheral blood mononuclear cells from which white blood cells (WBCs) have been removed are isolated. The blood circulating tumor cells can be isolated using a size-selective chip having a function of selectively separating only blood circulating tumor cells from the peripheral blood mononuclear cells.
또한, 피콜 용액을 사용하여 말초혈액 단핵세포를 분리하기 전, 전처리 과정을 수행할 수 있다. 전처리 방법의 일 예로서, (a) 혈액에 백혈구의 항체를 넣어 백혈구를 제거하는 단계, 또는 (b) 혈액의 적혈구를 용해하는 단계일 수 있으나, 이 전처리 과정은 생략할 수 있다.In addition, a pretreatment process can be performed before the peripheral blood mononuclear cells are separated using the phycol solution. As an example of the pretreatment method, (a) a step of removing leukocytes by adding an antibody of leukocyte to blood, or (b) a step of dissolving erythrocytes of blood, this pretreatment step may be omitted.
본 발명의 실시예에서 상기 (iii) 단계에서의 단기 배양 기간은 7일 내지 14일일 수 있다. 혈액으로부터 분리된 혈중 순환 종양세포는 혈액 내 극소수의 종양세포를 획득한 것으로서, 종양세포를 단기 배양하는 단계(S12)를 거쳐 짧은 시간 내에 후보 항암제와의 반응검사를 실시할 수 있을 다량의 종양세포를 확보해야 한다. 종양세포를 단기 배양하는 기간은 7일 내지 14일이 적합할 수 있으나, 혈중 순환 종양세포는 암의 종류에 따라 증식속도가 다르고, 환자의 암 진행 정도와 환자의 상태에 따라 환자 혈액으로부터 획득할 수 있는 혈중 순환 종양세포의 개수가 다르기 때문에, 단기 배양기간을 7일 내지 14일로 제한하는 것은 아님을 명시한다. 나아가, 일반적으로 항암제 치료를 받는 경우 환자가 항암제를 처음 투약한 후 3주 정도를 항암치료의 일반적인 주기로 보는데, 이는 항암제의 독성이 커서 연속적으로 치료할 수 없기 때문이다. 따라서, 본 발명에 따른 선별방법에 따른 항암제가 환자에게 적합하지 않으면 1차 항암치료를 한 이후 2차 항암치료를 준비할 수 있도록, 배양 기간을 더 길게 설정할 수도 있다.In the embodiment of the present invention, the short-term culture period in step (iii) may be 7 days to 14 days. Blood circulating tumor cells isolated from the blood are obtained from a very small number of tumor cells in the blood. After a short-term culture step (S12) of tumor cells, a large amount of tumor cells capable of conducting a reaction test with a candidate anticancer agent . The duration of short-term culture of the tumor cells may be suitable from 7 to 14 days, but the blood-circulating tumor cells have different proliferation rates depending on the type of cancer and are obtained from the blood of the patient depending on the degree of cancer progression and the condition of the patient Indicate that the short-term incubation period is not limited to 7 to 14 days, since the number of circulating blood tumor cells is different. Furthermore, in general, when patients receive chemotherapy, the patient usually sees three weeks after the first dose of chemotherapy as a general cycle of chemotherapy, because the toxicity of the chemotherapeutic agent is so great that it can not be treated continuously. Therefore, if the anticancer agent according to the screening method according to the present invention is not suitable for the patient, the incubation period may be set to be longer so as to prepare the second chemotherapy after the first chemotherapy.
본 발명의 실시예에서 상기 (iv) 단계에서의 후보 항암제는 암의 유전적 정보를 이용하여 선별되는 것일 수 있다. In the embodiment of the present invention, the candidate anticancer agent in the step (iv) may be selected using the genetic information of the cancer.
본 발명의 실시예에서 상기 암의 유전적 정보는 암 특이적 SNP 분석결과, 암 특이적 일배체형(haplotype) 분석결과, 암 특이적 돌연변이 분석결과 및 암 특이적 유전자 마커 분석결과에서 선택된 하나 이상의 유전적 정보인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.In an embodiment of the present invention, the genetic information of the cancer is one or more genes selected from cancer-specific SNP analysis results, cancer-specific haplotype analysis results, cancer-specific mutation analysis results and cancer- It may be, but is not limited to, information.
암 환자의 정보는 유전적 정보 또는 임상정보가 될 수 있다. 암 환자의 정보로서 암의 유전형을 분석하여 수득한 SNP, 돌연변이, 일배체형, 전장 염기서열 등의 유전적 정보를 사용할 경우, 유전적 정보를 약물반응 데이터 베이스에 적용하여 유전적 정보에 상응하는 후보 항암제를 도출하는 방식으로 수행될 수 있다. 또한, 암의 유전적 정보를 수득하지 않고서 환자의 임상정보만을 사용할 경우에도 후보 항암제를 도출할 수 있는데, 구체적으로는 암의 발생부위, 암 특이적 유전자 마커 분석 결과, 전이 관련 정보, 환자의 증상정보 등의 임상정보를 암의 임상정보와 유전적 정보를 포함하는 데이터 베이스에 적용하여, 후보 항암제를 도출하는 방식으로 수행될 수 있다.The information of the cancer patient can be genetic information or clinical information. Genetic information such as SNPs, mutations, haplotypes, and full-length sequences obtained by analyzing the genotype of cancer as information on cancer patients is used to apply genetic information to the drug reaction database to identify candidates corresponding to genetic information Can be carried out in such a manner as to derive an anticancer drug. In addition, candidate cancer drugs can be derived even when clinical information of the patient is used without obtaining the genetic information of cancer. Specifically, the candidate cancer agent can be derived from cancer occurrence site, cancer-specific gene marker analysis result, Information may be applied to a database containing cancer clinical information and genetic information, and a candidate anticancer agent may be derived.
혈중 순환 종양세포의 단기 배양 후, 환자의 유전적 정보를 고려한 후보 항암제 군을 선별하고, 상기 후보 항암제군을 환자의 혈중 순환 종양세포와 반응시키는 단계(S13)를 수행한다. 이후, 후보 항암제 군의 반응결과를 분석하면서 항암 활성 효과 및 부작용 등 후보 항암제의 반응 분석 단계(S14)를 수행한다. 후보 항암제 반응검사의 결과를 토대로 후보 항암제를 비교 분석하여 개인 맞춤형 항암제 선별 단계(S15)를 수행한다. 개인 맞춤형 항암제란, 맞춤의학(tailored medicine)을 이용하여 결정되어 암이 발병한 개체에게 특이적으로 최적의 치료효과를 나타낼 수 있는 의약 조성물을 의미한다. 맞춤의학(tailored medicine)이란 맞춤의료(order-made medicine) 또는 환자 맞춤형 의학(personalized medicine)이라고도 하며, 환자 개인의 체질이나 환경을 개별적으로 조사하여, 여기에 적합한 치료법을 결정하는 방법 또는 치료하는 방법을 의미한다.After the short-term culture of the blood circulating tumor cells, a candidate anticancer agent group considering the genetic information of the patient is selected, and the candidate anticancer agent group is reacted with the blood circulating tumor cells of the patient (S13). Thereafter, the reaction analysis result of the candidate anticancer drug group is analyzed, and the step S14 of analyzing the reaction of the candidate anticancer drug such as the anticancer activity effect and the side effect is performed. Based on the results of the candidate anticancer drug test, candidate anticancer drugs are compared and analyzed to perform a personalized anticancer drug screening step (S15). A personalized anticancer agent refers to a pharmaceutical composition which is determined using tailored medicine and can exhibit an optimal therapeutic effect specifically for an individual suffering from cancer. Tailored medicine is also referred to as order-made medicine or personalized medicine, and is used to individually examine the constitution or environment of a patient to determine the proper treatment method or to treat it .
본 발명의 실시예에서 상기 (v) 단계는 (v-1) 상기 혈중 순환 종양세포의 유전정보와 상기 후보 항암제 반응정보를 분석하는 단계, (v-2) 상기 (v-1) 단계에서의 정보를 활용하여 정보 클러스터를 구축하는 단계, (v-3) 상기 정보 클러스터를 데이터 마이닝 하는 단계 및 (v-4) 상기 데이터 마이닝한 정보를 기초로 개인별 반응효과에 대한 알고리즘을 구축하는 단계일 수 있다.(V-1) analyzing the genomic information of the blood circulating tumor cells and the candidate anticancer drug response information, (v-2) (V-3) data mining the information cluster, and (v-4) constructing an algorithm for individual reaction effects based on the data mining information. have.
도 2는 EGFR-TKI 내성 환자의 유전정보를 이용한 개인 맞춤형 항암제 선별방법을 보여주는 도면이다. 도 2를 참조하여 보면, 상기 분석단계는 혈중 순환 종양세포의 유전정보 분석 단계(S20) 및 혈중 순환 종양세포와 후보 항암제 간의 반응 분석하는 단계(S21)를 포함한다. 상기 정보들을 취합하여 정보 클러스터 구축 단계(S22) 및 상기 정보클러스터를 이용하여 데이터 마이닝(data mining) 단계(S23)를 수행한다. 데이터 마이닝이란 취합한 환자의 유전정보 및 혈중 순환 종양세포와 후보 항암제 간의 무수한 정보 가운데 숨겨져 있는 유용한 상관관계를 발견하여, 실행 가능한 정보를 추출하고 선별 결정에 이용하는 과정을 의미한다. 상기 상관관계를 발견하는 과정에서 혈중 순환 종양세포와 후보 항암제 간의 반응 효과에 따른 알고리즘 구축 단계(S24)를 수행할 수 있다. 본 발명에서의 알고리즘은 환자의 유전정보에 맞는 항암제를 선별하기 위하여 후보 항암제 중에 가장 적합한 항암제를 발견하기 위해 거치는 일련의 순서화된 절차를 의미한다.FIG. 2 is a diagram showing a method for selecting a customized anticancer agent using genetic information of an EGFR-TKI resistant patient. FIG. Referring to FIG. 2, the analyzing step includes analyzing genetic information of the blood circulating tumor cells (S20) and analyzing the reaction between the blood circulating tumor cells and the candidate anticancer agent (S21). Collects the information, and performs an information cluster construction step (S22) and a data mining step (S23) using the information cluster. Data mining refers to the process of discovering useful correlations hidden among the genetic information of the patient and the myriad of information between the circulating tumor cells and the candidate anticancer drug, and extracting the executable information and using it for selection. In the process of finding the correlation, an algorithm building step (S24) may be performed according to the reaction effect between the blood circulating tumor cells and the candidate anticancer agent. The algorithm in the present invention refers to a sequence of ordered procedures to find the most suitable anticancer agent among the candidate anticancer agents in order to select the anticancer agents that match the genetic information of the patient.
개인 맞춤형 항암제 선별방법으로 도출된 결과 데이터를 축적하고, 축적된 데이터를 이용하면 암의 유전적 정보 데이터 및 환자의 임상정보 데이터의 상관관계를 분석할 수 있고, 상기 분석결과를 이용하여 이들 데이터 간의 연관성을 예측하는 알고리즘을 구축할 수 있다. 구축된 알고리즘은 개인 맞춤형 항암제 선별방법에 사용된 데이터와 상기 방법으로부터 도출된 데이터를 연계시킬 수 있으므로, 도축된 알고리즘을 이용하면 보다 용이하게 개인 맞춤형 항암제를 선별할 수 있다. 암의 유전적 정보, 환자의 임상정보 및 환자 맞춤형 항암제 정보 데이터 사이의 상관관계를 분석하여 구축된 알고리즘은 in vitro 및 in vivo 조건에서 추가적인 실험 없이 암의 유전적 정보 데이터 및 환자의 임상정보 데이터로부터 개인 맞춤형 항암제를 선별하는데 사용될 수 있으며, 알고리즘에 환자 데이터를 추가하여 갱신함으로써 개인 맞춤형 항암제 선별 성공률을 향상시킬 수 있다.It is possible to accumulate the result data derived from the personalized anticancer agent selection method and analyze the correlation between genetic information data of the cancer and clinical information data of the patient using the accumulated data, We can construct an algorithm that predicts associativity. The constructed algorithm can link the data used in the personalized anticancer drug screening method with the data derived from the above method, so that the customized anticancer drugs can be more easily selected using the slaughtered algorithm. The algorithm constructed by analyzing the correlation between cancer genetic information, patient clinical information, and patient-tailored anticancer drug information data, can be used to generate genomic information from cancer genetic information and patient clinical information data without further experiments in vitro and in vivo It can be used to select a personalized anticancer drug, and by updating the patient data with the algorithm, it is possible to improve the selection success rate of the customized anticancer drug.
도 3은 맞춤형 항암제 선별 시스템을 보여주는 도면이다. 3 is a view showing a customized anti-cancer agent screening system.
상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명의 또 다른 실시예는 맞춤형 항암제 선별 시스템(200)으로서, EGFR-TKI 내성 환자의 혈액으로부터 분리된 말초혈액 단핵세포로부터 혈중 순환 종양세포를 분리하는 분리장치(210), 상기 분리된 혈중 순환 종양세포를 배양하는 배양장치(220), 상기 배양된 혈중 순환 종양세포에 상기 후보 항암제를 반응시키는 반응검사 장치(230), 상기 반응검사 장치의 검사결과를 분석하는 분석장치(240) 및 상기 분석장치에 의해 분석된 결과에 따라 맞춤형 항암제를 선별하는 선별장치(250)일 수 있다.According to another embodiment of the present invention, there is provided a customized anticancer drug screening system (200) comprising: a separation device for separating blood circulating tumor cells from peripheral blood mononuclear cells isolated from blood of an EGFR-TKI resistant patient 210), a culture device (220) for culturing the isolated blood circulating tumor cells, a reaction test device (230) for reacting the candidate anticancer drug with the cultured blood circulating tumor cells, and a test result of the reaction test device An
본 발명의 실시예에서 상기 분석장치는 정량적 중합효소 연쇄반응 기기(q-PCR machine), 플레이트 리더기(plate reader), 멀티플렉스 리더기(multiplex reader) 및 공초점 현미경(confocal microscope) 중에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다. 정량적 중합효소 연쇄반응 기기란 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 이용한 것으로 DNA 또는 RNA를 시간에 따라 모니터링하는 기기이다. 플레이트 리더기 및 멀티플렉스 리더기는 세포 수준의 반응을 미량으로 실행하고, 상기 변화를 감지하여 분석하는 기기이다. 공초점 현미경은 바늘구멍 조리개를 통해 여러 단면에 초점을 맞추는 현미경으로, 세포를 깊이감 있는 3차원 구조로 관찰할 수 있는 기기이다.In the embodiment of the present invention, the analyzer may be any one selected from a q-PCR machine, a plate reader, a multiplex reader, and a confocal microscope Or more, but is not limited to this. Quantitative polymerase chain reaction (PCR) is a device that uses DNA polymerase chain reaction (PCR) to monitor DNA or RNA over time. Plate readers and multiplex readers are devices that perform cell level reactions in a very small amount and detect and analyze the changes. The confocal microscope is a microscope that focuses on several cross-sections through a needle-eye iris, and is a device that can observe cells with a deep three-dimensional structure.
본 발명의 실시예에서 상기 분리장치는 혈중 순환 종양세포를 선택적으로 분리하는 기능을 가지는 사이즈 선택성 칩(chip)을 포함하는 것일 수 있다. 사이즈 선택성 칩은 혈액 세포의 크기 차이를 기반으로 하며 10분 이내에 약 90%의 회수율로 순환 종양세포를 포착할 수 있다.In an embodiment of the present invention, the separation device may include a size-selective chip having a function of selectively separating blood circulating tumor cells. Size-selectable chips are based on size differences in blood cells and can capture circulating tumor cells at a recovery rate of about 90% within 10 minutes.
본 발명의 실시예에서 상기 사이즈 선택성 칩은 혈액으로부터 분리된 말초혈액 단핵세포를 주입하는 주입구, 상기 말초혈액 단핵세포를 수송하는 제 1 도관, 상기 제 1 도관의 내측에 장착되어 있고, 복수의 기공(pore)을 갖는 여과 망, 상기 말초혈액 단핵세포 중 상기 여과 망을 통과하여 혈중 순환 종양세포를 제외한 세포가 배출되는 제 2 도관 및 상기 제 2 도관을 통과한 상기 혈중 순환 종양세포를 제외한 세포를 수집하는 실린더를 포함하는 것일 수 있다.In an embodiment of the present invention, the size-selective chip may include an inlet for injecting peripheral blood mononuclear cells separated from blood, a first conduit for transporting the peripheral blood mononuclear cells, a second conduit for receiving the peripheral blood mononuclear cells, a second conduit through which the cells except the blood circulating tumor cells are passed through the filter network of the peripheral blood mononuclear cells and the blood circulating tumor cells passing through the second conduit, Collecting cylinder.
도 4는 맞춤형 항암제 선별 시스템의 분리장치 중 사이즈 선택성 칩을 나타낸 도면이다. 도 4를 참조하여 보면, 혈액으로부터 분리한 말초혈액 단핵세포는 사이즈 선택성 칩의 주입구(211)로 주입되며, 제 1 도관(212)를 통해서 여과 망(213)까지 수송된다. 여과망(214)은 복수의 기공을 가지고 있는 얇은 그물로, 기공의 모양은 다각형 또는 원형이며, 기공의 크기는 5.5 내지 8.5μm일 수 있다. 말초혈액 단핵세포 중 혈중 순환 종양세포의 크기는 기공의 크기보다 크기 때문에 여과 망을 통과하지 못하고, 혈중 순환 종양세포 보다 크기가 작은 다른 세포들은 여과망 아래로 통과하여 제 2 도관(214)을 따라 실린더(215)로 모아져 폐기된다. 따라서 혈중 순환 종양세포는 여과망을 통과하지 않은 세포를 회수하여 사용한다.4 is a view showing a size selectivity chip among separation apparatuses of a customized anticancer agent sorting system. Referring to FIG. 4, the peripheral blood mononuclear cells isolated from the blood are injected into the
본 발명의 실시예에서 상기 복수의 기공의 각각의 모양은 다각형 또는 원형 중 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.In an embodiment of the present invention, the shape of each of the plurality of pores may be at least one of a polygonal shape and a circular shape, but is not limited thereto.
본 발명의 실시예에서 상기 복수의 기공의 각각의 사이즈는 5.5 내지 8.5μm일 수 있다. 기공의 크기가 5.5μm 보다 작을 경우 백혈구와 적혈구가 칩을 통과하지 못해 칩 상에 걸리게 되어 제거되지 못하고, 기공의 크기가 8.5μm 보다 클 경우에는 기공의 크기가 암 세포의 크기보다 커서 암세포가 칩을 통과하여 암세포를 선택적으로 회수할 수 없게 된다.In an embodiment of the present invention, the size of each of the plurality of pores may be 5.5 to 8.5 mu m. When the pore size is smaller than 5.5 袖 m, leukocytes and red blood cells can not pass through the chip, so that they can not be removed on the chip. If the pore size is larger than 8.5 袖 m, the pore size is larger than the cancer cell size, The cancer cells can not be selectively recovered.
이하, 본 발명의 실시예 및 실험예를 기재한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명의 구성 및 효과를 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아님을 명시한다.Hereinafter, examples and experimental examples of the present invention will be described. It should be understood, however, that these embodiments are provided for the purpose of further illustrating the structure and effects of the present invention, and the scope of the present invention is not limited thereto.
[[ 실시예Example 1] One]
사이즈 선택성을 가지는 칩 제작 단계Chip fabrication step with size selectivity
실험에서 사용되는 사이즈 선택성을 가지는 칩은 기공의 크기(pore-size)가 6.5μm로 형성되어 있어, 6.5μm 보다 작은 크기의 백혈구(WBC; white blood cell) 및 적혈구(RBC; red blood cell)는 칩을 통과시켜 제거하고, 6.5μm 보다 큰 사이즈의 암 세포는 칩 상에 걸리게 만들어 특정 사이즈를 선택적으로 회수할 수 있도록 고안한 마이크로 칩이다. The chip having size selectivity used in the experiment is formed with a pore-size of 6.5 μm, and a white blood cell (WBC) and a red blood cell (RBC) smaller than 6.5 μm It is a microchip designed to selectively remove a specific size by allowing the chip to pass through and removing cancer cells larger than 6.5 μm in size.
참고로, 사이즈 선택성을 가지는 칩의 세포 회수율을 확인하기 위해, 암 환자의 암세포를 10개, 100개, 1000개로 스파이킹(spiking)하여, 이를 칩으로 통과시켜 칩 상의 암세포의 회수율을 보는 실험을 수행하였다. 이의 결과를 하기 표 1에 나타내었다. For reference, in order to confirm the cell recovery rate of a chip having size selectivity, an experiment in which cancer cells in cancer patients were spiked with 10, 100, and 1000 cells and passed through the chip to examine the recovery rate of cancer cells on the chip Respectively. The results are shown in Table 1 below.
칩의 세포 회수율을 계산한 결과, 약 80% 이상의 높은 세포 회수율을 보였으며, 회수된 세포들이 암세포 임을 다시 한번 확인하기 위해, 기존에 암 검정에서 사용되고 있는 CK 항체를 염색하여 확인한 결과, 모두 CK 양성으로 암 세포임을 확인하였다.As a result of counting the cell recovery rate of the chip, the cell recovery rate was about 80% or higher. In order to confirm that the recovered cells are cancer cells, the CK antibody used in the cancer assay was stained. Was confirmed to be a cancer cell.
[[ 실시예Example 2] 2]
혈중 순환 종양세포 준비 단계Blood Circulation Tumor Cell Preparation Stage
<폐암 환자의 혈액으로부터 혈중 순환 종양세포의 분리 방법><Methods for the isolation of blood circulating tumor cells from the blood of patients with lung cancer>
1. 폐암 환자의 말초혈액을 추출하여 혈액 추출용 ACDA(acid citrate dextrose solution 'A') 튜브에 담는다. 1. Extract peripheral blood from patients with lung cancer and place in an ACDA (acid citrate dextrose solution 'A') for blood extraction.
2. 말초혈액과 동일 볼륨의 피콜(ficoll) 용액을 새로운 튜브에 담고, PBS(phosphate buffered saline, 인산완충식염수)로 희석시킨 말초혈액을 피콜 용액 층 위로 조심스럽게 옮긴다.2. Place the same volume of ficoll solution in a new tube and carefully transfer peripheral blood diluted with PBS (phosphate buffered saline) to the phycol solution layer.
3. 400xg의 스피드로 상온에서 30분간 원심분리 한다. 3. Centrifuge at 400xg for 30 minutes at room temperature.
4. 원심분리 후, 형성된 말초혈액 단핵세포 층을 새로운 튜브로 옮겨 담고, 제 3 버퍼(buffer)를 이용해 희석시킨다. 4. After centrifugation, the formed peripheral blood mononuclear cell layer is transferred to a new tube and diluted with a third buffer.
5. 사이즈 선택성을 가지는 칩을 고정대에 고정시킨 후, 제 4 버퍼를 이용하여 칩을 미리 적셔 놓는다. 5. Fix the chip with size selectivity to the holder, and pre-wet the chip with a fourth buffer.
6. 위 실험방법 5에서, 제 3 버퍼로 희석된 말초혈액 단핵세포를 칩으로 통과시킨다. 6. In Experimental Method 5 above, the peripheral blood mononuclear cells diluted with the third buffer are passed through the chip.
7. 세포의 회수율을 높이기 위해, 튜브에 남아있는 세포들을 제 3 버퍼로 헹군 후, 칩으로 통과시키는 과정을 반복 수행한다.7. To increase the recovery rate of the cells, the cells remaining in the tube are rinsed with a third buffer and then passed through the chip repeatedly.
8. 칩으로부터 세포를 회수한다.8. Recover cells from the chip.
<혈중 순환 종양세포의 단기배양 방법><Short-term culture method of blood circulating tumor cells>
회수한 칩에서 혈중 순환 종양세포를 분리한 후, 자동화 배양장치 TLI를 이용하여 2주간의 단기배양을 수행한다.Blood circulating tumor cells are isolated from the recovered chip, followed by short-term culture for 2 weeks using an automated culture device TLI.
[[ 실시예Example 3] 3]
혈중 순환 종양세포의 확인 단계Identification of blood circulating tumor cells
단기 배양된 혈중 순환 종양세포는 염색 방법을 통해 암 세포임을 확인하기 위하여, 하기 방법을 이용하여 세포 염색과정을 수행한다. In order to confirm that the short-term cultured blood circulating tumor cells are cancer cells through the staining method, the cell staining process is performed using the following method.
1. 세포 원심분리법인 싸이토스핀(cytospin) 과정을 수행하여 회수된 세포들을 염색용 슬라이드에 고정시킨다. 1. Cytospin, a cell centrifugation process, is performed to fix the recovered cells to a staining slide.
2. 항체가 세포 내부로 들어갈 수 있도록 투과(permeabilization)과정을 수행한다.2. Perform permeabilization to allow the antibody to enter the cell.
3. PBS로 워싱(washing) 과정을 수행한다.3. Perform a washing process with PBS.
4. PBS를 이용하여 1% BSA(bovine serum albumin)를 만들고, 비특이적 반응(non-specific binding)과 내인성 퍼옥시다제 활성(endogenous peroxidase activity)를 줄이기 위해 블러킹(blocking) 과정을 수행한다. 4. Perform 1% BSA (bovine serum albumin) using PBS and perform a blocking process to reduce non-specific binding and endogenous peroxidase activity.
5. 1차 항체로 EpCAM(epithelial cell adhesion molecule), CK(cytokeratin) 및 CD(cluster of differentiation) 45를 상온에서 60분간 반응시킨다. 5. EpCAM (epithelial cell adhesion molecule), CK (cytokeratin) and CD (cluster of differentiation) 45 are reacted as a primary antibody at room temperature for 60 minutes.
6. 상기 1차 항체에 결합하는 형광표지된 2차 항체를 상온에서 60분간 반응시킨다.6. The fluorescently labeled secondary antibody that binds to the primary antibody is reacted at room temperature for 60 minutes.
7. PBS로 워싱 과정을 수행한다. 7. Perform a washing process with PBS.
8. 최종적으로 세포 핵을 염색하기 위해, DAPI(4′,6-diamidino-2-phenylindole) solution을 넣은 후 커버글라스를 덮고 상온에서 10분간 반응시킨다. 8. Finally, to stain the cell nuclei, add DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole) solution and cover glass cover for 10 minutes at room temperature.
9. 염색된 세포들을 관찰하면서, 염색된 비율 및 회수율을 매뉴얼로 계산한다.9. While observing the stained cells, calculate the stained rate and recovery rate manually.
[[ 실험예Experimental Example 1] One]
혈중 순환 종양세포 확인 실험Blood circulation tumor cell confirmation experiment
상기 실시예 2 및 실시예 3과 동일한 조건 및 방법을 이용하여, 폐암 환자의 혈중 순환 종양세포를 분리하고 단기배양한 후, 세포 염색을 수행하였다. 혈액으로부터 분리된 혈중 순환 종양세포가 암 세포임을 확인하기 위해, 기존의 암 검정에서 사용되고 있는 EpCAM과 CK 항체를 이용하여 세포를 염색하였다. Blood circulating tumor cells of lung cancer patients were isolated and short-term cultured using the same conditions and methods as those of Example 2 and Example 3, followed by cell staining. Cells were stained with EpCAM and CK antibody, which are used in conventional cancer screening, to confirm that blood circulating tumor cells isolated from blood are cancerous cells.
도 5를 참조하여 보면, 혈중 순환 종양세포는 DAPI +/EpCAM+/CD45- 세포 또는 DAPI+/EpCAM+/CK+/CD45- 세포인 것을 확인하였다. 핵의 대조염색(counterstaining)을 위해 DAPI를 사용하였고, CD45는 백혈구 공통 항원으로 CD45 양성을 제외함으로써 순환 종양세포와 구별하기 위해 사용되었다. EpCAM은 상피세포결합분자로 상피성종양로부터 유래된 혈중 순환 종양세포를 선택하기 위해 사용되었으며, CK는 특이적 종양세포의 마커로 혈중 순환 종양세포를 선택하기 위해 사용되었다. 백혈구, PC9(비소세포 폐암 세포주)및 KG-1(급성 골수구성 백혈병 세포주)은 각각 CD45, EpCAM 및 CD45에 양성을 가지는 양성 대조군(positive control)로 사용되었다.Referring to FIG. 5, it was confirmed that blood circulating tumor cells were DAPI + / EpCAM + / CD45 - cells or DAPI + / EpCAM + / CK + / CD45 - cells. DAPI was used for nuclear counterstaining and CD45 was used to distinguish it from circulating tumor cells by excluding CD45 positive as a common white blood cell antigen. EpCAM was used to select blood circulating tumor cells derived from epithelial tumors as epithelial cell binding molecules, and CK was used to select circulating tumor cells as a marker of specific tumor cells. Leukocytes, PC9 (non-small cell lung cancer cell line) and KG-1 (acute myeloid leukemia cell line) were used as positive controls positive for CD45, EpCAM and CD45, respectively.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.It will be understood by those skilled in the art that the foregoing description of the present invention is for illustrative purposes only and that those of ordinary skill in the art can readily understand that various changes and modifications may be made without departing from the spirit or essential characteristics of the present invention. will be. It is therefore to be understood that the above-described embodiments are illustrative in all aspects and not restrictive. For example, each component described as a single entity may be distributed and implemented, and components described as being distributed may also be implemented in a combined form.
본 발명의 범위는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.The scope of the present invention is defined by the appended claims, and all changes or modifications derived from the meaning and scope of the claims and their equivalents should be construed as being included within the scope of the present invention.
200 : 개인 맞춤형 항암제 선별 시스템
210 : 분리장치
211 : 주입구
212: 제1도관
213 : 여과 망
214 : 제2도관
215 : 실린더
220 : 배양장치
230 : 반응검사 장치
240 : 분석장치
250 : 선별장치200: Personalized anti-cancer drug screening system
210: Separator
211: inlet
212: first conduit
213: Filtration net
214: second conduit
215: Cylinder
220: culture apparatus
230: Reaction testing device
240: Analyzer
250: sorting device
Claims (11)
ii) 상기 혈액으로부터 혈중 순환 종양세포(CTC circulating tumor cells)를 분리하는 단계;
iii) 상기 분리된 혈중 순환 종양세포를 단기 배양하는 단계;
iv) 상기 단기 배양된 혈중 순환 종양세포에 후보 항암제를 반응시키는 단계;
v) 상기 후보 항암제 반응을 분석하는 단계; 및
vi) 상기 분석된 후보 항암제 반응 정보를 활용하여 개인별 맞춤형 항암제를 선별하는 단계;
를 포함하고,
상기 (iii) 단계에서의 단기 배양 기간은 7일 내지 14일인 것을 특징으로 하며,
상기 (iv) 단계에서의 후보 항암제는 암의 유전적 정보를 이용하여 선별되는 것을 특징으로 하고,
상기 암의 유전적 정보는 암 특이적 SNP 분석결과, 암 특이적 일배체형(haplotype) 분석결과, 암 특이적 돌연변이 분석결과 및 암 특이적 유전자 마커 분석결과에서 선택된 하나 이상의 유전적 정보인 것을 특징으로 하며,
상기 (v) 단계는,
(v-1) 상기 혈중 순환 종양세포의 유전정보와 상기 후보 항암제 반응정보를 분석하는 단계;
(v-2) 상기 (v-1) 단계에서의 정보를 활용하여 정보 클러스터를 구축하는 단계;
(v-3) 상기 정보 클러스터를 데이터 마이닝 하는 단계; 및
(v-4) 상기 데이터 마이닝한 정보를 기초로 개인별 반응효과에 대한 알고리즘을 구축하는 단계;
를 포함하고,
상기 i) 단계이후 및 상기 ii) 단계 이전에, 전처리 단계로서 a) 혈액에 백혈구의 항체를 넣어 백혈구는 제거하는 단계; 및 b) 혈액의 적혈구를 용해하는 단계를 추가로 포함하며,
상기 i)단계는 사이즈 선택성 칩(chip)을 이용하여 혈중 순환 종양세포를 분리하는 것을 포함하고,
상기 사이즈 선택성 칩은,
혈액으로부터 분리된 말초혈액 단핵세포를 주입하는 주입구,
상기 말초혈액 단핵세포를 수송하는 제 1 도관,
상기 제 1 도관의 내측에 장착되어 있고, 복수의 기공(pore)을 갖는 여과 망,
상기 말초혈액 단핵세포 중 상기 여과 망을 통과하여 혈중 순환 종양세포를 제외한 세포가 배출되는 제 2 도관, 및
상기 제 2 도관을 통과한 상기 혈중 순환 종양세포를 제외한 세포를 수집하는 실린더를 포함하며,
상기 복수의 기공의 각각의 모양은 다각형 또는 원형 중 어느 하나인 것을 특징으로 하고,
상기 복수의 기공의 각각의 사이즈는 6.5μm인 것을 특징으로 하며,
상기 사이즈 선택성 칩은 10분이내에 세포회수율이 90%인 것을 특징으로 하는 것을 포함하는 폐암 환자의 혈중 순환 종양세포를 활용한 EGFR-TKI 내성 환자의 맞춤형 항암제 선별방법.
i) preparing blood of a patient resistant to EGFR-TKI (epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor);
ii) isolating CTC circulating tumor cells from the blood;
iii) short-term culture of the isolated blood circulating tumor cells;
iv) reacting the short-term cultured blood circulating tumor cells with a candidate anticancer agent;
v) analyzing the candidate anticancer response; And
vi) selecting a customized anticancer agent based on the analyzed candidate anticancer drug response information;
Lt; / RTI >
Wherein the short-term culture period in the step (iii) is 7 days to 14 days,
The candidate anticancer agent in the step (iv) is selected using genetic information of the cancer,
Wherein the genetic information of the cancer is at least one genetic information selected from cancer-specific SNP analysis results, cancer-specific haplotype analysis results, cancer-specific mutation analysis results and cancer-specific gene marker analysis results In addition,
The step (v)
(v-1) analyzing the genetic information of the blood circulating tumor cells and the candidate anticancer response information;
(v-2) building an information cluster using the information in the step (v-1);
(v-3) data mining the information cluster; And
(v-4) constructing an algorithm for an individual reaction effect based on the data mining information;
Lt; / RTI >
The method according to any one of the preceding claims, wherein after step i) and before step ii), as a pretreatment step a) removing leukocytes by adding an antibody of leukocyte to blood; And b) dissolving red blood cells in the blood,
Said step i) comprises separating blood circulating tumor cells using a size selective chip,
The size-
An injection port for injecting peripheral blood mononuclear cells separated from blood,
A first conduit for delivering said peripheral blood mononuclear cells,
A filter net mounted on the inside of the first conduit and having a plurality of pores,
A second conduit of the peripheral blood mononuclear cells through which the cells other than blood circulating tumor cells are released,
And a cylinder for collecting cells other than the blood circulating tumor cells that have passed through the second conduit,
Wherein each of the plurality of pores has a polygonal shape or a circular shape,
Wherein each of the plurality of pores has a size of 6.5 mu m,
Wherein said size-selective chip has a cell recovery rate of 90% within 10 minutes. ≪ Desc / Clms Page number 24 >
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