KR101857728B1 - 저선량 방사선 피폭의 바이오마커 - Google Patents

Abstract

본 발명은 저선량 방사선에 피폭된 후 세포생물학적 중기 반응을 감지할 수 있는 바이오 마커를 개발하는 방법 및 저선량 방사선 피폭을 확인하기 위한 진단용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 일 측면은 방사선 피폭 바이오마커 스크리닝 방법을 제공하는 것으로, 배양된 세포주에 방사선을 선량 의존적으로 조사하는 단계; 상기 방사선이 조사된 후 미리 설정된 시간이 경과할 때까지 상기 배양된 세포주를 배양하는 단계; 및 방사선이 선량 의존적으로 조사된 상기 배양된 세포주의 단백질들의 인산화 정도를 항체-항원 반응을 이용하여 웨스턴 블롯에 의하여 분석하는 단계; 를 포함한다. 이 때, 상기 분석하는 단계에서, 선량 의존적으로 인산화 정도가 차이가 있는 단백질을 방사선 피폭을 확인하기 위한 바이오마커로 판단한다. 본 발명에서 제시하는 저선량 방사선 영역에서 활성화되는 단백질 바이오마커는 결국 세포 방어메커니즘의 네트워크의 한 부분으로 작용할 가능성이 높으므로, 세포 수준에서 저선량 방사선에 특이적으로 활성화되는 단백질 동정은 분자생물학적 면에서 생물학적 기전을 규명하는 중요한 원천이 될 수 있는 자료를 제공할 수 있다.

Description

저선량 방사선 피폭의 바이오마커 {THE BIO-MARKER OF THE MIDDLE PERIODF FOR DETECTING LOW-DOSE RADIATION}

본 발명은 저선량 방사선에 피폭된 후 세포생물학적 중기 반응을 감지할 수 있는 바이오 마커를 개발하는 방법 및 이 방법에 의해 도출한 저선량 방사선 피폭을 확인하기 위한 세포생물학적 중기 반응 진단용 조성물에 관한 것이다.

고선량 방사선 피폭에 의한 확정적 영향과 발암 유발에 대해서는 잘 알려져 있으나, 100 mSv 이하의 저선량 방사선에 대해서는 아직 인체에 직접적으로 어떠한 영향을 미치는지에 대해서는 과학적으로 증명되지 않은 상태이다. 2011년 3월 후쿠시마 다이이치 원전 폭발사고 이후 방사성 물질의 국내 유입 및 방사능 오염 식품의 수입 및 유통 등에 대한 우려가 고조되면서 저선량 방사선(low-dose radiation)의 건강 영향에 대한 관심이 급격히 높아지고 있으며, 최근에는 병원 진단용 방사선 노출량 및 이에 대한 규제 문제가 이슈화되고 있다. 저선량 방사선은 인체 노출 시에 즉각적인 증상이나 영향은 관찰되고 있지 않으나 잠재적으로 인체에 미칠 영향에 대한 우려가 있다. 하지만 인체에 대한 위험성과 관련하여 생물학적, 역학적인 근거는 아직까지는 명확하게 밝혀져 있지 않다.

따라서, 저선량 방사선이 우리 몸에 미치는 영향에 대하여 알아내기 위하여 먼저 저선량 방사선에 피폭이 되었는지 여부를 가려내야 하지만 그에 대한 저선량 방사선 피폭에 대한 중기 반응을 확인할 수 있는 바이오 지표가 전무한 상태이다.

한편, 저선량 방사선 피폭을 확인할 수 있는 종래 기술로는 “에즈린을 이용한 방사선 생물학적 선량 평가용 바이오마커 및 이를 포함하는 키트”(대한민국 등록특허 공보 제10-1277373호)가 있다. 이 발명은 저선량 방사선이 조사된 후 세포 레벨에서 단백질의 변화를 분석하여 방사선 생물학적 선량을 평가할 수 있고 방사선 피폭 또는 조사에 의한 세포 손상을 측정할 수 있다는 점에서 장점이 있으나 알지닌 메틸화(arginine methylation)라는 번역후 변형(post translational modification)을 이용하였다는 점에서 다소 번거롭고 방사선 조사 후 24시간이나 지난 다음에 측정된 단백질의 변화를 보는 것이므로 본 발명에서 보고자 하는 중기 반응 단계와는 시간상 거리가 있다. 한편 “방사선 피폭 측정용 유전자, 이를 이용한 방사선 피폭측정방법, 및 이를 함유한 ＤＮＡ칩”(대한민국 등록특허 공보 제10-0458364호)에서는 세포수준에서 저선량 방사선에 의한 반응을 보았는데, 이 방법은 DNA 레벨에서의 변화를 본 것이므로 세포 내에 직접적으로 기능을 하고 영향을 미치는 단백질 레벨의 변화와는 다소 차이가 있으며 0.5 Gy의 비교적 고선량을 사용하여 실시를 한 것이어서 일반인들이 우려하는 방사성 물질의 국내 유입 및 방사능 오염 식품의 수입 및 유통 등에 대한 피폭 선량에 비하여 지나치게 높다는 단점이 있다.

한편, 본 발명자들은 “저선량 방사선 피폭의 바이오마커”(대한민국 특허 출원번호 제10-2016-0137921호)에서 저선량 방사선에 의한 피폭 후 30분 내에 일어나는 세포생물학적 초기 반응에 대한 바이오마커를 발명한 바가 있다. 그런데, 후설하겠으나, 30분 이내의 초기 반응과 8시간이 경과된 후의 중기 반응, 24시간이 경과된 후의 후기 반응은 전부 세포생물학적으로 그 의미가 다르다. 또한, 보통 진단은 피폭 후 30분 이내가 아닌 8시간 정도 경과된 이후에 이루어지는 것이 보통이므로, 진단 키트의 측면에서도 30분 이내의 초기 반응에 대한 바이오마커 이외에 8시간 정도가 경과된 후의 중기 시점에서의 검사가 가능한 바이오마커를 추가적으로 개발할 필요가 있다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명은 저선량 방사선에 피폭된 후 8시간이 경과된 이후에 나타나는 세포생물학적 중기 반응을 감지할 수 있는 바이오 마커를 개발하는 방법을 제공하는 것을 일 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의하여 도출된 저선량 방사선 피폭을 확인하기 위한 중기 반응 진단용 조성물을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 측면은 방사선 피폭 바이오마커 스크리닝 방법을 제공하는 것으로, 배양된 세포주에 방사선을 선량 의존적으로 조사하는 단계; 상기 방사선이 조사된 후 미리 설정된 시간이 경과할 때까지 상기 배양된 세포주를 배양하는 단계; 및 방사선이 선량 의존적으로 조사된 상기 배양된 세포주의 단백질들의 인산화 정도를 항체-항원 반응을 이용하여 웨스턴 블롯에 의하여 분석하는 단계; 를 포함한다. 이 때, 상기 분석하는 단계에서, 선량 의존적으로 인산화 정도가 차이가 있는 단백질을 방사선 피폭을 확인하기 위한 바이오마커로 판단한다.

본 발명의 한 구체적인 실시 형태에서는, 상기 방사선 피폭 바이오마커 스크리닝 방법에서 상기 방사선의 선량이 0.01 Gy에서 0.10 Gy 사이의 선량을 가지는 경우 저선량 방사선으로 보며, 상기 저선량 방사선을 조사했을 때 인산화 정도가 가장 큰 단백질을 저선량 방사선 피폭의 바이오마커로 판단하는 것이 바람직하고, 더욱 구체적으로는 상기 저선량 방사선의 선량이 0.04 Gy에서 0.06 Gy사이의 선량을 가지는 경우 저선량 방사선 피폭의 바이오마커로 판단하는 것이 더욱 바람직하다.

본 발명의 한 구체적인 실시 형태에서는, 상기 방사선 피폭 바이오마커 스크리닝 방법에서 상기 방사선이 조사된 후 경과된 상기 미리 설정된 시간이 8시간 이내이면 방사선 피폭 후 세포생물학적 중기 반응으로 판단하는 것이 바람직하다.

본 발명의 한 구체적인 실시 형태에서는, 상기 방사선 피폭 바이오마커 스크리닝 방법에서 상기 배양된 세포주는 폐 섬유 아세포(MRC-5)와 피부 섬유 아세포(NHDF)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 세포주인 것이 바람직하다.

또한, 본 발명의 다른 측면은 상기 스크리닝 방법에 의해 도출된 저선량 방사선 피폭에 의한 중기 반응 바이오마커를 포함하는 방사선 피폭 진단용 조성물을 제공하는 것이다. 이 때 중기 반응은 방사선 피폭 후 8시간이 경과된 시점의 세포학적 반응을 의미한다.

본 발명의 한 구체적인 실시 형태에서는, 상기 중기 반응 바이오마커는 pNF-kB(Ser536)와 pP70S6K(Ser418) 중에서 선택되는 하나 이상의 인산화 단백질을 바이오마커로 포함하는 것을 특징으로 하는 것이 바람직하다.

상기와 같은 본 발명에 따르면, 저선량 방사선 피폭에 의한 세포생물학적 중기 반응을 확인할 수 있는 바이오마커를을 개발하는 방법과 그것에 의해 도출된 저선량 방사선 피폭을 확인하기 위한 진단용 조성물을 제공할 수 있다. 더 나아가 본 발명에서 제시하는 저선량 방사선 영역에서 활성화되는 단백질 바이오마커는 결국 세포 방어메커니즘의 네트워크의 한 부분으로 작용할 가능성이 높으므로, 세포 수준에서 저선량 방사선에 특이적으로 활성화되는 단백질 동정은 분자생물학적 면에서 생물학적 기전을 규명하는 중요한 원천이 될 수 있는 자료를 제공할 수 있다.

도 1은 본 발명의 실시예에 따라 폐 섬유 아세포(MRC-5)에서 방사선 조사에 의한 세포의 생존 및 세포 손상의 정도에 대한 결과를 관찰한 그림이다.
도 2는 본 발명의 실시예에 따라 인산화 단백질 항원-항체 반응분석배치 방법을 통해 얻어진 결과의 유효성 검증을 위하여 폐 섬유 아세포(MRC-5)에 저선량(0.05 Gy)과 고선량(2 Gy) 방사선 조사 후 8시간에 반응하는 인산화 단백질을 확인하기 위하여 웨스턴 블롯을 수행한 결과를 분석한 그림이다.
도 3은 본 발명의 실시예에 따라 인산화 단백질 항원-항체 반응분석배치 방법을 통해 얻어진 결과의 유효성 검증을 위하여 피부 섬유 아세포(NHDF)에 저선량(0.05 Gy)과 고선량(2 Gy) 방사선 조사 후 8시간에 반응하는 인산화 단백질을 확인하기 위하여 웨스턴 블롯을 수행한 결과를 분석한 그림이다.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예를 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 어떤 의미로든 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.

저선량 방사선이란 통상적으로 100 mSv 이하의 선량을 의미한다. 국제 방사선 방호위원회에 의하면, ‘저선량’의 값은 1회 피폭 선량 또는 연간 누적피폭선량으로 약 100 mSv까지 해당이 되는데, 이 수치는 생물학적, 임상적 데이터의 검토로부터 조직 반응의 기초를 이루는 세포나 조직의 기전과, 주요 장기와 조직에 적용되는 선량 문턱에 대한 낮은 선량인 100 mSv를 의미한다. 또한, 매년 100 mSv보다 낮은 선량은 반복 피폭하더라도 낮은 선량 피폭으로 불 수 있음을 의미한다(ICRP, International Commission on Radiological Protection. 2005). 본 발명에서는 위 기준에 따라 방사선의 선량이 0.10 Gy보다 낮은 선량을 가지는 경우 저선량 방사선으로 보며, 더욱 구체적으로는 0.01 Gy에서 0.10 Gy보다 낮은 선량을 가지는 경우 저선량 방사선으로 본다.

본 발명은 불확실성을 지닌 저선량 방사선에 특이적으로 변화하는 단백질과 중기에 활성화될 수 있는 단백질들의 선별을 통해서 저선량 방사선에서 세포 방어 메카니즘과 관련된 단백질을 선별하는 방법을 제안하며, 이 방법에 의해 발견된 단백질의 세포생물학적 변화를 통하여 저선량 방사선 피폭을 확인할 수 있는 진단용 바이오마커를 제공한다.

본 발명은 0.05 Gy 이하의 선량을 나타내는 저선량 방사선을 정상 폐 섬유 아세포(MRC-5)에 조사하고 8시간이 경과된 시점에 반응하는 저선량 방사선 바이오 지표를 찾고자 시도되었다. 방사선 조사는 세포의 생물학적 손상을 유도하여 인체에 영향을 미친다. 특히 방사선 조사에 의해서 모든 생물체의 생존과 기능 유지에 필수적인 유전자인 DNA에 손상이 발생하는데, DNA가 손상된 세포 내에서는 그 즉시 분자 생물학적 수준에서 손상된 부위가 복구되고 회복되어야 하므로 세포 주기가 정지되고 전사 기전이 조절되는 등의 복구 메커니즘이 활발히 일어나게 된다. 그 후 DNA가 복구되어 세포 주기의 원활한 사이클이 지속된다면 세포의 형태를 유지하여 기능을 수행하기 위한 세포 발달 메커니즘이 활성화될 수 있다. 반대로 DNA가 손상된 세포 내에서 DNA가 제대로 복구되지 않는다면 세포의 노화가 촉진이 되어 결국 그 세포는 사멸하게 된다. 만약 DNA가 손상된 세포 내에서 DNA의 복구 메커니즘이 일어날 수 없을 정도로 DNA 손상이 심하다면, 생물체 전체의 이익을 위하여 손상된 DNA를 가진 세포를 사멸시키는 메커니즘이 활성화된다. 결과적으로, 고선량의 방사선에 의하여는 DNA의 손상 정도가 심하여 주로 세포 사멸이 유도가 되는데 비하여, 저선량의 방사선에 의하여는 DNA의 손상 정도가 비교적 미약하여 DNA 복구 메커니즘과 관련된 세포 기능이 활성화된다.

고선량 방사선에 의하여 유도되는 분자 세포생물학적 기전과 저선량 방사선에 의하여 유도되는 분자 세포생물학적 기전은 전혀 다르다. 그런데, 특히 저선량 방사선에 의하여 유도되는 분자 세포생물학적 기전은 아직까지 연구가 미비할 뿐만 아니라, 우리가 세포 내의 분자 기전을 이해하고 응용하여 신약을 개발하는 등의 관점에 있어서 매우 중요하다. 따라서 본 발명은 세포 수준에서 저선량 방사선에 특이적으로 반응하는 메커니즘을 규명하고자, 0.05 Gy의 저선량 방사선을 조사하여 특이적으로 증가하는 인산화 단백질들을 선별하고 저선량 방사선 반응 특이적 지표를 동정하고자 시도하였다. 이러한 저선량 방사선에 의해 특이적으로 증가하는 인산화 단백질들은 세포 수준에서의 분자 생물학적 반응 마커로써 향후 저선량 방사선에 활성화되는 생물학적 메커니즘을 연구하는 지표로 활용될 수 있다는 점에서 그 발명의 의의가 있다.

종래의 기술들에 의해 개발된 바이오 마커들은 12시간 이후에 나타나는 DNA 발현을 보거나 24시간 이후의 단백질의 메틸화 현상을 관찰한 것으로서, 본 발명자들의 저선량 방사선 조사 후 8시간이 경과된 중기의 시점에서 단백질의 변화를 살펴본 마커 개발은 전무하다. 방사선 조사에 의하여 나타나는 세포 기능의 변화는 단백질에 의하여 유도되므로 단백질들의 인산화와 같은 미세한 변화를 감지하고 관찰하는 것은 결국 분자 세포학적 기전을 밝히는 데 있어서 무엇보다 중요하다. DNA 발현 변화는 미세하게 변화된 단백질의 기능에 의해 수행되는 결과일 뿐이며, 24시간 이후에 관찰된 단백질의 메틸화는 복구 메커니즘의 결과 중에 하나일 뿐이지 DNA 복구 메커니즘을 촉발시키는 기본적이고 근원적인 메커니즘을 켜는 기능은 아니라 할 것이다. 따라서, 본 발명자들이 발명한 8시간 이내의 세포생물학적 바이오마커는 상대적으로 대단히 중요한 가치를 가진다.

저선량 방사선에 의한 생물학적 단백질의 활성화는, 면역력 증진이나 DNA 복구, 항산화제의 증가 및 에너지 대사의 활성화로 세포손상 기전을 억제하거나 보호하는 역할을 한다고 연구되고 있으나, 저선량 방사선이 인체에 직접적으로 어떠한 영향을 미치는 지에 대해서는 생물학적, 역학적으로 증명되지 않았다. 현재, 저선량 방사선 특이적으로 반응하는 단백질들의 구체적인 종류나 기능에 대한 자료들은 미미하다. 따라서, 본 발명에서 제공하는 저선량 방사선에 민감하게 반응하는 단백질 동정 방법은 향후 저선량 방사선 반응 생물학적 연구에 활용될 수 있다.

본 발명자들은 세포 수준에서 저선량 방사선에서 반응하는 생체인자를 발굴하고자, 저선량 방사선에 피폭된 후 세포생물학적 중기 반응을 감지할 수 있는 바이오 마커를 개발하는 방법을 발명하였다. 본 발명자들은 저선량 방사선 피폭을 위하여 저선량 방사선을 폐 섬유 아세포(MRC-5)와 피부섬유 아세포(NHDF)에 조사한 후에 8시간이 경과한 후에 활성화되는 단백질의 인산화를 측정하였다. 그 결과 저선량 방사선에 특이적으로 중기에 반응하는 단백질을 알아내었고, 선량 의존도에 따라 단백질의 인산화 정도도 특이적으로 변화하는 양상을 관찰하였다.

본 발명자들은 상기 저선량 방사선에 피폭된 후 세포생물학적 중기 반응을 감지할 수 있는 바이오 마커를 개발하는 방법에 의해 특이적으로 인산화하는 단백질 군을 발견하였고, 이들 단백질군을 포함하는 저선량 방사선 피폭을 확인하기 위한 진단용 조성물을 발명하였다. 저선량 방사선을 조사한 후 8시간 이내에 관찰된 인산화 단백질 중에서 NF-kB(NF-kB, nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells)와 P70S6K(P70-S6K, P70S6 kinase, Ribosomal protein S6 kinase beta-1)은 가장 특이적으로 변화 양상이 관찰된다. NF-kB는 Ser536 자리에서 인산화가 되며, P70S6K는 Ser418 자리에서 인산화가 된다. 상기 두 단백질의 인산화는 폐 섬유 아세포 MRC-5와 피부 섬유 아세포 NHDF 모두에서 0.05 Gy의 방사선이 조사되고 8시간이 경과한 후에 동일하게 활성화됨을 웨스턴 블롯으로 확인하였다. 또한, 저선량 방사선에 특이적으로 증가한 pNF-kB(Ser536) 와 pP70S6K(Ser418) 인산화 단백질(각각, NF-kB의 Ser536 자리에서 인산화된 단백질과 P70S6K의 Ser418 자리에서 인산화된 단백질, p는 ‘phospho-’를 의미함)은 고선량인 2 Gy를 조사한 경우에는 그 인산화 정도가 현저하게 감소함을 웨스턴 블롯을 통해서 검증하였다. 정상 섬유 아세포인 MRC-5와 NHDF 모두에서 동일한 결과를 얻었으며, pNF-kB(Ser536)와 pP70S6K(Ser418)의 인산화 정도는 정량분석을 통해서 그래프화 하였다(도 2, 도 3).

기존의 알려진 NF-kB는 0.1 Gy 내지 2 Gy의 방사선 범위에서 ROS발생에 관한 세포 신호 전달과 연관되어 있다고 밝혀진 바 있다(Radiat. Res. 140, 97-104, 1994). 그러나, 100 mSv 이하의 저선량 방사선에 의한 활성화는 보고되어 있지 않다. 특히, 조사 후 8시간 째 특이하게도 방사선에 반응하는 NF-kB는 고선량 방사선 2 Gy를 조사 후에도 활성화 되지 않았다. 이는 NF-kB가 방사선 조사 후 시간에 따라 기능하는 신호전달 체계가 다를 수 있음을 나타낸다. 또한, NF-kB는 세포의 죽음 및 생존 모두 활성화 되어 조절되는 생물학적 분자 메커니즘이 다른 것으로 알려져 있다. 이에 본 실험자는 방사선은 세포주기에 큰 영향을 미친다는 보고를 토대로 실험을 진행하였다. 정상 세포는 약 24시간 기준의 세포 주기를 가지고 있다. G1기에 머무르는 시간 약 11시간, DNA가 합성되는 S기의 약 8시간, G2기에 머무르는 시간 약 4시간 그리고 M기인 1시간의 싸이클을 통해서 세포는 분열하게 된다. 특히, 외부의 자극에 의해 DNA가 손상 받으면 G0/G1기에 머무르게 되고 손상된 DNA가 복구된 후에는 S기의 DNA 합성을 통해서 G2/M기를 거쳐 세포 분열을 하게 된다. 본 실험은 손상된 DNA의 복구 후 DNA가 합성되는 시기인 S기의 종착 시점인 8시간 째 저선량 방사선(0.05 Gy)에서 활성화 되는 NF-kB가 고선량 2 Gy에서는 활성화되지 않아 저선량 방사선에 활성화 되는 NF-kB는 세포주기와 관련된 단백질과의 연관성이 높다 생각된다. 이는 방사선에 반응하는 NF-kB가 저선량과 고선량 방사선에 따른 반응성이 다름을 시사한다.

이하, 본 별명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

[실험 재료와 방법]

실험예 1. 세포 배양과 방사선 조사

ATCC로부터 구매한 폐에서 유래한 섬유 아세포인 MRC-5 세포를 배양하여 사용하였다. 배양한 세포들은 감마발생장치(137Cs, 1.03 Gy/min, Best Theratronics, Gammacell 40)을 이용하여 선량을 각 실험군에 조사하였다.

실험예 2. Antibody Array 분석

조사가 끝난 세포들의 단백질을 이용하여 Full Moon Bio사의 Antibody Array를 통해 여러 종류의 단백질을 대상으로 연구자 샘플과 반응시켜 단백질 발현과 인산화 정도를 확인하고, 샘플간 특이적으로 차이나는 단백질을 찾는 단백질 칩 분석을 3회 이상 수행하였다.

실험예 3. 웨스턴 블롯 분석(western blot analysis)

정량한 단백질을 Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide (SDS-PAGE) 겔에서 전기영동하여 크기 별로 분리한 후, Nitrocellurose membrane에 이동시켜 항원-항체 반응을 통해서 특정 단백질의 발현을 확인하였다.

[실험 결과]

본 발명자들은 인산화 단백질 항원-항체 반응분석배치 (Phospho-Antibody array) 방법을 통해 저선량 방사선(0.05 Gy)에 조사 후 8시간에 활성화되는 인산화 단백질 중 1.3배 이상 증가한 대표적 단백질을 선별하여 도표화하였다(표 1). 실험은 독립적으로 3번 반복으로 수행하였으며, 실험 결과는 (평균값 ± 표준편차)로 표시 하였고, 유의성은 p<0.05로 표시하였다. 표 1에서, pNF-kB(Ser536)와 pP70S6K(Ser418)의 두 인산화 단백질의 P-value는 각각 0.005과 0.008의 값으로 다른 단백질들에 비하여 통계적으로 매우 유의미하다는 것을 확인할 수 있다.

[표 1]

또한, 본 발명자들은 인산화 단백질 항원항체 반응분석배치 (Phospho-Antibody array) 방법을 통해 고선량 방사선(2 Gy)에 조사 후 8시간에 활성화되는 인산화 단백질 중 1.3배 이상 증가한 대표적 단백질을 선별하여 도표화하였다. 실험은 독립적으로 3번 반복으로 수행하였으며, 실험 결과는 (평균값 ± 표준편차)로 표시 하였고, 유의성은 p<0.05로 표시하였다(표 2).

[표 2]

도 1은 폐 섬유 아세포 MRC-5에서 방사선 조사에 의한 세포의 생존 및 세포 손상의 정도에 대한 결과를 나타낸다. 정상 폐 섬유 아세포 MRC-5에서 조사 선량률(1.03 Gy/min)로 저선량(0.05 Gy)와 고선량(2 Gy) 방사선 조사 후 48시간 뒤 MTT 측정에 의해 세포의 생존도를 확인하였다(도 1A). 동일한 방사선 조사 후 8시간 뒤 웨스턴 블롯에 의해 세포 손상에 따른 단백질 변화를 검증하였다(도 1B). 실험결과는 평균±표준편차 값으로 결정하였고, 유의성 정도는 *p<0.05, **p<0.005 로 표시하였다.

도 1B에서 0.05 Gy의 저선량 방사선을 조사한 경우에는 세포의 손상에 매우 중요한 것으로 알려진 p53 단백질이나 p21단백질의 인산화가 대조군(0 Gy)에 비하여 거의 차이가 없는 것을 볼 수 있으며, 이는 0.05 Gy의 저선량 방사선 피폭은 거의 세포 손상을 일으키지 않는다는 것을 알 수 있다.

도 2, 도 3은 인산화 단백질 항원-항체 반응 분석배치 방법을 통해 얻어진 결과의 유효성 검증을 위한 결과이다. 선량 의존적(radiation dose dependent)으로 0, 0.05, 2 Gy의 각 선량을 세포에 조사하였다. 폐 섬유 아세포 MRC-5에서 저선량(0.05 Gy)과 고선량(2 Gy) 방사선 조사 후 8시간 경과 시점에 증가하는 인산화 단백질의 인산화 정도를 웨스턴 블롯을 통해서 확인하였다(도 2). 또한, 피부 섬유 아세포 NHDF에서도 동일한 방사선을 조사한 후 웨스턴 블롯으로 확인하였다(도 3). 대조군에 비해 1.3배 이상 증가된 인산화 단백질을 선별 후 densitometry 분석으로 결과를 검증 하였다(도2, 도 3). 두 정상세포에서 동일하게 인산화 양상을 보이는 인산화 단백질은 pNF-kB(Ser536)와 pP70S6K(Ser418)이다. 두 인산화 단백질의 인산화 변화는 정량분석을 통해서 그래프화 하였다 실험결과는 평균±표준편차로 표시하였다.

이상으로 본 발명의 실시 예를 상세히 기술하였다. 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (7)

1) 배양된 세포주에 방사선을 선량 의존적으로 조사하는 단계;
2) 상기 방사선이 조사된 후 미리 설정된 시간이 경과할 때까지 상기 배양된 세포주를 배양하는 단계; 및
3) 방사선이 선량 의존적으로 조사된 상기 배양된 세포주의 단백질들의 인산화 정도를 항체-항원 반응을 이용하여 웨스턴 블롯에 의하여 분석하는 단계 를 포함하고,
상기 1) 단계의 배양된 세포주는 폐 섬유 아세포 (MRC-5)이고,
상기 3) 단계의 단백질들은 pNF-kB(Ser536)과 pP70S6K(Ser418) 중에서 선택되는 하나 이상의 인산화 단백질을 포함하는 저선량 방사선 피폭 바이오마커 스크리닝 방법.

삭제

제 1 항에 있어서,
상기 저선량 방사선의 선량이 0.04 Gy 내지 0.06 Gy 선량을 가지는 것을 특징으로 하는 저선량 방사선 피폭 바이오마커 스크리닝 방법.

제 1항에 있어서,
상기 방사선이 조사된 후 미리 설정된 시간이 8 시간 이내인 것을 특징으로 하는 저선량 방사선 피폭 바이오마커 스크리닝 방법.

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저선량 방사선 피폭에 의한 중기 반응 바이오마커를 포함하고,
상기 중기 반응은 방사선 피폭 후 8 시간이 경과된 시점의 생물세포학적 반응이고,
상기 바이오마커는 pNF-kB(Ser536)과 pP70S6K(Ser418) 중에서 선택되는 하나 이상의 인산화 단백질인 것을 특징으로 하는 저선량 방사선 피폭 진단용 조성물.

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