KR101856624B1 - Nostoc sp. NK strain having excellent phycocyanin productivity and nitroten fixation ability and uses thereof - Google Patents

Nostoc sp. NK strain having excellent phycocyanin productivity and nitroten fixation ability and uses thereof Download PDF

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Abstract

본 발명은 피코시아닌 생산능 및 질소 고정능이 우수한 노스톡 속 NK 균주 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 노스톡 속 NK 균주는 질소원이 없는 배지에서도 높은 생장률을 가지며, 특정 광 조건에서 높은 함량의 피코시아닌 색소를 생산함과 동시에 수확이나 탈수, 그리고 용매 첨가의 추출 단계를 거치지 않고 저온 조건에서 즉각적으로 피코시아닌을 추출하는 단일 추출 공정을 개발함으로써 화장품, 건강식품, 의약품 등의 산업적 이용가능성을 높일 수 있다.The present invention relates to a strain of Nostok in the genus Nostoc, which has excellent phycocyanin production ability and nitrogen fixability, and its use, and the Nostok strain NK of the present invention has a high growth rate even in a medium without a nitrogen source, The present invention relates to a process for producing a phycocyanin pigment and a method for producing the phycocyanin pigment of the present invention. The possibility can be increased.

Description

피코시아닌 생산능 및 질소 고정능이 우수한 노스톡 속 NK 균주 및 이의 용도{Nostoc sp. NK strain having excellent phycocyanin productivity and nitroten fixation ability and uses thereof}Strain NK of the genus Nostoc, which has excellent phycocyanin production ability and nitrogen fixation ability, and its use {Nostoc sp. NK strain having excellent phycocyanin productivity and nitrogen fixation ability and uses thereof.

본 발명은 피코시아닌 생산능 및 질소 고정능이 우수한 노스톡 속 NK 균주 및 이의 용도에 관한 것이다.The present invention relates to a Nostok strain NK strain having excellent phycocyanin production ability and nitrogen fixation ability, and its use.

지구 온난화에 의한 기후변화는 산업 전반에 큰 변화를 주었으며, 녹색기술 선점을 위한 세계 각국의 경쟁이 심화되고 있다(NIC's Global Trends 2025). 우리나라에서도 미래 녹색성장의 기반이 되는 “저탄소 녹색성장” 비전 실현에 주력하고 있으며, 미세조류와 같은 광합성 생물을 이용한 녹색 기술을 부각하여 지구 온난화의 주범인 이산화탄소를 저감하는데 노력하고 있다. Climate change due to global warming has made major changes in the industry as a whole, and global competition for green technologies has intensified (NIC's Global Trends 2025). Korea is also focusing on realizing the vision of "Low Carbon Green Growth", which is the basis of future green growth, and is making an effort to reduce carbon dioxide, which is the main cause of global warming, by emphasizing green technology using photosynthetic organisms such as microalgae.

미세조류는 단위면적당 유입되는 태양에너지의 10%까지 고정할 수 있는 높은 광합성 효율로 인해 안정적인 바이오매스 생산이 가능하고, 전 세계적으로 식품 및 바이오 연료로서의 활용가능성에 의해 연간 약 1,400만 톤이 생산되고 있다. 바이오 연료뿐만 아니라 기능성 식품, 의약용 물질, 사료 등의 고부가 유용물질의 재료로 활용 가능성이 점차 커지고 있는 추세이다. 항산화 효소, 카로티노이드, 피코빌리단백질(phycobiliprotein), 클로로필, 루테인, 아스타잔틴 등 천연 생리활성 물질을 활용한 건강식품, 화장품, 의료소재 및 의학품으로 개발하고자 하는 노력이 전세계적으로 활발히 이루어지고 있다.Microalgae can produce stable biomass because of its high photosynthetic efficiency, which can fix up to 10% of solar energy per unit area, and about 14 million tons per year is produced due to its potential for use as food and biofuels worldwide have. Biofuels as well as high-value useful materials such as functional foods, medicinal materials, and feed are increasingly becoming more and more available. Cosmetics, medical materials and medical products using natural physiologically active substances such as antioxidant enzymes, carotenoids, phycobiliprotein, chlorophyll, lutein and astaxanthin have been actively developed all over the world .

피코빌리단백질(phycobiliproteins, PBPs)은 열린고리 데트라피롤의 구조를 갖는 광 수집 단백질(light-harvesting protein)로서, 시아노박테리아, 홍조류 및 은편모조류에 의해 생산된다. 세포 내 틸라코이드 막에 존재하며, 수용성 단백질로 흡광도에 따라 피코시아닌(phycocyanin, C-PC), 피코에리스린(phycoerythrin, PE), 그리고 알로피코시아닌(allophycocyanin, APC)으로 구분된다. 피코빌리단백질은 색감이 진하며, 수용성의 단백질이기 때문에 식품, 화장품, 의약 분야에서 천연 착색제로 이용이 가능하다. 그 중 피코시아닌은 아이스크림이나 화장품의 천연색소 및 형광마커로 이용되고 있으며, 항산화, 항염증 그리고 항암 효과에 대한 연구도 보고되고 있다. 하지만, 배양이 까다롭고 세포 내 단백질의 함량이 높지 않아 생산 단가가 높고 산업화가 어려운 상황이다. 이를 극복하기 위해, 균주 개량 및 배양공정 최적화를 통해 세포 내 피코시아닌의 함량을 높이고, 세포 내 단백질의 추출 공정 개선을 통해 상품화에 대한 연구가 시급한 실정이다. Phycobiliproteins (PBPs) are light-harvesting proteins with the structure of an open loop detrital roll, produced by cyanobacteria, red algae and giant algae. It is present in the intracellular thylakoid membrane. It is classified as phycocyanin (C-PC), phycoerythrin (PE), and allophycocyanin (APC) depending on the absorbance as a water-soluble protein. Pico Billy protein is a color-rich, water-soluble protein that can be used as a natural coloring agent in the food, cosmetics and pharmaceutical fields. Among them, phycocyanin is used as a natural pigment and fluorescent marker of ice cream and cosmetics, and studies on antioxidant, anti-inflammatory and anti-cancer effects are also reported. However, the cultivation is difficult and the protein content in the cells is not high, so the production cost is high and industrialization is difficult. In order to overcome this problem, it is urgently required to increase the content of picosane in the cell through optimization of the strain and culture process, and to commercialize the protein by improving the extraction process of intracellular protein.

기존의 연구에서는 조류를 질소원이 없는 배지에서 배양할 경우, 질소 고정이 가능한 조류일지라도 생장률이 1g DCW/L 미만으로 매우 낮았다. 질소원이 충분한 배지에서 배양할 경우 기간이 길어짐에 따라 배지에 질소원이 고갈되는 시점부터 세포 내 피코시아닌의 함량이 급격히 감소하여 3% (w/w)까지 낮아졌으며, 그로 인해 최종 수확단계의 피코시아닌의 생산성이 낮았다. 또한, 종래의 피코시아닌 추출방법은 크게 3 단계로 나눠지며, 1단계는 미세조류 수확 및 탈수, 2단계는 추출 용매 첨가 및 세포 파쇄, 그리고 3단계에서는 저온 조건에서 12시간 이상 추출 시간을 두고, 피코시아닌을 회수한다. 종래의 추출 공정은 많은 단계를 포함하므로 인해 생산 단가의 상승을 초래하여 산업화에 큰 걸림돌이 되고 있다.Previous studies have shown that when the algae are cultured in a medium without nitrogen source, the growth rate is very low, less than 1 g DCW / L, even for algae capable of nitrogen fixation. When the nitrogen source was cultured in a sufficient medium, the content of picosene in the cells decreased rapidly to 3% (w / w) from the time when the nitrogen source was depleted in the medium as the period became longer, The productivity of cyanine was low. In addition, the conventional picosylan extraction method is divided into three stages. In the first stage, microalgae harvesting and dehydration, second stage extraction solvent addition and cell disruption, and third stage, , And recover the phycocyanin. Conventional extraction processes involve many steps, resulting in an increase in the production unit price, which is a major obstacle to industrialization.

한편, 한국등록특허 제1406039호에서는 '신규한 미세조류 노스톡 ＫＮＵＡ００３ 균주 및 이로부터의 알칸, 지방 알코올 및 지방산 생산 방법'이 개시되어 있으나, 본 발명에서와 같이, 피코시아닌 생산능 및 질소 고정능이 우수한 노스톡 속 NK 균주 및 이의 용도에 대해서는 밝혀진 바가 전혀 없다.Korean Patent No. 1406039 discloses a novel microalgae strain KNUA003 and a method for producing an alkane, a fatty alcohol and a fatty acid therefrom. However, as in the present invention, the production ability of phycocyanin and nitrogen fixation The NK strain in the non-Stokes strain, which has excellent ability, and its use have never been disclosed.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명에서는 종래의 토착 광합성 미세조류를 자원화하고 생리활성물질 추출방법을 개량하여 미세조류 활용 원천기술을 개발하여 바이오 경제 활성화에 기여하고자, 안정적인 피코시아닌 생산용 균주인 노스톡 속(Nostoc sp.) NK 균주(KCTC12772BP)를 선발함으로써 본 발명을 완성하였다.SUMMARY OF THE INVENTION The present invention has been made in view of the above-mentioned needs, and it is an object of the present invention to provide a stable bio-active material for the microbial algae, The present invention was completed by selecting Nostoc sp. NK strain (KCTC12772BP), which is a strain for producing cyanine.

기존의 미세조류를 질소원이 없는 배지에서 배양할 경우, 질소 고정이 가능한 미세조류일지라도 생장률이 매우 낮았고, 질소원이 충분한 배지에서 배양할 경우 배양기간이 길어짐에 따라 배지에 질소원이 고갈되는 시점부터 세포 내 피코시아닌의 함량이 급격히 감소하였으며, 최종 수확단계의 피코시아닌의 생산성이 낮아 산업화에 큰 걸림돌이 되고 있었다.When the microalgae were cultured in a culture medium without nitrogen source, the microalgae capable of nitrogen fixation had a very low growth rate. When the culture medium was cultured in a medium with sufficient nitrogen source, as the culture period became longer, The content of ficocyanin decreased sharply, and the productivity of phycocyanin in the final harvesting stage was low, which was a major obstacle to industrialization.

그러나, 본 발명을 통해 분리된 토착 남조류 노스톡 속 NK 균주(KTCT 12772BP)는 질소영양원이 없는 BG11 배지(BG110)에서 질소 고정 생장률이 높게 나타나 질소 고정 능력이 우수함을 증명하였으며, 배지 내 질소원이 필요치 않으므로 배지 비용 절감에 큰 기여를 할 수 있음을 확인하였다. 또한, 배양기간이 종료되는 시점까지 높은 함량의 피코시아닌이 감소되지 않고 유지됨을 확인하였다.However, the NK strain (KTCT 12772BP) isolated from the native indigenous cyanobacterial isolate of the present invention showed a high nitrogen fixation growth rate in the BG11 medium (BG11 0 ) without the nitrogen nutrient source, and the nitrogen fixation ability in the medium was excellent And it is confirmed that it is possible to make a great contribution to the reduction of the badge cost. Also, it was confirmed that a high content of picosanoid was maintained without decreasing until the end of the incubation period.

특히, 본 발명에서 분리한 노스톡 속 NK 균주(KTCT 12772BP)를 1단계로 질소가 없는 BG11 배지(BG110)에서, 25℃, 1% CO2 폭기(aeration) 조건 하에, 적색광을 조사하면서 세포 배양하고, 2단계로 5℃, 암조건에서 정치하여 피코시아닌의 분비가 이루어지도록 유도함으로써, 상기 두 단계를 이용하여 기존의 방법보다 용이한 피코시아닌의 분리정제를 통해 배지 내로 분비되는 피코시아닌의 생산 수율이 현저히 증가하는 효과를 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.Specifically, the Nostoc state NK strain (KTCT 12772BP) isolated in the present invention was cultured in a single step in a nitrogen-free BG11 medium (BG11 0 ) under the condition of 25 ° C and 1% CO 2 aeration, Cultured and allowed to stand at 5 ° C under dark conditions to induce secretion of phycocyanin. By using the above two steps, the picosan is released into the culture medium through the separation and purification of phycocyanin, which is easier than the conventional method. The present inventors have completed the present invention by confirming the effect that the production yield of cyanine is remarkably increased.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 피코빌리단백질(phycobiliproteins) 생산능 및 질소 고정능이 우수한 노스톡 속(Nostoc sp.) NK 균주(KCTC12772BP)를 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a Nostoc sp. NK strain (KCTC12772BP) having phycobiliproteins producing ability and nitrogen fixation ability.

또한, 본 발명은 In addition,

(a) 상기 균주를 배양하여 세포 배양액을 얻는 단계; 및(a) culturing the strain to obtain a cell culture solution; And

(b) 상기 (a) 단계의 세포 배양액을 4~8℃, 암조건에서 정치하여 피코빌리단백질(phycobiliproteins)의 분비가 이루어지도록 유도하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 배지 내로 분비되는 피코빌리단백질을 고수율로 생산하는 방법을 제공한다.(b) inducing secretion of phycobiliproteins by allowing the cell culture solution of step (a) to stand at 4 to 8 캜 in a dark condition to induce secretion of phycobiliproteins. And a method for producing the protein at a high yield.

또한, 본 발명은 상기 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축액, 상기 배양물의 건조물 및 상기 배양물의 추출물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 함유하는 피코빌리단백질(phycobiliproteins) 생산용 조성물을 제공한다.The present invention also relates to a method for producing phycobiliproteins comprising, as an active ingredient, at least one selected from the group consisting of the strain, the culture of the strain, the concentrate of the culture, the dried product of the culture and the extract of the culture Lt; / RTI >

본 발명의 노스톡 속 NK 균주는 질소원이 없는 배지에서도 높은 생장률을 가지며, 적색광 조건에서 높은 함량의 피코시아닌 색소를 생산함과 동시에 수확이나 탈수, 그리고 용매 첨가의 추출 단계를 거치지 않고 저온 조건에서 즉각적으로 피코시아닌을 추출하는 단일 추출 공정을 개발함으로써 화장품, 건강식품, 의약품 등의 산업적 이용가능성을 높일 수 있다.The Nostok strain NK of the present invention has a high growth rate even in a medium without a nitrogen source and produces a high content of picocyanin pigment under the red light condition and at the same time it does not undergo extraction step of harvesting, By developing a single extraction process that instantly extracts phycocyanin, it is possible to increase the industrial availability of cosmetics, health foods, medicines, and the like.

특히, 본 발명을 통해 토착 남조류 노스톡 NK 균주(KTCT 12772BP)는 질소영양원이 없는 BG11 배지(BG110)에서 질소 고정 생장률이 3g DCW/L로 높게 나타나 질소 고정 능력이 우수함을 증명하였으며, 일반 형광등을 이용할 경우 피코빌리단백질 내 피코시아닌 함량이 38%에 불과하였지만, 적색광을 이용할 경우 피코시아닌 함량을 71%까지 높일 수 있음을 증명하였다. 또한, 배지 내 질소원이 필요치 않으므로 배지 비용 절감에 큰 기여를 할 수 있음을 보였다. 그리고 배양기간이 종료되는 시점까지 높은 함량의 피코시아닌을 유지함을 증명하였다. 질소가 없는 배양 배지에서 1% CO2를 주입하여 배양한 노스톡 속 NK 균주 배양액을 추가적인 피코시아닌 추출공정을 따로 거치지 않고 빛이 없는 저온 조건에 12시간 이상 3일 이하로 저장할 경우 세포 내 모든 피코시아닌이 배양액으로 추출되는 것을 확인하였으며, 이를 통해 추출공정에 따른 부가적인 에너지와 자원의 투입 없이 경제적이고 효율적으로 피코시아닌을 얻는 것이 가능해졌다. Particularly, through the present invention, the native cyanobacterial NK strain (KTCT 12772BP) showed a high nitrogen fixation growth rate of 3 g DCW / L in the BG11 medium (BG11 0 ) without the nitrogen nutrient source, Showed that the content of phycocyanin in phycobiliprotein was only 38%, but that the use of red light could increase the content of phycocyanin up to 71%. In addition, it was shown that a nitrogen source in the culture medium is not required, which can contribute to the reduction of the culture medium cost. And maintained a high content of picocyanin until the end of the incubation period. If NK strains cultured in NK culture medium supplemented with 1% CO 2 are stored for 12 hours to less than 3 days at low temperatures without light, without additional picocyanin extraction, It has been confirmed that phycocyanin is extracted with the culture solution, and it is possible to obtain phycocyanin economically and efficiently without adding additional energy and resources according to the extraction process.

따라서, 본 발명의 노스톡 NK 균주(KTCT 12772BP)는 질소원이 없는 배양배지를 사용함으로 배지 원가의 50% 이상을 절감할 수 있으며, 우수한 바이오매스 생산성과 피코시아닌 생산성을 가짐으로써 산업화에 적용 시 고부가 가치 색소 물질의 생산비용을 획기적으로 절감할 수 있어, 관련 산업에 매우 유용하다.Therefore, the Nostok NK strain (KTCT 12772BP) of the present invention can be used to reduce the cost of the medium by 50% or more by using a culture medium without a nitrogen source, and has superior biomass productivity and picocyanin productivity, It is very useful for related industry because it can drastically reduce production cost of high value-added coloring matter substance.

도 1은 본 발명에서 분리한 남조류 노스톡 속 NK 균주의 계통수를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에서 이용한 BG11 배지와 질소가 없는 BG11 배지(BG110)의 조성을 나타낸 것이다.
도 3은 BG11 배지와 질소가 없는 BG11 배지(BG110)에서 노스톡 속 NK 균주의 바이오매스 변화(A) 및 세포 내 피코빌리단백질의 함량 변화(B)를 나타낸 그래프이다.
도 4는 BG11 배지와 질소가 없는 BG11 배지(BG110) 조건에서 배양한 노스톡 속 NK 균주의 바이오매스 변화와 세포 내 피코시아닌(C-PC) 함량 변화를 일반 형광등(A, White), 식물재배용 형광등(B, Plant), 그리고 붉은색 형광등(C, Red, 본 발명에서 기재한 적색광과 동일) 조건에서 관찰한 그래프이다.
도 5는 노스톡 속 NK 균주를 일반 형광등(White), 식물재배용 형광등(Plant), 그리고 붉은색 형광등(Red) 조건에서 배양하였을 때 피코시아닌(C-PC)의 최종 함량을 나타낸 그래프이다.
도 6은 노스톡 속 NK 균주를 일반 형광등(White), 식물재배용 형광등(Plant), 그리고 붉은색 형광등(Red) 조건에서 질소가 없는 BG11 배지(BG110)에서 5일 동안 배양하였을 때 피코빌리단백질들의 구성비를 조사한 결과이다. APC, 알로피코시아닌; PE, 피코에리스린; PC, 피코시아닌
도 7은 BG11 배지와 질소가 없는 BG11 배지(BG110)에서 배양한 노스톡 속 NK 균주 배양액을 다양한 조건(명/암조건, 저온/중온)에 저장하였을 때 시간에 따른 피코빌리단백질의 방출량을 나타낸 그래프이다.
도 8은 일반 형광등(좌)과 붉은색 형광등(우) 조건에서 배양한 노스톡 속 NK 균주 배양액을 저온 및 암조건에서 3일 저장한 결과를 나타내는 것으로, 상등액에 해당하는 붉은색 및 청색 부분은 방출된 피코빌리단백질을 나타낸다.1 shows the phylogenetic tree of the NK strain of the genus Cyanobacteria isolated in the present invention.
Fig. 2 shows the composition of BG11 medium and BG11 medium (BG11 0 ) without nitrogen used in the present invention.
3 is a graph showing changes in the biomass (A) and intracellular pycobiliprotein content (B) in the BG11 medium and the nitrogen-free BG11 medium (BG11 0 ).
FIG. 4 shows changes in biomass and intracellular phycocyanin (C-PC) content of Nostri sp. NK strain cultured under BG11 medium and BG11 medium (BG11 0 ) A plant fluorescent lamp (B, Plant), and a red fluorescent lamp (C, Red, the same as the red light described in the present invention).
FIG. 5 is a graph showing the final content of phycocyanin (C-PC) when Nostok strain NK was cultured under the conditions of a general fluorescent lamp (White), a fluorescent lamp for plant cultivation (plant), and a red fluorescent lamp (Red).
Figure 6 shows that when the Nostok strain NK was cultured for 5 days in nitrogen-free BG11 medium (BG11 0 ) under the conditions of general fluorescent lamp (White), plant cultivation fluorescent lamp, and red fluorescent lamp (Red) The results of this study are as follows. APC, allophycocyanin; PE, pico erythrine; PC, phycocyanin
FIG. 7 is a graph showing changes in the amount of picofile protein released over time under various conditions (temperature / light condition, low temperature / medium temperature) in BG11 medium and BG11 medium without nitrogen (BG11 0 ) Fig.
FIG. 8 shows the results of storage of the NK strain cultured in a nonsteroidal culture under the conditions of a general fluorescent lamp (left) and a red fluorescent lamp (right) for 3 days under low temperature and dark conditions. The red and blue portions corresponding to the supernatant Lt; / RTI > protein.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 피코빌리단백질(phycobiliproteins) 생산능 및 질소 고정능이 우수한 노스톡 속(Nostoc sp.) NK 균주(KCTC12772BP)를 제공한다.In order to accomplish the object of the present invention, the present invention provides a Nostoc sp. NK strain (KCTC12772BP) having phycobiliproteins producing ability and nitrogen fixation ability.

본 발명의 일 구현 예에 따른 피코빌리단백질은 바람직하게는 피코시아닌(phycocyanin, PC), 피코에리스린(phycoerythrin, PE) 또는 알로피코시아닌(allophycocyanin, APC)일 수 있고, 가장 바람직하게는 피코시아닌(phycocyanin)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.The picofile protein according to one embodiment of the present invention may preferably be phycocyanin (PC), phycoerythrin (PE) or allophycocyanin (APC), and most preferably, But is not limited to, phycocyanin.

본 발명을 통해 충청남도 논산시 가야곡면 야촌리에 위치한 한국야쿠르트 논산 공장 폐수처리시설의 토양에서 분리된 토착 남조류 노스톡 속 NK 균주(KCTC12772BP)는 질소영양원이 없는 BG11 배지(BG110)에서 질소고정 생장률이 3g DCW/L로 높게 나타나 질소고정 능력이 우수함을 증명하였으며, 배지 내 질소원이 필요치 않으므로 배지비용 절감에 큰 기여를 할 수 있음을 보였다. 그리고 배양기간이 종료되는 시점까지 높은 함량의 피코시아닌(18%(w/w))이 감소하지 않고 유지함을 확인하였다(도 5).Through the present invention, NK strain (KCTC12772BP) isolated from the soil of a wastewater treatment facility in the Yakult Nonsan factory in Yaocheon, Nogsan, Nongsan city, Chungcheongnam-do proved that the nitrogen fixation growth rate was 3g DCW (BG11 0 ) / L, indicating that the nitrogen fixation ability is excellent, and it is shown that the nitrogen source in the culture medium is not required, which can contribute to the reduction of the culture medium cost. And maintained a high content of picocyanin (18% (w / w)) without decreasing until the end of the incubation period (FIG. 5).

특히, 본 발명에서 분리한 상기 노스톡 속 NK 균주(KCTC12772BP)를 1단계로 질소영양원이 없는 BG11 배지(BG110)에서, 25℃, 1% CO2 폭기 조건 하에, 적색광에서 세포 배양한 후, 2단계로 5℃, 암조건에서 정치하여 피코시아닌의 분비가 이루어지도록 유도함으로써, 상기 두 단계를 이용하여 기존의 방법보다 용이한 피코시아닌의 분리정제를 통해 배지 내로 분비되는 피코시아닌의 생산 수율이 현저히 증가하는 효과를 확인하였다. 따라서, 상기 노스톡 속(Nostoc sp.) NK 균주를 한국생명공학연구원에 2015년 03월 25일자로 기탁하였다(기탁번호: KCTC12772BP).In particular, the Nostoc strain NK strain (KCTC12772BP) isolated in the present invention was cultured in a single step in BG11 medium (BG11 0 ) without nitrogen nutrient solution under the condition of 25 ° C and 1% CO 2 aeration, And then allowing the secretion of picosanine to be established by leaving the cells in a dark condition at 5 DEG C in two steps. By using the above two steps, the picocyanin secreted into the medium through the separation and purification of phycocyanin, And the production yield was remarkably increased. Therefore, the Nostoc sp. NK strain was deposited at the Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology on Mar. 25, 2015 (Accession No .: KCTC12772BP).

또한, 본 발명은 In addition,

(a) 상기 균주를 배양하여 세포 배양액을 얻는 단계; 및(a) culturing the strain to obtain a cell culture solution; And

(b) 상기 (a) 단계의 세포 배양액을 4~8℃, 암조건에서 정치하여 피코빌리단백질(phycobiliproteins)의 분비가 이루어지도록 유도하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 배지 내로 분비되는 피코빌리단백질을 고수율로 생산하는 방법을 제공한다.(b) inducing secretion of phycobiliproteins by allowing the cell culture solution of step (a) to stand at 4 to 8 캜 in a dark condition to induce secretion of phycobiliproteins. And a method for producing the protein at a high yield.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 균주의 배양은 질소가 없는 배지에서 적색광을 조사하여 배양하는 것일 수 있으며, 바람직하게는 미세조류 배양을 위해 당업계에 일반적으로 사용할 수 있는 질소가 없는 배양 배지일 수 있고, 가장 바람직하게는 질소가 없는 BG11 배지(BG110)에서 적색광을 조사하여 배양하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In the method according to an embodiment of the present invention, the cultivation of the strain may be carried out by irradiating red light in a nitrogen-free medium, preferably in the absence of nitrogen which can be generally used in the art for microalgae culture Culture medium, and most preferably, it is cultured by irradiating red light in BG11 medium (BG11 0 ) without nitrogen, but it is not limited thereto.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법은 바람직하게는,The method according to an embodiment of the present invention is preferably carried out by a method,

(a) 상기 균주를 질소가 없는 BG11 배지(BG110)에 접종하고, 23~27℃, 0.5~1.5% CO2 폭기(aeration) 조건 하에, 적색광을 조사하면서 세포 배양하여 세포 배양액을 얻는 단계; 및(a) Inoculating the strain into a BG11 medium (BG11 0 ) without nitrogen and culturing the cells under irradiation of red light at a temperature of 23 to 27 ° C under 0.5 to 1.5% CO 2 aeration to obtain a cell culture solution; And

(b) 상기 (a) 단계의 세포 배양액을 4~8℃, 암조건에서 정치하여 피코빌리단백질의 분비가 이루어지도록 유도하는 단계;를 포함하는 것일 수 있고,(b) inducing secretion of the picofile protein by allowing the cell culture solution of step (a) to stand at 4 to 8 ° C under dark condition,

가장 바람직하게는,Most preferably,

(a) 상기 균주를 질소가 없는 BG11 배지(BG110)에 접종하고, 25℃, 1% CO2 폭기(aeration) 조건 하에, 적색광을 조사하면서 세포 배양하여 세포 배양액을 얻는 단계; 및(a) inoculating the strain into a BG11 medium (BG11 0 ) without nitrogen and culturing the cells under irradiation of red light at 25 ° C under 1% CO 2 aeration to obtain a cell culture; And

(b) 상기 (a) 단계의 세포 배양액을 5℃, 암조건에서 정치하여 피코빌리단백질의 분비가 이루어지도록 유도하는 단계;를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.(b) inducing secretion of the picofile protein by allowing the cell culture solution of step (a) to stand at 5 ° C under dark condition, but the present invention is not limited thereto.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 피코빌리단백질은 바람직하게는 피코시아닌(phycocyanin, PC), 피코에리스린(phycoerythrin, PE) 또는 알로피코시아닌(allophycocyanin, APC)일 수 있고, 가장 바람직하게는 피코시아닌(phycocyanin)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In a method according to an embodiment of the present invention, the picofile protein may preferably be phycocyanin (PC), phycoerythrin (PE) or allophycocyanin (APC) Most preferably phycocyanin, but is not limited thereto.

또한, 본 발명은 상기 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축액, 상기 배양물의 건조물 및 상기 배양물의 추출물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 함유하는 피코빌리단백질(phycobiliproteins) 생산용 조성물을 제공한다.The present invention also relates to a method for producing phycobiliproteins comprising, as an active ingredient, at least one selected from the group consisting of the strain, the culture of the strain, the concentrate of the culture, the dried product of the culture and the extract of the culture Lt; / RTI >

본 발명의 일 구현 예에 따른 조성물에서, 상기 피코빌리단백질은 바람직하게는 피코시아닌(phycocyanin, PC), 피코에리스린(phycoerythrin, PE) 또는 알로피코시아닌(allophycocyanin, APC)일 수 있고, 가장 바람직하게는 피코시아닌(phycocyanin)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
In a composition according to an embodiment of the present invention, the picofile protein may preferably be phycocyanin (PC), phycoerythrin (PE) or allophycocyanin (APC) Most preferably phycocyanin, but is not limited thereto.

이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, the constitution and effects of the present invention will be described in more detail through examples. These examples are only for illustrating the present invention, and the scope of the present invention is not limited by these examples.

실시예Example 1.  One. 노스톡No-Stokes 속  genus NKNK 균주의 분리 및 동정 Isolation and Identification of Strain

수집된 토양시료(50 g)를 800 ml BG11 배지에 넣고 50 rpm으로 섞어주면서 100 μmol/m2/s의 빛을 조사하여 한달간 농화배양하였다. 배양액을 12시간 이상 정치시킨 후 상등액만 분리하여 질소원이 없는 BG11 고형 배지에 도말하였다. 배지에서 자란 조류를 분리하여 현미경 관찰하였으며, 16S rDNA 염기서열 분석을 수행하였다. 이때 사용된 프라이머는 남조류에만 적용되는 특이 프라이머로 다음과 같다; CYA-359F (5'-GGGGAATYTTCCGCAATGGG-3' : 서열번호 1) 및 CYA-781R (5'-GACTACWGGGGTATCTAATCCCW-3' : 서열번호 2). 남조류의 염기서열을 BLAST 분석한 결과 노스톡 속으로 98% 이상의 일치를 보였으며, Neighbor-Joining 방법을 이용해 계통수를 도 1에 나타내었다.
The collected soil samples (50 g) were added to 800 ml of BG11 medium and incubated at 100 rpm for 1 month with light irradiation at 50 rpm. After the culture was allowed to stand for 12 hours or more, only the supernatant was separated and spread on a BG11 solid medium having no nitrogen source. The algae grown in the medium were separated and observed under a microscope, and 16S rDNA sequencing was performed. The primer used here is a specific primer applied only to cyanobacteria; CYA-359F (5'-GGGGAATYTTCCGCAATGGG-3 ': SEQ ID NO: 1) and CYA-781R (5'-GACTACWGGGGTATCTAATCCCW-3': SEQ ID NO: 2). BLAST analysis of the nucleotide sequence of cyanobacteria showed more than 98% agreement with the nonsteroidal genome. The phylogenetic tree is shown in Fig. 1 using Neighbor-Joining method.

실시예Example 2.  2. BG11BG11 배지와 질소 무첨가(N-free)  The medium and nitrogen-free (N-free) BG11BG11 배지( badge( BG11BG11 00 )에서의 ) In 노스톡No-Stokes 속  genus NKNK 균주 배양 Culture of the strain

본 발명자들은 노스톡 속 NK 균주의 질소 고정능 측정 및 세포 내 피코빌리단백질의 함량 변화를 측정하기 위해 BG11 배지와 질소 무첨가 BG11 배지(BG110)에서 배양을 수행하였다(도 2). 이때, 1% CO2를 공급하였으며, pH는 7.0-7.2 수준을 유지하였다(도 3). 노스톡 속 NK 균주의 생장 패턴은 배지에 따라 크게 차이가 나지 않았으며, 이는 광생물 반응기의 지름이 10cm임을 감안할 때, 빛에 의한 생장저해 영향으로 인해 생장의 차이가 뚜렷이 나타나지 않은 것으로 판단하였다. 피코빌리단백질의 함량 변화는 배지에 따라 패턴이 크게 차이가 나타났다. BG11 배지의 피코빌리단백질은 배양이 길어짐에 따라 6.8%로 급격히 감소한 반면, 질소 무첨가 BG11 배지(BG110)의 피코빌리단백질은 20%의 높은 함량을 유지하였다(도 3). 이 결과를 통해 저렴한 질소 무첨가 BG11 배지(BG110)를 노스톡 속 NK 균주의 배양에 이용할 경우 높은 피코빌리단백질의 수확이 가능하여 산업화 이용가능성이 높음을 알 수 있었다.
The present inventors cultured the BG11 medium and the nitrogen-free BG11 medium (BG11 0 ) (FIG. 2) in order to measure the nitrogen fixation ability and the content of the intracellular picofile protein in the Nostok strain NK. At this time, 1% CO 2 was supplied, and the pH was maintained at 7.0-7.2 (FIG. 3). The growth pattern of the Nostok strain NK was not significantly different depending on the medium. Considering that the diameter of the photobioreactor was 10 cm, it was judged that the difference in growth was not apparent due to the inhibition of light-induced growth. The content of pycobiliprotein varied greatly depending on the medium. The picofile protein of the BG11 medium rapidly decreased to 6.8% as the culture was prolonged, whereas the picofile protein of the BG11 medium (BG11 0 ) without the nitrogen maintained a high content of 20% (FIG. 3). These results suggest that the use of low - nitrogen - free BG11 medium (BG11 0 ) for the cultivation of NK strain in Nostok is highly possible for industrialization because it is possible to harvest high pycobiliprotein.

실시예Example 3. 다양한  3. Various 광조건에서의Light 피코시아닌  Picosian 생산능Production capacity 향상 Improving

본 발명자들은 세포 내 피코시아닌 함량을 증가시키기 위한 다양한 광조건 실험을 수행하였다. 피코빌리단백질을 가지는 남조류는 보색순응이라는 기작을 통해 환경의 빛의 파장 영역에 따라 세포 내 피코빌리단백질의 피코시아닌(PC)과 피코에리스린(PE)의 함량을 조절하여 최대한 많은 빛을 흡수하려는 특성을 가진다. 보색순응을 통해 세포 내 피코시아닌의 함량을 증대시키기 위해, 일반 형광등, 식물재배용 형광등, 그리고 붉은색 형광등(적색광과 동일)을 이용하여 노스톡 속 NK 균주의 배양을 수행하였으며, 이때 사용된 광생물 반응기는 지름이 5cm인 관형반응기를 사용하여 빛의 이용성을 증가시킴으로써 바이오매스 향상에 걸림돌이 되는 그림자 효과를 상쇄시키도록 설계하였다. 배양 배지는 BG11 배지와 질소 무첨가 BG11 배지(BG110)를 이용하였으며, 1% CO2를 공급하였다. 노스톡 속 NK 균주는 BG11 배지에서 4g/L 바이오매스 생산율을 보인 반면, 질소 무첨가 BG11 배지(BG110)에서는 3g/L의 바이오매스 생산율을 보였다(도 4). 이를 통해, 질소 무첨가 BG11 배지(BG110)에서 배양할 경우 BG11 배지에 비해 조금 낮은 바이오매스 생산율을 보임을 알 수 있었다. 하지만, 질소 무첨가 BG11 배지(BG110)의 피코시아닌 생산량의 경우 BG11 배지에 비해 월등히 높은 생산량을 나타내었으며, 붉은색 형광등 배양 조건에서 가장 높은 최종 피코시아닌 함량 18%를 얻을 수 있었다(도 5). We performed various light conditioning experiments to increase intracellular phycocyanin content. Cyanobacteria with picofillery proteins are able to absorb as much light as possible by controlling the content of picobicyan (PC) and picoerythrin (PE) in the intracellular picofile protein according to the light wavelength region of the environment through the mechanism of complementary adaptation . In order to increase the amount of phycocyanin in the cell through complementary complementation, cultivation of the NK strain in the Nostok was carried out using general fluorescent lamps, fluorescent lamps for plant cultivation, and red fluorescent lamps (same as red light) The bioreactor is designed to offset the shadow effect, which is a hindrance to biomass enhancement, by increasing the availability of light using a tubular reactor with a diameter of 5 cm. The culture medium was BG11 medium and BG11 medium (BG11 0 ) supplemented with 1% CO 2 . The Nostok strain NK showed 4 g / L biomass production rate in the BG11 medium while the BG11 medium without the nitrogen (BG11 0 ) showed 3 g / L biomass production rate (FIG. 4). It was found that when cultured in BG11 medium (BG11 0 ) without nitrogen, the biomass production rate was slightly lower than that of BG11 medium. However, the production of picosane from the nitrogen-free BG11 medium (BG11 0 ) was much higher than that from the BG11 medium, and the highest final phycocyanin content was obtained at 18% under the red fluorescent lamp culture condition ).

일반 형광등에서 배양된 노스톡 속 NK는 세포 내 높은 피코에리스린의 함량 때문에 전체적으로 적갈색을 띄었지만, 붉은색 형광등에서 배양된 노스톡 속 NK는 세포 내 피코에리스린의 함량이 줄어들고 피코시아닌의 함량이 증가하여 전체적으로 청녹색을 띄게 되었다. 보색 순응을 통해 노스톡 속 NK의 세포 내 피코빌리단백질 중 피코시아닌의 함량을 71% 까지 높일 수 있었으며, 이때 그와 비례하여 피코에리스린의 함량이 줄어든 것을 확인할 수 있었다(도 6).
NK, which is cultured in a general fluorescent lamp, was reddish brown overall due to high intracellular content of picoerythrin. However, NK in Nostok cultured in a red fluorescent lamp decreased the content of picoerythrin in the cell, And the whole was blue-green. By the complementary complementation, the content of picoxiban in the intracellular picofile protein of Nostok in Nostok can be increased up to 71%, and it was confirmed that the content of picofilicin was reduced in proportion to that.

실시예Example 4.  4. 피코빌리단백질Picobili protein 추출 공정 개선  Improve extraction process

본 발명자들은 세포 내 피코빌리단백질 추출 공정을 개선하기 위해 BG11 배지와 질소 무첨가 BG11 배지(BG110) 배양액을 다양한 조건에서 저장하여 피코빌리단백질이 다른 추가의 추출 공정없이 자연 추출되도록 실험을 설계하였다. BG11 배지에서 배양한 노스톡 속 NK 균주는 자연 추출이 발생하지 않은 반면, 질소 무첨가 BG11 배지(BG110)에서 배양한 노스톡 속 NK 균주는 자연 추출이 발생하였으며, 저장 조건에 따라 추출되는 정도의 차이를 보였다(도 7 및 도 8). 피코빌리단백질의 최적 자연추출 조건은 저온(5℃) 및 암조건이였으며, 이 조건에서 대부분의 피코빌리단백질이 세포 밖으로 자연 추출되었다(도 7 및 도 8). 가장 큰 영향을 미치는 조건은 질소 무첨가 BG11 배지(BG110) 조건이였으며, 그 다음으로 암조건, 온도조건이 자연 추출에 영향을 주었다. 이를 통해 질소 무첨가 BG11 배지(BG110)를 이용한 노스톡 속 NK 균주의 배양은 가장 효율적이고 경제적으로 피코시아닌을 생산 및 추출할 수 있는 방법임을 증명할 수 있었다.The present inventors designed an experiment in which a culture medium of BG11 medium and BG11 medium without BG11 (BG11 0 ) medium was stored under various conditions to naturally extract the picobilleri protein without any additional extraction process, in order to improve the extraction process of intracellular picofile protein. NK strain cultivated in BG11 medium did not undergo natural extraction, whereas NK strain cultivated in BG11 medium (BG11 0 ) without nitrogen resulted in natural extraction, (Fig. 7 and Fig. 8). Optimum natural extraction conditions of the picobilleri protein were low temperature (5 캜) and dark condition, and most of the picobillery proteins were naturally extracted from the cells under these conditions (Figs. 7 and 8). The most effective conditions were BG11 medium (BG11 0 ) without nitrogen, followed by dark and temperature conditions. Through this study, it was proved that culture of Nostok strain NK using BG11 medium (BG11 0 ) supplemented with no nitrogen is the most efficient and economical method to produce and extract picocyanin.

한국생명공학연구원Korea Biotechnology Research Institute KCTC12772BPKCTC12772BP 2015032520150325

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Nostoc sp. NK strain having excellent phycocyanin productivity and nitroten fixation ability and uses thereof <130> PN16327 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 ggggaatytt ccgcaatggg 20 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 gactacwggg gtatctaatc ccw 23 <110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Nostoc sp. NK strain having excellent phycocyanin productivity          and niten fixation ability and uses thereof <130> PN16327 <160> 2 <170> Kopatentin 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 ggggaatytt ccgcaatggg 20 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 gactacwggg gtatctaatc ccw 23

Claims (7)

삭제delete 삭제delete (a) 적색광 하에서 피코시아닌(phycocyanin) 생산능 및 질소가 없는 배지에서 질소 고정능이 우수한 노스톡 속(Nostoc sp.) NK 균주(KCTC12772BP)를 질소가 없는 BG11 배지에 접종하고, 적색광을 조사하면서 세포 배양하여 세포 배양액을 얻는 단계; 및
(b) 상기 (a) 단계의 세포 배양액을 4~8℃, 암조건에서 정치하여 피코시아닌(phycocyanin)의 분비가 이루어지도록 유도하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 배지 내로 분비되는 피코시아닌(phycocyanin)을 고수율로 생산하는 방법. (a) A Nostoc sp. NK strain (KCTC12772BP), which is capable of producing phycocyanin and capable of nitrogen fixation in a nitrogen-free medium under red light, was inoculated into BG11-free medium containing no nitrogen and irradiated with red light Culturing the cells to obtain a cell culture solution; And
(b) inducing the secretion of phycocyanin by allowing the cell culture solution of step (a) to stand at 4 to 8 캜 in a dark condition, thereby producing a picocyte secreted into the culture medium A method for producing phycocyanin in high yield. 삭제delete 삭제delete 제3항에 있어서,
(a) 적색광 하에서 피코시아닌(phycocyanin) 생산능 및 질소가 없는 배지에서 질소 고정능이 우수한 노스톡 속(Nostoc sp.) NK 균주(KCTC12772BP)를 질소가 없는 BG11 배지에 접종하고, 23~27℃, 0.5~1.5% CO2 폭기(aeration) 조건 하에, 적색광을 조사하면서 세포 배양하여 세포 배양액을 얻는 단계; 및
(b) 상기 (a) 단계의 세포 배양액을 4~8℃, 암조건에서 정치하여 피코시아닌(phycocyanin)의 분비가 이루어지도록 유도하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.The method of claim 3,
(a) A Nostoc sp. NK strain (KCTC12772BP) having phycocyanin production ability and excellent nitrogen fixation ability in a nitrogen-free medium was inoculated into BG11-free medium without nitrogen, and cultured at 23 to 27 ° C , And culturing the cells under irradiation of 0.5 to 1.5% CO 2 aeration with irradiation of red light to obtain a cell culture solution; And
(b) inducing phycocyanin secretion by allowing the cell culture solution of step (a) to stand at 4 to 8 ° C under dark conditions. 삭제delete
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