KR101873316B1

KR101873316B1 - 발효된 천연유황분말을 포함하는 단미사료 및 그 제조 방법

Info

Publication number: KR101873316B1
Application number: KR1020160082486A
Authority: KR
Inventors: 이창민; 이상석
Original assignee: 유바이오텍 주식회사
Priority date: 2016-06-30
Filing date: 2016-06-30
Publication date: 2018-07-04
Also published as: KR20180003681A

Abstract

본 발명은 a) 유황, 소맥피 및 미강을 혼합하는 단계; b) 상기 a) 단계의 혼합물에 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium), 류코노스톡 슈도메센세로이드(Leuconostoc seudomesenteroides), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 및 바실러스 아밀로리쿠에파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens)로 이루어진 군으로부터 4종 이상 선택된 균주의 배양액을 접종하고 발효하여 유황의 독성을 1차로 제거하는 단계; c) 상기 b) 단계의 발효물을 건조하여 유황의 독성을 2차로 제거하는 단계; d) 상기 c) 단계의 건조물에 미네랄, 자색바이오 및 규산염을 첨가하고 수분 함량을 10% 이하로 조절하는 단계를 포함하는 단미사료의 제조 방법 및 그 제조 방법에 따라 제조된 단미사료에 관한 것이다. 본 발명에 따른 단미사료는 유황의 유해물질이 제거되어 가축이 안전하게 섭취할 수 있으며, 가축 급여시 분변에서의 악취 저감과 사료효율을 개선하는 효과가 있어 가축 사료 및 사료첨가제로서 유용하게 사용 가능하다.

Description

발효된 천연유황분말을 포함하는 단미사료 및 그 제조 방법{Single ingredient comprising fermented natural sulfur powder and method of preparing therefor}

본 발명은 발효된 천연유황분말을 포함하는 단미사료 및 그 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 미생물 발효에 의한 유황의 독소물질을 저감시키고, 가축 급여시 분변에서의 냄새 저감과 사료효율을 개선할 수 있는 발효된 천연유황분말을 포함하는 단미사료 및 그 제조 방법에 관한 것이다.

유황(sulfur)은 광물성, 동물성 또는 식물성 형태로 존재하며, 탈모방지, 항암, 숙변제거, 생체 내 독성제거, 염증제거, 면역력 증대, 항균 등 다양한 약리효과를 나타내는 원소이다.

이러한 유황은 인체 내에서 자연적으로 생성되지 않아 외부에서 보충해주어야 하는데, 광물성 유황은 함께 섞여 있는 중금속 성분과 독성 때문에 식용으로는 사용할 수 없어 대부분 동물(녹각, 웅담, 사향, 동물의 쓸개 등) 또는 식물(생강, 더덕, 파, 양파, 갓, 부추, 인삼, 마늘 등)을 섭취함으로써 보충한다. 그러나, 상기 식물에 존재하는 유황의 양은 매우 적고, 대부분 무기유황 상태로 흡수가 어려우며, 상기 동물에 존재하는 유황을 섭취하기 위해서는 많은 비용과 시간이 소요되는 문제가 있다.

이에 종래 당업계에서는 유황의 여러 효능을 그대로 유지하면서 독성을 제거하기 위해 광물성 유황을 독물 취급 용기 등에 투입, 밀봉시켜 일정시간 동안 가열하여 구워낸 후, 이를 분말화하여 독성을 감소시키는 유황 법제방법이 통용되었다. 하지만 상기 유황 법제방법은 유황의 독성감소 효율이 매우 미약하여 가축의 사료로서 이용할 경우 가축의 사멸률이 30% 이상 나타나 제공량에 제한을 두어야 하며, 섭취한 유황이 2시간 이내에 배설물과 함께 배설되어 잔류효과가 적어지는 등의 문제가 있다. 따라서 유황의 독성을 용이하게 제거하는 방법을 개발하기 위한 시도가 다양하게 이루어지고 있다.

이와 관련하여, 대한민국 등록특허 제10-454574호에는 참나무 삶은 물, 식초, 보릿가루 용액, 순무즙, 솔잎즙 및 물의 혼합물에 유황을 첨가하여 가열, 숙성 및 건조시키는 공정으로 이루어진 유황의 유해성분을 제거하는 방법에 대해 개시되어 있다. 그러나, 상기 방법에서 사용하는 혼합물은 구성 원료의 수가 다양하고, 상기 원료들의 전처리 공정이 번거로워 전체 제조공정이 용이하지 못한 단점이 있다.

또한, 대한민국 공개특허 제2010-0019914호에는 콩가루에 함유된 단백질에 바실러스 균주를 접종시켜 1차 발효시킨 후 유황을 첨가하여 다시 2차 발효시킨 다음 액상녹조식물을 첨가하고 가열시켜 유황의 독성을 제거하는 방법에 대해 개시되어 있으며, 대한민국 등록특허 10-1334157호에 는 유산균 및 효모로 이루어진 혼합 미생물 배양액에 독성유황 분말을 첨가한 후 2단계에 걸쳐 발효 분해한 후 건조시켜 제독된 유황발효분말을 제조하는 방법에 대해 개시되어 있다. 그러나, 상기 방법은 단순히 발효 미생물만을 사용하므로 유황의 독성을 제거하는데 다소 많은 시간이 소요되며, 발효 미생물의 종류에 따라 발효시간이 달라져 자동화 공정에 따른 대량생산이 이루어질 수 없는 문제가 있다.

이에 본 발명자들은 상기 문제점들을 해결하면서 유황의 약리효능 중 악취저감 및 사료효율 개선이 향상된 천연유황분말의 미생물 발효를 활용한 단미사료를 제조하고자 노력하던 중, 유황의 유해성분을 제거하는 효능이 있는 미생물을 활용하여 사료발효 시 유황의 유해성분을 제거할 수 있으며, 가축 급여 시 분변에서의 냄새 저감과 사료효율 개선을 나타냄을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 하나의 목적은 유황의 유해성분이 제거되며, 가축 급여시 분변에서의 냄새 저감과 사료효율을 개선할 수 있는 단미사료를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 단미사료의 제조 방법을 제공하는데 있다.

하나의 양태로서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 단미사료의 제조 방법을 제공한다.

a) 유황, 소맥피 및 미강을 혼합하는 단계;

b) 상기 a) 단계의 혼합물에 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium), 류코노스톡 슈도메센세로이드(Leuconostoc seudomesenteroides), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 및 바실러스 아밀로리쿠에파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens)로 이루어진 군으로부터 4종 이상 선택된 균주의 배양액을 접종하고 발효하여 유황의 독성을 1차로 제거하는 단계;

c) 상기 b) 단계의 발효물을 건조하여 유황의 독성을 2차로 제거하는 단계;

d) 상기 c) 단계의 건조물에 미네랄, 자색바이오 및 규산염을 첨가하고 수분 함량을 10% 이하로 조절하는 단계.

a) 단계로서, 유황, 소맥피 및 미강을 혼합하여 혼합물을 제조하는 단계이다.

본 발명에 있어서, 상기 유황, 소맥피 및 미강은 분말 형태인 것이 바람직하며, 소맥피 100 중량부를 기준으로 유황이 100 내지 120 중량부, 미강이 90 내지 110 중량부로 혼합되는 것이 바람직하다. 상기 범위 외로 유황을 사용하는 경우 유황의 섭취가 충분하지 않거나 유황을 다량 섭취하게 되어 섭취하는 가축에 이상을 초래할 수 있는 문제가 있다. 또한, 상기 범위 외로 소맥피 및 미강이 포함되는 경우 이후의 발효 과정에서 발효가 충분히 이루어지지 않아 유황의 독성 제거가 충분하지 않거나 과발효되어 유황의 섭취가 감소하는 결과를 초래하게 된다.

b) 단계로서, 효모 및 유산균으로부터 4종 이상의 균주를 선택하고 이들 선택된 균주의 혼합 배양액을 상기 a) 단계의 혼합물에 첨가하고 발효하는 단계이다.

본 발명에 있어서, 효모 및 유산균은 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium), 류코노스톡 슈도메센세로이드(Leuconostoc seudomesenteroides), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 및 바실러스 아밀로리쿠에파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens)으로부터 선택될 수 있으며, 바람직하게 4종 이상, 보다 바람직하게는 4종을 선택하여 발효균주로 사용한다. 이와 같이 4종 이상의 균주를 혼합하여 사용하는 경우에 유황의 독성이 효과적으로 이루어지는 장점이 있다.

이들 선택된 발효 균주는 혼합된 상태로 배지에서 배양되는데, 상기 배양을 위한 배지는 천일염(또는 염화나트륨), 탄산수소나트륨, 염화암모늄, 인산염, 당밀(또는 설탕), 글루코스, 효모 추출물, 콩가루, 폴리소르베이트(polysorbate), 시트르산암모늄(ammonium citrate), 황산마그네슘, 황산망간(Manganese sulfate), 디포타슘포스페이트(dipotassium phosphate), 및 액상발효유황을 포함한다.

상기 액상발효유황은 두충, 감초, 및 회향의 추출물에 유황, 운모, 셀레늄을 혼합하고 발효한 것으로, 상기 발효균주의 배양 배지의 총 중량%를 기준으로 0.01 내지 0.1 중량%, 바람직하게는 0.01 내지 0.05 중량%, 보다 바람직하게는 0.01 내지 0.03 중량%, 보다 더 바람직하게는 0.02 중량%의 함량으로 포함된다.

상술한 액상발효유황의 제조시 두충, 감초 및 회향은 1.8 내지 2.2: 1.8 내지 2.2: 0.8 내지 1.2의 중량비, 바람직하게는 1.9 내지 2.1: 1.9 내지 2.1: 0.9 내지 1.1의 중량비, 보다 바람직하게는 2: 2: 1의 중량비로 혼합되어 추출되며, 그 추출물의 100 중량부를 기준으로 유황이 180 내지 220 중량부, 바람직하게는 190 내지 210 중량부, 보다 바람직하게는 200 중량부, 운모 및 셀레늄 각각이 80 내지 120 중량부, 90 내지 110 중량부, 보다 바람직하게는 100 중량부로 혼합되어 발효된다.

또한 상술한 액상발효유황의 발효는 통상의 방법에 의하여 이루어지나, 바람직하게는 35 내지 38℃에서 100일 내지 140일, 바람직하게는 120일 동안 이루어진다.

이러한 액상발효유황이 포함된 배양 배지에서 상기 발효 균주들이 배양됨에 따라 본 발명에 따른 단미사료의 제조시 발효 균주들의 유황의 독성 제거, 즉 유황법제 능력의 향상을 기대할 수 있다.

상술한 배양 배지에 포함되는 성분들 중 천일염(또는 염화나트륨), 탄산수소나트륨, 염화암모늄, 인산염, 당밀(또는 설탕), 글루코스, 효모 추출물, 콩가루, 폴리소르베이트(polysorbate), 시트르산암모늄(ammonium citrate), 황산마그네슘, 황산망간(Manganese sulfate), 및 디포타슘포스페이트(dipotassium phosphate)은 1: 1: 0.5: 1: 4: 2: 3: 2: 0.2: 0.4: 20: 10: 0.4의 중량비로 배양 배지에 포함된다.

한편, 상기 b) 단계의 발효는 교반 발효가 적합한데, 상기 교반 발효는 30 내지 35℃, 바람직하게는 32 내지 33℃에서 20분 내지 40분, 바람직하게는 30분 동안 교반하고 2 내지 4시간, 바람직하게는 3시간 동안 정치하는 것을 반복하면서 40 내지 60시간, 바람직하게는 45 내지 52시간, 보다 바람직하게는 47 내지 49시간, 보다 더 바람직하게는 48시간 동안 이루어진다.

상기 b) 단계의 혼합 균주에 의한 발효에 의하여 유황에 함유된 독성이 1차적으로 제거된다.

c) 단계는 상기 b) 단계에서 제조된 발효물을 건조하는 단계이다.

상기 건조는 통상의 방법에 의하여 이루어질 수 있으나, 바람직하게는 열풍 건조 또는 냉동 건조이다. 열풍 건조를 하는 경우 46 내지 50℃, 바람직하게는 47 내지 49℃에서 70 내지 96시간, 바람직하게는 70 내지 80시간, 보다 바람직하게는 72 내지 75시간, 보다 더 바람직하게는 72시간 동안 이루어진다. 냉동 건조를 하는 경우 -18℃ 이하, 바람직하게는 -30℃ 이하, 보다 바람직하게는 -30℃ 내지 -50℃에서 바람직하게는 47 내지 49℃에서 70 내지 96시간, 바람직하게는 70 내지 80시간, 보다 바람직하게는 72 내지 75시간, 보다 더 바람직하게는 72시간 동안 이루어진다. 상기와 같은 조건에서 건조가 이루어지는 경우에 유황의 독성이 2차적으로 유효하게 효과적으로 제거될 수 있다.

마지막 단계로서, d) 단계는 상기 c) 단계에서 제조된 건조물에 미네랄, 자색바이오 및 규산염을 첨가하고 수분 함량을 10% 이하로 조절하는 단계이다.

상기 자색바이오는 화산활동이 활발한 시기에 화산의 심저부에서 맥반석과 함께 생성된 물질로서, 주요 성분은 SiO₂(산화규소) 24.4%, Al₂O₃(산화알미늄) 0.72%, Fe₂O₃(산화철) 3.43%, CaO(산화칼슘) 2.48%, MgO(산화마그네슘) 0.31%, K₂O(산화칼륨) 1.86%, Na₂O(산화나트륨) 1.41%, Zn(아연) 99.0㎎/㎏, Cu(구리) 28.8㎎/㎏, Mn(망간) 607㎎/㎏, Cr(크롬) 127.1㎎/㎏, Ge(게르마늄) 51.0㎎/㎏, As(비소) 8.05㎎/㎏, Ni(니켈) 113㎎/㎏, Pd(납) 31,1㎎/㎏ 등이다.

상기 미네랄은 건조물 100 중량부를 기준으로 1 내지 3 중량부, 바람직하게는 1.2 내지 2 중량부, 보다 바람직하게는 1.2 내지 1.6 중량부, 보다 더 바람직하게는 1.5 중량부로 포함된다.

상기 자색바이오는 건조물 100 중량부를 기준으로 3 내지 7 중량부, 바람직하게는 4 내지 6 중량부, 보다 바람직하게는 5 중량부로 포함된다.

상기 규산염은 건조물 100 중량부를 기준으로 8 내지 15 중량부, 바람직하게는 8 내지 12 중량부, 보다 바람직하게는 9 내지 11 중량부, 보다 더 바람직하게는 10 중량부로 포함된다.

이들 미네랄, 자색바이오, 규산염이 상기 범위 내에 포함되는 경우 가축이 본 발명에 따른 단미사료를 섭취 시 법제유황의 효과를 보다 유효하게 얻을 수 있다.

한편, 상기 미네랄, 자색바이오 및 규산염은 상기 범위 내로 c) 단계의 건조물에 첨가하면서 수분 함량을 조절할 수 있으나, 수분 함량이 10% 이하가 되지 않을 경우 건조 과정을 통하여 수분 함량을 10% 이하로 조절하는 것이 요구된다.

이와 같이 수분 함량을 조절하는 것은 최종 제조되는 본 발명에 따른 단미사료의 포장 및 보관의 편이성, 그리고 가축의 섭취 용이성을 위한 것이다.

본 발명에 따라 제조된 단미사료는 유해성분이 사료기준 허용치 이하로서 적합한 사료이며, 특히 수은은 기준치 이하로 가축이 섭취 시 유해 가능성이 거의 없는 사료이다(실시예 6 참조).

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 제조 방법에 의하여 제조된 단미사료를 제공한다.

본 발명의 단미사료는 광물성 유황의 독성을 중화시켜 가축이 섭취시 유해가 없는 안전한 사료일 뿐만 아니라 가축의 섭취에 의해 가축 분변에 의한 악취를 저감시킬 수 있고 가축의 사료 효율을 개선할 수 있는 장점이 있다(실시예 7 등 참조).

따라서, 본 발명의 단미사료는 양계, 양돈, 한우, 젖소, 육우, 오리, 토종닭 등 전 가축 사료 또는 사료첨가제로서 유용하게 사용 가능하다.

본 발명에 따른 발효된 천연유황분말을 포함하는 단미사료는 특정 혼합 균주에 의한 발효 및 건조에 의해 유황의 유해물질(독성물질)이 제거된 사료이며, 가축 급여시 분변에서의 악취 저감과 사료효율을 개선하는 효과가 있다. 따라서 본 발명의 단미사료는 가축 사료 또는 사료 첨가제로서 유용하게 사용 가능하다.

이하, 실시예 등을 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예 등은 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예 등에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 액상발효유황의 제조

혼합균주의 대량 배양 배지에 함유되는 액상발효유황을 제조하기 위하여 일차로 물 1,000L에 한약재 두충 20kg, 감초 20kg, 회향 10kg를 넣은 후 100℃로 가열하여 500L로 농축하였다. 농축한 한약재 추출물에 물 1,500L, 천연유황 분말 1,000kg, 운모 500kg, 셀레늄 500g를 혼합하고 38℃에서 120일 동안 교반하면서 자연상태에서 발효하여 제조하였다. 이와 같이 제조된 액상발효유황은 ICP 정량법으로 황 함유량을 검사한 결과 평균 420mg/kg의 황 함량을 확인하였다.

실시예 2: 혼합균주 배양 및 준비

2-1. 균주의 준비

Tryptic Soy Broth(Casein peptone 17.0g/L, Soy peptone 3.0g/L, dextrose 2.5g/L, sodium acetate 5g/L, K₂HPO₄ 2.5g/L, pH 6.2-6.6), YM Broth(peptone 5.0g/L, Malt extract 3.0g/L, dextrose 10.0g/L, Yeast extract 3g/L, pH 6.2-6.6), MRS broth(MRS broth; peptone 10g/L, beef extract 10g/L, yeast extract 5g/L, dextrose 10g/L, diammonium-citrate 3g/L, sodium acetate 5g/L, tween 80 1ml, K₂HPO₄ 2g/L, MgSO₄·7H₂O 0.2g/L, MnSO₄·7H₂O 0.2g/L, pH 6.2-6.6)를 각각 121℃에서 15분간 멸균한 다음, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)는 Tryptic Soy broth에, 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)는 YM broth에, 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium) 및 류코노스톡 슈도메센세로이드(Leuconostoc pseudomesenteroides) 균주는 각각 MRS broth에 접종하고 배양하여 하기 실험에 사용하였다.

2-2. 혼합균주 대량 배양 배지 준비

상기 2-1에서 준비한 각 개별 균주를 혼합 배양하기 위하여 하기 표 1에 기재된 바와 같은 조성을 가지는 배지를 90 내지 110℃에서 60 내지 90분 동안 가열하여 살균하여 준비하였다.

배지 원료	함량(총 1000L)
NaCl(또는 천일염)	5kg
탄산수소나트륨	5kg
염화암모늄(식첨)	2.5kg
인산염(식첨)	5kg
당밀(또는 설탕)	20kg
글루코스 분말	10kg
효모 추출물	15kg
콩가루	10kg
폴리소르베이트	1kg
Ammonium Citrate	2kg
Magnesium Sulfate	100g
Manganese Sulfate	50g
Dipotassium Phosphate	2kg
물	나머지

실시예 3: 혼합 균주의 효능 검사

상기 실시예 2-2에서 준비한 혼합균주의 대량 배양배지에 상기 실시예 1에서 제조한 액상발효유황(410mg의 황 함유)을 10%, 20%, 및 30%로 희석한 20L를 첨가하고 상기 실시예 2-1에서 준비한 균주 4종을 동일한 양으로 5mL 접종한 후 35 내지 38℃에서 240시간 배양하였다. 배양 중 72시간, 240시간에 황 함유량을 ICP 정량법(mg/kg)으로 측정하였으며, 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

	72시간 배양(mg/kg) ICP정량법	240시간 배양(mg/kg) EPA3050B, 6010D	비고
무첨가(대조구)	140	-	균 접종안함
액상발효유황 10%(41mg)	150	140	410mg 액상 발효유황 사용
액상발효유황 20%(82mg)	160	150
액상발효유황 30%(123mg)	190	160

상기 표 2에서 볼 수 있듯이, 대조군에 비해 모든 처리군에서 유황 농도가 감소되었으며, 발효 72시간에는 액상발효유황 30% 처리군의 유황 농도가 제일 많이 감소되었으며, 240시간에도 액상발효유황 30% 처리군의 유황 농도가 제일 많이 감소되었다. 전체적으로 미생물 발효에 의한 황 농도가 감소됨을 확인되었다. 따라서, 본 발명에 따른 상기 혼합균주는 유황을 이용할 수 있음을 확인하였으며, 이후 상기 혼합균주의 대량 배양 배지로 표 1의 조성에 실시예 1의 액상발효유황 20L가 함유된 것으로 하여 상기 혼합균주를 35 내지 38℃에서 대량 배양하고 이하의 본 발명에 따른 단미사료 제조시 사용하였다.

실시예 4: 본 발명에 따른 단미사료의 제조

발효기에 유황분말 300kg, 소맥피 267.5kg, 미강 267.5kg을 넣고 혼합하였다. 상기 유황분말, 소맥피 및 미강의 혼합물에 실시예 2-2에서 배양한 혼합균주의 배양액 500L를 혼합하고 32℃에서 30분 교반 후 3시간 정치를 반복하면서 48시간 동안 발효하였다. 이후 48℃에서 72시간 동안 열풍건조하여 발효물의 수분 함량이 10% 이하가 되도록 하였다. 건조 후 1톤당 미네랄 분말 15kg, 자색바이오 분말 50kg, 규산염 분말 100kg을 첨가하여 본 발명에 따른 단미사료를 제조하였다.

실시예 5: 본 발명에 따른 단미사료의 제조 과정 중 미생물 균수의 변화 확인

상기 실시예 4의 발효 후 건조 전에 혼합균주의 접종 전과 발효 후의 균수의 변화를 확인하고 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.

	접종 혼합균주	48시간 발효
시료	1.0 × 10¹⁰cfu/ml	8.0 × 10⁸cfu/ml

상기 표 3에서 볼 수 있듯이, 발효 후 혼합균주의 균수가 10⁸cfu/ml로 확인되어 정상적으로 유효하게 발효된 것을 확인할 수 있었다.

실시예 6: 본 발명에 따른 단미사료의 성분 분석

상기 실시예 4에서 제조한 단미사료를 한국단미사료협회 사료연구소에 의뢰하여 일반성분 및 유황 함량 분석을 하였다. 일반 성분, 유기산, 유해성분, 아미노산 분석은 사료표준분석방법으로, 유황 함량은 침전중량법(In-house)으로, 포화지방산과 불포화지방산은 AOCS method으로 분석하였다. 그 결과로서 하기 표 4에 일반성분 및 유황 함량 분석 결과를, 표 5에 유기산 분석 결과를, 표 6에 아미노산 조성을, 표 7에 지방산 조성을, 표 8에 유해성분 분석 결과를 나타내었다.

성 분	함 량	검정방법
수분(135℃, 2시간)(%)	4.67	사료표준분석방법
조단백질(%)	9.74	사료표준분석방법
조지방(%)	12.57	사료표준분석방법
조섬유(%)	10.55	사료표준분석방법
조회분(%)	17.53	사료표준분석방법
유황(total)(%)	25.76	침전중량법

상기 표 4에서 볼 수 있듯이, 본 발명에 따른 단미사료는 유황 함량이 25.76%인 것으로 조사되었다.

성 분	발효 전	발효 후	검정방법
프로피온산(mg/kg)	1,239.31	4,643.83	사료표준분석방법
초산(mg/kg)	896.70	1,237.31	사료표준분석방법
젖산(mg/kg)	2,594.71	29,700.71	사료표준분석방법
낙산(mg/kg)	-	4,356.55	사료표준분석방법
전체 유기산(mg/kg)	4730.72	39,938.4

상기 표 5에서 볼 수 있듯이, 본 발명에 따른 단미사료는 발효 전 유기산은 프로피온산은 1,239.31이었고, 초산은 896.70mg/kg이었고, 젖산은 2,594.71mg/kg이었고, 낙산은 검출되지 않았다. 발효 후 유기산은 프로피온산은 4,643.83mg/kg이었고, 초산은 1,237.31mg/kg이었고, 젖산은 29,700.71mg/kg이었고, 낙산은 4,356.55mg/kg이었다. 유기산 전체함량은 발효 전 시제품에 비하여 발효 후 시제품에서 약 8.44배 이상 함량이 높았다.

성분	함량(%)
Tryptophan	0.07
Threonine	0.30
Serin	0.37
Proline	0.34
Valine	0.41
Iso-leucine	0.25
Leucine	0.56
Tyrosine	0.27
Methionine	0.10
Cysteine	0.15
Lysine	0.24
Glycine	0.49
Alanine	0.53
Arginine	0.50
Glutamic acid	1.27
Aspartic acid	0.73
Histidine	0.32
Phenylalanine	0.33

표 6에서 볼 수 있듯이, 본 발명에 따른 단미사료는 다양한 아미노산을 균일하게 존재하고 있음을 확인할 수 있었다.

성분	함량(%)	비고
포화지방산(%)	22.47	상대함량
불포화지방산(%)	76.47	상대함량
Lauric acid C12:0	0.32
Myristic acid C14:0	0.45
Palmitic acid C16:0	19.89
Palmitoleic acid C16:1	0.29
Stearic acid C18:0	1.81
Oleic acid C18:1	37.09
Linoleic acid C18:2 n-6	36.81
Linoleic acid C18:3 n-3	1.72
Eicosatrienoic acid C20:1	0.56
Unknown	1.06

표 7에서 볼 수 있듯이, 본 발명에 따른 단미사료는 지방산 조성에서 포화지방산은 22.47%이었고, 불포화지방산은 76.47%였다. 지방산 중 Palmitic acid 19.89%이었고, Oleic acid 37.09%이었고, Linoleic acid 36.81%이었으며, 이 세 항목이 전체량의 약 94%를 차지하였다.

성분	본 발명의 단미사료 (ppm)	본 발명의 발효 전 (ppm)	천연유황분말 (ppm)	허용기준치 (ppm)
납(Pb)	2.28	1.60	1.25	30
카드뮴(Cd)	0.69	0.09	0.28	1,800
비소(As)	0.57	0.20	3.24	40
수은(Hg)	0.50	0.71	2.21	0.5
불소(F)	16.66	17.81	0.31	50

표 8에서 볼 수 있듯이, 본 발명에 따른 단미사료는 유해성분 분석 결과에서 사료기준 허용치 이하를 나타내었다. 특히, 천연유황분말(유황분말)의 경우 납, 카드뮴, 비소, 불소는 기준 허용치 보다 낮았으나, 수은은 천연유황분말의 경우 2.21ppm로 기준허용치를 초과 하였고, 발효 전에서도 수은은 기준허용치를 초과하였다. 이에 반해 본 발명에 따른 단미사료는 미생물 발효에 의해 수은이 0.50ppm으로 허용기준치보다 낮게 되었다. 따라서, 미생물 발효에 의한 천연유황의 유해성분 및 독소를 제거함으로써 제품의 안정성을 확보할 수 있음을 확인할 수 있었다.

실시예 7: 본 발명에 따른 단미사료의 급여에 따른 육계의 생산성과 계사 악취가스 발생 변화 조사

7-1. 사료의 배합 및 급여

본 실험에 사용된 실험 사료의 조성을 표 9에 나타내었다. 옥수수와 대두박을 기초로 하였고, 에너지와 모든 필수 영양소함량을 NRC 요구량(1994)에 맞거나 상회하는 수준으로 실험 사료를 배합하였다. 실험 설계는 일반사료만 급여한 대조구와 본 발명에 따른 단미사료를 총 사료 급여 중량의 0.2중량% 첨가한 첨가구(급여구)(이하에서는 편의상 ‘발효유황첨가제 사료’라 함)로 하였으며 유황 급여량은 600ppm 수준이었다. 본 실험에서는 1일령 Ross 육용종 병아리를 공시하여, 개체별로 체중을 측정한 후 2개 처리에 3반복으로 반복당 30수씩, 총 180수를 선발하여 평사케이지에서 실험을 진행하였다. 사양시험 기간은 35일이었으며, 사양시험 기간 동안 물과 사료는 자유 채식시켰고, 사육실 내의 온도는 처음 1주간은 38±2℃로 한 뒤 시험 종료 마지막 주에는 30±2℃가 유지되도록 하고 24시간 점등을 실시하였다.

본 실험에서 얻어진 결과의 통계분석은 SAS package program의 GLM(General Linear Model)를 이용하여 분산분석을 실시하였으며(SAS, 2003), 처리평균간 차이는 Ducan 다중검정법(1995)에 의해 처리구간 2의성(p<0.05)을 검증하였다.

Item	1 day to 3 weeks(Starter)	4 to 5 weeks(Finisher)
Ingredient, %
Corn	32.41	35.00
Wheat bran	25.00	21.47
Rice bran	4.00	4.00
Soybean meal	23.86	22.11
Rapeseed meal	-	2.00
DDGS	5.00	5.00
Tallow	2.00	1.00
Meat and bone meal	1.00	1.00
Lysine	0.46	1.00
Threonine	-	0.03
MHA(methionine hydroxyl analogue)	0.30	0.36
Salt	0.22	0.19
Limestoene	1.15	1.37
Sodium bicarbonate	0.20	0.20
Vitamin and mineral premix	0.25	0.25
Phytase	0.01	0.01
Chemical composition, %
ME,Kcal	3,080.00	3,114.25
Crude protein	20.00	19.00
Crude fiber	2.67	2.78
Crude fat	6.00	7.00
Crude ash	5.30	5.46
Lys	1.19	1.17
Met	0.55	0.60
Ca	0.92	1.00
Na	0.17	0.16
Cl	0.24	0.26

Mineral mixture provided following nutrients per kg of diet: Fe,35 mg; Zn, 60 mg; Mn, 85 mg; Cu, 70 mg; I, 1.6 mg; Se 0.1 mg.

Vitamin mixture provided following nutrients per kg of diet: Vitamin A, 12000 IU; Vitamin D3, 2500 IU; Vitamin E, 25 mg; Vitamin K3, 0.7 mg; Vitamin B1, 1 mg; Vitamin B2, 12 mg; Vitamin B6, 2 mg; Vitamin B12, 0.03 mg; Niacin, 35 mg; Pantothenic acid, 10 mg; Biotin, 0.05 mg; Folic acid, 0.5 mg; Ethoxyquin, 1700 mg.

7-2. 증체량, 사료섭취량, 사료요구율 및 폐사율

상기 실시예 7-1에 따라 육계의 사료 섭취량은 전기 및 후기 종료 시, 총 급여량에서 잔량을 제외하여 측정하였고, 증체량은 단계별 종료 시 체중과 개시 체중을 계산하여 산출하였다. 얻어진 사료 섭취량과 증체량으로부터 사료 요구율을 산출하였다. 폐사율은 입추시부터 출하 시까지 처리구별로 매일 조사하여 총 입추수에 대하여 폐사수를 나누어 구하였다. 그 결과를 하기 표 10에 나타내었다.

ITEM	Control	FA
Starter - 1
Initial Body weight(g)	41.86±0.40	41.97±0.20
Final Body weight (g)	513.54±16.17	504.53±19.50
Body Weight Gain (g)	471.68±15.85	462.56±19.32
Feed Intake (g)	690.79±5.76	706.82±12.12
Feed Conversion Ratio	1.47±0.07	1.53±0.04
Finisher - 5
Initial Body weight(g)	513.54±16.17	504.53±19.50
Final Body weight (g)	1,619.33±111.92	1,890.89±23.68
Body Weight Gain (g)	1,105.79±99.31^b	1,386.36±18.53^a
Feed Intake (g)	1,771.63±141.04	2,076.69±21.75
Feed Conversion Ratio	1.60±0.01^a	1.50±0.02^b
Overall
Initial Body weight(g)	41.86±0.40	41.97±0.20
Final Body weight (g)	1,619.33±111.92	1,890.89±23.68
Body Weight Gain (g)	1,577.47±111.52	1,848.92±23.49
Feed Intake (g)	2,462.42±136.32	2,783.51±31.79
Feed Conversion Ratio	1.56±0.03	1.51±0.00
Mortality, %	6.25	3.13

± standard error

ab Means in the same row with the same superscript letter are not significantly different(P<0.05) by DMRT.

FA: broilers fed a basal diet containing 0.2% fermented sulfur feed

상기 표 10에서 볼 수 있는 바와 같이, 전기사양시험 결과 종료체중과 증체량은 대조구가 높은 경향을 보였고, 사료섭취량과 사료요구율은 발효유황첨가제 급여구에서 높은 경향을 보였으나 통계적인 유의차는 없었다. 후기사양시험 결과, 종료체중, 사료섭취량은 발효유황첨가제 급여구에서 높은 경향을 보였으나 통계적인 유의차는 없었다. 증체량은 발효유황사료 급여구에서 280g 높게 측정되었으며, 사료요구율은 1.50으로 낮게 측정되었다(P<0.05). 사양시험 결과, 개시체중, 종료체중, 증체량 및 사료섭취량은 발효유황첨가제 급여구에서 높은 경향을 보였고, 사료요구율 및 폐사율은 발효 유황사료 첨가구에서 낮은 경향을 보였다. 육계 배합사료 내 발효유황첨가제 급여는 후기 사양기간에 증체량 및 사료요구율을 개선하였으며, 폐사율도 감소하는 효과를 나타내었다.

7-3. 계사 내 악취가스 발생량 조사

악취가스 측정을 위해 채집한 가스를 Sensor gas chromatograph(Fis inc, Japan)를 이용하여 분석하였다. Hydrogen sulfide, Methylmercaptan 및 Dimethyl sulfide의 측정은 ODSA-P2 Sensor gas chromatograph를 이용하였고 Ammonia 및 Trimethylamine의 측정은 ODNA-P2 Sensor gas chromatograph를 이용하였다. 그 결과를 하기 표 11에 나타내었다.

Time(weeks)	Treatments
Time(weeks)	Control	FA
Hydrogen sulfide(H₂S)
1	737.49 ±56.64	619.99 ±34.83
2	714.23 ±67.15	718.58 ±26.89
3	834.74 ±55.52	688.59 ±122.28
4	360.12 ±13.83	383.62 ±21.88
5	380.03 ±29.81	420.18 ±29.35
Methyl mercaptan(CH₃SH)
1	15.83 ±8.64	9.02 ±4.69
2	56.81 ±3.61	61.66 ±4.06
3	71.77 ±1.74	68.47 ±2.50
4	58.86 ±1.38^b	65.73 ±0.78^a
5	66.62 ±1.70	67.80 ±1.53
Demethyl sulfide((CH₃)₂S)
1	15.11 ±1.48	9.26 ±2.07
2	13.17 ±2.48	13.61 ±1.17
3	20.67 ±1.76	23.52 ±2.59
4	11.34 ±1.69	13.19 ±3.94
5	13.52 ±1.52	15.72 ±3.39
Ammonia(NH₃)
1	50.59 ±3.67	56.41 ±3.27
2	47.19 ±3.20	45.79 ±2.01
3	48.79 ±2.80	45.99 ±4.10
4	54.71 ±2.80^a	45.33 ±0.99^b
5	46.23 ±2.35	45.04 ±0.77
Trimethylamine((TMA(CH₃))
1	0	0
2	0	0
3	0	0
4	0	0
5	0	0

± standard error

FA: broilers fed a basal diet containing 0.2% fermented sulfur feed

상기 표 11에서 볼 수 있듯이, 황계열 악취물질인 황화수소, 메틸머캅탄 및 디메칠설파이드 농도는 시험 1주차에 대조구에 비해 발효유황첨가제 급여구에서 낮은 경향을 보였다. 암모니아 농도는 시험 2주차부터 대조구에 비해 발효유황첨가제 급여구에서 낮은 경향을 보였으며, 시험 4주차에 발효유황첨가제 급여구에서 대조구에 비해 10ppm낮은 농도를 나타내어 17% 암모니아 가스를 억제하는 효과를 나타내었다(P<0.05).

7-4. 도체 일반성분 분석

시험 종료 시 반복별로 체중이 비슷한 개체 3수씩 도계한후 탈모 처리 후 정강이 고기와 가슴고기의 무게를 1:1의 비율로 각각 적출하여 분쇄기로 분쇄한 것을 분석 시료로 하여 수분, 조단백질, 조지방 및 조회분함량을 분석하였다. 일반성분 분석은 AOAC(1994)의 방법에 따라 분석하였다. 수분은 105~110℃ 건조법, 조단백질은 Kjeldahl법, 조지방은 Soxhlet 추출법, 조회분은 회화로를 이용한 회화법을 이용하였다. 그 결과를 하기 표 12에 나타내었다.

Item(%)	Moisture	Crude protein	Crude fat	Crude Ash
Control	75.08^b±0.27	26.14±0.34	1.08±0.06	1.23^b±0.09
FA	75.96^a±0.06	25.48±0.37	1.14±0.14	1.70^a±0.02

± standard error

FA: broilers fed a basal diet containing 0.2% fermented sulfur fee

상기 표 12에서 볼 수 있는 바와 같이, 수분 함량 및 조회분 함량은 발효유황첨가제 급여구의 계육에서 높게 나타났으며(P<0.05), 조단백질 함량은 대조구 계육에서 높은 경향을 나타냈으며, 조지방 함량은 발효유황첨가제 계육에서 낮은 경향을 나타냈다.

7-5. 계육내 지방산 조성 평가

지질 추출은 Folch et al. (1957)의 방법에 따라 추출하였으며, 메틸화한 후 상층액을 분리하여 밀봉 후 냉동 보관 후 gas chromatography(680D, Youngin Scientific Co. LTD, Korea)로 분석하였다. 이때의 분석 조건은 column의 초기 온도는 145℃로 조정하고, 분당 5℃씩 온도를 높여, 최종 온도는 280℃로 설정하였다. Carrier gas는 N₂이었다. 그 결과를 하기 표 13에 나타내었다.

ITEM	Control	FA
C12:0	0.34±0.03	0.27±0.08
C14:0	0.79±0.03	0.75±0.02
C15:0	1.33±0.08	1.19±0.05
C16:0	23.64a±0.04	22.70b±0.31
C16:1ω7	5.20±0.40	4.71±0.16
C18:0	9.07±0.38	9.20±0.26
C18:1t	0.27±0.02	0.23±0.02
C18:1ω9	36.26b±0.44	37.99a±0.56
C18:2ω6	17.75±0.25	17.24±0.26
C18:3ω3	0.42b±0.01	0.46a±0.01
C20:0	0.62±0.02	0.59±0.02
C20:2ω6	0.61±0.15	0.81±0.02
C20:4ω6	3.71±0.33	3.86±0.27
SFA - 포화지방산	35.79±0.35	34.70±0.49
UFA - 포화지방산	64.21±0.35	65.30±0.49
MUFA 단가 지방산	41.72±0.79	42.93±0.70
PUFA - 폴리 지방산	22.48±0.47	22.37±0.42
UFA/SFA	1.79±0.03	1.88±0.04

± standard error

FA: broilers fed a basal diet containing 0.2% fermented sulfur feed

상기 표 13에서 볼 수 있는 바와 같이, 일반 시판사료를 급여한 대조구에서는 palmitic acid(C16:1)가 유의하게 높은 결과를 나타났으며, 발효유황첨가제 급여구의 계육에서는 oleic acid(C18:1), alpha-linolenic acid(C18:3)가 유의하게 높은 결과를 나타났다. 발효유황첨가제 급여구의 계육에서 포화지방산 함량은 낮은 결과를 보였고, 불포화지방산 함량은 높은 결과를 보였으나 통계적인 유의차를 보이지 않았다.

7-8. 혈액 성상 분석

혈액은 도계 전 익하정맥에서 헤파린 튜브에 채혈을 하고 3,000rpm에서 15분간 원심 분리한 후 혈장을 획득하였다. 혈액성상 분석은 albumin, total protein, triglyceride, cholesterol, glucose 및 AST(aspartate aminotransferase) 분석하였고, 녹십자의료재단에 의뢰하여 혈액자동화분석기로 분석하였다. 그 결과를 하기 표 14에 나타내었다.

Items	Albumin	AST	Total cholesterol	Glucose	Total protein	Triglyceride
Control	1.38±0.06	251.00±13.34	152.00±8.98	257.40±7.46	3.00±0.06	58.40^a±5.89
FA	1.42±0.06	238.80±8.22	137.80±6.91	270.00±15.02	2.86±0.07	41.40^b±4.42

± standard error

FA: broilers fed a basal diet containing 0.2% fermented sulfur feed

상기 표 14에서 볼 수 있는 바와 같이, 중성지방인 Triglyceride는 대조구에 비해 발효유황첨가제 급여구 육계 혈청에서 낮게 측정되었으며, 다른 분석항목은 대조구와 비슷한 수준을 나타내어 간이나 신장 등의 이상 증세와 같은 병리현상에 대한 문제가 없는 것으로 사료된다.

7-9. 혈액 내 면역 글로불린 측정

면역 글로불린 측정을 위해 혈청을 분석 전까지 냉동 보관하였다. Immunoglobulin 함량은 chicken IgA, IgG, IgM kit(Bethyl Laboratories, Inc. USA)를 사용하여 측정하였다. Goat anti-chicken IgA, IgG, IgM을 coating buffer(0.05 M carbonate-bicarbonate)에 1:100 비율로 희석한 후, 96 well microplate에 100 μL씩 넣고 37℃에서 60분간 반응시켰다. 반응 후, 96 well microplate의 각 well에 coating buffer를 제거하고, washing solution(50 mM tris, 0.14 M NaCl, 0.05% tween20)으로 3회 세척하였다. 이어서 blocking solution(50 mM tris, 0.14 M NaCl, 1% BSA)를 넣고, 37℃에서 30분간 반응시킨 후 washing solution으로 3회 세척하였다. Sample diluents(50 mM tris, 0.14 M NaCl, 1% BSA, 0.05% tween 20)으로 희석된 혈청을 각 well에 100 μL씩 넣고 60분간 37℃에서 반응시킨 다음 5회 세척하고, HRP conjugate 100 μL를 넣고 반응(37℃, 60분)시켰다. 이를 다시 5회 세척한 후, enzyme substrate(TMB peroxidase substrate, peroxidase solution B)를 100 μL씩 넣고 반응시켰다. 5 μL 30분간 반응에 따른 색 변화를 관찰하여 색이 고정되면 2 M H2SO4를 넣고 반응을 정지시킨 후, microplate reader(Benchmark plus, Bio-Rad Laboratories, USA)로 450 nm에서 흡광도를 측정하고, 작성된 표준곡선을 이용하여 IgA, IgG, IgM의 함량을 산출하였다. 그 결과를 하기 표 15에 나타내었다.

Item(mg/ml)	IgG	IgM	IgA
Control	5.86b±0.12	2.00±0.43	4.21b±0.50
FA	6.59a±0.29	2.35±0.10	6.95a±0.92

± standard error

FA: broilers fed a basal diet containing 0.2% fermented sulfur feed

상기 표 15에서 볼 수 있는 바와 같이, 혈중 면역글로불린 IgG 및 IgA 함량 분석 결과, 대조구와 비교하여 처리구에서 유의적으로 높게 나타났으나 IgM의 경우 통계적인 유의차가 나타나지 않았다.

7-10. 소화기관 내 미생물정량 분석

사양 실험 종료 후결장 샘플을 채취하여 eCube Stool DNA MiniKit(Philek korea, Korea)를 이용하여 DNA를 추출한 후 -70℃에 보관 하였다. SYBR^®Green을 이용한 Real-time PCR 반응액은 Template genomic DNA 50ng, Quantispeed SYBR Greenmix 10㎕, forward 및 reverse primer 각각 1㎕를 넣은 후 최종 부피가 20㎕가 되도록 멸균된 3차 증류수를 첨가하여 Eco Real-Time PCR SYSTEM(illumina, USA)에 반응시켰다. Taqman^®Probe를 이용한 Real-time PCR 반응액은 Template genomic DNA 10ng, Quantispeed probe mix 10㎕, forward 및 reverse primer 각각 0.8㎕, Probe 0.4㎕를 넣은 후 최종 부피가 20㎕가 되도록 멸균된 3차 증류수를 첨가하여 Eco Real-Time PCR SYSTEM(illumina, USA)에 반응시켜 정량하였다. 실험에 사용된 PCR 프라이머 및 프로브는 하기 표 16에 나타내었으며, 실험 결과를 하기 표 17에 나타내었다.

Target		Primer sequence	References
Total bacteria	F^a	CGG CAA CGA GCG CAA CCC	Mcsweeney & Denman, 2007
Total bacteria	R^b	CCA TTG TAG CAC GTG TGT AGC C	Mcsweeney & Denman, 2007
Lactobacillus sp.	F	CTC AAA ACT AAA CAA AGT TTC	Dubernet et al., 2002
Lactobacillus sp.	R	CTT GTA CAC CGC CCG TCA	Dubernet et al., 2002
E.coli	F	GTT CCA AAG CGG CGA TTT G	Lee et al., 2008
	R	CAG GCC AGA AGT TCT TTT TCC A
	PR^c	FAM-ACG GCA GAG AAG GTA-BHQ-1
Salmonella sp.	F	CGT TTC CTG CGG TAC TGT TAA TT	Lee et al., 2008
	R	AGA CGG CTG GTA CTG ATC GAT AA
	PR	FAM-CCA CGC TCT TTC GTC T-BHQ-1

a: Forward primer. b: Reverseprimer. c: Taqman^®probe

ITEM	Control	FA
General bacteria	9.63±0.07a	8.88±0.23b
Lactobacillus sp.	9.12±0.29a	8.22±0.09b
E.coli	6.83±0.15	6.98±0.14
Salmonella sp.	5.73±0.03	5.73±0.04

상기 표 17에서 볼 수 있는 바와 같이, 일반세균수 및 Lactobacillus sp.는 대조구에 비해 낮게 검출되었으며(P<0.05), E.coli는 대조구에서 낮게 검출되었고 Salmonella sp.는 같은 결과를 나타내었으나 통계적인 유의차는 나타나지 않았다.

상기한 결과, 본 발명에 따른 단미사료는 양계, 양돈, 한우, 젖소, 육우, 오리, 토종닭 등 전 가축의 사료첨가제로써 충분한 효과가 있을 것으로 판단된다.

Claims

a) 유황, 소맥피 및 미강을 혼합하는 단계;
b) 상기 a) 단계의 혼합물에 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae), 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium) 및 류코노스톡 슈도메센세로이드(Leuconostoc pseudomesenteroides) 균주의 배양액을 접종하고 30 내지 35℃에서 20분 내지 40분 동안 교반하고 2 내지 4시간 동안 정치하는 것을 반복하면서 40 내지 60시간동안 발효하여 유황의 독성을 1차로 제거하는 단계;
c) 상기 b) 단계의 발효물을 건조하여 유황의 독성을 2차로 제거하는 단계; 및
d) 상기 c) 단계의 건조물에 건조물 100중량부를 기준으로 1 내지 3 중량부의 미네랄, 3 내지 7 중량부의 자색바이오 및 8 내지 15 중량부의 규산염을 첨가하고 수분 함량을 10 중량% 이하로 조절하는 단계
를 포함하는 단미사료의 제조 방법.
제1항에 있어서, 상기 a) 단계의 유황, 소맥피 및 미강은 소맥피 100 중량부를 기준으로 유황이 100 내지 120 중량부, 미강이 90 내지 110 중량부로 혼합되는 것을 특징으로 하는 단미사료의 제조 방법.
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제1항에 있어서, 상기 c) 단계의 건조는 열풍건조 또는 냉동 건조인 것을 특징으로 하는 단미사료의 제조 방법.
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제1항, 제2항 및 제4항 중 어느 한 항의 제조 방법에 의하여 제조된 단미사료.