KR101861055B1 - Method for Diagnosis of Pulmonary Disease by Detecting ROMO1 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 ROMO1을 이용한 폐암의 진단 또는 예후 예측 방법에 관한 것으로, 구체적으로는 체액 내에 존재하는 ROMO1 단백질의 양을 측정하여 폐암을 진단 또는 예후 예측하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 미량의 혈액으로부터 정확하고 용이하게 폐암을 진단 또는 예후 예측할 수 있으므로 질병의 예방 및 치료에 유용하다.The present invention relates to a diagnostic or prognostic prediction method for lung cancer using ROMO1, and more particularly, to a method for diagnosing or prognosing lung cancer by measuring the amount of ROMO1 protein present in body fluids. INDUSTRIAL APPLICABILITY According to the present invention, it is possible to accurately and easily diagnose or prognose lung cancer from a trace amount of blood, which is useful for prevention and treatment of diseases.

Description

ROMO1을 이용한 폐질환의 진단방법{Method for Diagnosis of Pulmonary Disease by Detecting ROMO1}[0001] The present invention relates to a method for diagnosing pulmonary disease using ROMO1,

본 발명은 ROMO1을 이용한 폐암의 진단 또는 예후 예측 방법에 관한 것으로, 구체적으로는 혈청 내에 ROMO1 단백질의 양을 측정하여 폐암을 진단 또는 예후 예측하는 방법에 관한 것이다.More particularly, the present invention relates to a method for diagnosing or prognosing lung cancer by measuring the amount of a protein of the present invention in serum.

ROMO1은 2006년에 처음 보고된 단백질로서 항암제 내성 관련 유전자를 탐색 중에 확인되었다. ROMO1 유전자는 미토콘드리아에 위치하며 발현이 증가할 경우 세포 내 활성산소를 증가시키는 것으로 알려져 있다(Chung YM et al., Biochem Biophys Res Commun., 347:649-55, 2006). 그러나 ROMO1 발현에 의한 세포 내 활성산소 증가는 NADPH oxidase, xanthine oxidase, cyclooxygenases 또는 lipoxygenases 등의 효소와 다른 방식으로 이루어지는 것으로 보인다. ROMO1은 미토콘드리아 막에 위치하며 8.9 kDa의 분자량을 가진 transmembrane 단백질이기 때문에 효소보다는 막에 위치하는 통로(channel)로서 작용을 하여 미토콘드리아에서 발생하는 활성산소를 세포질로 수송하는 역할을 갖고 있을 것으로 추정된다(Kim JJ et al., Cell Death Differ., 17:1420-34, 2011; Bae YS et al., Mol Cells., 32:491-509, 2011). ROMO1 was first identified in 2006 and identified during the search for anticancer resistance genes. It is known that the ROMO1 gene is located in the mitochondria and increases the intracellular reactive oxygen when the expression is increased (Chung YM et al., Biochem Biophys Res Commun., 347: 649-55, 2006). However, the increase of intracellular reactive oxygen species by the expression of ROMO1 appears to be different from that of enzymes such as NADPH oxidase, xanthine oxidase, cyclooxygenases or lipoxygenases. Since ROMO1 is a transmembrane protein with a molecular weight of 8.9 kDa located in the mitochondrial membrane, it is presumed that it plays a role as a channel located in the membrane rather than an enzyme and transports active oxygen generated in the mitochondria to the cytoplasm ( Kim JJ et al., Cell Death Differ., 17: 1420-34, 2011; Bae YS et al., Mol Cells., 32: 491-509, 2011).

각종 염증자극(inflammatory stimuli)에 의해 폐의 내피세포, 폐포세포 및 기도의 상피세포와 대식세포(macrophage)에 의해 ROS가 발생하는데, 이러한 oxidant-antioxidant 간의 불균형이 특발폐섬유증(idiopathic pulmonary fibrosis, IPF), 만성폐쇄폐질환(chronic obstructive pulmonary disease, COPD), 폐암과 같은 폐손상에 관련된 폐질환의 병인기전에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 섬유폐질환(fibrotic lung disease) 중 대표적인 질환인 특발폐섬유증(idiopathic pulmonary fibrosis, IPF)은 만성적으로 진행되는 간질폐질환의 하나로, 병의 경과가 좋지 않고 증명된 치료 방법이 없는 질환이다. IPF는 그 병인이 밝혀져 있지는 않아 사전 진단이 어려운 실정이다.ROS is generated by various inflammatory stimuli by endothelial cells of the lungs, alveolar cells and airways epithelial cells and macrophages. These imbalances between the oxidant-antioxidants cause idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) ), Chronic obstructive pulmonary disease (COPD), and pulmonary disease. Idiopathic pulmonary fibrosis (IPF), one of the most common fibrotic lung diseases, is one of the chronic progressive interstitial lung diseases. IPF is not known, so it is difficult to diagnose it.

만성폐쇄폐질환(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)은 폐장의 만성 염증 질환으로 흡연, 대기 오염 등의 다양한 환경적인 요인과 노화 등이 주된 원인으로 알려져 있으며 발병 기전에 대한 연구가 활발하게 이루어지고 있으나 아직 밝혀지지 않아 초기 진단이 어려운 실정이다.Chronic obstructive pulmonary disease (COPD) is a chronic inflammatory disease of the lungs. It is known to be caused by various environmental factors such as smoking and air pollution and aging. It is difficult to diagnose early.

폐암은 조직형에 따라 크게 소세포 폐암(small cell lung cancer)과 비소세포 폐암(non-small cell lung cancer)로 구분하는데, 소세포암의 경우 병의 진행 속도가 매우 빠르지만 항암요법이나 방사선요법에 잘 반응하는 특징이 있어 비소세포암과 치료 방법이 완전히 다른 특징을 가진다. 따라서 폐암은 조직학적 진단, 즉 조직검사의 결과가 치료방침을 결정하는 데 아주 중요하지만, 진행된 폐암이더라도 증상이 없는 경우가 흔하고 증상이 미약하더라도 이미 진행된 경우가 많아 실제 폐암 환자의 약 5~15% 는 무증상일 때 폐암으로 진단을 받는 것으로 알려져 있다. Lung cancer is divided into small cell lung cancer and non-small cell lung cancer depending on the type of tissue. Small cell lung cancer has a very rapid disease progression but is well tolerated by chemotherapy or radiotherapy. The characteristics of non-small cell carcinoma and treatment method are totally different. Therefore, lung cancer is very important in determining the treatment plan, but the histological diagnosis, that is, the result of biopsy, is very important even in advanced lung cancer. Is known to be diagnosed as lung cancer when it is asymptomatic.

혈액으로부터 폐암을 진단하기 위하여 CEA(carcinoembryonic antigen), NSE(Neuron-specific enolase), SCCA(squamous cell carcinoma-related antigen), ProGRP(ProGastrin-Releasing Peptide) 등 다양한 바이오마커를 이용한 노력이 있어 왔으나 모두 민감도(sensitivity)가 낮아 상용화되지 못하였으며, 가슴 부위의 전산화 단층촬영(CT)을 이용한 폐암의 조기 검진에 대한 연구 또한 활발히 이루어지고 있으나, 아직 유효성이 입증되지 못하였다. 즉. 증상이 나타나기 전에 건강 검진으로 폐암을 조기에 발견할 수 있는 전단 방법이 현재까지 개발되지 못하였다.Efforts have been made to use various biomarkers such as carcinoembryonic antigen (CEA), neuron-specific enolase (NSE), squamous cell carcinoma-related antigen (SCCA), and ProGRP (ProGastrin-Releasing Peptide) (CT) of the chest area has been actively investigated for the early detection of lung cancer, but its effectiveness has not yet been proven. In other words. No shearing methods have been developed to detect lung cancer early in the first few years before symptoms appear.

결핵은 주로 폐결핵 환자로부터 나온 미세한 침방울 혹은 비말핵(droplet nuclei)에 의해 직접 감염되지만 감염된다고 하여 모두 결핵에 걸리는 것은 아니다. 폐결핵 환자의 70~80% 정도가 급성 혹은 아급성으로 증상을 가지고 있지만, 이는 반드시 폐결핵 환자에서만 볼 수 있는 특이한 증상은 아니기 때문에 감기로 혹은 다른 폐 질환 또는 흡연과 관련된 증상으로 취급되어 종종 증상만 가지고는 결핵인지 아닌지 진단하기가 어려운 경우가 많다. Tuberculosis is primarily caused by fine droplets or droplet nuclei from pulmonary tuberculosis patients. Although 70% to 80% of patients with pulmonary tuberculosis have acute or subacute symptoms, they are not specific symptoms seen only in pulmonary tuberculosis patients. Therefore, they are treated as a cold or other lung disease or symptoms related to smoking, Are often difficult to diagnose whether they are tuberculosis or not.

이상으로 살펴본 바와 같이 ROMO1의 질병과의 연관성에 관한 연구는 아직 초기 상태이며 지금까지 밝혀진 결과로는 세포 노화와 TNF-α 유도 질병과의 연관성이 일부 알려져 있을 뿐이다. 또한 폐와 관련한 다양한 질환들에 대한 효과적인 진단방법이 없는 경우가 많기 때문에, 세포배양 또는 조직학적 검사 등 시간을 요하는 진단 방법이 널리 쓰이고 있다.As shown above, studies on the association of the disease with ROMO1 are still in their early stage. As a result, there is only some known association between cell senescence and TNF-α induced disease. In addition, since there is often no effective diagnosis method for various diseases related to the lung, time-consuming diagnostic methods such as cell culture or histological examination are widely used.

이에, 본 발명자들은 정확하고 간편한 폐질환의 진단방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 미량의 체액으로부터 ROMO1 단백질의 증가를 검출하는 경우, 폐암을 진단 및 예후 예측할 수 있다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.Accordingly, the present inventors have made intensive efforts to develop an accurate and simple method for diagnosing pulmonary disease. As a result, they have confirmed that diagnosis of lung cancer can be made and prognosis can be predicted when the increase of ROMO1 protein is detected from a trace amount of body fluids. .

본 발명의 목적은 ROMO1 단백질의 양을 측정할 수 있는 물질을 포함하는 폐암 의심 환자 또는 진단 대상 유래의 혈청 시료를 대상으로 폐암의 진단 또는 예후 예측용 키트를 제공하는 데 있다.It is an object of the present invention to provide a kit for diagnosing or prognosing lung cancer, which comprises a substance capable of measuring the amount of a protein of ROMO1, in a suspected patient of lung cancer or a serum sample derived from a diagnosis subject.

본 발명의 다른 목적은 폐암 의심 환자 또는 진단 대상 유래의 혈청에서 ROMO1 단백질의 양을 측정하는 단계를 포함하는 폐암의 진단 또는 예후 예측에 필요한 정보 제공방법을 제공하는 데 있다.It is another object of the present invention to provide a method for providing information necessary for diagnosis or prediction of prognosis of lung cancer, comprising the step of measuring the amount of the ROMO1 protein in a suspected patient of lung cancer or a serum derived from a diagnosis subject.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 ROMO1 단백질의 양을 측정할 수 있는 물질을 포함하는 폐암 의심 환자 또는 진단 대상 유래의 혈청 시료를 대상으로 폐암의 진단 또는 예후 예측용 키트를 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a kit for diagnosing or prognosing lung cancer, which comprises a substance capable of measuring the amount of a protein of the present invention.

본 발명은 또한 폐암 의심 환자 또는 진단 대상 유래의 혈청에서 ROMO1 단백질의 양을 측정하는 단계를 포함하는 폐암의 진단 또는 예후 예측에 필요한 정보 제공방법을 제공한다.The present invention also provides a method for providing information necessary for the diagnosis or prognosis prediction of lung cancer, comprising the step of measuring the amount of the ROMO1 protein in a serum suspected to be a lung cancer suspicious patient or a diagnosis subject.

본 발명에 따르면, 미량의 혈액으로부터 정확하고 용이하게 폐질환을 진단 및 예후 예측할 수 있으므로 질병의 예방 및 치료에 유용하다.INDUSTRIAL APPLICABILITY According to the present invention, it is possible to accurately and easily diagnose and prognose pulmonary disease from a trace amount of blood, so that it is useful for prevention and treatment of diseases.

도 1은 정상인과 폐암환자의 혈청 내 ROMO1 농도를 ELISA로 비교 측정한 결과이다.FIG. 1 shows the results of ELISA for the comparison of serum levels of ROMO1 in normal and lung cancer patients.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.Unless otherwise defined, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs. In general, the nomenclature used herein is well known and commonly used in the art.

본 발명에서는, 폐질환 의심 환자의 체액 내에 존재하는 물질 중 ROMO1 단백질의 양을 측정함으로써 폐암의 진단 및 예후 예측을 하였다.In the present invention, the diagnosis of lung cancer and the prognosis of lung cancer were made by measuring the amount of the protein of the present invention in the body fluids of patients suspected of having pulmonary disease.

본 발명의 다른 실시예에서는, 폐암환자 혈액에서 ROMO1 단백질의 농도를 측정한 결과, 폐암환자의 약 70%가 혈액 내에 ROMO1 단백질 농도가 증가되어 있는 것을 확인하였다. In another embodiment of the present invention, the concentration of the ROMO1 protein in the blood of lung cancer patients was measured, and it was confirmed that about 70% of the lung cancer patients had an increase in the concentration of the ROMO1 protein in the blood.

또 다른 관점에서, 본 발명은 임상샘플에서 ROMO1 단백질의 양을 측정할 수 있는 물질을 포함하는, 폐질환의 진단 또는 예후 예측용 키트에 관한 것이다.In another aspect, the present invention relates to a kit for diagnosing or prognosing a lung disease, comprising a substance capable of measuring the amount of a ROMO1 protein in a clinical sample.

본 발명에 따른 ROMO1 검출용 키트는 시료 내의 ROMO1의 존재를 측정하기 위한 것이면 어떤 것이든 제한 없이 사용될 수 있다. 즉, 키트 내지 시료에 존재하는 ROMO1의 검출은 당업계에 공지된 통상의 기술 내지 방법을 사용할 수 있다. 이러한 방법으로는 ROMO1에 특이적으로 결합하는 항체를 이용한 방사능면역분석법(RIA), 효소면역분석법 (ELISA), 웨스턴 블로팅 방법(Western Blotting) 등을 예로 들 수 있다. 또한, 96-웰 내부에 다수의 항체를 고정화하여 한꺼번에 많은 수의 시료를 분석하는 ELISA 변형법이 이용될 수 있다.The kit for detecting a ROMO1 according to the present invention can be used without limitation as long as it is for measuring the presence of ROMO1 in a sample. That is, the detection of the ROMO1 present in the kit or the sample can be performed using conventional techniques or methods known in the art. Examples of such methods include radioimmunoassay (RIA), enzyme immunoassay (ELISA), and Western blotting using an antibody specifically binding to ROMO1. In addition, an ELISA modification method in which a large number of samples are analyzed at once by immobilizing a plurality of antibodies in a 96-well can be used.

본 발명에 있어서, 상기 키트에는 항체를 이용하여 각종의 면역화학적 반응을 수행하기에 적합한 물질들, 예를 들어, 항체의 보존제, 완충액 등이 포함될 수 있다. 또한, 추가적인 시약을 포함할 수 있으며, 일 예로써는, 발색 효소, 형광물질, 방사성 동위원소 또는 콜로이드로 표지한 접합체(conjugate)로 2차 항체 등이 있다. 발색효소는 퍼록시다제(peroxidase), 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase) 또는 산성 포스파타제(acid phosphatase)(예: 양고추냉이 퍼록시다제(horseradishperoxidase))일 수 있고, 형광물질인 경우, 플루오레신카복실산(FCA), 플루오레신 이소티오시아네이트(FITC), 플루오레신 티오우레아(FTH), 7-아세톡시쿠마린-3-일, 플루오레신-5-일, 플루오레신-6-일, 2',7'-디클로로플루오레신-5-일, 2',7'-디클로로플루오레신-6-일, 디하이드로테트라메틸로사민-4-일, 테트라메틸로다민-5-일, 테트라메틸로다민-6-일, 4,4-디플루오로-5,7-디메틸-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-에틸 또는 4,4-디플루오로-5,7-디페닐-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-에틸이 가능하다. 또한, 키트는 효소와 발색반응할 기질 및 결합되지 않은 단백질 등은 제거하고, 결합된 복합체만을 보유할 수 있는 세척액 또는 용리액을 포함할 수 있다. In the present invention, the kit may include materials suitable for performing various immunochemical reactions using antibodies, for example, preservatives, buffers, etc., of antibodies. In addition, an additional reagent may be included. As an example, a conjugate labeled with a coloring enzyme, a fluorescent substance, a radioactive isotope or a colloid may be used as a secondary antibody. The chromogenic enzyme may be a peroxidase, an alkaline phosphatase or an acid phosphatase such as horseradish peroxidase, and in the case of a fluorescent substance, fluorescein carboxylic acid ( FCA), fluorescein isothiocyanate (FITC), fluorescein thiourea (FTH), 7-acetoxycarin-3-yl, fluorescein-5-yl, 2 ', 7'-dichlorofluorescein-6-yl, dihydrotetramethyl rosamin-4-yl, tetramethylrhodamine-5-yl, 4,4-difluoro-5,7-dimethyl-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene-3-ethyl or 4,4-difluoro- 5,7-diphenyl-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene-3-ethyl. In addition, the kit may include a washing solution or an eluting solution which can remove the substrate to be color-developed with the enzyme and the unbound protein and retain only the bound complex.

또 다른 관점에서, 본 발명은 폐암의 진단 또는 예후 예측에 필요한 정보 제공을 위해, 임상샘플에서 ROMO1 단백질의 양을 측정하는 단계를 포함하는 ROMO1의 분석방법에 관한 것이다.In yet another aspect, the present invention relates to a method for the analysis of ROMO1 comprising the step of measuring the amount of the ROMO1 protein in a clinical sample, in order to provide information necessary for diagnosis or prognosis prediction of lung cancer.

상기 ROMO1 단백질의 양이 정상 대조군에 비해 증가한 경우 폐암에 걸렸거나 걸릴 가능성이 높은 것으로 판정하는 것이다. When the amount of the above-mentioned ROMO1 protein is increased as compared with the normal control group, it is determined that the lung cancer is likely to be caught or taken.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 더욱 상세하게 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail by way of the following examples. It will be apparent to those skilled in the art that these embodiments are merely illustrative of the present invention and that the scope of the present invention is not limited to these embodiments.

실시예 1: 폐암환자 혈액내의 ROMO1 단백질 측정Example 1: Measurement of ROMO1 protein in the blood of patients with lung cancer

7명의 정상인과 25명의 폐암환자로부터 수득한 혈액을 1,000 xg 로 15분간 원심분리한 후 상층액인 혈청을 분리하였다. 분리한 혈청으로부터 ROMO1의 정량은 colorimetric Sandwich ELISA kit(Quantikine, R&D Systems, USA)를 사용하여 측정하였다. 96 well plate의 각 well에 standard와 혈청을 100㎕씩 분주하여 2시간 동안 실온에서 반응시킨 후 wash buffer 400㎕로 4회 세척하고, 각각의 conjugate을 200㎕씩 첨가하여 실온에서 반응시켰다. 2시간 후 wash butter 400㎕로 4회 세척한 다음, 각 well에 substrate을 200㎕씩 넣고 실온에서 30분간 반응시키고 stop solution 50㎕를 넣어 반응을 종결시켰다. 30분 후에 ELISA reader(BIO-TEK Instruments, USA)로 450nm에서 흡광도를 측정하였다. Blood obtained from 7 normal subjects and 25 lung cancer patients was centrifuged at 1,000 xg for 15 minutes and the supernatant serum was isolated. Quantification of ROMO1 from the separated serum was performed using a colorimetric sandwich ELISA kit (Quantikine, R & D Systems, USA). 100 μl of standard and serum were dispensed into each well of a 96-well plate and reacted at room temperature for 2 hours. After washing with 400 μl of wash buffer four times, 200 μl of each conjugate was added and reacted at room temperature. After 2 hours, wash with 400 μl of wash butter four times, add 200 μl of substrate to each well, react at room temperature for 30 minutes, and stop reaction by adding 50 μl of stop solution. After 30 minutes, the absorbance was measured at 450 nm with an ELISA reader (BIO-TEK Instruments, USA).

그 결과, 폐암환자의 약 88% 에서 ROMO1의 농도가 증가하여 있는 것을 관찰하였다. 정상인의 혈청 내 ROMO1의 농도는 약 11.14 pg/ml인 것에 비하여 폐암환자 88%의 경우 평균 391.54 pg/ml로 ROMO1의 농도가 약 33.34배 증가되어 있었다. 따라서, 혈청 내의 ROMO1 농도를 측정하는 경우 미량의 혈액으로 폐질환을 진단할 수 있음을 확인하였다.As a result, it was observed that the concentration of ROMO1 was increased in about 88% of lung cancer patients. The concentration of ROMO1 in healthy subjects was about 11.14 pg / ml, compared with an average of 391.54 pg / ml in 88% of lung cancer patients. The concentration of ROMO1 was increased about 33.34 times. Therefore, it was confirmed that the measurement of the concentration of ROMO1 in serum can diagnose pulmonary disease with a very small amount of blood.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당 업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의한 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.While the present invention has been particularly shown and described with reference to specific embodiments thereof, those skilled in the art will readily appreciate that many modifications are possible in the exemplary embodiments without materially departing from the novel teachings and advantages of this invention. something to do. Accordingly, the actual scope of the present invention will be defined by the appended claims and their equivalents.

Claims (3)

ROMO1 단백질의 양을 측정할 수 있는 물질을 포함하는 폐암 의심 환자 또는 진단 대상 유래의 혈청 시료를 대상으로 폐암의 진단 또는 예후 예측용 키트.A kit for the diagnosis or prognosis prediction of lung cancer in a suspected patient of lung cancer or a serum sample derived from a diagnosis subject, which comprises a substance capable of measuring the amount of a protein of ROMO1. 폐암 의심 환자 또는 진단 대상 유래의 혈청에서 ROMO1 단백질의 양을 측정하는 단계를 포함하는 폐암의 진단 또는 예후 예측에 필요한 정보 제공방법.A method for providing information necessary for diagnosis or prognosis prediction of lung cancer, comprising the step of measuring the amount of a protein of ROMO1 in a patient suspected of lung cancer or a serum derived from a diagnosis subject. 제2항에 있어서, 상기 ROMO1 단백질의 양이 정상 대조군에 비해 증가한 경우 폐암에 걸렸거나 걸릴 가능성이 높은 것으로 판정하는 단계를 포함하는 폐암의 진단 또는 예후 예측에 필요한 정보 제공방법.

3. The method according to claim 2, comprising determining that the amount of the ROMO1 protein is higher than that of a normal control, and determining that the lung cancer is likely to occur or is likely to be taken.

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Biochemical and Biophysical Research Communications, Vol. 347, pp. 649-655 (2006.07.05.)
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