KR101853701B1 - Compositions with bioconversion Sesamum indicum for improvement of immunity, diabetes, hyperlipemia or protection against liver damage - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 참깨생물전환물을 함유하는 면역증강용, 당뇨개선용, 고지혈증 개선용 또는 간 보호용 조성물에 관한 것이다. The present invention relates to a composition for improving immunity, for improving diabetes, for improving hyperlipemia or for protecting liver containing a sesame bioconversion product.
면역은 크게, 선청성면역(innate immunity, 일명 자연면역)과 후천성면역(acquired immuniry, 일명 획득면역)으로 구분된다. 2011년 노벨생리의학상 공동수상자 3명은 인체의 면역체계가 세균, 바이러스, 곰팡이 등의 침입에 맞서 작동하는 핵심 원칙들을 밝혀낸 업적으로 노벨의학상을 수상한 바 있다. Immunity is largely divided into innate immunity (aka natural immune) and acquired immunity (aka acquired immunity). The three Nobel laureates of the 2011 Nobel Prize in Physiology awarded the Nobel Prize for medicine for discovering the core principles of the immune system against bacteria, viruses and fungi.
이들의 연구에 의하면, 병원성 미생물 등의 외부침입자들은 우리 몸에 들어와 제일 먼저 선천성면역을 담당하는 면역세포의 세포표면에 있는 특정 수용체와 결합하게 된다. 이때, 우리 몸은 외부침입자인 외부항원을 발견하고, 신속하게 대응하게 된다. 이 결과로 세포와 조직에 염증반응이 일어나, 우리 몸은 열이 나거나 몸살 기운을 느끼게 되는 것이다. According to these studies, foreign invaders such as pathogenic microorganisms enter our bodies and are first associated with specific receptors on the cell surface of immune cells responsible for innate immunity. At this time, our body discovers external antigens, which are external intruders, and responds quickly. As a result, an inflammatory reaction occurs in cells and tissues, and the body feels fever or body fatigue.
이런 초기 면역반응은 외부항원의 정체와 상관없이 즉각적으로 일어난다. 선천성면역은 항원에 대해 비특이적으로 반응한다. 선천성면역을 담당하는 세포로는 식균작용을 담당하는 대식세포(macrophage)와 다형핵 백혈구(polymorphonuclear leucocyte), 감염세포를 죽일 수 있는 자연살해세포(NK cell) 등이 있으며, 실제로 대부분의 감염은 선천성면역에 의해 방어된다.This early immune response occurs immediately, regardless of the identity of the foreign antigen. Congenital immunity reacts nonspecifically to the antigen. In congenital immunity, macrophage, polymorphonuclear leucocyte, and NK cell, which can kill infected cells, are the most common. In fact, most infections are congenital It is defended by immune.
다만, 다양한 이유로 인해 인체 내의 면역력이 약해진 경우, 면역을 증강시키기 위해 많은 면역증강제들이 개발되어 사용되고 있다. 근래에 들어, 곰팡이류와 버섯류를 포함하는 균류에서 추출된 전기 다당류의 항보체활성, 림프구 분열 유도활성 등의 면역활성이 주목받았다. 이에, 신규한 면역조절물질을 개발하기 위하여, 균류에서 생산되는 다당류가 집중적으로 연구되고 있다. However, when immunity in the human body is weakened for various reasons, many immune enhancers have been developed and used to enhance immunity. Recently, immune activities such as anti-complement activity and lymphocyte division induction activity of electric polysaccharides extracted from fungi including fungi and mushroom have attracted attention. Therefore, in order to develop a new immunomodulating substance, polysaccharides produced in fungi have been intensively studied.
한편, 당뇨는 그 자체 뿐 아니라, 다양한 합병증을 불러와 사망에 이를 수 있어 위험성이 강조되고 있다. 당뇨의 유병률은 전 세계적으로 높을 뿐만 아니라, 특히 우리나라는 이미 당뇨 및 당뇨 합병증 발병률이 OECD 평균 이상이며, 선진국형 생활 패턴으로 바뀜에 따라 우리나라에서도 발병률이 증가하고 있는 추세이다. 따라서, 이에 따른 사회적인 비용도 점차 증가하고 있어 해결되어야 할 과제로 관심을 받고 있다. On the other hand, the risk of diabetes is emphasized because it can lead to various complications as well as death itself. The prevalence of diabetes is not only high in the world but also in Korea, the prevalence of diabetes and diabetes complications is higher than the OECD average. Therefore, the social cost is gradually increasing, which is attracting attention as a task to be solved.
당뇨는 크게 두 가지 종류로 분류하는데, 먼저 췌장의 베타세포 기능이 망가져 인슐린이 제대로 분비되지 않아 혈당조절이 되지 않는 경우를 제1형이라 하고, 인슐린 분비에는 문제가 없으나 인슐린에 대한 민감도가 떨어져 인슐린 신호전달이 제대로 되지 않아 혈당조절을 제대로 하지 못하는 경우를 제2형 당뇨라고 한다. Diabetes mellitus is classified into two types. First, the pancreatic beta cell function is broken and insulin is not properly secreted. Therefore, the first type of insulin is not controlled, and there is no problem with insulin secretion, but insulin sensitivity is low.
제1형 당뇨는 주로 선천적으로 발생하는 경우가 대부분이며, 인슐린 분비가 제대로 되지 않기 때문에 인슐린을 투여하는 간단치료법으로 관리가 가능하다.
반면, 제2형 당뇨는 주로 후천적인 요인으로 발생하게 되며, 주로 인슐린 저항성에 의하여 제2형 당뇨가 발생하는 것으로 알려져 있다. 정상인의 경우, 음식 섭취 후, 소화 흡수를 거쳐 혈중 포도당 농도가 증가하면 인슐린 분비가 원활하게 이루어지고, 당을 받아들여야 하는 각 조직의 세포들이 인슐린을 정상적으로 인지하여 당을 흡수한다. 흡수된 당은 에너지 생산 또는 글리코겐 저장 등 다양한 용도에 맞게 사용되는데, 이를 통해 혈당을 낮추게 된다. 그러나, 인슐린 저항성이 있는 사람의 경우, 각 조직의 세포들이 인슐린에 대한 민감도가 낮아져 분비된 인슐린을 정상적으로 인지하지 못하고, 적절한 당 흡수 및 이용이 이루어지지 않아 혈당이 높은 상태로 유지된다.On the other hand,
이처럼 인슐린 저항성 상태에서 인슐린이 제 역할을 하지 못하면 각 조직에서 당을 흡수하여 에너지원으로 소비하지 못하거나 간에서 글리코겐을 포도당으로 분해하는 신생합성과정을 적절하게 억제하지 못해 혈당이 더 증가하게 되고, 결국에는 제2형 당뇨로 진행되게 된다. 이러한 당뇨는 중성지방, 콜레스테롤을 증가시키며, 간과 췌장 조직의 손상을 초래하기도 한다. If insulin does not play a role in insulin resistance, glucose can not be absorbed as an energy source by each tissue, or glucose can not be properly decomposed into glycogen, Eventually leading to
한편, 알코올로 인해 간이 손상되기도 하는데, 이와 같은 경우를 알코올성 지방간이라고 한다. 현재 전 세계 만성간질환환자 수는 약 6~8억 명에 이르고 우리나라 40대 사망원인 1위가 간질환일 정도로 사태는 심각하다. 그러나, 현재 시판되고 있는 의약품으로는 간섬유화나 간경화 치료 효과가 낮아 국내외에서 개발에 부단히 노력하고 있으나, 아직까지 그 결과가 미흡한 실정이다. On the other hand, alcohol can cause liver damage, which is called alcoholic fatty liver. Currently, the number of chronic liver disease patients in the world reaches about 600 ~ 800 million, and the first cause of death in Korea is the liver disease. However, the currently marketed medicines are not effective in treating liver fibrosis or cirrhosis, and have been making efforts to develop them at home and abroad. However, the results are still insufficient.
한편, 참깨(Sesamum indicum)는 쌍떡잎 식물로, 호마(胡麻)·지마(芝麻)·향마(香麻)라고도 불린다. 참깨의 열매는 삭과로 원기둥 모양이며, 80개 정도의 종자가 들어 있다. 참깨 종자에는 45∼55%의 기름, 36% 단백질이 함유되어 있다. 참깨 종자는 각종 식품과 조미료로 이용되는데, 우리나라를 포함한 아시아 지역에서 특히 많이 사용된다. 또한, 종자에서 품질 좋은 기름을 짜내 사용하고, 기름을 짜고 남은 깻묵은 사료 및 비료로 쓰이기도 한다. On the other hand, sesame (Sesamum indicum ) is a dicotyledonous plant, also called homa, 麻麻, and 麻麻. Sesame seeds are capillary, cylindrical, and contain about 80 seeds. Sesame seeds contain 45-55% oil and 36% protein. Sesame seeds are used for various foods and seasonings, and are especially used in Asia including Korea. It also uses squeezed oil from the seeds and leaves the oil, which is then used as feed and fertilizer.
참깨에는 레시틴 성분이 풍부하게 들어있기 때문에, 기미 또는 주근깨를 예방해줄 뿐 아니라, 비타민 E가 풍부하기 때문에 항산화작용을 하여 피부가 노화되는 것을 예방해주는 효과가 있으며, 참깨에 함유된 캄슘이 뼈건강 및 치아 건강에 좋은 효능을 보인다고 알려져 있다. 또한, 참깨에는 필수지방산이 들어있어, 참깨를 꾸준하게 섭취하게 되며, 뇌기능의 활성화를 돕고, 기억력 및 집중력 등을 향상시켜주며, 치매 예방에도 좋은 효능을 나타낸다고 알려져 있다. Because sesame contains a lot of lecithin ingredient, it not only prevents spots or freckles, it also has antioxidant effect because it is rich in vitamin E, and it prevents the aging of skin. It is said that it shows good efficacy for dental health. In addition, sesame contains essential fatty acids, and it is known that it steadily consumes sesame seeds, it helps activation of brain function, improves memory and concentration, and shows good efficacy against dementia.
그러나, 현재까지는 표고균사로 생물전환된 참깨생물전환물을 포함하는 동시에, 면역증강, 당뇨개선, 중성지방 및 콜레스테롤 억제, 간 보호 효능을 모두 발휘하는 조성물은 연구된 바 없는 것으로 확인된다. However, up to now, it has been confirmed that a composition exhibiting both immunological enhancement, diabetic improvement, triglyceride and cholesterol suppression, and hepatoprotective effect, including a sesame bioconversion bioconverted into a superficial hyphae, has not been studied.
본 발명에서는 면역력 향상, 당뇨 개선, 고지혈증 개선 또는 간 보호용 효능을 발휘하는 새로운 조성물을 개발하여 제공하고자 한다.In the present invention, it is intended to develop and provide a novel composition exhibiting an immunity enhancing effect, diabetic improvement, hyperlipidemia improvement or liver protecting effect.
상기 목적을 달성하고자, 본 발명은 참깨(Sesamum indicum)를 함유하는 액상배지를 제조하는 단계 (a); 상기 단계 (a) 후, 상기 액상배지에 표고버섯 균사를 접종하고, 배양하여 발효물을 제조하는 단계 (b); 상기 단계 (b)후, 상기 발효물에 섬유소분해효소를 첨가하여 반응시키는 단계 (c); 를 포함하는 과정으로부터 제조되는 참깨생물전환물을 함유하는 것을 특징으로 하는 면역증강(增强)용 식품 또는 약학조성물을 제공한다. To achieve the above object, the present invention sesame (Sesamum indicum ), comprising the steps of: (a) preparing a liquid medium; (B) preparing a fermented product by inoculating shiitake mycelia into the liquid medium after the step (a) and culturing the same; (C) a step of adding a fibrinolytic enzyme to the fermentation product after the step (b); And a sesame bioconversion product prepared from a process comprising the steps of:
본 발명의 면역증강용 식품 또는 약학조성물에 있어서, 상기 참깨생물전환물은 바람직하게 단계 (c)후, 80~100℃에서 0.5~2시간 동안 처리하는 '효소불활성화 및 살균 단계 (d)'가 추가로 더 포함되는 과정으로부터 제조될 수 있다. 또한, 상기 '효소불활성화 및 살균단계 (d)' 후, '건조 및 분말화 단계 (e)'를 더 포함할 수 있다. In the immunoenhancing food or pharmaceutical composition of the present invention, the sesame bioconverting agent is preferably subjected to 'enzyme inactivation and sterilization step (d)' in which the step (c) is followed by treatment at 80 to 100 ° C for 0.5 to 2 hours, May be prepared from the process further comprising. Further, after the 'enzyme inactivation and sterilization step (d)', the 'drying and pulverization step (e)' may be further included.
본 발명의 면역증강용 식품 또는 약학조성물에 있어서, 상기 단계 (a)의 액상배지는 바람직하게 참깨에 아밀라아제(amylase) 또는 셀룰라아제(cellulase) 중 선택되는 하나 이상을 첨가하여, 반응시킨 후, 멸균처리하여 제조되는 것이 좋다. 이때, 상기 아밀라아제(amylase) 또는 셀룰라아제(cellulase) 효소는 바람직하게 0.1~0.5%(w/v) 첨가되고, 0.5~2시간 동안 반응시키는 것이 좋다. 상기 아밀라아제(amylase) 또는 셀룰라아제(cellulase) 효소를 처리할 경우, 참깨의 전분 및 셀룰로오스를 분해할 수 있어, 액상배지로 제조하는데에 용이하기 때문이다. In the immunoconjugation food or pharmaceutical composition of the present invention, the liquid medium of step (a) is preferably prepared by adding at least one selected from amylase or cellulase to sesame, reacting, . At this time, the amylase or cellulase enzyme is preferably added in an amount of 0.1 to 0.5% (w / v) and reacted for 0.5 to 2 hours. When the amylase or cellulase enzyme is treated, sesame starch and cellulose can be decomposed, which facilitates preparation into a liquid medium.
본 발명의 면역증강용 식품 또는 약학조성물에 있어서, 상기 단계 (b)의 표고버섯 균사는 배양을 통해 섬유소분해효소를 생성하여 외부로 배출할 수 있다. 이렇게 배출된 섬유소분해효소는 참깨를 가수분해할 수 있게 된다.In the immunoconjugation food or pharmaceutical composition of the present invention, the mushroom mycelium of step (b) may be produced by culturing the cellulolytic enzyme and discharging it to the outside. The released cellulose decomposing enzyme can hydrolyze sesame seeds.
본 발명의 면역증강용 식품 또는 약학조성물에 있어서, 상기 단계 (c)의 섬유소분해효소는 일 예로, 셀룰라아제(cellulase), 헤미셀룰라아제(hemicellulase), 펙티나아제(pectinase), 글루카나제(glucanase), 베타-글루카네이즈(β-glucanase), 베타-글루코시다아제(β-glucosidase), 리소자임(lysozyme), 비스코자임(viscozyme), 필트라제(filtrase), 라피다제(rapidase) 및 스미자임(sumizyme) 중 선택되는 하나 이상인 것일 수 있다.In the immunoconjugation food or pharmaceutical composition of the present invention, the fibrinolytic enzyme of step (c) may be, for example, a cellulase, a hemicellulase, a pectinase, a glucanase, , Beta-glucanase, beta-glucosidase, lysozyme, viscozyme, filtrase, rapidase and sumizyme ). ≪ / RTI >
본 발명의 면역증강용 식품 또는 약학조성물에 있어서, 상기 참깨생물전환물은 바람직하게 대식세포의 활성화를 통해 미생물 감염에 대한 면역력(항병력)을 지니게 한다. 상기 면역력(항변력)은 병에 대한 저항력을 뜻한다.In the immunomodulating food or pharmaceutical composition of the present invention, the sesame bioconversion preferably has immunity against microbial infection (activation) through activation of macrophages. The immunity (resistance) refers to resistance to disease.
본 발명의 면역증강용 식품 또는 약학조성물에 있어서, 상기 참깨생물전환물은, 바람직하게 다당체(polysaccharide)일 수 있다. 이때, 상기 다당체는 바람직하게 단계 (c)를 통해 수득한 참깨생물전환물에, 증류수를 첨가하여 수용성물질을 추출하는 단계 (가); 상기 수용성물질 추출 후, 원심분리를 통해 잔사를 제거하고, 추출상등액을 분리하는 단계 (나); 상기 추출상등액에, EtOH을 첨가하여 잘 섞어주고, 유지하는 단계 (다); 상기 유지 후, 생성된 침전물을 분리하는 단계 (라); 상기 분리한 침전물에, 증류수를 첨가하여 침전물을 용해시킨 후, 원심분리 또는 여과를 통해 용해되지 않은 물질을 제거하는 단계 (마); 및 상기 원심분리 또는 여과 과정을 거친 침전물용해액에 대해 투석을 수행하는 단계 (바);를 더 포함하는 과정으로부터 수득된 것일 수 있다. In the immunomodulating food or pharmaceutical composition of the present invention, the sesame bioconversion may preferably be a polysaccharide. In this case, the polysaccharide is preferably obtained by adding distilled water to the sesame bioconversion product obtained through step (c) to extract a water-soluble substance; Removing the residue through centrifugation after extracting the water-soluble substance, and separating the extracted supernatant (B); Adding EtOH to the extracted supernatant, mixing and maintaining (c); Separating the resulting precipitate after said holding (d); Adding distilled water to the separated precipitate to dissolve the precipitate, and then removing undissolved material by centrifugation or filtration; And performing dialysis against the sediment lysis solution after the centrifugation or filtration step (f).
본 발명의 면역증강용 약학조성물에 있어서, 상기 약학조성물은 바람직하게 전체조성물 대비 참깨생물전환물 0.00001~100 중량%를 포함하는 것이 좋다. 0.00001 중량% 미만일 경우에는 그 효과가 미미하기 때문이다.In the pharmaceutical composition for enhancing immunity of the present invention, the pharmaceutical composition preferably contains 0.00001 to 100% by weight of a sesame bioconversion product relative to the whole composition. When the content is less than 0.00001% by weight, the effect is insignificant.
본 발명의 면역증강용 약학조성물에 있어서, 상기 약학조성물은 유효성분 이외에 약제학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 더욱 포함할 수 있다. 사용가능한 담체, 부형제 또는 희석제로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자이리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘포스페이트, 칼슘실리케이트, 셀룰로즈, 메틸셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘스테아레이트 및 광물유가 있으며, 이중 선택되는 하나 이상을 사용할 수 있다. 또한, 상기 약학조성물이 약제인 경우, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 또는 방부제 중 선택되는 하나 이상을 추가적으로 포함할 수 있다.In the pharmaceutical composition for immunostaining according to the present invention, the pharmaceutical composition may further comprise a pharmaceutically acceptable carrier, diluent or excipient in addition to the active ingredient. Examples of usable carriers, excipients or diluents include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methylcellulose, Microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil, and one or more selected from among them may be used. When the pharmaceutical composition is a pharmaceutical, it may further include at least one selected from a filler, an anti-coagulant, a lubricant, a wetting agent, a flavoring agent, an emulsifying agent or an antiseptic agent.
본 발명의 면역증강용 약학조성물에 있어서, 상기 약학조성물의 제형은 사용방법에 따라 바람직한 형태일 수 있으며, 특히 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 채택하여 제형화 하는 것이 좋다. 구체적인 제형의 예로는 경고제(PLASTERS), 과립제(GRANULES), 로션제(LOTIONS), 리니멘트제(LINIMENTS), 리모나데제(LEMONADES), 방향수제(AROMATIC WATERS), 산제(POWDERS), 시럽제(SYRUPS), 안연고제(OPHTHALMIC OINTMENTS), 액제(LIQUIDS AND SOLUTIONS), 에어로솔제(AEROSOLS), 엑스제(EXTRACTS), 엘릭실제(ELIXIRS), 연고제(OINTMENTS), 유동엑스제(FLUIDEXTRACTS), 유제(EMULSIONS), 현탁제(SUSPENSIONS), 전제(DECOCTIONS), 침제(INFUSIONS), 점안제(OPHTHALMIC SOLUTIONS), 정제(TABLETS), 좌제(SUPPOSITORIES), 주사제(INJECTIONS), 주정제(SPIRITS), 카타플라스마제(CATAPLSMA), 캅셀제(CAPSULES), 크림제(CREAMS), 트로키제(TROCHES), 틴크제(TINCTURES), 파스타제(PASTES), 환제(PILLS), 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀 중 선택되는 어느 하나일 수 있다. In the pharmaceutical composition for enhancing immunity of the present invention, the formulation of the pharmaceutical composition may be in a desired form depending on the method of use, and may be in the form of a pharmaceutical composition, To be formulated by employing a method known in the art. Examples of specific formulations include, but are not limited to, PLASTERS, GRANULES, LOTIONS, LINIMENTS, LEMONADES, AROMATIC WATERS, POWDERS, SYRUPS, OPHTHALMIC OINTMENTS, LIQUIDS AND SOLUTIONS, AEROSOLS, EXTRACTS, ELIXIRS, OINTMENTS, FLUIDEXTRACTS, EMULSIONS, ), Suspensions, DECOCTIONS, INFUSIONS, OPHTHALMIC SOLUTIONS, TABLETS, SUPPOSITORIES, INJECTIONS, SPIRITS, CATAPLSMA, ), Capsules, CREAMS, TROCHES, TINCTURES, PASTES, PILLS, soft or hard gelatin capsules.
본 발명의 면역증강용 약학조성물에 있어서, 상기 약학조성물의 투여량은 투여방법, 복용자의 연령, 성별, 체중, 및 질환의 중증도 등을 고려하여 결정하는 것이 좋다. 일 예로, 본 발명의 상기 약학조성물은 유효성분을 기준으로 하였을 때 1일 0.00001 내지 100 ㎎/㎏(체중)으로 1회 이상 투여가능하다. 그러나 상기의 투여량은 예시하기 위한 일 예에 불과하며, 복용자의 상태에 따라 의사의 처방에 의해 변화될 수 있다.In the pharmaceutical composition for enhancing immunity of the present invention, the dosage of the pharmaceutical composition is preferably determined in consideration of the administration method, the age, sex, weight, and severity of the disease. For example, the pharmaceutical composition of the present invention can be administered at least once per day, 0.00001 to 100 mg / kg (body weight) based on the active ingredient. However, the dosage is only an example and may be changed by a doctor's prescription depending on the condition of the recipient.
본 발명의 면역증강용 식품 조성물에 있어서, 상기 식품조성물은 바람직하게 전체조성물 대비 참깨생물전환물 0.00001~100 중량%를 포함하는 것이 좋다. 0.00001 중량% 미만일 경우에는 그 효과가 미미하기 때문이다.In the food composition for immunostaining according to the present invention, the food composition preferably contains 0.00001 to 100% by weight of sesame bioconversion to the whole composition. When the content is less than 0.00001% by weight, the effect is insignificant.
본 발명의 면역증강용 식품 조성물에 있어서, 상기 식품 조성물은 일 예로, 육류, 곡류, 카페인 음료, 일반음료, 초콜렛, 빵류, 스낵류, 과자류, 사탕, 피자, 젤리, 면류, 껌류, 유제품류, 아이스크림류, 알코올성 음료, 술, 비타민 복합제 및 그 밖의 건강보조식품류 중 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.In the food composition for enhancing immunity of the present invention, the food composition may be, for example, meat, cereal, caffeinated beverages, ordinary beverages, chocolate, bread, snacks, confectionery, candy, pizza, jelly, noodles, Alcoholic beverages, alcoholic beverages, vitamin complexes, and other health supplement foods, but the present invention is not limited thereto.
한편, 본 발명은 참깨를 함유하는 액상배지를 제조하는 단계 (a); 상기 단계 (a) 후, 상기 액상배지에 표고버섯 균사를 접종하고, 배양하여 발효물을 제조하는 단계 (b); 상기 단계 (b)후, 상기 발효물에 섬유소분해효소를 첨가하여 반응시키는 단계 (c); 를 포함하는 과정으로부터 제조되는 참깨생물전환물을 함유하는 것을 특징으로 하는 '당뇨개선용 식품 조성물' 또는 '당뇨병 예방 또는 치료용 약학조성물'을 제공한다. On the other hand, the present invention relates to a process for producing a liquid medium comprising sesame (a); (B) preparing a fermented product by inoculating shiitake mycelia into the liquid medium after the step (a) and culturing the same; (C) a step of adding a fibrinolytic enzyme to the fermentation product after the step (b); A diabetic improvement food composition or a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of diabetes, which comprises a sesame bioconversion product prepared from a process comprising the steps of:
본 발명의 '당뇨개선용 식품 조성물' 또는 '당뇨병 예방 또는 치료용 약학조성물'에 있어서, 상기 참깨생물전환물은 단계 (c)후, 80~100℃에서 0.5~2시간 동안 처리하는 '효소불활성화 및 살균 단계 (d)'가 추가로 더 포함되는 과정으로부터 제조될 수 있다. 또한, 상기 '효소불활성화 및 살균단계 (d)' 후, '건조 및 분말화 단계 (e)'를 더 포함할 수 있다.In the 'diabetic food composition for improvement of diabetes mellitus' or 'pharmaceutical composition for the prevention or treatment of diabetes' of the present invention, the sesame bioconversion product may be prepared by mixing the enzymatic fire Activation and sterilization step (d) 'are further included. Further, after the 'enzyme inactivation and sterilization step (d)', the 'drying and pulverization step (e)' may be further included.
본 발명의 '당뇨개선용 식품 조성물' 또는 '당뇨병 예방 또는 치료용 약학조성물'에 있어서, 상기 단계 (a)의 액상배지는 바람직하게 참깨에 아밀라아제(amylase) 또는 셀룰라아제(cellulase) 중 선택되는 하나 이상을 첨가하여, 반응시킨 후, 멸균처리하여 제조되는 것이 좋다. 이때, 상기 아밀라아제(amylase) 또는 셀룰라아제(cellulase) 효소는 바람직하게 0.1~0.5%(w/v) 첨가되고, 0.5~2시간 동안 반응시키는 것이 좋다. 상기 아밀라아제(amylase) 또는 셀룰라아제(cellulase) 효소를 처리할 경우, 참깨의 전분 및 셀룰로오스를 분해할 수 있어, 액상배지로 제조하는데에 용이하기 때문이다. In the 'diabetic food composition for improving diabetes' or the 'pharmaceutical composition for the prevention or treatment of diabetes' of the present invention, the liquid medium of step (a) is preferably at least one selected from the group consisting of amylase or cellulase And then sterilization treatment is carried out. At this time, the amylase or cellulase enzyme is preferably added in an amount of 0.1 to 0.5% (w / v) and reacted for 0.5 to 2 hours. When the amylase or cellulase enzyme is treated, sesame starch and cellulose can be decomposed, which facilitates preparation into a liquid medium.
본 발명의 '당뇨개선용 식품 조성물' 또는 '당뇨병 예방 또는 치료용 약학조성물'에 있어서, 상기 단계 (b)의 표고버섯 균사는 배양을 통해 섬유소분해효소를 생성하여 외부로 배출할 수 있다. 이렇게 배출된 섬유소분해효소는 참깨를 가수분해할 수 있게 된다.In the 'diabetic food composition for improving diabetes' or the 'pharmaceutical composition for the prevention or treatment of diabetes' of the present invention, the mushroom mycelium of step (b) may be produced by culturing and then releasing the cellulolytic enzyme to the outside. The released cellulose decomposing enzyme can hydrolyze sesame seeds.
본 발명의 '당뇨개선용 식품 조성물' 또는 '당뇨병 예방 또는 치료용 약학조성물'에 있어서, 상기 단계 (c)의 섬유소분해효소는 일 예로, 셀룰라아제(cellulase), 헤미셀룰라아제(hemicellulase), 펙티나아제(pectinase), 글루카나제(glucanase), 베타-글루카네이즈(β-glucanase), 베타-글루코시다아제(β-glucosidase), 리소자임(lysozyme), 비스코자임(viscozyme), 필트라제(filtrase), 라피다제(rapidase) 및 스미자임(sumizyme) 중 선택되는 하나 이상인 것일 수 있다. In the 'diabetic food composition for improving diabetes' or the 'pharmaceutical composition for the prevention or treatment of diabetes' of the present invention, the fibrotic enzyme of step (c) includes, for example, cellulase, hemicellulase, pectinase, glucanase, beta-glucanase, beta-glucosidase, lysozyme, viscozyme, filtrase, Rapidase and Sumizyme may be used.
본 발명의 '당뇨개선용 식품 조성물' 또는 '당뇨병 예방 또는 치료용 약학조성물'에 있어서, 상기 참깨생물전환물은 바람직하게 당뇨로부터 발생하는 간 손상 또는 췌장의 랑게르한스섬 손상을 개선할 수 있다. In the 'diabetic food composition for improving diabetes' or 'the pharmaceutical composition for preventing or treating diabetes' of the present invention, the sesame bioconversion can improve liver damage or damage of the pancreas to Langerhans is caused by diabetes mellitus.
본 발명의 '당뇨개선용 식품 조성물' 또는 '당뇨병 예방 또는 치료용 약학조성물'에 있어서, 상기 참깨생물전환물은, 바람직하게 다당체(polysaccharide)일 수 있다. 이때, 상기 다당체는 바람직하게 단계 (c)를 통해 수득한 참깨생물전환물에, 증류수를 첨가하여 수용성물질을 추출하는 단계 (가); 상기 수용성물질 추출 후, 원심분리를 통해 잔사를 제거하고, 추출상등액을 분리하는 단계 (나); 상기 추출상등액에, EtOH을 첨가하여 잘 섞어주고, 유지하는 단계 (다); 상기 유지 후, 생성된 침전물을 분리하는 단계 (라); 상기 분리한 침전물에, 증류수를 첨가하여 침전물을 용해시킨 후, 원심분리 또는 여과를 통해 용해되지 않은 물질을 제거하는 단계 (마); 및 상기 원심분리 또는 여과 과정을 거친 침전물용해액에 대해 투석을 수행하는 단계 (바);를 더 포함하는 과정으로부터 수득된 것일 수 있다. In the 'diabetic food composition for improving diabetes' or the 'pharmaceutical composition for the prevention or treatment of diabetes' of the present invention, the sesame bioconversion may preferably be a polysaccharide. In this case, the polysaccharide is preferably obtained by adding distilled water to the sesame bioconversion product obtained through step (c) to extract a water-soluble substance; Removing the residue through centrifugation after extracting the water-soluble substance, and separating the extracted supernatant (B); Adding EtOH to the extracted supernatant, mixing and maintaining (c); Separating the resulting precipitate after said holding (d); Adding distilled water to the separated precipitate to dissolve the precipitate, and then removing undissolved material by centrifugation or filtration; And performing dialysis against the sediment lysis solution after the centrifugation or filtration step (f).
본 발명의 당뇨병 예방 또는 치료용 약학조성물에 있어서, 상기 약학조성물은 바람직하게 전체조성물 대비 참깨생물전환물 0.00001~100 중량%를 포함하는 것이 좋다. 0.00001 중량% 미만일 경우에는 그 효과가 미미하기 때문이다.In the pharmaceutical composition for preventing or treating diabetes according to the present invention, the pharmaceutical composition preferably contains 0.00001 to 100% by weight of a sesame bioconversion product relative to the whole composition. When the content is less than 0.00001% by weight, the effect is insignificant.
본 발명의 당뇨병 예방 또는 치료용 약학조성물에 있어서, 상기 약학조성물은 유효성분 이외에 약제학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 더욱 포함할 수 있다. 사용가능한 담체, 부형제 또는 희석제로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자이리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘포스페이트, 칼슘실리케이트, 셀룰로즈, 메틸셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘스테아레이트 및 광물유가 있으며, 이중 선택되는 하나 이상을 사용할 수 있다. 또한, 상기 약학조성물이 약제인 경우, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 또는 방부제 중 선택되는 하나 이상을 추가적으로 포함할 수 있다.In the pharmaceutical composition for preventing or treating diabetes according to the present invention, the pharmaceutical composition may further comprise a pharmaceutically acceptable carrier, diluent or excipient in addition to the active ingredient. Examples of usable carriers, excipients or diluents include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methylcellulose, Microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil, and one or more selected from among them may be used. When the pharmaceutical composition is a pharmaceutical, it may further include at least one selected from a filler, an anti-coagulant, a lubricant, a wetting agent, a flavoring agent, an emulsifying agent or an antiseptic agent.
본 발명의 당뇨병 예방 또는 치료용 약학조성물에 있어서, 상기 약학조성물의 제형은 사용방법에 따라 바람직한 형태일 수 있으며, 특히 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 채택하여 제형화 하는 것이 좋다. 구체적인 제형의 예로는 경고제(PLASTERS), 과립제(GRANULES), 로션제(LOTIONS), 리니멘트제(LINIMENTS), 리모나데제(LEMONADES), 방향수제(AROMATIC WATERS), 산제(POWDERS), 시럽제(SYRUPS), 안연고제(OPHTHALMIC OINTMENTS), 액제(LIQUIDS AND SOLUTIONS), 에어로솔제(AEROSOLS), 엑스제(EXTRACTS), 엘릭실제(ELIXIRS), 연고제(OINTMENTS), 유동엑스제(FLUIDEXTRACTS), 유제(EMULSIONS), 현탁제(SUSPENSIONS), 전제(DECOCTIONS), 침제(INFUSIONS), 점안제(OPHTHALMIC SOLUTIONS), 정제(TABLETS), 좌제(SUPPOSITORIES), 주사제(INJECTIONS), 주정제(SPIRITS), 카타플라스마제(CATAPLSMA), 캅셀제(CAPSULES), 크림제(CREAMS), 트로키제(TROCHES), 틴크제(TINCTURES), 파스타제(PASTES), 환제(PILLS), 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀 중 선택되는 어느 하나일 수 있다. In the pharmaceutical composition for the prevention or treatment of diabetes according to the present invention, the formulation of the pharmaceutical composition may be in a desired form depending on the method of use, and in particular, may be formulated so as to provide rapid, sustained or delayed release of the active ingredient It is preferable to employ a method known in the art to formulate it. Examples of specific formulations include, but are not limited to, PLASTERS, GRANULES, LOTIONS, LINIMENTS, LEMONADES, AROMATIC WATERS, POWDERS, SYRUPS, OPHTHALMIC OINTMENTS, LIQUIDS AND SOLUTIONS, AEROSOLS, EXTRACTS, ELIXIRS, OINTMENTS, FLUIDEXTRACTS, EMULSIONS, ), Suspensions, DECOCTIONS, INFUSIONS, OPHTHALMIC SOLUTIONS, TABLETS, SUPPOSITORIES, INJECTIONS, SPIRITS, CATAPLSMA, ), Capsules, CREAMS, TROCHES, TINCTURES, PASTES, PILLS, soft or hard gelatin capsules.
본 발명의 당뇨병 예방 또는 치료용 약학조성물에 있어서, 상기 약학조성물의 투여량은 투여방법, 복용자의 연령, 성별, 체중, 및 질환의 중증도 등을 고려하여 결정하는 것이 좋다. 일 예로, 본 발명의 상기 약학조성물은 유효성분을 기준으로 하였을 때 1일 0.00001 내지 100 ㎎/㎏(체중)으로 1회 이상 투여가능하다. 그러나 상기의 투여량은 예시하기 위한 일 예에 불과하며, 복용자의 상태에 따라 의사의 처방에 의해 변화될 수 있다.In the pharmaceutical composition for preventing or treating diabetes according to the present invention, the dose of the pharmaceutical composition is preferably determined in consideration of the administration method, the age, sex, weight, and severity of the disease. For example, the pharmaceutical composition of the present invention can be administered at least once per day, 0.00001 to 100 mg / kg (body weight) based on the active ingredient. However, the dosage is only an example and may be changed by a doctor's prescription depending on the condition of the recipient.
본 발명의 당뇨개선용 식품 조성물에 있어서, 상기 식품 조성물은 바람직하게 전체조성물 대비 참깨생물전환물 0.00001~100 중량%를 포함하는 것이 좋다. 0.00001 중량% 미만일 경우에는 그 효과가 미미하기 때문이다.In the food composition for improving diabetes mellitus of the present invention, the food composition preferably contains 0.00001 to 100% by weight of sesame bioconversion to the whole composition. When the content is less than 0.00001% by weight, the effect is insignificant.
본 발명의 당뇨개선용 식품 조성물에 있어서, 상기 식품조성물은 일 예로, 육류, 곡류, 카페인 음료, 일반음료, 초콜렛, 빵류, 스낵류, 과자류, 사탕, 피자, 젤리, 면류, 껌류, 유제품류, 아이스크림류, 알코올성 음료, 술, 비타민 복합제 및 그 밖의 건강보조식품류 중 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.In the food composition for improving diabetes mellitus of the present invention, the food composition may be at least one selected from the group consisting of meat, cereal, caffeinated beverages, general beverages, chocolate, bread, snacks, confectionery, candy, pizza, jelly, Alcoholic beverages, alcoholic beverages, vitamin complexes, and other health supplement foods, but the present invention is not limited thereto.
또한, 본 발명은 참깨를 함유하는 액상배지를 제조하는 단계 (a); 상기 단계 (a) 후, 상기 액상배지에 표고버섯 균사를 접종하고, 배양하여 발효물을 제조하는 단계 (b); 상기 단계 (b)후, 상기 발효물에 섬유소분해효소를 첨가하여 반응시키는 단계 (c); 를 포함하는 과정으로부터 제조되는 참깨생물전환물을 함유하는 것을 특징으로 하는 '고지혈증 개선용 식품 조성물' 또는 '고지혈증 예방 또는 치료용 약학조성물'을 제공한다. 이때, 상기 고지혈증은 바람직하게 '당뇨'로 인한 것일 수 있다. 본 발명에서 상기 '고지혈증'이라 함은 체내의 중성지방 수치가 높아져 발생하는 고지혈증을 포함하는 의미이다. 즉, 본 발명의 고지혈증은 체내 중성지방 함량이 높아져 발생하는 질환을 포함하는 개념으로서, 고중성지방혈증을 포함하는 개념이다.The present invention also relates to a process for producing a liquid medium comprising (a) preparing a liquid medium containing sesame seeds, (B) preparing a fermented product by inoculating shiitake mycelia into the liquid medium after the step (a) and culturing the same; (C) a step of adding a fibrinolytic enzyme to the fermentation product after the step (b); Or a sesame bioconversion product produced from a process comprising the steps of: (a) adding a sesame bioconversion product prepared by a process comprising the steps of: At this time, the hyperlipemia may be preferably caused by 'diabetes'. In the present invention, the term 'hyperlipidemia' is meant to include hyperlipidemia caused by a rise in triglyceride levels in the body. That is, the hyperlipemia of the present invention is a concept including a disease caused by an increase in the content of triglycerides in the body, including the concept of hypertriglyceridemia.
본 발명의 '고지혈증 개선용 식품 조성물' 또는 '고지혈증 예방 또는 치료용 약학조성물'에 있어서, 상기 참깨생물전환물은 단계 (c)후, 80~100℃에서 0.5~2시간 동안 처리하는 '효소불활성화 및 살균 단계 (d)'가 추가로 더 포함되는 과정으로부터 제조될 수 있다. 또한, 상기 '효소불활성화 및 살균단계 (d)' 후, '건조 및 분말화 단계 (e)'를 더 포함할 수 있다. In the 'food composition for improving hyperlipidemia' or 'pharmaceutical composition for the prevention or treatment of hyperlipidemia' according to the present invention, the sesame bioconversion product may be prepared by mixing the enzymatic fire, which is treated at 80 to 100 ° C for 0.5 to 2 hours, Activation and sterilization step (d) 'are further included. Further, after the 'enzyme inactivation and sterilization step (d)', the 'drying and pulverization step (e)' may be further included.
본 발명의 '고지혈증 개선용 식품 조성물' 또는 '고지혈증 예방 또는 치료용 약학조성물'에 있어서, 상기 단계 (a)의 액상배지는 바람직하게 참깨에 아밀라아제(amylase) 또는 셀룰라아제(cellulase) 중 선택되는 하나 이상을 첨가하여, 반응시킨 후, 멸균처리하여 제조되는 것이 좋다. 이때, 상기 아밀라아제(amylase) 또는 셀룰라아제(cellulase) 효소는 바람직하게 0.1~0.5%(w/v) 첨가되고, 0.5~2시간 동안 반응시키는 것이 좋다. 상기 아밀라아제(amylase) 또는 셀룰라아제(cellulase) 효소를 처리할 경우, 참깨의 전분 및 셀룰로오스를 분해할 수 있어, 액상배지로 제조하는데에 용이하기 때문이다. In the 'food composition for improving hyperlipidemia' or the 'pharmaceutical composition for the prevention or treatment of hyperlipidemia' according to the present invention, the liquid medium of step (a) is preferably at least one selected from the group consisting of amylase or cellulase And then sterilization treatment is carried out. At this time, the amylase or cellulase enzyme is preferably added in an amount of 0.1 to 0.5% (w / v) and reacted for 0.5 to 2 hours. When the amylase or cellulase enzyme is treated, sesame starch and cellulose can be decomposed, which facilitates preparation into a liquid medium.
본 발명의 '고지혈증 개선용 식품 조성물' 또는 '고지혈증 예방 또는 치료용 약학조성물'에 있어서, 상기 단계 (b)의 표고버섯 균사는 배양을 통해 섬유소분해효소를 생성하여 외부로 배출할 수 있다. 이렇게 배출된 섬유소분해효소는 참깨를 가수분해할 수 있게 된다.In the 'food composition for the improvement of hyperlipemia' or 'the pharmaceutical composition for the prevention or treatment of hyperlipidemia' according to the present invention, the mushroom mycelium of step (b) may be cultured to produce a fibrolysis enzyme and be discharged to the outside. The released cellulose decomposing enzyme can hydrolyze sesame seeds.
본 발명의 '고지혈증 개선용 식품 조성물' 또는 '고지혈증 예방 또는 치료용 약학조성물'에 있어서, 상기 단계 (c)의 섬유소분해효소는 일 예로, 셀룰라아제(cellulase), 헤미셀룰라아제(hemicellulase), 펙티나아제(pectinase), 글루카나제(glucanase), 베타-글루카네이즈(β-glucanase), 베타-글루코시다아제(β-glucosidase), 리소자임(lysozyme), 비스코자임(viscozyme), 필트라제(filtrase), 라피다제(rapidase) 및 스미자임(sumizyme) 중 선택되는 하나 이상인 것일 수 있다. In the 'food composition for improving hyperlipidemia' or the 'pharmaceutical composition for the prevention or treatment of hyperlipidemia' according to the present invention, the fibrotic enzymes of step (c) include, for example, cellulase, hemicellulase, pectinase, glucanase, beta-glucanase, beta-glucosidase, lysozyme, viscozyme, filtrase, Rapidase and Sumizyme may be used.
본 발명의 '고지혈증 개선용 식품 조성물' 또는 '고지혈증 예방 또는 치료용 약학조성물'에 있어서, 상기 참깨생물전환물은 중성지방 및 저밀도 콜레스테롤(LDL-cholesterol)의 생성을 억제하고, 고밀도 콜레스테롤(HDL-cholesterol)의 생성을 증가시킬 수 있다. In the 'food composition for improving hyperlipidemia' or the 'pharmaceutical composition for the prevention or treatment of hyperlipidemia' according to the present invention, the sesame bioconversion inhibits the production of triglyceride and LDL-cholesterol and the production of high-density cholesterol (HDL- cholesterol. < / RTI >
본 발명의 '고지혈증 개선용 식품 조성물' 또는 '고지혈증 예방 또는 치료용 약학조성물'에 있어서, 상기 참깨생물전환물은, 바람직하게 다당체(polysaccharide)인 것일 수 있다. 이때, 상기 다당체는 바람직하게 단계 (c)를 통해 수득한 참깨생물전환물에, 증류수를 첨가하여 수용성물질을 추출하는 단계 (가); 상기 수용성물질 추출 후, 원심분리를 통해 잔사를 제거하고, 추출상등액을 분리하는 단계 (나); 상기 추출상등액에, EtOH을 첨가하여 잘 섞어주고, 유지하는 단계 (다); 상기 유지 후, 생성된 침전물을 분리하는 단계 (라); 상기 분리한 침전물에, 증류수를 첨가하여 침전물을 용해시킨 후, 원심분리 또는 여과를 통해 용해되지 않은 물질을 제거하는 단계 (마); 및 상기 원심분리 또는 여과 과정을 거친 침전물용해액에 대해 투석을 수행하는 단계 (바);를 더 포함하는 과정으로부터 수득된 것일 수 있다. In the 'food composition for improving hyperlipemia' or the 'pharmaceutical composition for the prevention or treatment of hyperlipidemia' according to the present invention, the sesame bioconversion may preferably be a polysaccharide. In this case, the polysaccharide is preferably obtained by adding distilled water to the sesame bioconversion product obtained through step (c) to extract a water-soluble substance; Removing the residue through centrifugation after extracting the water-soluble substance, and separating the extracted supernatant (B); Adding EtOH to the extracted supernatant, mixing and maintaining (c); Separating the resulting precipitate after said holding (d); Adding distilled water to the separated precipitate to dissolve the precipitate, and then removing undissolved material by centrifugation or filtration; And performing dialysis against the sediment lysis solution after the centrifugation or filtration step (f).
한편, 본 발명의 고지혈증 예방 또는 치료용 약학조성물에 있어서, 상기 약학조성물은 바람직하게 전체조성물 대비 참깨생물전환물 0.00001~100 중량%를 포함하는 것이 좋다. 0.00001 중량% 미만일 경우에는 그 효과가 미미하기 때문이다.Meanwhile, in the pharmaceutical composition for preventing or treating hyperlipidemia of the present invention, the pharmaceutical composition preferably contains 0.00001 to 100% by weight of sesame bioconversion to the whole composition. When the content is less than 0.00001% by weight, the effect is insignificant.
본 발명의 고지혈증 예방 또는 치료용 약학조성물에 있어서, 상기 약학조성물은 유효성분 이외에 약제학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 더욱 포함할 수 있다. 사용가능한 담체, 부형제 또는 희석제로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자이리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘포스페이트, 칼슘실리케이트, 셀룰로즈, 메틸셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘스테아레이트 및 광물유가 있으며, 이중 선택되는 하나 이상을 사용할 수 있다. 또한, 상기 약학조성물이 약제인 경우, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 또는 방부제 중 선택되는 하나 이상을 추가적으로 포함할 수 있다.In the pharmaceutical composition for preventing or treating hyperlipidemia of the present invention, the pharmaceutical composition may further comprise a pharmaceutically acceptable carrier, diluent or excipient in addition to the active ingredient. Examples of usable carriers, excipients or diluents include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methylcellulose, Microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil, and one or more selected from among them may be used. When the pharmaceutical composition is a pharmaceutical, it may further include at least one selected from a filler, an anti-coagulant, a lubricant, a wetting agent, a flavoring agent, an emulsifying agent or an antiseptic agent.
본 발명의 고지혈증 예방 또는 치료용 약학조성물에 있어서, 상기 약학조성물의 제형은 사용방법에 따라 바람직한 형태일 수 있으며, 특히 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 채택하여 제형화 하는 것이 좋다. 구체적인 제형의 예로는 경고제(PLASTERS), 과립제(GRANULES), 로션제(LOTIONS), 리니멘트제(LINIMENTS), 리모나데제(LEMONADES), 방향수제(AROMATIC WATERS), 산제(POWDERS), 시럽제(SYRUPS), 안연고제(OPHTHALMIC OINTMENTS), 액제(LIQUIDS AND SOLUTIONS), 에어로솔제(AEROSOLS), 엑스제(EXTRACTS), 엘릭실제(ELIXIRS), 연고제(OINTMENTS), 유동엑스제(FLUIDEXTRACTS), 유제(EMULSIONS), 현탁제(SUSPENSIONS), 전제(DECOCTIONS), 침제(INFUSIONS), 점안제(OPHTHALMIC SOLUTIONS), 정제(TABLETS), 좌제(SUPPOSITORIES), 주사제(INJECTIONS), 주정제(SPIRITS), 카타플라스마제(CATAPLSMA), 캅셀제(CAPSULES), 크림제(CREAMS), 트로키제(TROCHES), 틴크제(TINCTURES), 파스타제(PASTES), 환제(PILLS), 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀 중 선택되는 어느 하나일 수 있다. In the pharmaceutical composition for the prevention or treatment of hyperlipidemia according to the present invention, the formulation of the pharmaceutical composition may be in a desired form depending on the method of use, and in particular, may be formulated so as to provide rapid, sustained or delayed release of the active ingredient It is preferable to employ a method known in the art to formulate it. Examples of specific formulations include, but are not limited to, PLASTERS, GRANULES, LOTIONS, LINIMENTS, LEMONADES, AROMATIC WATERS, POWDERS, SYRUPS, OPHTHALMIC OINTMENTS, LIQUIDS AND SOLUTIONS, AEROSOLS, EXTRACTS, ELIXIRS, OINTMENTS, FLUIDEXTRACTS, EMULSIONS, ), Suspensions, DECOCTIONS, INFUSIONS, OPHTHALMIC SOLUTIONS, TABLETS, SUPPOSITORIES, INJECTIONS, SPIRITS, CATAPLSMA, ), Capsules, CREAMS, TROCHES, TINCTURES, PASTES, PILLS, soft or hard gelatin capsules.
본 발명의 고지혈증 예방 또는 치료용 약학조성물에 있어서, 상기 약학조성물의 투여량은 투여방법, 복용자의 연령, 성별, 체중, 및 질환의 중증도 등을 고려하여 결정하는 것이 좋다. 일 예로, 본 발명의 상기 약학조성물은 유효성분을 기준으로 하였을 때 1일 0.00001 내지 100 ㎎/㎏(체중)으로 1회 이상 투여가능하다. 그러나 상기의 투여량은 예시하기 위한 일 예에 불과하며, 복용자의 상태에 따라 의사의 처방에 의해 변화될 수 있다.In the pharmaceutical composition for preventing or treating hyperlipidemia of the present invention, the dose of the pharmaceutical composition is preferably determined in consideration of the administration method, the age, sex, weight, and severity of the disease. For example, the pharmaceutical composition of the present invention can be administered at least once per day, 0.00001 to 100 mg / kg (body weight) based on the active ingredient. However, the dosage is only an example and may be changed by a doctor's prescription depending on the condition of the recipient.
한편, 본 발명의 고지혈증 개선용 식품 조성물에 있어서, 상기 식품 조성물은 바람직하게 전체조성물 대비 참깨생물전환물 0.00001~100 중량%를 포함하는 것이 좋다. 0.00001 중량% 미만일 경우에는 그 효과가 미미하기 때문이다.On the other hand, in the food composition for improving hyperlipemia of the present invention, the food composition preferably contains 0.00001 to 100% by weight of sesame bioconversion to the whole composition. When the content is less than 0.00001% by weight, the effect is insignificant.
본 발명의 고지혈증 개선용 식품 조성물에 있어서, 상기 식품조성물은 일 예로, 육류, 곡류, 카페인 음료, 일반음료, 초콜렛, 빵류, 스낵류, 과자류, 사탕, 피자, 젤리, 면류, 껌류, 유제품류, 아이스크림류, 알코올성 음료, 술, 비타민 복합제 및 그 밖의 건강보조식품류 중 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.In the food composition for improving hyperlipidemia according to the present invention, the food composition may be at least one selected from the group consisting of meat, cereal, caffeinated beverages, ordinary beverages, chocolate, bread, snacks, confectionery, candy, pizza, jelly, noodles, Alcoholic beverages, alcoholic beverages, vitamin complexes, and other health supplement foods, but the present invention is not limited thereto.
한편, 본 발명은 참깨를 함유하는 액상배지를 제조하는 단계 (a); 상기 단계 (a) 후, 상기 액상배지에 표고버섯 균사를 접종하고, 배양하여 발효물을 제조하는 단계 (b); 상기 단계 (b)후, 상기 발효물에 섬유소분해효소를 첨가하여 반응시키는 단계 (c); 를 포함하는 과정으로부터 제조되는 참깨생물전환물을 함유하는 것을 특징으로 하는 '간 보호용 식품 조성물' 또는 '간질환 예방 또는 치료용 약학조성물'을 제공한다.On the other hand, the present invention relates to a process for producing a liquid medium comprising sesame (a); (B) preparing a fermented product by inoculating shiitake mycelia into the liquid medium after the step (a) and culturing the same; (C) a step of adding a fibrinolytic enzyme to the fermentation product after the step (b); Or a sesame bioconversion product produced from a process comprising the steps of: (a) providing a liver-protecting composition for preventing or treating liver disease;
본 발명의 '간 보호용 식품 조성물' 또는 '간질환 예방 또는 치료용 약학조성물'에 있어서, 상기 참깨생물전환물은 단계 (c)후, 80~100℃에서 0.5~2시간 동안 처리하는 '효소불활성화 및 살균 단계 (d)'가 추가로 더 포함되는 과정으로부터 제조될 수 있다. 또한, 상기 '효소불활성화 및 살균단계 (d)' 후, '건조 및 분말화 단계 (e)'를 더 포함할 수 있다. In the 'liver protection food composition' or the 'pharmaceutical composition for preventing or treating liver disease' of the present invention, the sesame bioconversion product may be treated with an enzyme fire which is treated at 80 to 100 ° C for 0.5 to 2 hours after step (c) Activation and sterilization step (d) 'are further included. Further, after the 'enzyme inactivation and sterilization step (d)', the 'drying and pulverization step (e)' may be further included.
본 발명의 '간 보호용 식품 조성물' 또는 '간질환 예방 또는 치료용 약학조성물'에 있어서, 상기 단계 (a)의 액상배지는 바람직하게 참깨에 아밀라아제(amylase) 또는 셀룰라아제(cellulase) 중 선택되는 하나 이상을 첨가하여, 반응시킨 후, 멸균처리하여 제조되는 것이 좋다. 이때, 상기 아밀라아제(amylase) 또는 셀룰라아제(cellulase) 효소는 바람직하게 0.1~0.5%(w/v) 첨가되고, 0.5~2시간 동안 반응시키는 것이 좋다. 상기 아밀라아제(amylase) 또는 셀룰라아제(cellulase) 효소를 처리할 경우, 참깨의 전분 및 셀룰로오스를 분해할 수 있어, 액상배지로 제조하는데에 용이하기 때문이다. In the 'liver protecting food composition' or the 'pharmaceutical composition for preventing or treating liver disease' according to the present invention, the liquid medium of step (a) is preferably at least one selected from the group consisting of amylase or cellulase And then sterilization treatment is carried out. At this time, the amylase or cellulase enzyme is preferably added in an amount of 0.1 to 0.5% (w / v) and reacted for 0.5 to 2 hours. When the amylase or cellulase enzyme is treated, sesame starch and cellulose can be decomposed, which facilitates preparation into a liquid medium.
본 발명의 '간 보호용 식품 조성물' 또는 '간질환 예방 또는 치료용 약학조성물'에 있어서, 상기 단계 (b)의 표고버섯 균사는 배양을 통해 섬유소분해효소를 생성하여 외부로 배출할 수 있다. 이렇게 배출된 섬유소분해효소는 참깨를 가수분해할 수 있게 된다.In the 'liver protecting food composition' or the 'pharmaceutical composition for preventing or treating liver disease' of the present invention, the mushroom mycelium of step (b) may be produced through the cultivation to produce a cellulolytic enzyme and be discharged to the outside. The released cellulose decomposing enzyme can hydrolyze sesame seeds.
본 발명의 '간 보호용 식품 조성물' 또는 '간질환 예방 또는 치료용 약학조성물'에 있어서, 상기 단계 (c)의 섬유소분해효소는 일 예로, 셀룰라아제(cellulase), 헤미셀룰라아제(hemicellulase), 펙티나아제(pectinase), 글루카나제(glucanase), 베타-글루카네이즈(β-glucanase), 베타-글루코시다아제(β-glucosidase), 리소자임(lysozyme), 비스코자임(viscozyme), 필트라제(filtrase), 라피다제(rapidase) 및 스미자임(sumizyme) 중 선택되는 하나 이상인 것일 수 있다. In the 'liver protecting food composition' or the 'pharmaceutical composition for the prevention or treatment of liver disease' of the present invention, the fibrinolytic enzyme of step (c) includes, for example, cellulase, hemicellulase, pectinase, glucanase, beta-glucanase, beta-glucosidase, lysozyme, viscozyme, filtrase, Rapidase and Sumizyme may be used.
본 발명의 '간 보호용 식품 조성물' 또는 '간질환 예방 또는 치료용 약학조성물'에 있어서, 상기 참깨생물전환물은 바람직하게 알코올로 인해 발현되는 알코올성 지방간 또는 알코올성 지방간염을 억제할 수 있다. In the 'liver protecting food composition' or the 'pharmaceutical composition for preventing or treating liver disease' of the present invention, the sesame bioconduct may preferably inhibit alcoholic fatty liver or alcoholic fatty liver hepatitis expressed by alcohol.
본 발명의 '간 보호용 식품 조성물' 또는 '간질환 예방 또는 치료용 약학조성물'에 있어서, 상기 참깨생물전환물은 바람직하게 다당체(polysaccharide)인 것일 수 있다. 이때, 상기 다당체는 바람직하게 단계 (c)를 통해 수득한 참깨생물전환물에, 증류수를 첨가하여 수용성물질을 추출하는 단계 (가); 상기 수용성물질 추출 후, 원심분리를 통해 잔사를 제거하고, 추출상등액을 분리하는 단계 (나); 상기 추출상등액에, EtOH을 첨가하여 잘 섞어주고, 유지하는 단계 (다); 상기 유지 후, 생성된 침전물을 분리하는 단계 (라); 상기 분리한 침전물에, 증류수를 첨가하여 침전물을 용해시킨 후, 원심분리 또는 여과를 통해 용해되지 않은 물질을 제거하는 단계 (마); 및 상기 원심분리 또는 여과 과정을 거친 침전물용해액에 대해 투석을 수행하는 단계 (바);를 더 포함하는 과정으로부터 수득된 것일 수 있다. In the 'liver protecting food composition' or the 'pharmaceutical composition for the prevention or treatment of liver disease' of the present invention, the sesame bioconversion may preferably be a polysaccharide. In this case, the polysaccharide is preferably obtained by adding distilled water to the sesame bioconversion product obtained through step (c) to extract a water-soluble substance; Removing the residue through centrifugation after extracting the water-soluble substance, and separating the extracted supernatant (B); Adding EtOH to the extracted supernatant, mixing and maintaining (c); Separating the resulting precipitate after said holding (d); Adding distilled water to the separated precipitate to dissolve the precipitate, and then removing undissolved material by centrifugation or filtration; And performing dialysis against the sediment lysis solution after the centrifugation or filtration step (f).
한편, 본 발명의 간질환 예방 또는 치료용 약학조성물에 있어서, 상기 약학조성물은 바람직하게 전체조성물 대비 참깨생물전환물 0.00001~100 중량%를 포함하는 것이 좋다. 0.00001 중량% 미만일 경우에는 그 효과가 미미하기 때문이다.In the pharmaceutical composition for preventing or treating liver diseases according to the present invention, the pharmaceutical composition preferably contains 0.00001 to 100% by weight of a sesame bioconversion product relative to the whole composition. When the content is less than 0.00001% by weight, the effect is insignificant.
본 발명의 간질환 예방 또는 치료용 약학조성물에 있어서, 상기 약학조성물은 유효성분 이외에 약제학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 더욱 포함할 수 있다. 사용가능한 담체, 부형제 또는 희석제로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자이리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘포스페이트, 칼슘실리케이트, 셀룰로즈, 메틸셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘스테아레이트 및 광물유가 있으며, 이중 선택되는 하나 이상을 사용할 수 있다. 또한, 상기 약학조성물이 약제인 경우, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 또는 방부제 중 선택되는 하나 이상을 추가적으로 포함할 수 있다.In the pharmaceutical composition for preventing or treating liver disease according to the present invention, the pharmaceutical composition may further comprise a pharmaceutically acceptable carrier, diluent or excipient in addition to the active ingredient. Examples of usable carriers, excipients or diluents include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methylcellulose, Microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil, and one or more selected from among them may be used. When the pharmaceutical composition is a pharmaceutical, it may further include at least one selected from a filler, an anti-coagulant, a lubricant, a wetting agent, a flavoring agent, an emulsifying agent or an antiseptic agent.
본 발명의 간질환 예방 또는 치료용 약학조성물에 있어서, 상기 약학조성물의 제형은 사용방법에 따라 바람직한 형태일 수 있으며, 특히 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 채택하여 제형화 하는 것이 좋다. 구체적인 제형의 예로는 경고제(PLASTERS), 과립제(GRANULES), 로션제(LOTIONS), 리니멘트제(LINIMENTS), 리모나데제(LEMONADES), 방향수제(AROMATIC WATERS), 산제(POWDERS), 시럽제(SYRUPS), 안연고제(OPHTHALMIC OINTMENTS), 액제(LIQUIDS AND SOLUTIONS), 에어로솔제(AEROSOLS), 엑스제(EXTRACTS), 엘릭실제(ELIXIRS), 연고제(OINTMENTS), 유동엑스제(FLUIDEXTRACTS), 유제(EMULSIONS), 현탁제(SUSPENSIONS), 전제(DECOCTIONS), 침제(INFUSIONS), 점안제(OPHTHALMIC SOLUTIONS), 정제(TABLETS), 좌제(SUPPOSITORIES), 주사제(INJECTIONS), 주정제(SPIRITS), 카타플라스마제(CATAPLSMA), 캅셀제(CAPSULES), 크림제(CREAMS), 트로키제(TROCHES), 틴크제(TINCTURES), 파스타제(PASTES), 환제(PILLS), 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀 중 선택되는 어느 하나일 수 있다. In the pharmaceutical composition for the prevention or treatment of liver disease according to the present invention, the formulation of the pharmaceutical composition may be in a desired form depending on the method of use, and can be used to provide rapid, sustained or delayed release of the active ingredient It is preferable to employ a method known in the art. Examples of specific formulations include, but are not limited to, PLASTERS, GRANULES, LOTIONS, LINIMENTS, LEMONADES, AROMATIC WATERS, POWDERS, SYRUPS, OPHTHALMIC OINTMENTS, LIQUIDS AND SOLUTIONS, AEROSOLS, EXTRACTS, ELIXIRS, OINTMENTS, FLUIDEXTRACTS, EMULSIONS, ), Suspensions, DECOCTIONS, INFUSIONS, OPHTHALMIC SOLUTIONS, TABLETS, SUPPOSITORIES, INJECTIONS, SPIRITS, CATAPLSMA, ), Capsules, CREAMS, TROCHES, TINCTURES, PASTES, PILLS, soft or hard gelatin capsules.
본 발명의 간질환 예방 또는 치료용 약학조성물에 있어서, 상기 약학조성물의 투여량은 투여방법, 복용자의 연령, 성별, 체중, 및 질환의 중증도 등을 고려하여 결정하는 것이 좋다. 일 예로, 본 발명의 상기 약학조성물은 유효성분을 기준으로 하였을 때 1일 0.00001 내지 100 ㎎/㎏(체중)으로 1회 이상 투여가능하다. 그러나 상기의 투여량은 예시하기 위한 일 예에 불과하며, 복용자의 상태에 따라 의사의 처방에 의해 변화될 수 있다.In the pharmaceutical composition for preventing or treating liver disease according to the present invention, the dose of the pharmaceutical composition is preferably determined in consideration of the administration method, the age, sex, weight, and severity of the disease. For example, the pharmaceutical composition of the present invention can be administered at least once per day, 0.00001 to 100 mg / kg (body weight) based on the active ingredient. However, the dosage is only an example and may be changed by a doctor's prescription depending on the condition of the recipient.
한편, 본 발명의 간 보호용 식품 조성물에 있어서, 상기 식품 조성물은 바람직하게 전체조성물 대비 참깨생물전환물 0.00001~100 중량%를 포함하는 것이 좋다. 0.00001 중량% 미만일 경우에는 그 효과가 미미하기 때문이다.On the other hand, in the food composition for liver protection of the present invention, the food composition preferably contains 0.00001 to 100% by weight of sesame bioconversion to the whole composition. When the content is less than 0.00001% by weight, the effect is insignificant.
본 발명의 간 보호용 식품 조성물에 있어서, 상기 식품조성물은 일 예로, 육류, 곡류, 카페인 음료, 일반음료, 초콜렛, 빵류, 스낵류, 과자류, 사탕, 피자, 젤리, 면류, 껌류, 유제품류, 아이스크림류, 알코올성 음료, 술, 비타민 복합제 및 그 밖의 건강보조식품류 중 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.In the food composition for liver protection of the present invention, the food composition may be, for example, meat, cereal, caffeinated beverages, general beverages, chocolate, bread, snacks, confectionery, candy, pizza, jelly, noodles, , An alcoholic beverage, a drink, a vitamin complex, and other health supplement foods, but the present invention is not limited thereto.
본 발명의 참깨생물전환물은 대식세포의 활성화를 통해 미생물 감염에 대한 면역력을 증가시키고, 당뇨를 개선할 수 있으며, 간 손상 또는 췌장의 랑게르한스섬 손상을 개선하고, 중성지방의 생성을 억제하는 효과를 발휘한다. 또한, 알코올로 인해 발현되는 알코올성 지방간 또는 알코올성 지방간염을 억제하는 효과를 보인다.The sesame bioconversion product of the present invention can increase immunity against microbial infection through the activation of macrophages, improve diabetes, improve liver damage or damage of the pancreas to Langerhans islet, and inhibit the production of triglycerides I will exert. It also has the effect of inhibiting alcoholic fatty liver or alcoholic fatty liver disease expressed by alcohol.
도 1은 본 발명 참깨생물전환물의 제조공정도이다.
도 2는 본 발명 참깨생물전환물의 후처리 및 회수작업 공정도이다.
도 3은 본 발명 참깨생물전환물에 의해 획기적으로 향상된 NO 생성능 및 농도의존적으로 증가하는 대식세포의 NO 생성 결과 그래프이다.
도 4는 참깨 및 본 발명 참깨생물전환물의 사이토카인(cytokine) 발현능 그래프이다.
도 5는 본 발명 참깨생물전환물의 살모넬라 항균활성을 나타낸 그래프이다.
도 6은 농도별 본 발명 참깨생물전환물이 대식세포의 살모넬라 탐식능에 미치는 효과를 나타낸 결과 그래프이다.
도 7은 농도별 본 발명 참깨생물전환물이 대식세포 내 살모넬라 증식 억제에 미치는 효과를 나타낸 결과 그래프이다.
도 8은 마우스의 살모넬라 감염에 의해 발생한 치사율에 있어서, 본 발명 참깨생물전환물에 의한 지연 효과를 나타낸 결과 그래프이다.
도 9는 본 발명 참깨생물전환물의 복강 내 살모넬라 억제 효과를 나타낸 결과 그래프이다.
도 10은 Caco-2 세포주를 이용하여, 살모넬라의 장관세포 내 침투에 본 발명 참깨생물전환물이 미치는 침투 억제 활성을 나타낸 그래프이다.
도 11은 알록산(alloxan)에 의해 유도되는 INS-1 세포주의 사멸과 활성산소종(reactive oxygen species, ROS) 생성에 본 발명 참깨생물전환물이 미치는 효과를 나타낸 그래프이다.
도 12(A)는 알록산(alloxan)에 의해 유도되는 제1형 당뇨 마우스에 있어서, 본 발명 참깨생물전환물의 간 손상 보호 효과를 측정한 그래프이다.
도 12(B)는 알록산(alloxan)에 의해 유도되는 제1형 당뇨 마우스에 있어서, 본 발명 참깨생물전환물의 간 손상 보호 효과를 촬영한 사진이다.
도 13은 알록산(alloxan)에 의해 유도되는 제1형 당뇨 마우스에 있어서, 본 발명 참깨생물전환물의 췌장 손상 보호 효과를 촬영한 사진이다.
도 14는 제2형 당뇨 마우스에 있어서, 본 발명 참깨생물전환물의 효과를 나타낸 그래프이다.
도 15(A)는 제2형 당뇨 마우스에 있어서, 본 발명 참깨생물전환물의 간 조직 보호 효과를 촬영한 사진이다.
도 15(B)는 제2형 당뇨 마우스에 있어서, 본 발명 참깨생물전환물의 췌장 조직 보호 효과를 촬영한 사진이다.
도 16은 알코올에 의해 유도되는 간세포 사멸에 본 발명 참깨생물전환물이 미치는 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 17은 알코올에 의해 유도되는 간세포 사멸에서 ROS 발생에 본 발명 참깨생물전환물이 미치는 발생 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 18은 알코올에 의해 유도되는 간 손상 마우스에 있어서, 본 발명 참깨생물전환물의 투여로 인한 간 무게 증가 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 19는 알코올에 의해 유도되는 간 손상 마우스에 있어서, 본 발명 참깨생물전환물의 투여로 인한 간 손상 보호 효과를 촬영한 사진이다.
도 20은 본 발명 참깨생물전환물로부터 다당체분획물을 수득하는 제조공정도 및 제조과정을 보여준다.
도 21은 본 발명 참깨생물전환물 다당체분획물들의 제조공정별 HPLC분석 크로마토그램 결과이다.
도 22는 본 발명 참깨생물전환물 다당체분획물들의 대식세포 활성화능 평가 결과이다.
도 23은 본 발명 참깨생물전환물 및 참깨생물전환물 다당체분획물의 사이토카인 분비패턴 조사 결과이다.
도 24는 TLR4 저해제 처리시, 본 발명 참깨생물전환물 및 참깨생물전환물 다당체분획물의 사이토카인 분비량 억제 평가 결과이다. BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS FIG.
Fig. 2 is a process chart of the post-treatment and recovery operation of the sesame biological conversion product of the present invention.
FIG. 3 is a graph showing the results of NO production of macrophages which are remarkably improved by the sesame bioconversion of the present invention and which are increased in NO production ability and concentration-dependent manner.
4 is a graph showing the cytokine expression potential of sesame and the sesame bioconversion of the present invention.
5 is a graph showing the antimicrobial activity of Salmonella in the sesame bioconversion product of the present invention.
FIG. 6 is a graph showing the effect of the sesame bioconversion of the present invention on the salmonellosis of macrophages by concentration.
7 is a graph showing the effect of the sesame bioconversion of the present invention on inhibition of salmonellosis in macrophages by concentration.
8 is a graph showing the delayed effect of the sesame biotransformation according to the present invention in the mortality rate caused by Salmonella infection of a mouse.
FIG. 9 is a graph showing the inhibitory effect of the sesame biotransformation of the present invention on intraabdominal salmonella.
10 is a graph showing the penetration inhibiting activity of the sesame bioconversion product of the present invention in intestinal intestinal permeation of Salmonella using Caco-2 cell line.
11 is a graph showing the effect of the sesame bioconversion of the present invention on the death of INS-1 cell line induced by alloxan and production of reactive oxygen species (ROS).
Fig. 12 (A) is a graph showing the liver damage protection effect of the sesame bioconversion product of the present invention in a
Fig. 12 (B) is a photograph of the effect of protecting the liver damage of the sesame biotransformation of the present invention in a
Fig. 13 is a photograph of the protective effect of the sesame biotransformation of the present invention on pancreatic damage in a
14 is a graph showing the effect of the sesame biotransformation of the present invention in a
Fig. 15 (A) is a photograph showing the protective effect of the liver tissue of the sesame biotransformation of the present invention in a
Fig. 15 (B) is a photograph of the protective effect of pancreatic tissue of the sesame biotransformation of the present invention in a
16 is a graph showing an inhibitory effect of the sesame bioconversion of the present invention on alcohol-induced hepatocyte death.
FIG. 17 is a graph showing the inhibitory effect of the sesame bioconversion of the present invention on the generation of ROS in alcohol-induced hepatocyte death. FIG.
18 is a graph showing an effect of inhibiting liver weight increase due to the administration of the sesame bioconversion of the present invention in an alcohol-induced liver injury mouse.
FIG. 19 is a photograph showing the protective effect of liver damage caused by the administration of the sesame biotransformation of the present invention in an alcohol-induced liver damaged mouse.
20 shows a production process chart and a manufacturing process for obtaining a polysaccharide fraction from the sesame bioconversion product of the present invention.
FIG. 21 shows chromatogram results of HPLC analysis of polysaccharide fractions of the sesame bioconverted product according to the present invention.
22 shows the results of evaluating the macrophage activation ability of the polysaccharide fractions of the sesame biotransformation of the present invention.
FIG. 23 shows the results of investigation of cytokine secretion patterns of the sesame bioconversion product and the sesame bioconversion polysaccharide fraction of the present invention.
24 shows the result of inhibition of the secretion amount of cytokine of the sesame bioconversion and sesame bioconversion polysaccharide fractions of the present invention at the time of TLR4 inhibitor treatment.
본 발명에서는 참깨(Sesamum indicum)를 함유하는 액상배지를 제조하는 단계 (a); 상기 단계 (a) 후, 상기 액상배지에 표고버섯 균사를 접종하고, 배양하여 배양물을 제조하는 단계 (b);상기 단계 (b)후, 상기 배양물에 섬유소분해효소를 첨가하여 반응시키는 단계 (c); 를 포함하는 과정으로부터 제조되는 참깨생물전환물을 포함하는 식품 또는 약학조성물을 제공한다. In the present invention, sesame (Sesamum indicum ), comprising the steps of: (a) preparing a liquid medium; (B) a step (b) of adding a fibrinolytic enzyme to the culture after the step (a), and then adding a fibrinolytic enzyme to the culture after the step (c); A sesame bioconversion product prepared from a process comprising the steps of:
하기 본 발명의 실험에 의할 경우, 본 발명의 과정으로부터 수득한 참깨생물전환물은 대식세포의 활성화를 통해 미생물 감염에 대한 면역력을 증가시킬 수 있는 것으로 확인되었다. 또한, 당뇨를 개선할 수 있으며, 간 손상 또는 췌장의 랑게르한스섬 손상을 개선하고, 중성지방의 생성을 억제하여 고지혈증을 개선 또는 예방(또는 치료)할 수 있는 효과가 발휘됨이 확인되었다. 또한, 알코올로 인해 발현되는 알코올성 지방간 또는 알코올성 지방간염 등 간을 보호하거나 간질환을 예방(또는 치료)하는 효과가 발휘될 수 있는 것으로 확인되었다. According to the experiment of the present invention as described below, it was confirmed that the sesame bioconversion obtained from the process of the present invention can increase the immunity against microbial infection through activation of macrophages. In addition, it has been confirmed that diabetes can be improved, hepatic damage or damage of the pancreas to Langerhans islet can be prevented, and the production of triglyceride is inhibited, thereby improving or preventing (or treating) hyperlipemia. In addition, it has been confirmed that the effect of protecting the liver such as alcoholic fatty liver or alcoholic fatty liver disease expressed by alcohol or preventing (or treating) liver disease can be exerted.
한편, 본 발명에서는 상기 단계 (c)를 통해 수득한 참깨생물전환물에, 증류수를 첨가하여 수용성물질을 추출하는 단계 (가); 상기 수용성물질 추출 후, 원심분리를 통해 잔사를 제거하고, 추출상등액을 분리하는 단계 (나); 상기 추출상등액에, EtOH을 첨가하여 잘 섞어주고, 유지하는 단계 (다); 상기 유지 후, 생성된 침전물을 분리하는 단계 (라); 상기 분리한 침전물에, 증류수를 첨가하여 침전물을 용해시킨 후, 원심분리 또는 여과를 통해 용해되지 않은 물질을 제거하는 단계 (마); 및 상기 원심분리 또는 여과 과정을 거친 침전물용해액에 대해 투석을 수행하는 단계 (바);를 더 포함하는 과정으로부터 수득된 다당체분획물을 제공한다. Meanwhile, in the present invention, a step (a) of adding distilled water to the sesame biological conversion product obtained through the step (c) to extract a water-soluble substance; Removing the residue through centrifugation after extracting the water-soluble substance, and separating the extracted supernatant (B); Adding EtOH to the extracted supernatant, mixing and maintaining (c); Separating the resulting precipitate after said holding (d); Adding distilled water to the separated precipitate to dissolve the precipitate, and then removing undissolved material by centrifugation or filtration; And performing dialysis against the sediment lysis solution after the centrifugation or filtration. The polysaccharide fraction obtained by the process further comprises:
본 발명에서는 참깨생물전환물로부터 다당체분획물을 수득한 후, 참깨생물전환물 및 그로부터 분리한 다당체분획물이 면역세포의 특이수용체인 패턴인식수용체에 인식되어 신호전달이 매개되는지 확인하였다. In the present invention, sesame bioconversion and polysaccharide fractions isolated therefrom are recognized in a pattern recognition receptor, which is a specific receptor of immune cells, to confirm that signal transduction is mediated after the polysaccharide fraction is obtained from the sesame bioconversion.
참깨생물전환물 및 그 다당체분획물의 면역활성 관련 사이토카인을 분석한 하기 실험 결과, TNF-α, IL-6, IL-10 및 IFN-β가 발현되는 것을 확인할 수 있었으며, 참깨생물전환물의 상기 면역활성은 그로부터 분리된 다당체분획물에 기인한 것임을 확인할 수 있었다. As a result of the following experiments, it was confirmed that the TNF-α, IL-6, IL-10 and IFN-β were expressed in the sesame bioconversion and the polysaccharide fractions thereof. The activity was confirmed to be due to the polysaccharide fraction isolated therefrom.
한편, 본 발명의 하기 실험에서는 참깨생물전환물로부터 분리한 다당체분획물이 LPS(lipopolysaccharide)와 사이토카인 분비 패턴에 있어, 유사하게 나타나는 것을 확인할 수 있었는데, 이를 통해 본 발명의 다당체분획물이 LPS의 안티아고니스트(antagonist)임을 확인할 수 있었다. Meanwhile, in the following experiment of the present invention, it was confirmed that the polysaccharide fraction isolated from the sesame biotransformant was similar to that of LPS (lipopolysaccharide) and the cytokine secretion pattern. Thus, it was confirmed that the polysaccharide fraction of the present invention is an antioxidant Which is an antagonist.
한편, 본 발명의 참깨생물전환물 및 그 다당체분획물이 TLR4에 특이적으로 인식되어 신호를 매개하는 것인지 확인하기 위하여 TLR4에 대한 특이적 저해제인 TAK-242를 사용하여 확인하였다. 하기 실험 결과, 참깨생물전환물 또는 그 다당체분획물의 처리에 의해 나타나는 반응들이 TLR4 특이적 저해제인 TAK242에 의해 모두 억제됨을 확인할 수 있었고, 이로부터, TLR4가 참깨생물전환물 및 그 다당체분획물의 수용체임을 확인할 수 있었다. Meanwhile, TAK-242, which is a specific inhibitor for TLR4, was used to confirm whether the sesame bioconversion product and its polysaccharide fraction of the present invention were specifically recognized and mediated by TLR4. As a result of the following experiment, it was confirmed that the reactions represented by the treatment of the sesame bioconvert or its polysaccharide fraction were all inhibited by the TLR4-specific inhibitor TAK242. From this, TLR4 is a receptor for the sesame bioconversion and its polysaccharide fraction I could confirm.
이와 같은 결과로부터 본 발명에서 추구하는 생물전환공정에 의해 생산된 참깨생물전환물 및 그 다당체분획물이 TLR4 아고니스트의 활성을 갖고 있음을 확인할 수 있었다.From these results, it was confirmed that the sesame bioconversion product and its polysaccharide fraction produced by the bioconversion process pursued in the present invention have TLR4 agonist activity.
이하, 본 발명의 내용을 하기 실시예를 들어 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to the following examples. However, the scope of the present invention is not limited to the following embodiments, and includes modifications of equivalent technical ideas.
[실시예 1: 참깨생물전환물 제조][Example 1: Preparation of Sesame Bioconversion]
(1) 전처리공정(이물 및 곰팡이 세척공정) (1) Pretreatment process (foreign body and mold washing process)
참깨생물전환물을 생산하기 위해, 참깨(Sesamum indicum)의 이물 및 곰팡이 등의 오염물질을 제거하기 위하여 세척공정을 수행하였다. To produce a sesame bioconversion, sesame ( Sesamum indicum ) was cleaned to remove contaminants such as foreign matter and fungi.
1차로, 고압의 에어건(air gun)으로 참깨의 겉면에 붙어있는 이물 및 먼지 등을 제거하였다. 2차로, 체를 쳐서 그 외 존재할 수 있는 이물을 제거하였다. 3차로, 물 또는 에탄올을 처리하여 곰팡이 포자 등의 오염물질을 제거하는 공정을 거쳤다.First, high-pressure air guns were used to remove foreign matter and dust from the surface of sesame seeds. Secondly, the sieve was sieved to remove other foreign matter. Thirdly, water or ethanol was treated to remove contaminants such as mold spores.
이렇게 3차의 세척공정을 거친 참깨는 미생물오염 검사를 수행한 후, 원재료로 사용하였다. The sesame which had been subjected to the third washing process was used as a raw material after performing the microbial contamination test.
(2) 배지화를 위한 가수분해효소에 의한 효소처리공정 (2) Enzymatic treatment with hydrolytic enzymes for culture
이물 및 곰팡이 오염 등을 제거한 참깨를 분말화 한 후, 다양한 가수분해효소를 사용하여 효소처리공정을 수행하였다. 가수분해효소는 참깨의 전분 및 셀룰로오스 등을 분해할 수 있는 아밀라아제(amylase) 계열의 효소와 셀룰라아제(cellulase) 계열의 효소를 사용하여 실험을 수행하였다.After the sesame seeds were removed from the soil and fungal contamination, the enzymatic treatment was carried out using various hydrolytic enzymes. The hydrolytic enzymes were tested using enzymes of amylase family and cellulase family which can decompose starch and cellulose of sesame seeds.
각각의 효소는 0.3%(w/v)으로 처리하고, 최적 활성을 나타내는 온도에서 1시간 동안 반응시킨 후, 멸균과정을 거쳐 액상배지를 제조하였다. Each enzyme was treated with 0.3% (w / v), reacted for 1 hour at the temperature showing optimal activity, and sterilized to prepare a liquid medium.
(3) 발효 및 효소처리 생물전환공정 (3) Fermentation and enzyme treatment Bioconversion process
참깨를 배양배지화한 액상배지에 표고균사를 접종하여 30℃에서 배양하였다. 잔류 탄소원이 고갈되는 시점에서 농축된 액상배지를 첨가하는 유가식공정으로 8일간 배양하였다. 표고균사는 배양을 통해 섬유소분해효소를 생성하여 참깨를 가수분해할 수 있게 된다. 배양 후, 배양발효공정에 의해 생산된 표고균사발효참깨에, 추가적으로 2차 생물전환공정인 효소처리공정을 수행하였다. Sesame seedlings were inoculated on a liquid culture medium and cultured at 30 ° C. At the time when the residual carbon source was depleted, the cells were cultured for 8 days in a liquid phase process in which a concentrated liquid medium was added. It is possible to hydrolyse sesame seeds by cultivating ovarian mycelium by producing fibrotic enzymes. After cultivation, an enzyme treatment process, which is a secondary bioconversion process, was further added to the fermented sesame seeds produced by the fermentation process.
상기 발효 및 효소처리 생물전환공정은 배양발효기질인 참깨와 함께, 배양발효산물인 표고균사로부터 세포벽 유래의 면역활성 물질을 효과적으로 생산하기 위한 것으로, 세포벽을 구성하고 있는 성분 중 특정성분의 구조변화를 통해 면역활성 물질로 전환시킴과 함께 효율적으로 추출할 수 있는 효과적인 추출방법을 고려하여 설계되었다. The above-mentioned fermentation and enzymatic treatment bioconversion process is intended to effectively produce an immunopotentiating substance derived from a cell wall from a fermentation product, a cultured fermentation product, together with sesame, which is a fermentation medium for a culture fermentation. , Which is an effective method for extracting and efficiently extracting an immunologically active substance.
따라서, 본 발명자들은 'cell wall lytic enzyme complex' (세포벽을 분해할 수 있는 세포벽 가수분해효소인 셀룰라아제(cellulase), 헤미-셀룰라아제(hemi-cellulase) 및 펙티나아제(pectinase) 및 베타글루칸 분해효소인 베타-글루칸(β-glucanase)의 효소복합제)를 사용하고, 50~60℃ 조건에서 250 rpm로 쉐이킹(shaking) 하여 효소/기질반응을 최적화하였다 (도 1 참조). 도 1은 참깨생물전환물의 제조공정도이다.Accordingly, the present inventors have found that a cell wall lytic enzyme complex (cellulase, hemi-cellulase, pectinase, and beta-glucanase, which is a cell wall hydrolase capable of degrading a cell wall, The enzyme / substrate reaction was optimized by shaking at 250 rpm at 50 to 60 ° C using an enzyme conjugate of β-glucanase (see FIG. 1). BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS FIG.
(4) 후처리 공정 (4) Post-treatment process
2차 생물전환공정(효소 반응)에 의해 생산된 참깨생물전환물은 90℃에서 1시간 동안 '효소불활성화 및 살균' 과정을 거친 후, 건조 및 분말화하여, 하기 실험예에서 사용하였다 (도 2 참조). 도 2는 참깨생물전환물의 후처리 및 회수작업 공정도이다. The sesame bioconversion product produced by the secondary biotransformation process (enzyme reaction) was subjected to 'enzyme inactivation and sterilization' process at 90 ° C for 1 hour, followed by drying and pulverization, and used in the following experimental examples 2). FIG. 2 is a process chart of a post-treatment and recovery operation of a sesame bioconversion product.
[ 실험예 1: 참깨 및 참깨생물전환물에 의한 대식세포( 마크로파지 )에서의 in vitro NO 생성능 측정] [ Experimental Example 1: Measurement of in vitro NO production ability in macrophages ( macrophages ) by sesame and sesame biotransformation ]
참깨 및 참깨생물전환물의 대식세포 활성화 효능을 확인하기 위하여 대식세포(마크로파지), RAW264.7 세포주에서의 NO 생성능을 조사하였다. In order to confirm the macrophage activation effect of sesame and sesame bioconversion, the NO production ability in macrophage (macrophage), RAW264.7 cell line was examined.
96 웰 플레이트(well plate)에 참깨생물전환물과 연속희석된 참깨 및 참깨생물전환물과 스탠다드(standard)를 100 ㎕ 분주하고, 'Griess reagent'(① N-(1-naphtyl) ethlene diamine dihydrochloride : 0.5 g/500 ml ② Sulfanilamide : 5 g / 85% H3PO4 29.5 ml/470.5 ml)를 100 ㎕ 분주한 후 1분간 반응시켰다. 이후, 'ELISA leader'를 이용하여 540 nm(또는 550 nm)에서 흡광값의 측정을 통해 시료의 대식세포 NO 생성능을 측정하여 면역활성 역가를 평가하였다. 100 μl of a sesame biotransformant and a serially diluted sesame and sesame biotransformant and a standard were dispensed into a 96-well plate, and a 'Griess reagent' (① N- (1-naphtyl) ethlene diamine dihydrochloride: 0.5 g / 500
실험결과, 참깨생물전환물은 참깨에 비해 1/1,000 ~ 1/10,000 보다 낮은 농도에서 대식세포가 NO 생성능을 나타내어, 참깨생물전환물에 의한 대식세포의 NO 생성능이 획기적으로 향상되며, 또한 농도의존적으로 증가하는 것을 확인할 수 있었다 (도 3). 도 3은 참깨생물전환물에 의해 획기적으로 향상된 NO 생성능 및 농도의존적으로 증가하는 대식세포의 NO 생성 결과 그래프이다. The results showed that the sesame bioconversion showed NO production ability of macrophages at a concentration lower than 1 / 1,000 ~ 1 / 10,000 compared with sesame, and the NO production ability of macrophages by sesame bioconductors was remarkably improved, (Fig. 3). FIG. 3 is a graph showing the NO production ability and the concentration-dependent increasing NO production of macrophages remarkably improved by the sesame bioconversion.
[ 실험예 2: 대식세포에서의, 참깨 및 참깨생물전환물의 사이토카인(cytokine) 분비능 분석] [ Experimental Example 2: Analysis of cytokine secretion ability of sesame and sesame biotransformants in macrophages ]
참깨 및 본 발명의 참깨생물전환물의 선천성 면역반응 활성화 효능을 확인하기 위하여 대식세포(마크로파지), RAW264.7 세포주에서의 사이토카인(Cytokine) 분비능을 조사하였다.In order to confirm the effect of sesame and the sesame bioconversion of the present invention on the innate immune response activation activity, cytokine secretion ability in macrophages (macrophages), RAW264.7 cell lines was examined.
참깨 및 본 발명의 참깨생물전환물은 1, 10, 100 ㎍/ml의 농도로 각각 처리하여 실험을 수행하였다. 시료 처리 16시간 후 배양상등액을 취하여 TNF-α(Tumor necrosis factor-α), IL-1β(Interlukine-1β), IL-4(Interlukine-4), IL-5(Interlukine-5), IL-6(Interlukine-6), IL-10(Interlukine-10), IL-12p70(Interlukine-12p70), IFN-β(Interferon-β), IFN-α(Interferon-α)를 ELISA(Enzyme linked immuno solvent assay) 실험법으로 분석하였다. Sesame and the sesame bioconversion of the present invention were treated at a concentration of 1, 10, and 100 / / ml, respectively. After 16 hours of sample treatment, the supernatant of the culture was taken and TNF-α, IL-1β, IL-4, IL-5, (Interleukin-6), IL-10 (Interlukine-10), IL-12p70 (Interlukine-12p70), IFN- Respectively.
실험결과, 참깨생물전환물을 처리한 경우, TNF-α, IL-6, IL-10 및 IFN-β가 발현되는 것을 확인할 수 있었다 (도 4). 도 4는 참깨 및 참깨생물전환물의 사이토카인(cytokine) 발현능 그래프이다. As a result of the experiment, it was confirmed that TNF-α, IL-6, IL-10 and IFN-β were expressed when the sesame bioconversion was treated (FIG. 4 is a graph showing the cytokine expression potential of sesame and sesame biotransformants.
TNF-α는 탐식작용시, 대식세포와 단핵세포 등에서 분비되며, '유도형 일산화질소(NO)'와 함께 독감바이러스 등의 다양한 바이러스에 대하여 항바이러스 효과가 있는 것으로 알려져 있다. TNF-α is secreted from macrophages and mononuclear cells during phagocytosis, and is known to have an antiviral effect against various viruses such as influenza virus along with 'inducible nitrogen monoxide (NO)'.
IL-6는 항원특이면역반응, 염증반응, 급성반응에서의 주요 중개자이며, 생체 내 방어체계에서 핵심역할을 담당하는 대표적 사이토카인(cytokine)이다.IL-6 is a major mediator in antigen-specific immune responses, inflammatory responses, and acute responses, and is a representative cytokine that plays a key role in the in vivo defense system.
IFN-β는 IFN-α와 함께 'type I 인터페론'으로 항균, 항바이러스 효과가 있으며, Th1 세포의 분화에 기여하여 Th1 면역반응을 유도하는 대표적인 사이토카인으로, Th1 면역반응을 유도하는 반면, Th2 및 Th17 면역반응을 억제하는 면역조절 기능이 있다.IFN-β is a type I interferon with IFN-α, and has antiviral and antiviral effects. It is a typical cytokine that induces Th1 immune response by contributing to Th1 cell differentiation, inducing Th1 immune response, while Th2 And Th17 immune response.
시료 처리 시간대 별로(6시간, 12시간, 18시간 후) 배양상등액을 취하여 사이토카인(cytokine) 분비능을 조사하는 실험을 진행하였으며, 3번 반복 실험을 진행하였다. The culture supernatant was taken every 6 hours, 12 hours, and 18 hours after the sample treatment time, and the cytokine secretion was examined. The experiment was repeated three times.
따라서, 본 발명의 참깨생물전환물은 Th1 면역반응을 특이적으로 활성화시킬 수 있는 소재로, 동시에 항진된 Th2 면역반응도 억제시킬 수 있을 것으로 판단되었다. 또한, Th1 면역반응을 향상시킬 필요가 있거나 또는 Th2 면역반응이 항진되어 발생하는 질환에도 효능을 나타낼 수 있을 것으로 예상되었다.Therefore, the sesame bioconversion product of the present invention was found to be capable of specifically activating the Th1 immune response, and at the same time, could suppress the exaggerated Th2 immune response. It is also expected that it may be effective in diseases where it is necessary to improve the Th1 immune response or that the Th2 immune response is exaggerated.
[ 실험예 3: 참깨생물전환물의 , 대식세포에서의 in vitro 살모넬라 감염 억제능 평가] [ Experimental Example 3: Assessment of Inhibitory Effect of Sesame Bioconversion on Salmonella In Vitro in Macrophages ]
본 실험예에서는 참깨생물전환물이 대식세포를 이용한 in vitro 실험계에서 대식세포의 활성화를 유도하여 탐식작용 및 세포 내 미생물 생존 억제능에 미치는 영향을 확인하고자 하였다. In this experiment, we investigated the effect of sesame bioconversion on the phagocytosis and inhibition of intracellular microbial survival by inducing macrophage activation in an in vitro experimental system using macrophages.
(1) 참깨생물전환물의 항균활성 측정 (1) Antimicrobial activity measurement of sesame bioconversion product
참깨생물전환물의 살모넬라 감염 억제능을 평가하기 위하여, 참깨생물전환물이 직접적인 항균활성을 갖는지 확인하고자 하였다. In order to evaluate the ability of sesame bioconversion to inhibit Salmonella infection, we tried to determine whether sesame bioconversion has direct antimicrobial activity.
지시균주로는 Salmonella typhimurium ATCC14028 균주를 사용하였고, 일반적인 살모넬라 배양배지인 'nutrient broth'와 지시약인 페놀 레드(phenol red) 및 발효를 위한 글루코스(glucose)가 포함된 'nutrient broth (NBGP)'를 사용하여 살모넬라의 성장 및 당발효로 인한 색 변화를 측정하였다. Salmonella typhimurium ATCC14028 strain was used as the indicator strain and nutrient broth (NBGP), which is a general salmonella culture medium, and phenol red and glucose for fermentation, was used as an indicator strain. The growth of salmonella and color change due to sugar fermentation were measured.
살모넬라 배양 시, 참깨생물전환물을 1, 10, 100 ㎍/mL의 농도로 각각 처리하여 살모넬라의 생존 억제를 유도하는지 확인하였으며, 배양 후 0, 2, 4, 8 시간에 흡광도를 측정하여 생존율을 계산하였다.When the salmonella was cultured, the sesame bioconversion was treated at 1, 10, and 100 ㎍ / mL, respectively, to induce the survival inhibition of Salmonella, and the absorbance was measured at 0, 2, 4, Respectively.
실험결과, 참깨생물전환물은 직접적인 항균활성을 보이지 않는 것으로 확인되었다 (도 5). 도 5는 참깨생물전환물의 살모넬라 항균활성을 나타낸 그래프이다.As a result of the experiment, it was confirmed that the sesame bioconversion does not show direct antibacterial activity (FIG. 5). 5 is a graph showing the antimicrobial activity of salmonella in the sesame bioconversion product.
(2) 참깨생물전환물의 대식세포 탐식능 측정 (2) Measuring Macrophage Phagocytosis of Sesame Bioconversion
대식세포 RAW 264.7 세포주에 참깨생물전환물을 1, 10, 100 ㎍/mL의 농도로 각각 4시간 동안 처리한 후, Salmonella typhimurium ATCC14028를 30분, 60분간 감염시켰다.The RAW 264.7 cells were treated with sesame bioconverters at a concentration of 1, 10, and 100 ㎍ / mL for 4 hours, followed by Salmonella typhimurium ATCC14028 was infected for 30 minutes and 60 minutes.
실험결과, 살모넬라 30분 감염시에 참깨생물전환물의 처리로 인한 탐식능의 증가가 최대 4.24배까지 증가함을 확인하였고, 살모넬라 60분 감염시에는 최대 9.7배까지 증가함을 확인하였다 (도 6). 도 6은 농도별 참깨생물전환물이 대식세포의 살모넬라 탐식능에 미치는 효과를 나타낸 결과 그래프이다.As a result of the experiment, it was confirmed that the increase of the spermatogenesis caused by the treatment of the sesame biotransformation was increased to 4.24 times at the time of infection with
(3) 참깨생물전환물의 살모넬라 증식 억제능 측정 (3) Measurement of inhibition of salmonella proliferation of sesame bioconversion
대식세포 RAW 264.7 세포주에 참깨생물전환물을 1, 10, 100 ㎍/mL의 농도로 각각 4시간 동안 처리한 뒤, 살모넬라(Salmonella typhimurium ATCC14028)를 2시간, 4시간, 8시간 동안 감염시킨 후, 살모넬라의 증가 여부를 관찰하였다. The RAW 264.7 macrophage cell line was treated with sesame bioconducts at a concentration of 1, 10, and 100 μg / mL for 4 hours, followed by salmonella typhimurium ATCC14028) was infected for 2 hours, 4 hours, and 8 hours, and then an increase in Salmonella was observed.
실험결과, 2시간 배양 시에는 세포 내 살모넬라의 증가가 일어났으며, 그 이후로는 감소하는 경향을 보였다. 100 ㎍/mL의 참깨생물전환물을 처리하고 살모넬라를 감염시킨 군은, 최대 8시간 경과 시, 세포 내에 존재하는 살모넬라가 대조군에 비하여 대폭 감소하는 것으로 확인되었다 (도 7). 도 7은 농도별 참깨생물전환물이 대식세포 내 살모넬라 증식 억제에 미치는 효과를 나타낸 결과 그래프이다.As a result of the experiment, the increase of intracellular salmonella occurred for 2 hours, and then decreased. In the group treated with sesame biotransformation of 100 / / mL and infected with Salmonella, it was confirmed that salmonella present in cells significantly decreased after a maximum of 8 hours (FIG. 7). 7 is a graph showing the effect of the sesame bioconversion per concentration on the inhibition of salmonellosis in macrophages.
[ 실험예 4: 살모넬라 감염으로 발생한 마우스 치사율에 대한 조절 효능 평가] [ Experimental Example 4: Evaluation of modulating efficacy against mouse mortality caused by Salmonella infection ]
상기 실험을 통해 참깨생물전환물이 대식세포를 이용한 in vitro 실험계에서 대식세포의 활성화를 유도하여 탐식작용을 증가시키고, 탐식작용 후, 세포 내 미생물 생존을 억제하는 것을 확인함에 따라, 본 실험예에서는 'Salmonella typhimurium ATCC14028)' 균주를 이용한 미생물 감염 마우스 모델을 제작하여 참깨생물전환물의 in vivo 항미생물 활성을 검정하고자 하였다. Through the above experiments, it was confirmed that the sesame bioconverted product induces macrophage activation in macrophage in vitro using macrophages to increase phagocytosis and suppress the survival of intracellular microorganisms after phagocytosis, ' Salmonella typhimurium ATCC14028)' strains were used to test the in vivo antimicrobial activity of sesame biotransformants.
참깨생물전환물의 투여가 살모넬라 감염으로 인한 마우스의 치사율을 감소시킬 수 있는지 확인하기 위해 살모넬라(Salmonella typhimurium ATCC14028) 균주의 치사 농도인 105 CFU를 복강 내로 주사하여 감염에 의한 마우스의 사망을 유도하였다. In order to determine if the sesame bioconversion could reduce the mortality rate of mice due to Salmonella infection, 10 5 CFU, the lethal concentration of Salmonella typhimurium ATCC14028 strain, was injected intraperitoneally to induce the death of mice by infection.
실험결과, 대조군 마우스는 감염 후 7일째 모든 마우스가 사망한데 비해 참깨생물전환물을 10 mg/kg의 섭취량으로 투여한 경우, 최대 19일까지 마우스가 생존하여 참깨생물전환물의 투여로 인해 마우스의 사망이 지연되는 효과가 있음을 확인하였다 (도 8). 도 8는 마우스의 살모넬라 감염에 의해 발생한 치사율에 있어서, 참깨생물전환물에 의한 지연 효과를 나타낸 결과 그래프이다.As a result of the experiment, when all mice were killed at 7 days after the infection, when the sesame bioconversion was administered at a dose of 10 mg / kg, the mouse survived up to 19 days, (Fig. 8). FIG. 8 is a graph showing the delayed effect of the sesame biotransformation on mortality caused by Salmonella infection in mice.
[ 실험예 5: 참깨생물전환물의 , 살모넬라 감염 마우스에서의 in vivo 살모넬라 감염 억제능 평가] Experimental Example 5: Sesame bioconversion of water, in vivo live in Salmonella infection mice infected with Monel called inhibitory ability evaluation;
상기 실험을 통해 참깨생물전환물의 투여가 치사 농도의 살모넬라 감염으로 인한 마우스의 치사율을 감소시켰음을 확인함에 따라, 본 실험예에서는 아치사 농도의 살모넬라 감염에서의 in vivo 항미생물 활성과 참깨생물전환물에 의해 유도되는 면역반응의 활성화를 확인하고자 하였다. As a result of the above experiment, it was confirmed that the administration of the sesame bioconverting agent reduced the mortality rate of the mice due to the Salmonella infection at the lethal concentration. Thus, in this Example, the in vivo antimicrobial activity and the sesame bioconversion Induced activation of the immune response.
참깨생물전환물을 10 mg/kg 의 섭취량으로 2주간 식이 투여한 후, 'Salmonella typhimurium ATCC14028' 균주를 1x104 CFU 농도로 복강 주사하여 복강 내 살모넬라 감염을 유도하였다. The sesame biotransformation was fed at a dose of 10 mg / kg for 2 weeks, and then ' Salmonella typhimurium ATCC14028 'strain was intraperitoneally injected at a concentration of 1 × 10 4 CFU to induce intraperitoneal Salmonella infection.
감염 2일 후, 마우스의 복강 내 살모넬라를 PBS를 이용해 회수한 뒤, LB 플레이트에 스프레딩(spreading)하여 복강 내 생존하는 살모넬라의 수를 측정하였다. Two days after infection, the salmonella in the abdominal cavity of the mice was recovered using PBS, and the number of Salmonella surviving in the abdominal cavity was measured by spreading on an LB plate.
측정 결과, 참깨생물전환물을 처리한 그룹에서 대조군에 비하여 생존하는 살모넬라가 월등히 감소함을 확인하였다 (도 9). 도 9는 참깨생물전환물의 복강 내 살모넬라 억제 효과를 나타낸 결과 그래프이다. As a result of the measurement, it was confirmed that surviving salmonella was significantly reduced in the group treated with sesame bioconversion compared to the control group (Fig. 9). 9 is a graph showing a result of suppressing the salmonella in the abdominal cavity of the sesame bioconversion product.
[ 실험예 6: 살모넬라 감염 마우스에서의 림프구 증식 유도 및 인터페론-감마(interferon-γ) 생산 활성화 평가] [ Experimental Example 6: Induction of lymphocyte proliferation and evaluation of interferon-gamma production activation in Salmonella-infected mice ]
상기 복강 내 살모넬라 실험 후, 마우스의 비장을 적출하여 비장 내 림프구를 분리하였다. 분리한 림프구를 T세포 증식 유도물질인 콘칸나발린 A (concanavalin A)와 B세포 증식 유도물질인 LPS로 자극하여 세포의 증식이 얼마나 유도되는지 확인하였으며, 그 결과는 하기 표 1과 나타내었다. After the intraperitoneal salmonellar experiment, the spleen of the mouse was excised and splenic lymphocytes were isolated. The isolated lymphocytes were stimulated with concanavalin A, which is a T cell proliferation inducing substance, and LPS, which is a B cell proliferation inducing substance, to determine how cell proliferation is induced. The results are shown in Table 1 below.
실험결과, 대조군보다 참깨생물전환물 투여 마우스의 경우, 마우스 비장 림프구가 더 많이 증가하는 것으로 확인되었다. 또한, 대표적 Th1 사이토카인인 인터페론-감마(IFN-γ)의 발현량이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. Experimental results showed that mouse spleen lymphocytes were more increased in mice treated with sesame bioconversion than in the control group. In addition, it was confirmed that the expression level of interferon-gamma (IFN-y), a representative Th1 cytokine, was increased.
[ 실험예 7: 살모넬라 감염 마우스에서의 Th1 사이토카인( cytokine ) 활성화 효능 평가] Test Example 7: Evaluation Th1 cytokine (cytokine) activation efficacy in mice infected with Salmonella;
참깨생물전환물의 투여가 Th1 면역반응의 활성화를 유도하는지 확인하기 위하여, 상기 아치사 농도의 살모넬라를 복강 내 감염시킨 마우스의 비장에서의 Th1 사이토카인(cytokine)의 발현량을 측정하여 Th1 활성화 효과를 평가하고자 하였다. Th1 사이토카인(cytokine) 중 IL-1β, IL-2, IL-6, IL-12의 네 가지 사이토카인(cytokine)을 ELISA 방법을 이용하여 측정하였다.In order to confirm whether the sesame bioconversion induces the activation of the Th1 immune response, the amount of Th1 cytokine expressed in the spleen of the mouse infected with salmonella at the above-mentioned concentration of saliva was measured to determine the Th1 activation effect Respectively. Four cytokines, IL-1β, IL-2, IL-6 and IL-12, were measured in the Th1 cytokine using ELISA.
살모넬라를 감염시키지 않은 마우스와, 살모넬라를 감염시킨 마우스에 참깨생물전환물을 각각 투여하여 활성화 효과를 비교하였으며, 그 결과는 하기 표 2에 나타내었다. The effect of the sesame bioconversion was compared between the mice not infected with Salmonella and the mice infected with Salmonella. The results are shown in Table 2 below.
참깨생물전환물10 mg / kg
Sesame Bioconversion
참깨생물전환물10 mg / kg
Sesame Bioconversion
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실험결과, 정상 마우스에 참깨생물전환물을 투여한 경우, IL-1β의 발현량이 약간 증가한 것을 제외하면 사이토카인(cytokine)의 발현량에 있어 큰 차이를 보이지 않았다. 반면, 살모넬라에 감염된 경우, 살모넬라 감염에 의해 IL-1β, IL-2, IL-6, IL-12 등의 사이토카인(cytokine)의 발현량이 많이 증가하며, 또한 참깨생물전환물을 살모넬라 감염에 있어서 동시에 투여한 경우, 더 많은 사이토카인(cytokine)의 생산이 유도되는 것으로 확인되었으며, 특히 대표적 Th1 사이토카인인 IL-12에서 가장 현저히 발현량이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. As a result, when the sesame bioconversion was administered to normal mice, there was no significant difference in the amount of cytokine expression except that the expression level of IL-1β was slightly increased. On the other hand, when infected with Salmonella, the amount of cytokines such as IL-1β, IL-2, IL-6 and IL-12 is increased by Salmonella infection and the sesame bioconversion In the case of simultaneous administration, it was confirmed that more cytokine production was induced. In particular, IL-12, which is a representative Th1 cytokine, showed the most remarkable increase in the expression level.
이와 같은 결과는 참깨생물전환물의 투여가 정상 생체 내에서는 불필요한 면역반응의 활성화를 유도하지 않으며, 미생물 감염시, Th1 면역반응의 활성화를 유도하여 생체 내 감염된 미생물을 효과적으로 제어할 수 있음을 보여주는 것이다.These results show that the administration of the sesame bioconversion does not induce unnecessary activation of the immune response in a normal organism, and induces the activation of the Th1 immune response upon microbial infection, thereby effectively controlling the infected microorganism in vivo.
[ 실험예 8: 살모넬라 감염 마우스에서의 Th2 사이토카인( cytokine ) 발현 효능 평가] Test Example 8: Th2 cytokine (cytokine) expression efficacy evaluation in Salmonella infected mice;
상기 Th1 사이토카인(cytokine) 활성화 효능 평가 결과에서, 참깨생물전환물의 투여가 Th1 사이토카인(cytokine)의 발현을 활성화 시킴에 따라, Th1 면역반응의 길항적 반응인 Th2 면역반응의 활성화 여부를 확인하기 위하여 Th2 사이토카인(cytokine) 발현량을 확인하고자 하였다.As a result of evaluating the cytotoxic activity of Th1 cytokine, it was confirmed that the administration of sesame bioconversion activates the expression of Th1 cytokine, thereby activating Th2 immune response, which is an antagonistic reaction of Th1 immunoreactivity To investigate the expression level of Th2 cytokine,
대표적 Th2 사이토카인(cytokine)인 IL-4, IL-5, IL-10의 세 가지 사이토카인(cytokine) 발현량을 확인하였다. Th1 사이토카인(cytokine)과 마찬가지로 살모넬라에 감염되지 않은 정상 마우스와 살모넬라에 감염된 마우스 모두에서 조사하였다. 그 결과는 하기 표 3에 나타내었다. Three cytokines, IL-4, IL-5 and IL-10, which are representative Th2 cytokines, were detected. Similar to Th1 cytokines, they were examined in both normal and Salmonella-infected mice not infected with Salmonella. The results are shown in Table 3 below.
참깨생물전환물10 mg / kg
Sesame Bioconversion
참깨생물전환물10 mg / kg
Sesame Bioconversion
실험결과, 참깨생물전환물의 투여는 살모넬라에 감염되지 않은 정상 마우스는 물론 감염된 마우스 모두에서 Th2 사이토카인(cytokine)의 생성을 증가시키지 않는 것으로 확인되었다 As a result of the experiment, it was confirmed that administration of the sesame bioconversion does not increase the production of Th2 cytokine in both the normal mouse not infected with Salmonella and the infected mouse
이와 같은 결과는 참깨생물전환물의 투여가 정상 생체 내에서는 불필요한 면역반응의 활성화를 유도하지 않으며, 미생물 감염시, Th2 면역반응의 활성화도 유도하지 않음을 보여주는 것이다. These results show that the administration of the sesame bioconversion does not induce activation of unnecessary immune responses in normal organisms and does not induce activation of Th2 immune response upon microbial infection.
[ 실험예 9: 참깨생물전환물의 , 장관세포에서의 in vitro 살모넬라 침투 억제능 평가] Experimental Example 9: Sesame bioconversion of water, in the intestinal cells Evaluation of inhibition of penetration of Salmonella in vitro ]
본 실험예에서는 Caco-2 세포주를 이용하여 참깨생물전환물이 살모넬라에 대해 장관세포 점착 및 침입 억제 효능을 나타내는지 평가하고자 하였다. 살모넬라 감염의 대부분은 장관 내 감염을 통해 일어나기 때문에, 참깨생물전환물이 살모넬라의 장관세포 점착 및 침입을 억제할 수 있는지 확인하고자 하였다. 사람 유래 대장암 세포주인 Caco-2 세포주와 Salmonella typhimurium SL1344 균주를 이용한 in vitro 실험계에서 평가하였다. In this experiment, we evaluated the effect of sesame bioconversion on the intestinal cell adhesion and penetration inhibition of Salmonella using Caco-2 cell line. Since most of the Salmonella infections occur through intestinal infections, we wanted to see if the sesame bioconversion could inhibit salmonella intestinal cell adhesion and invasion. Who was evaluated in colon cancer derived cell line, Caco-2 cell line and in vitro experimental system using the Salmonella typhimurium SL1344 strain.
Caco-2 세포주에 100 ㎍/mL 농도의 참깨생물전환물을 4시간 전처리 또는 Salmonella typhimurium SL1344 균주와 동시 처리한 후, 세포 내로 침투한 살모넬라의 수를 측정하였다. Caco-2 cell line was treated with 100 ㎍ / mL sesame bioconversion for 4 hours or with Salmonella typhimurium SL1344, and the number of salmonella infiltrated into cells was measured.
실험결과, 4시간 전처리 경우, 11.4%의 살모넬라 침투 억제능을 보였으며, 동시처리의 경우, 54.5%의 살모넬라 침투 억제능을 나타내었다. 상기 실험에서 참깨생물전환물은 항균활성을 가지지 않는 것으로 확인되었기 때문에, Caco-2 세포주에 직접 작용하여 미생물의 침투를 억제한 것으로 판단되었다 (도 10). 도 10은 Caco-2 세포주를 이용한 참깨생물전환물의 장관세포 내 침투 억제 활성을 나타낸 그래프이다. As a result of the experiment, it showed 11.4% inhibition of salmonella penetration in the case of pretreatment for 4 hours, and 54.5% inhibition of salmonella penetration in simultaneous treatment. Since the sesame bioconversion was confirmed to have no antimicrobial activity in the above experiment, it was judged that it acted directly on the Caco-2 cell line and inhibited microbial penetration (FIG. 10). 10 is a graph showing inhibitory activity of intestinal intracellular penetration of sesame bioconversion using Caco-2 cell line.
[ 실험예 10: 살모넬라 감염 마우스에서의, 참깨생물전환물의 in vivo 살모넬라 침투 억제능 평가] [ Experimental Example 10: Effect of salmonella biotransformation in vivo inhibition of Salmonella penetration]
본 실험예에서는 참깨생물전환물의 in vivo 살모넬라 침투 억제능을 확인하고자 하였다. In this experimental example, the ability to inhibit Salmonella permeation in vivo of sesame bioconversion was investigated.
(1) 분변으로 배출되는 살모넬라의 확인 (1) Identification of salmonella excreted in feces
세포주를 이용한 실험에서 참깨생물전환물이 살모넬라의 장관세포 내 침투를 억제하는 효과가 있음을 확인함에 따라, 살모넬라 식중독 마우스 모델에서 살모넬라 침투 억제 효과를 평가하고자 하였다. As a result of the experiment using the cell line, it was confirmed that the sesame bioconversion inhibits salmonella intestinal cell penetration, so that the salmonella infestation inhibitory effect was evaluated in a salmonella food poisoning mouse model.
참깨생물전환물을 각각 10 mg/kg의 섭취량으로 2주간 식이 투여한 후, 108 CFU의 'Salmonella typhimurium SL1344' 균주를 경구 투여하여 살모넬라의 감염을 유도하였다. 감염 24시간, 48시간 후 분변을 각각 채취하여 분변 내 살모넬라의 생균 수를 측정하였으며, 그 결과는 하기 표 4에 나타내었다. Salmonella typhimurium SL1344 strain was orally administered with 10 8 CFU of the sesame bioconversion at a dose of 10 mg / kg for 2 weeks, respectively, to induce Salmonella infection. The feces were sampled 24 hours and 48 hours after infection, and the viable cell counts of Salmonella in feces were measured. The results are shown in Table 4 below.
10 mg/kg 참깨생물전환물SL1344 infection +
10 mg / kg sesame bioconversion
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실험결과, 참깨생물전환물을 투여한 경우, 모두 대조군에 비하여 많은 양의 살모넬라가 장관 내로 침투되지 않았고, 분변으로 빠져나온 것으로 확인되었다.As a result of the experiment, it was confirmed that a large amount of salmonella did not penetrate into the intestinal tract and excreted into the feces when the sesame bioconversion was administered.
(2) 조직 내로 침투한 살모넬라의 확인 (2) Identification of Salmonella infiltrated into tissues
상기 표 4의 결과에서, 참깨생물전환물 투여 시, 생체 내로 들어간 살모넬라가 조직 내로 침투하지 못하고 체외로 배출되는 것을 확인함에 따라, 상기 분변 배출 실험 마우스를 대상으로 맹장과 장관막림프절, 비장, 간을 적출하여 조직 내로 침투한 살모넬라의 수를 측정하였다. From the results of Table 4, it was confirmed that when the sesame biotransformant was administered, Salmonella entered into the organism could not permeate into the tissues and was discharged to the outside of the body. Therefore, the fecal release experiment mice were administered to the cecum and intestinal membrane lymph nodes, spleen, liver And the number of Salmonella infiltrated into the tissues was measured.
① 맹장 및 장관막림프절① Cecum and intestinal membrane lymph nodes
살모넬라의 감염 후, 1차 침투 조직인 맹장과 그에 연결된 림프조직인 장관막림프절 내의 살모넬라를 측정하여 참깨생물전환물의 조직 침투 억제 효과를 확인하고자 하였다. 그 결과는 하기 표 5에 나타내었다. After the infection of salmonella, salmonella in the intestinal membrane lymph node, the cecum, which is the primary infiltrating tissue, and the lymphatic tissue connected with it, were measured to confirm the tissue infiltration inhibition effect of sesame bioconversion. The results are shown in Table 5 below.
10 mg/kg 참깨생물전환물SL1344 infection +
10 mg / kg sesame bioconversion
실험결과, 참깨생물전환물은 살모넬라의 맹장 내 침투를 억제하였으며, 참깨생물전환물은 49.1%의 억제 효과를 보이는 것으로 확인되었다. 참깨생물전환물은 65.4%의 장관막림프절 내 살모넬라를 억제하는 것으로 확인되었고, 맹장보다 장관막림프절에서의 억제율이 더 큰 것으로 확인되었다. The results showed that the sesame bioconversion inhibited the penetration of Salmonella into the cecum, and the sesame bioconversion showed a suppressive effect of 49.1%. The sesame bioconversion was found to inhibit Salmonella in 65.4% of intestinal membrane lymph nodes, and it was found that the inhibition rate in the intestinal membrane lymph nodes was greater than in the cecum.
이러한 결과는 장관막림프절에 존재하는 면역세포가 참깨생물전환물에 의하여 활성화됨으로써 살모넬라가 침투되었더라도 효과적으로 제거할 수 있었던 것으로 판단되었다.These results suggest that the immune cells in the intestinal membrane lymph node were activated by the sesame biotransformant and could be effectively removed even if Salmonella was infiltrated.
② 비장 및 간② spleen and liver
조직 내로의 침투 및 체액을 통한 이동이 가능한 비장과 간에서의 살모넬라의 양을 측정하였다. The amount of Salmonella in the spleen and liver which can penetrate into tissues and move through body fluids was measured.
10 mg/kg 참깨생물전환물SL1344 infection +
10 mg / kg sesame bioconversion
실험결과, 참깨생물전환물을 투여한 경우, 79.2%의 비장 내 살모넬라를 억제하는 효과를 보였다. 또한, 간에 존재하는 살모넬라에 대해 참깨생물전환물은 69.4%의 억제율을 보였다. 비장과 간 모두 맹장에 비해 높은 억제율을 보였는데, 이러한 결과 또한 다양한 면역세포의 활성화로 인한 것으로 추측되었다. The results showed that 79.2% of salmonella in the spleen was inhibited by the sesame bioconversion. Also, sesame bioconversion against Salmonella present in the liver showed a inhibition rate of 69.4%. Both the spleen and liver showed a higher inhibition rate than the cecum, and these results were also attributed to the activation of various immune cells.
[ 실험예 11: 베타세포에서의, 참깨생물전환물의 in vitro 제1형 당뇨 억제능 평가] [ Experimental Example 11: Preparation of Sesame Bioconversion in Beta Cells In vitro inhibition of
본 실험예에서는 참깨생물전환물이 제1형 당뇨에 대한 억제 활성을 갖는지 확인하기 위하여, 마우스 유래 췌장 베타세포주인 INS-1 세포주를 이용한 in vitro 실험계에서 참깨생물전환물의 활성을 평가하고자 하였다.In order to confirm that the sesame bioconversion has an inhibitory activity against
(1) 베타세포에서 세포독성 및 활성산소 생성에 미치는 효과 (1) Effect on beta-cell cytotoxicity and reactive oxygen production
췌장 베타세포, INS-1 세포주에 'Glucose transporter 2 (GLUT2)'를 통해 베타세포 특이적으로 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)을 생산, 독성을 유발하는 알록산(alloxan)을 처리하여 세포의 사멸을 유도하고, 참깨생물전환물을 처리하여 세포 사멸을 억제할 수 있는지 확인하였다.Pancreatic beta cells and beta-cell specific reactive oxygen species (ROS) through INS-1 cell line through 'Glucose transporter 2 (GLUT2)', and treatment with alloxan, And that the sesame bioconversion can be treated to inhibit cell death.
INS-1 세포주를 5x105 cells/well 의 농도로 96 웰 플레이트(well plate) 에 분주한 후, 10 mM의 알록산(alloxan)과 1, 10, 100 ㎍/mL의 참깨생물전환물을 처리하여 48시간 배양하였다. 배양 후, MTT assay를 통해 세포의 생존률을 측정하였다. The INS-1 cell line was dispensed into a 96-well plate at a concentration of 5 × 10 5 cells / well, treated with 10 mM alloxan and 1, 10, 100 μg / mL sesame bioconversion And cultured for 48 hours. After incubation, cell viability was measured by MTT assay.
참깨생물전환물의 베타세포 사멸 억제능과, ROS 생성 억제능을 확인한 결과, 농도 의존적으로 알록산(alloxan)에 의한 세포 사멸과 ROS 생성을 억제하는 것으로 나타났으며, 최대 농도인 100 ㎍/mL 농도에서 각각 39.7%의 세포 사멸 억제와 60.3%의 ROS 생성 억제 효율을 보이는 것으로 확인되었다 (도 11). 도 11은 알록산(alloxan)에 의해 유도되는 INS-1 세포주의 사멸과 활성산소종(reactive oxygen species, ROS) 생성에 참깨생물전환물이 미치는 효과를 나타낸 그래프이다. As a result of confirming the ability of the sesame bioconversion inhibitor to inhibit beta cell death and inhibit ROS formation, it was found to inhibit cell death and ROS production by alloxan in a concentration dependent manner. At a concentration of 100 ㎍ / mL, 39.7% inhibition of cell death and 60.3% inhibition of ROS formation (Fig. 11). 11 is a graph showing the effect of sesame bioconversion on the death of INS-1 cell line induced by alloxan and production of reactive oxygen species (ROS).
(2) 베타세포에서 NO 생성 및 인슐린 분비에 미치는 효과 (2) Effect on beta -cellular NO production and insulin secretion
알록산(alloxan)의 처리에 의해 베타세포, INS-1 세포주 내 ROS 증가와 세포의 사멸이 일어나게 되면, 세포가 생성 및 분비하는 NO(nitric oxide)의 양이 증가하며, 인슐린의 분비는 감소하게 된다. Increased ROS and cell death in the beta cell, INS-1 cell line by treatment with alloxan increase the amount of nitric oxide (NO) produced and secreted by the cells and decrease the secretion of insulin do.
상기 실험에서 알록산(alloxan)의 처리에 의해 증가된 세포 내 ROS의 양과 세포 사멸율이 참깨생물전환물의 동시 처리에 의해 감소하였으므로, INS-1 세포주가 분비하는 NO(nitric oxide)의 양과 인슐린의 양에 대해서도 측정하였다. 그 결과는 하기 표 7에 나타내었다.In this experiment, the amount of nitric oxide (NO) secreted by the INS-1 cell line and the amount of insulin secreted by the INS-1 cell line decreased as the amount of intracellular ROS increased and the cell death rate increased by the simultaneous treatment of the sesame biotransformation by alloxan treatment The amount was also measured. The results are shown in Table 7 below.
(arbitrary fluorescent unit)Nitric oxide
(arbitrary fluorescent unit)
참깨
생물전환물10 mM Alloxan +
Sesame
실험결과, 알록산(alloxan)의 처리에 의해 증가된 NO의 분비가 참깨생물전환물의 동시 처리에 의해 농도 의존적으로 억제되고 또한 알록산(alloxan)의 처리에 의해 억제된 인슐린의 분비량이 참깨생물전환물의 동시 처리에 의해 회복시키는 효과를 확인하였으며, 100 ㎍/mL의 최대 농도에서 참깨생물전환물은 69.2%의 NO 생성 및 분비를 억제하는 것으로 확인되었다.Experimental results showed that the secretion of NO increased by the treatment of alloxan was inhibited by the concurrent treatment of sesame bioconversion in a concentration dependent manner and that the secretion of insulin suppressed by treatment with alloxan was reduced by sesame biotransformation Water, and it was confirmed that the sesame bioconversion inhibited NO production and secretion by 69.2% at the maximum concentration of 100 ㎍ / mL.
또한, 인슐린의 경우는 100 ㎍/mL의 최대 농도에서 64.6%까지 분비량이 회복되는 것으로 확인되었다. In the case of insulin, it was confirmed that the secretion amount was recovered up to 64.6% at the maximum concentration of 100 ㎍ / mL.
[ 실험예 12: 제1형 당뇨 유발 마우스에서의, 참깨생물전환물의 in vivo 제1형 당뇨 억제능 평가] [ Experimental Example 12: Effect of sesame biotransformation on
상기 in vitro 실험계에서 참깨생물전환물의 처리가 제1형 당뇨에 대한 항당뇨 효과가 있음이 확인됨에 따라, 본 실험예에서는 제1형 당뇨의 마우스 모델에서 참깨생물전환물의 항당뇨 효과를 검정하고자 하였다. As a result of confirming the antidiabetic effect of the sesame bioconversion on the
(1) 제1형 당뇨 마우스모델에서 혈당, 혈청 내 인슐린, 간 내 글리코겐 양에 미치는 효과 확인
(1) The effect of the
참깨생물전환물을 각각 10 mg/kg의 섭취량으로 2주간 식이 투여한 후, 100 mg/kg의 알록산(alloxan)을 복강주사로 투여하여 제1형 당뇨를 유도하였다. 1주일간 당뇨를 유도한 뒤, 당뇨의 지표로서 마우스의 혈당량, 혈중 인슐린 농도, 간 내 글리코겐의 농도를 측정하였으며, 그 결과는 하기 표 8에 나타내었다. The diabetic rats were fed diets containing 10 mg / kg of sesame bioconversion for two weeks followed by 100 mg / kg of alloxan administered intraperitoneally. After one week of diabetes induction, blood glucose level, blood insulin concentration, and hepatic glycogen concentration were measured as an indicator of diabetes, and the results are shown in Table 8 below.
(ng/mg protein)Serum insulin
(ng / mg protein)
(mg/g liver wt.)Glycogen
(mg / g liver wt.)
10 mg/kg 참깨생물전환물Alloxan +
10 mg / kg sesame bioconversion
실험결과, 당뇨가 유도된 대조군은 혈당이 308.4 mg/dL로 증가하였으나, 참깨생물전환물을 투여한 마우스에서는 혈당이 210 mg/dL로, 혈당량의 증가가 억제되는 것으로 확인되었다. As a result, the blood glucose level was increased to 308.4 mg / dL in the control group in which the diabetes was induced, but it was confirmed that the blood sugar level was 210 mg / dL and the increase in the blood glucose level was suppressed in the mouse treated with sesame bioconversion.
또한, 혈중 인슐린 농도는 당뇨 유발 시, 정상 마우스에 비하여 15.9% 수준으로 감소하는데 반해, 참깨생물전환물 투여 시, 67.3% 수준까지 회복되는 것으로 확인되었다. 혈중 인슐린의 감소로 인하여 감소하는 간 내 글리코겐 농도 역시 당뇨 유발 대조군이 정상 대비 79.8% 수준으로 감소됨에 반하여 참깨생물전환물 투여 시, 94.8% 수준까지 회복되는 것으로 확인되었다.In addition, blood insulin concentration was decreased to 15.9% compared with that of normal mice when diabetic induction was performed, and it was confirmed that 67.3% of sesame bioconversion was recovered. The glycogen level in the liver, which is decreased due to the decrease of blood insulin, was also recovered to 94.8% when the sesame bioconversion was administered, while the diabetic control group was reduced to 79.8%.
(2) 당 대사 관련 효소에 대한 조절능 평가 (2) Evaluation of the ability to regulate glucose metabolism enzymes
당 대사 관련 효소 중 인슐린에 의해 조절되는 'Glucose-6-phosphatase (G6pase)', 'Phosphoenolpyruvate carboxykinase (PEPCK)', 'Glucokinase (GCK)'의 활성에 참깨생물전환물의 투여가 미치는 효과를 측정하고자 하였다.To investigate the effect of sesame bioconversion on the activities of glucose-6-phosphatase (G6pase), phosphoenolpyruvate carboxykinase (PEPCK) and glucokinase (GCK) .
당뇨에 의해 혈중 인슐린의 농도가 감소하면, G6pase와 PEPCK가 활성화되어 포도당 신생합성이 촉진되며, GCK의 억제로 인하여 글리코겐의 합성이 억제된다. 따라서, 참깨생물전환물의 투여 시, 인슐린 분비가 회복됨에 따라, 이 세 효소의 활성을 제어할 수 있는지 확인하였다. 그 결과는 하기 표 9에 나타내었다. When the insulin concentration in the blood is reduced by diabetes, G6pase and PEPCK are activated to promote glucose synthesis, and inhibition of glycogen synthesis is inhibited by inhibition of GCK. Therefore, it was confirmed that the activity of these three enzymes can be controlled as the insulin secretion is restored when the sesame bioconversion is administered. The results are shown in Table 9 below.
10 mg/kg 참깨생물전환물Alloxan +
10 mg / kg sesame bioconversion
실험결과, G6pase 활성은 당뇨 유발 시, 정상 마우스 대비 2.4배로 활성이 증가하지만, 참깨생물전환물 투여 시, 정상 마우스 대비 1.3배로 활성 증가가 억제됨을 확인하였다. 또한, PEPCK의 경우, 당뇨 유발 마우스에서 약 1.9배 활성이 증가하였으나, 참깨생물전환물 투여 시, 각각 약 1.3배로 억제되는 것으로 확인되었다. GCK의 경우, 당뇨 유발 시, 정상 마우스 대비 48.2% 수준으로 활성이 감소하였으나, 참깨생물전환물 투여 시, 정상 마우스 대비 85.6% 수준으로 활성이 증가됨을 확인하였다.As a result, the activity of G6pase was 2.4 times higher than that of the normal mouse in the case of diabetic induction. In the case of PEPCK, the activity was increased about 1.9 times in the diabetic mouse, but it was found to be about 1.3 times in the case of the sesame bioconversion. In the case of GCK, the activity was decreased to 48.2% of normal mice when diabetic induced, but it was confirmed that the activity increased to 85.6% of normal mice when the sesame bioconversion was administered.
(3) 간 조직 및 췌장 조직 보호 효과 (3) Protection effect of liver tissue and pancreatic tissue
제1형 당뇨로 인해 유발되는 간 손상을 참깨생물전환물 투여로 억제할 수 있는지 알아보기 위하여 혈중 GOT/GPT 농도의 측정 및 조직 염색을 수행하였다. GOT / GPT levels were measured and tissue staining was performed to determine if liver damage induced by
당뇨 유발 시, GOT는 정상 대비 1.8배 증가하며, GPT는 3.1배 증가하였으나, 참깨생물전환물 투여 시에는 각각 1.3배와 1.5배로 증가폭이 감소하는 것으로 확인되어 당뇨에 의해 유발되는 간 손상을 효과적으로 억제할 수 있음이 확인되었다 (도 12(A)). 도 12(A)는 알록산(alloxan)에 의해 유도되는 제1형 당뇨 마우스에 있어서, 참깨생물전환물의 간 손상 보호 효과를 측정한 그래프이다.In the case of diabetic induction, GOT was increased 1.8 times and GPT was increased 3.1 times, but when the sesame bioconversion was administered, the increase was 1.3 times and 1.5 times, respectively, to effectively suppress the liver damage caused by diabetes (Fig. 12 (A)). Fig. 12 (A) is a graph showing the liver damage protection effect of a sesame bioconversion in a
또한, 간 조직을 적출하여 파라핀 블록 제작 후, 'hematoxylene'과 'eosin Y'로 염색하여 조직의 손상 정도를 확인한 결과, 알록산(alloxan)에 의한 당뇨 유발 시, 간 조직의 손상이 강하게 유도된 데 비해, 참깨생물전환물의 투여 시, 간 손상의 정도가 완화된 것으로 확인되었다 (도 12(B)). 도 12(B)는 알록산(alloxan)에 의해 유도되는 제1형 당뇨 마우스에 있어서, 참깨생물전환물의 간 손상 보호 효과를 촬영한 사진이다. In addition, liver tissue was extracted, and paraffin blocks were stained with 'hematoxylene' and 'eosin Y' to examine the extent of damage to the tissues. As a result, it was shown that when alloxan induced diabetes, , It was confirmed that the degree of liver damage was alleviated upon administration of the sesame bioconversion (Fig. 12 (B)). Fig. 12 (B) is a photograph of the liver damage protection effect of the sesame bioconversion in a
동일한 방법으로 췌장 조직을 염색하여 확인한 결과, 도 13과 같이 당뇨가 유발된 마우스의 췌장 조직 내 랑게르한스섬은 β-세포의 파괴로 인하여 크기가 작아졌으며, 조직이 치밀하지 못한 결과를 보이는데 비해, 참깨생물전환물을 투여한 마우스의 경우, 췌장 랑게르한스섬의 조직 손상이 완화되는 것으로 확인되었다. 도 13은 참깨생물전환물의 췌장 손상 보호 효과를 촬영한 사진이다. As shown in FIG. 13, when the pancreas tissue was stained in the same manner, the size of the Langerhans islet in the pancreatic tissue of the mouse induced diabetes was reduced due to the breakdown of the? -Cell and the result was inadequate, In mice treated with the diets, it was found that the tissue damage of the pancreatic islets was alleviated. FIG. 13 is a photograph showing the protective effect of the sesame biotransformation on pancreatic damage.
[ 실험예 13: 제2형 당뇨 유발 마우스에서의, 참깨생물전환물의 in vivo 제2형 당뇨 억제능 평가] [ Experimental Example 13: Effect of sesame biotransformation on
본 실험예에서는 고지방식이로 인한 비만에 의해 유도되는 제2형 당뇨 마우스 모델에서 참깨생물전환물의 항당뇨 효과를 평가하고자 하였다. In this experiment, we aimed to evaluate the antidiabetic effect of sesame bioconversion in a
(1) 제2형 당뇨 마우스 모델에서 참깨생물전환물의 투여가 체중, 간 무게, 백색지방 무게 변화에 미치는 효과 확인 (1) The effect of sesame bioconversion on the weight, liver weight, and white fat weight changes in the
당뇨 유발용 고지방식이는 'Dyet사'의 제품을 사용하였으며, 식이의 조성은 하기 표 10에 나타내었다. The high fat diet for diabetes induction was manufactured by Dyet Company and the composition of the diet is shown in Table 10 below.
(※ aDyets cat. no. 200000, bDyets cat. no. 310025)(* A Dyets cat No. 200000, b Dyets cat.
한편, 참깨생물전환물을 10 mg/kg의 섭취량으로 고지방식이에 섞어 식이 투여하였으며, 7주간 식이하여 제2형 당뇨를 유발하였다. 7주 후, 마우스의 체중, 간 무게, 백색지방 무게를 측정하였으며, 그 결과는 하기 표 11에 나타내었다. On the other hand, the sesame bioconversion was dietary supplemented with 10 mg / kg of high - fat diets and fed for 7 weeks to induce
참깨생물전환물HFD-10 mg / kg
Sesame Bioconversion
실험결과, 정상 마우스의 경우, 7주 간의 체중 증가가 8.01 g인데 비하여, 제2형 당뇨 유발 마우스는 12.04 g의 체중 증가가 일어났다. As a result, weight gain of 12.04 g in the type II diabetic mouse was observed in normal mice compared with 8.01 g in the weight gain at 7 weeks.
고지방식이 마우스에 참깨생물전환물을 투여한 경우, 9.09 g의 체중 증가를 보여 대조군 대비 체중 증가율이 감소함을 보였다. 간 무게 와 백색지방 무게 또한 당뇨 유발 대조군에 비하여 억제됨을 확인하였다. 다만, 평균 먹이 섭취량의 차이는 보이지 않았으므로 이러한 효과는 먹이의 미섭취 때문은 아닌 것으로 확인되었다.When the high fat diet was administered to the mice with the sesame bioconversion, the body weight gain was 9.09 g, indicating a decrease in body weight gain compared to the control group. Liver weight and white fat weight were also inhibited compared to diabetic control group. However, since the difference in the average food intake was not observed, it was confirmed that this effect was not due to unhealthy food.
(2) 혈당 및 혈청 내 인슐린에 미치는 효과 측정 (2) Measurement of effect on blood glucose and insulin in serum
제2형 당뇨 마우스 모델에서 혈당량 및 혈중 인슐린 농도에 참깨생물전환물의 투여가 미치는 효과를 측정하였으며, 그 결과는 하기 표 12에 나타내었다. The effect of the sesame bioconversion on the blood glucose level and blood insulin concentration in the
혈당 측정결과, 고지방식이 마우스의 경우, 혈당량이 약 1.9배 증가하였으나, 고지방식이 마우스에 참깨생물전환물 투여 시, 약 1.3배로 혈당량의 증가가 억제되었다. As a result of blood glucose measurement, blood glucose level was increased about 1.9 times in the high fat diet mouse, but the blood glucose level was inhibited about 1.3 times in the high fat diet when the sesame bioconversion was administered to the mouse.
혈중 인슐린 농도의 경우, 고지방식이 마우스에서 정상 대비 51.1% 수준으로 감소하여 제2형 당뇨가 유발되는 것으로 확인되었고, 고지방식이 마우스에 참깨생물전환물 투여 시, 정상 대비 69.1%로 회복되는 것으로 확인되었다.In the case of insulin concentration in blood, it was confirmed that the high-fat diet decreased to 51.1% of the normal level in the mouse and the
(3) 당내성(glucose tolerance)에 미치는 효과(3) Effect on glucose tolerance
제2형 당뇨에 의한 혈당조절 장애 측정을 위한 경구 당부하 검사를 실시하였다. 7주간 고지방식이를 섭취한 마우스를 16시간 동안 절식시킨 후, 포도당을 경구 투여하고, 30분 간격으로 마우스 꼬리정맥에서 혈액을 채취하여 혈당량을 측정하였다.Oral glucose tolerance test was performed to measure blood glucose control disorder by
실험결과, 정상 마우스의 경우, 포도당 투여 시, 30분까지 혈당이 증가하며, 그 이후로 감소하기 시작하여 120분 후에는 정상 수치에 가깝게 감소하나 제2형 당뇨가 유발된 마우스의 경우, 이러한 혈당 강하 효과가 크게 감소된 것으로 확인되었다. As a result, in the case of normal mice, the blood glucose level increased until 30 minutes after the administration of glucose, and then decreased after 120 minutes. However, in the case of mice in which type 2 diabetes was induced, It was confirmed that the descent effect was greatly reduced.
고지방식이 마우스에 참깨생물전환물의 투여 시, 전체적인 혈당 증가폭이 감소하는 것으로 확인되었으며, 혈당 증가 억제 및 조절 능력이 뛰어난 것으로 확인되었다 (도 14). 도 14는 제2형 당뇨 마우스에 있어서, 참깨생물전환물의 효과를 나타낸 그래프이다. It was confirmed that the high-fat diet reduced the overall blood glucose increase when the sesame biotransformation was administered to the mice, and it was confirmed that the blood glucose increase inhibition and control ability was excellent (Fig. 14). 14 is a graph showing the effect of a sesame bioconversion in a
(4) 지질 분석(4) Lipid analysis
고지방식이로 인하여 증가하는 혈청 내 지질을 분석한 결과, 제2형 당뇨 마우스의 경우, HDL의 양이 감소하며, 중성지방과 콜레스테롤, LDL의 양은 증가하는 것으로 확인되었다. 고지방식이 마우스에 참깨생물전환물의 투여 시, 감소한 HDL의 양을 회복시키며, 증가된 중성지방과 콜레스테롤, LDL의 양은 억제하는 효과가 있음이 나타났다. 이는 하기 표 13에 나타내었다. Analysis of serum lipids increased by high fat diet showed that the amount of HDL decreased and the amount of triglyceride, cholesterol and LDL increased in
참깨생물전환물HFD-10 mg / kg
Sesame Bioconversion
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(5) 당 대사 관련 효소 조절능 평가(5) Assessment of metabolic enzyme-regulating ability
참깨생물전환물의 투여가 제2형 당뇨로 인해 감소한 인슐린의 분비량을 회복시킴에 따라, G6pase, PEPCK, GCK의 활성을 측정하였다. 그 결과는 하기 표 14에 나타내었다. The activity of G6pase, PEPCK, and GCK was measured as the sesame bioconversion recovers insulin secretion reduced by
참깨생물전환물HFD-10 mg / kg
Sesame Bioconversion
실험결과, 제1형 당뇨와 마찬가지로 참깨생물전환물은 G6pase와 PEPCK의 활성을 억제하며, GCK의 활성을 회복시키는 효과가 있는 것으로 확인되었다. 이로부터, 참깨생물전환물의 효소활성 조절 효과가 우수한 것으로 판단할 수 있었다. The results showed that sesame bioconversion inhibited the activity of G6pase and PEPCK, and regulated the activity of GCK, as did
(6) 염증성 사이토카인 분석 (6) Inflammatory cytokine analysis
비만으로 인한 제2형 당뇨의 유발 기전은 아직 확실히 알려져 있지 않으나, 지방조직에서 분비하는 염증성 사이토카인(cytokine)이 중요한 역할을 한다는 사실이 보고되어 있다. 따라서, 참깨생물전환물의 투여가 지방조직 내 사이토카인(cytokine)의 발현과 혈액 내로 분비된 사이토카인(cytokine)에 어떠한 영향을 미치는지 확인하였다. 그 결과는 하기 표 15에 나타내었다. Although the induction mechanism of
참깨생물전환물HFD-10 mg / kg
Sesame Bioconversion
실험결과, 제2형 당뇨 유발 시, 지방조직과 혈청 내 TNF-α, IL-1β, IL-6 모두 증가하는 것으로 확인되었고, 참깨생물전환물의 투여 시, 3가지 사이토카인(cytokine) 모두 발현이 억제되는 것으로 확인되었다.As a result of the experiment, it was confirmed that both
베타세포의 인슐린 저항성에 가장 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 IL-1β의 경우, 참깨생물전환물 투여 시에는 혈청과 지방조직에서 모두 감소하여 억제 효과를 보였다.In the case of IL-1β, which is known to play the most important role in the insulin resistance of the beta cells, both the serum and the adipose tissue showed a suppressive effect when the sesame bioconversion was administered.
(7) 간 조직 및 췌장 조직 보호 효과 (7) Protection effect of liver tissue and pancreatic tissue
제2형 당뇨를 유발한 마우스에서 간 조직과 췌장 조직을 적출하여 염색한 결과, 당뇨 유발 시, 간에서는 조직의 손상 및 지방의 축적이 관찰되었고, 췌장에서는 랑게르한스섬의 파괴가 관찰되었다. 반면, 참깨생물전환물의 투여시에는 이러한 간 조직의 손상 및 지방 축적이 완화되는 효과를 보였으며, 췌장의 랑게르한스섬 역시 보호되는 효과를 보였다 (도 15(A) 및 도 15(B)). 도 15(A)는 제2형 당뇨 마우스에 있어서, 참깨생물전환물의 간 조직 보호 효과를 촬영한 사진이고, 도 15(B)는 제2형 당뇨 마우스에 있어서, 참깨생물전환물의 췌장 조직 보호 효과를 촬영한 사진이다. When liver and pancreatic tissues were extracted and stained in mice induced
[실험예 14: 간세포에서의, 참깨생물전환물의 in vitro 간 보호 기능 평가] [Experimental Example 14: Evaluation of in vitro liver protective function of sesame bioconduct in hepatocytes ]
본 실험예에서는 참깨생물전환물의 알코올에 의한 간독성 억제 효과를 확인하기 위해 사람 유래 간암 세포주인 HepG2 세포주를 이용하여 실험하였다. In this experiment, HepG2 cell line, a human-derived liver cancer cell line, was used to examine the alcohol-induced hepatotoxicity of sesame biological transformants.
(1) HepG2 세포주를 이용한 세포독성 측정 (1) Cytotoxicity measurement using HepG2 cell line
1x105 cells/well의 밀도로 96 웰 플레이트(well plate)에 HepG2 세포주를 분주한 후, 1, 10, 100 ㎍/mL 농도의 참깨생물전환물과 200 mM의 에탄올을 함께 처리하여 간세포의 사멸을 유도하였다. 24시간 배양 후, MTT assay를 통해 세포의 생존률을 측정하였다.HepG2 cells were seeded in a 96-well plate at a density of 1 × 10 5 cells / well, treated with sesame biotransformers at a concentration of 1, 10, 100 μg / mL and 200 mM of ethanol to kill the hepatocytes Respectively. After 24 hours of culture, cell viability was measured by MTT assay.
실험결과, 참깨생물전환물의 처리 시, 농도 의존적으로 생존률이 증가하였으며, 100 ㎍/mL 농도에서 생존률은 80.1%로 확인되었다 (도 16). 도 16은 알코올에 의해 유도되는 간세포 사멸에 참깨생물전환물이 미치는 억제 효과를 나타낸 그래프이다. As a result of the experiment, the survival rate of the sesame biotransformant was increased in a concentration dependent manner, and the survival rate was 80.1% at the concentration of 100 ㎍ / mL (FIG. 16). 16 is a graph showing an inhibitory effect of sesame bioconversion on alcohol-induced hepatocyte death.
(2) 에탄올 처리에 의해 유도된 ROS 소거 활성 (2) ROS scavenging activity induced by ethanol treatment
간세포에 에탄올 처리 시, 세포의 사멸이 유도되는 기전 중 하나인 ROS의 발생을 참깨생물전환물의 투여로 억제할 수 있는지 확인하였다. 참깨생물전환물을 1, 10, 100 ㎍/mL의 농도로 각각 30분간 처리한 후, 200 mM의 에탄올을 30분간 처리하여 ROS의 발생을 유도하였다. 이후, ROS의 형광 표지자인 DCFH-DA를 처리하여 표지하였고, ROS에 의해 발생한 형광을 측정하였다.We confirmed that the generation of ROS, one of the mechanisms of cell death induced by ethanol treatment of hepatocytes, can be inhibited by the administration of sesame bioconversion. Sesame bioconversion was carried out for 30 minutes at 1, 10, and 100 ㎍ / mL, respectively, followed by treatment with 200 mM ethanol for 30 minutes to induce the development of ROS. Then, DCFH-DA, a fluorescent marker of ROS, was treated and labeled, and the fluorescence generated by ROS was measured.
실험결과, 참깨생물전환물은 농도 의존적인 ROS 생성 억제 능력을 나타내었으며, 100 ㎍/mL 농도에서 37.3%의 ROS 억제 능력이 있음이 확인되었다 (도 17). 도 17은 알코올에 의해 유도되는 간세포에서 ROS 발생에 참깨생물전환물이 미치는 발생 억제 효과를 나타낸 그래프이다. As a result, the sesame bioconversion showed a concentration-dependent inhibition of ROS production, and it was confirmed that ROS inhibition ability was 37.3% at a concentration of 100 ㎍ / mL (FIG. 17). FIG. 17 is a graph showing the inhibitory effect of sesame bioconversion on the generation of ROS in alcohol-induced hepatocytes.
[ 실험예 15: 알코올에 의한 간 손상 유도 마우스에서의, 참깨생물전환물의 in vivo 간 보호 기능 평가] [ Experimental Example 15: Alcohol-Induced Liver Damage Induced Mice, Sesame Bioconversion Evaluation of in vivo liver protection]
본 실험예에서는 in vivo 실험계에서 참깨생물전환물의 알코올성 지방간 억제 효능을 확인하고자 하였다. In this experiment, we investigated the effect of sesame bioconversion on the inhibition of alcoholic fatty liver disease in an in vivo experimental system.
(1) 알코올의 투여로 유도된 알코올성 지방간 마우스 모델에서 간 무게의 변화 (1) Changes in liver weight in alcoholic fatty liver mouse models induced by alcohol administration
in vivo 실험계에서는 'Liber-Decarli' 액체기본식이를 이용한 에탄올 유도 지방간 마우스 모델을 이용하였다. 'Liber-Decarli' 액체기본식이의 조성은 하기 표 16과 같으며, 일반식이를 공급받는 일반식이군 (normal diets, AIN-93G)과 에탄올식이에 포함된 에탄올과 동일한 열량을 말토덱스트린으로 대체한 대조군 (control diet)을 포함하여 실험하였다. The ethanol-induced liver mouse model using the 'Liber-Decarli' liquid basic diet was used in the in vivo experimental system. The composition of the 'Liber-Decarli' liquid basic diet is shown in Table 16 below, and the same calories as the ethanol contained in the normal diets (AIN-93G) and the ethanol diets fed with the normal diet were substituted with maltodextrin Control diet (control diet).
(※ asalt mix (g/kg mix): calcium phosphate, dibasic, 500; sodium chloride, 74; potassium citrate, monohydrate, 220; potassium sulfate, 52; magnesium oxide, 24; manganous sulfate H2O, 4.6; ferrous sulfate 7H2O, 4.95; zinc carbonate, 1.6; cupric carbonate, 0.3; potassium iodate, 0.01; sodium selenite, 0.01; chromium potassium sulfate, 0.55; sodium fluoride, 0.06; sucrose, finely powdered, 117.92./ bvitamin mix (g/kg mix): thiamin HCl, 0.6; riboflavin, 0.6; pyridoxine HCl, 0.7; niacin, 3.0; calcium pantothenate, 1.6; folic acid, 0.2; biotin, 0.02; vitamin B12 (0.1%), 10; vitamin A acetate (500,000 IU/g), 4.8; vitamin D3 (400,000 IU/g), 24; menadione sodium bisulfite, 0.08; p-aminobenzoin acid, 5; inositol, 10; dextrose, 939.)(* A salt mix (g / kg mix): calcium phosphate, dibasic, 500; sodium chloride, 74; potassium citrate, monohydrate, 220; potassium sulfate, 52 magnesium oxide, 24 manganous sulfate, , 4.95; zinc carbonate, 1.6; cupric carbonate, 0.3; potassium iodate, 0.01; sodium selenite, 0.01; chromium potassium sulfate, 0.55; sodium fluoride, 0.06; sucrose, finely powdered, 117.92./ b vitamin mix (g / kg mix ), vitamin A12 (0.1%), vitamin A acetate (500,000 IU / ml), thiamin HCl, 0.6, riboflavin, 0.6, pyridoxine HCl, 0.7, niacin, 3.0, calcium pantothenate, 1.6, folic acid, 0.2, biotin, g), 4.8, vitamin D3 (400,000 IU / g), 24 menadione sodium bisulfite, 0.08, p-aminobenzoic acid, 5, inositol, 10, dextrose, 939.)
참깨생물전환물은 10 mg/kg의 섭취량으로 에탄올식이에 첨가하여 총 8주간 식이하여 에탄올에 의한 지방간 및 간염을 유도하였다. Sesame bioconverts were added to ethanol diet at a dose of 10 mg / kg for a total of 8 weeks to induce fatty liver and hepatitis by ethanol.
8주 후, 마우스의 체중과 간 무게를 측정한 결과, 에탄올식이군의 경우, 간의 염증 및 지방간의 발생으로 인하여 간 무게/체중 비율이 정상 마우스 대비 13.0% 증가하는 것으로 확인되었다. 하지만, 참깨생물전환물을 투여한 경우, 1.1% 증가하는 것으로 확인되어 간 조직 내 염증 반응 및 지방간 형성을 억제하는 것으로 판단되었다 (도 18). 도 18은 알코올에 의해 유도되는 간 손상 마우스에 있어서, 참깨생물전환물의 투여로 인한 간 무게 증가 억제 효과를 나타낸 그래프이다. After 8 weeks, the weight and liver weight of the mice were measured. As a result, it was confirmed that the liver weight / body weight ratio was increased by 13.0% compared to that of the normal mice due to inflammation and fatty liver in the ethanol diet group. However, when the sesame bioconversion was administered, it was confirmed that it increased by 1.1%, and thus it was judged to inhibit the inflammatory reaction and fatty liver formation in liver tissue (FIG. 18). 18 is a graph showing the effect of inhibiting liver weight increase due to administration of a sesame bioconversion in an alcohol-induced liver damaged mouse.
(2) 혈청 내 생화학적 지표의 측정 (2) Measurement of serum biochemical indicators
마우스의 혈청을 분리한 후, 혈청 내 존재하는 생화학적 지표들을 측정하여 간손상 여부를 확인하였다. 그 결과는 하기 표 17에 나타내었다. After isolating the mouse serum, biochemical markers present in the serum were measured to confirm liver damage. The results are shown in Table 17 below.
참깨생물전환물Ethanol diet-10 mg / kg
Sesame Bioconversion
실험결과, 에탄올에 의해 간손상이 유도된 마우스는 네 가지 생화학적 지표가 모두 증가하였으나, 참깨생물전환물를 함께 투여한 경우에는 정상수치에 가깝게 감소하는 것으로 확인되었다.Experimental results showed that all of the four biochemical markers were increased in ethanol - induced liver injury, but they were found to be close to the normal values when the sesame bioconversion was administered together.
(3) 간 조직 내 항산화물질의 변화 (3) Changes in antioxidants in liver tissues
환원형 GSH는 산화적 스트레스에 대한 세포 보호 효과를 보이지만, 알코올에 의해 간 독성이 유발되면 글루타치온(glutathione)이 산화되어 GSSG로 전환되고, 간 독성을 제어하지 못하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 간 조직 내 대표적 항산화물질인 글루타치온(glutathione, GSH)의 양과 형태를 측정하였다. 그 결과는 하기 표 18에 나타내었다. Reduced GSH shows cytoprotective effect against oxidative stress, but it is known that when alcohol induced liver toxicity, glutathione is oxidized to GSSG and does not control liver toxicity. Therefore, the amount and type of glutathione (GSH), a representative antioxidant in liver tissue, were measured. The results are shown in Table 18 below.
(㎍/mg tissue)Total GSH
([Mu] g / mg tissue)
(㎍/mg tissue)Reduced GSH
([Mu] g / mg tissue)
(㎍/mg tissue)GSSG / GSH ratio
([Mu] g / mg tissue)
참깨생물전환물Ethanol diet-10 mg / kg
Sesame Bioconversion
알코올을 식이한 마우스의 경우, 총 GSH의 양과 환원형 GSH의 양이 모두 감소되어 있으며, GSSG/GSH 비율 역시 정상 대비 1.38배 증가한 결과를 보였다. 반면, 참깨생물전환물을 처리한 경우, 총 GSH 양의 증가, 환원형 GSH 양의 증가가 일어났으며, 특히 GSSG/GSH 비율은 정상수치에 근접하게 감소하는 것으로 확인되었다.In the alcohol-fed mice, both the total amount of GSH and the amount of reduced GSH were decreased, and the ratio of GSSG / GSH was 1.38 times higher than the normal value. On the other hand, when treated with sesame bioconversion, the total GSH amount and the reduced GSH amount were increased, and the GSSG / GSH ratio was found to be decreased to the normal value.
(4) 간 조직 보호 효과 (4) Protection effect of liver tissue
마우스를 희생한 뒤 간을 적출하여 'hematoxylene'과 'eosin Y'로 염색한 후, 조직의 손상 및 지방축적 정도를 확인하였다. The mice were sacrificed and liver was extracted and stained with 'hematoxylene' and 'eosin Y'.
실험결과, 정상 마우스와 대조군 식이 마우스는 간 손상 및 지방 축적이 없는데 비해 에탄올 식이 마우스에서는 간 조직의 손상과 출혈, 지방의 축적이 다량으로 일어난 것을 확인하였다. 하지만, 참깨생물전환물을 투여한 경우에는 에탄올에 의한 간 손상이 강하게 억제되는 것으로 나타났으며, 지방 축적 또한 매우 적게 일어나는 것으로 확인되어 참깨생물전환물의 간 보호 효과가 뛰어난 것으로 확인되었다 (도 19). 도 19는 알코올에 의해 유도되는 간 손상 마우스에 있어서, 참깨생물전환물의 투여로 인한 간 손상 보호 효과를 촬영한 사진이다. Experimental results showed that normal mice and control mice had no hepatic lesions and no fat accumulation, whereas hepatocyte damage, hemorrhage, and fat accumulation occurred in ethanol - fed mice. However, when the sesame bioconversion was administered, liver damage caused by ethanol was strongly inhibited, and fat accumulation was also found to be very low. Thus, it was confirmed that the liver protection effect of the sesame bioconversion was excellent (Fig. 19) . FIG. 19 is a photograph showing the protective effect of liver damage caused by administration of a sesame bioconversion in an alcohol-induced liver damaged mouse.
[실시예 2: 면역활성 유효성분(다당체) 분리·정제][Example 2: Isolation and purification of immunological active ingredient (polysaccharide)] [
(1) 분리·정제공정(1) Separation and purification process
참깨생물전환물로부터 다당체분획물을 수득하는 제조과정은 도 20과 같다. 분말화된 참깨생물전환물(실시예 1)에 약 20배수의 3차증류수를 첨가하여 수용성물질을 추출하였다. 수용성물질 추출 후 원심분리를 통해 잔사를 제거하고 추출상등액을 분리하였다. 추출상등액에 상등액의 4배수에 해당하는 양의 EtOH을 첨가하여 잘 섞어준 후, 4℃에서 밤새 보관하였다. The production process for obtaining polysaccharide fractions from sesame bioconverts is shown in Fig. To the pulverized sesame bioconversion (Example 1) about 20 times of the third distilled water was added to extract the water-soluble substance. After extracting the water soluble substance, the residue was removed by centrifugation and the extract supernatant was separated. To the extract supernatant was added EtOH in an amount corresponding to four times that of the supernatant, mixed well, and stored at 4 ° C overnight.
생성된 침전물을 원심분리를 통해 분리하고, 상등액을 제거한 침전물에 3차증류수를 첨가해 용해시킨 후, 원심분리 또는 여과를 통해 용해되지 않은 물질을 제거하였다. 여과된 침전물용해액에 대해 투석용 튜브를 사용하여 투석을 진행하였다. 2시간에 한 번씩 3차증류수를 교체하고, 이를 10회 이상 반복하였다. 투석완료 후 동결건조를 통해 분말화하였다.The resulting precipitate was separated by centrifugation, and the supernatant was removed. The precipitate was dissolved by adding tertiary distilled water, and the undissolved material was removed by centrifugation or filtration. Dialysis was carried out using a dialysis tube for the filtered precipitate solution. The third distilled water was changed every 2 hours, and this was repeated 10 times or more. After completion of the dialysis, it was pulverized through lyophilization.
(2) 다당체분획물의 분석(2) Analysis of polysaccharide fractions
다당체분획물의 분석에 사용한 기기는 Shimadzu LC 010Avp (Shimadzu Co., Japan)로 분석조건은 아래 표와 같았다.The instrument used for the analysis of the polysaccharide fractions was Shimadzu LC 010Avp (Shimadzu Co., Japan), and the analysis conditions were as follows.
원심분리 후 분석100 mg of the sample was shaken with 10 ml of HPLC water at 250 rpm for 1 hour,
Analysis after centrifugation
50L 발효조에서 생산된 제1배치의 참깨생물전환물을 사용하여 분리정제를 통해 다당체분획물을 제조하였다. 참깨생물전환물의 다당체분획물을 HPLC로 분석한 결과, 모두 저분자물질이 잘 제거되고 면역활성 다당체의 분획이 잘 이루어졌음을 크로마토그램의 피크를 통해 확인하였다. 하기 표 20은 다당체분획물의 회수율을 보여준다. Polysaccharide fractions were prepared by separation purification using sesame bioconducts of the first batch produced in a 50 L fermenter. Analysis of the polysaccharide fractions of sesame bioconverted by HPLC showed that the fractions of immunologically active polysaccharides were well removed from all chromatogram peaks. Table 20 below shows the recovery rates of the polysaccharide fractions.
한편, 참깨생물전환물의 다당체분획물 제조공정별로 샘플을 채취하여, 공정에 따른 크로마토그램 패턴변화를 분석하였다. 비교물질로 상황버섯 균사체 유래의 면역활성 다당체로 항암치료에 사용되고 있는 전문의약품인 메시마캅셀550을 사용하였다. On the other hand, a sample was collected for each polysaccharide fraction production process of the sesame bioconversion, and the chromatogram pattern change according to the process was analyzed. As a comparative substance, Mesima Capsule 550, which is an immunoactive polysaccharide derived from Mycelia mycelium and used for chemotherapy, was used.
참깨생물전환물의 불용성물질을 제거한 상등액을 젤 필트레이션 (filtration) HPLC를 통해 분석한 결과, 도 21에서 보듯이 18.7분대에서 저분자물질의 피크가 나타났으며, 8.3분대에서 고분자의 다당체분획 피크가 검출되었다. The supernatant from which the insoluble material of the sesame biotransformation was removed was analyzed by gel filtration HPLC. As shown in FIG. 21, the peak of the low molecular weight substance was observed at 18.7 minutes and the peak of the polysaccharide fraction of the polymer was detected at 8.3 minutes .
저분자물질의 피크의 용출액과 고분자의 다당체분획 피크의 용출액에 대한 대식세포 NO생성능을 측정한 결과, 고분자의 다당체분획 피크에서만 대식세포 NO생성능이 관찰되었다. As a result of measuring the macrophage NO production ability of the eluate of the peak of the low molecular substance and the eluate of the polysaccharide fraction peak of the polymer, only macrophage NO production ability was observed in the polysaccharide fraction peak of the polymer.
EtOH침전공정과 투석공정을 진행 후, 저분자물질이 제거되어 분석 시 저분자물질의 피크가 감소함을 확인하였고 동결건조 후에도 큰 변화가 없음을 확인하였다.After the EtOH precipitation process and the dialysis process, the low molecular weight material was removed and the peak of the low molecular weight material was decreased. Also, it was confirmed that no significant change was observed after freeze drying.
[실험예 16: 대식세포 NO 생성 측정을 통한 대식세포 활성화능 평가] [Experimental Example 16: Assessment of macrophage activation ability by measurement of macrophage NO production]
50L 발효조에서 생산된 제1배치의 참깨생물전환물을 사용하여, 다당체분획물을 제조하였고, 대식세포 NO 생성능을 측정하여 대식세포 활성화능을 평가하였다.Polysaccharide fractions were prepared using the first batch of sesame bioconversion produced in a 50 L fermenter and the ability of macrophage NO production was measured to evaluate macrophage activation.
측정 결과, 50L 제1배치의 참깨생물전환물로부터 제조한 다당체분획물의 NO 생성능은 참깨생물전환물 대비 큰 폭으로 향상되었음을 확인할 수 있었다. 제1배치에서 생산된 참깨생물전환물로부터 제조한 다당체분획물의 면역활성역가 MEC100은 대략 1/4 ㎍/ml 임을 확인할 수 있었다 (도 22).As a result of the measurement, it was confirmed that the NO production ability of the polysaccharide fraction prepared from the sesame biotransformant of the first batch of 50 L was significantly improved as compared with the sesame biotransformant. It was confirmed that the polysaccharide fraction prepared from the sesame biotransformant produced in the first batch had an immunostimulatory activity MEC 100 of about 1/4 占 퐂 / ml (FIG. 22).
[ 실험예 17: 대식세포에서의 사이토카인 분비패턴 조사 및 수용체 유추 해석] [ Experimental Example 17: Analysis of cytokine secretion pattern in macrophages and analysis of receptor solubility ]
최근 면역활성을 나타내는 다당체에 의한 마크로파지(macrophage) 활성화, NK세포 자극활성 및 사이토카인(cytokine) 생산 자극 등과 같은 여러 생리활성에 대한 연구결과들이 속속 발표되고 있다. Recently, research results on various physiological activities such as macrophage activation, NK cell stimulating activity and stimulation of cytokine production by polysaccharide showing immunological activity have been continuously announced.
또한, 면역활성을 나타내는 다당체의 특이적 구조가 대식세포 등 면역세포들이 세포표면에 발현하고 있는 특이수용체인 패턴인식수용체(pattern recognition receptor, PRR)에 인식되면서 신호전달을 매개한다고 밝혀지고 있다. In addition, the specific structure of the polysaccharide exhibiting immunological activity is known to be a pattern recognition receptor (PRR), which is a specific receptor expressing on the cell surface, such as macrophages, and it is known that it mediates signal transduction.
이러한 연구결과들에 근거하여, 앞에서 확립된 분리정제공정을 통해 제조된 참깨생물전환물의 다당체분획물도 면역세포의 특이수용체인 패턴인식수용체에 인식되어 신호전달이 매개되는지를 확인하고자 하였다. 우선, 대식세포에서의 사이토카인 분비패턴 비교를 통해 특이수용체(specific receptor)를 유추하였고, 이를 확인하기 위하여 유추된 특이수용체에 대한 저해제(inhibitor)를 처리하여 신호전달이 차단되는지 확인하는 실험도 함께 진행하였다. Based on these results, we tried to confirm whether the polysaccharide fractions of sesame bioconverts produced by the separation and purification process established above were recognized in pattern recognition receptors, which are specific receptors of immune cells, and mediated signal transduction. First, a specific receptor was deduced from the comparison of cytokine secretion patterns in macrophages. In order to confirm this, an experiment was carried out to examine whether signaling is blocked by treating an inhibitor against the specific receptor expressed .
저해제 처리 실험을 통해 참깨생물전환물에 대한 특이수용체가 패턴인식수용체의 하나인 TLR4(Toll-like receptor4)임을 확인할 수 있었으며, TLR4의 리간드(ligand)로 잘 알려진 LPS와 함께 TLR4 아고니스트(agonist)로 입증된 면역조절소재인 MPLA와의 비교를 통해 참깨생물전환물의 면역활성 특성을 조사하였다. The TLR4 (Toll-like receptor4) receptor was identified as a specific receptor for the sesame bioconversion. TLR4, a TLR4 ligand, and TLR4 agonist, The immunoreactivity of sesame bioconductors was investigated by comparison with MPLA, a proven immunomodulator.
우선, 참깨생물전환물 다당체분획물의 면역활성을 확인하기 위하여 대식세포에서의 사이토카인 분비패턴을 조사하였다. 대조군 물질로는 LPS(Lipopolysaccharide)를 각각 0.01 ㎍/mL, 0.1 ㎍/mL, 1 ㎍/mL의 농도를 처리하였으며, 참깨생물전환물은 0.08 ㎍/mL, 0.8 ㎍/mL, 8 ㎍/mL의 농도로 처리한 반면 참깨생물전환물의 다당체분획물은 LPS와 동일한 농도인 0.01 ㎍/mL, 0.1 ㎍/mL, 1 ㎍/mL의 농도로 실험을 수행하였다. 참깨생물전환물의 처리농도 설정은 참깨생물전환물로부터 다당체분획물의 회수율이 반복실험을 통해 약 12%로 나왔기 때문에 이를 근거로 하여 농도를 설정하였다. First, the secretory pattern of cytokines in macrophages was examined in order to confirm the immunological activity of polysaccharide fractions of sesame bioconvert. As a control, LPS (Lipopolysaccharide) was treated at concentrations of 0.01 ㎍ / mL, 0.1 ㎍ / mL and 1 ㎍ / mL, respectively. The sesame bioconduct was treated with 0.08 ㎍ / mL, 0.8 ㎍ / mL and 8 ㎍ / mL While the polysaccharide fractions of the sesame bioconversion were tested at the concentrations of 0.01 ㎍ / mL, 0.1 ㎍ / mL, and 1 ㎍ / mL, which are the same as those of LPS. The concentration of the sesame bioconversion was determined based on the recovery rate of the polysaccharide fractions from the sesame bioconversion, which was about 12% through repeated experiments.
(2) TNF-α 분비량 평가 (2) Evaluation of TNF-α secretion amount
시료 처리 후 16시간에 대식세포 배양상등액을 취하여 TNF-α(Tumor necrosis factor-α)의 분비 여부 및 농도를 ELISA(Enzyme linked immuno solvent assay)로 분석하였다.Sixteen hours after the sample treatment, the supernatants of the macrophage culture were taken and the secretion and concentration of TNF-α (Tumor necrosis factor-α) were analyzed by ELISA (enzyme linked immuno solvent assay).
분석 결과는 도 23과 같이 나타났다. 참깨생물전환물의 경우, 처리농도 0.08 ㎍/mL에서부터 TNF-α가 분비되는 것을 확인할 수 있었으며, 처리농도가 증가함에 따라 TNF-α의 분비량도 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 참깨생물전환물 다당체분획물의 경우 0.01 ㎍/mL의 처리농도에서부터 TNF-α가 분비되기 시작해서 0.1 ㎍/mL, 1 ㎍/mL로 처리농도가 증가함에 따라 TNF-α의 분비량이 증가하는 것을 확인할 수 있었으며, 분비량 정도는 회수율을 근거로 설정한 농도에서의 참깨생물전환물의 TNF-α 분비량과 비슷한 수치를 나타내었다. 또한, 참깨생물전환물과 참깨생물전환물 다당체분획물 모두에서 농도가 증가할수록 TNF-α 분비량이 유사하게 증가함을 보임을 확인하였다. The results of the analysis are shown in FIG. In the case of sesame bioconversion, it was confirmed that TNF-α was secreted from the treatment concentration of 0.08 μg / mL. As the treatment concentration increased, the secretion amount of TNF-α also increased. In the sesame bioconverted polysaccharide fraction, the secretion of TNF-α increased from 0.01 μg / mL to 0.1 μg / mL and 1 μg / mL. And the level of secretion was similar to that of TNF-α in the sesame bioconversion at the concentration determined based on the recovery rate. In addition, it was confirmed that the TNF-α secretion amount was similarly increased with increasing concentration in both sesame bioconversion and sesame bioconversion polysaccharide fractions.
이를 통해 참깨생물전환물에 함유된 여러 물질들 중에서 다당체 성분이 대식세포의 특이수용체에 인식되어 신호전달을 매개하여 TNF-α를 분비하게 만드는 유효성분임을 확인할 수 있었다. It was confirmed that polysaccharide component was recognized as a specific receptor of macrophage among several substances contained in sesame bioconversion, and thus it was confirmed that TNF-α is secreted by mediating signal transduction.
또한, 참깨생물전환물 다당체분획물과 LPS의 TNF-α 분비량을 비교하였을 때, 0.01 ㎍/mL에서는 LPS가 더 높은 분비량을 나타냈으나, 0.1 ㎍/mL 및 1 ㎍/mL의 농도에서는 서로 비슷한 정도의 TNF-α 분비량을 보였다.In addition, when LPS was secreted at a concentration of 0.01 ㎍ / mL, the amount of TNF-α secreted by the polysaccharide fraction of sesame bioconverted polysaccharide was higher than that of LPS at the concentration of 0.1 ㎍ / mL and 1 ㎍ / mL TNF-a < / RTI >
(3) IL-1β 분비량 평가(3) Evaluation of IL-1β secretion amount
시료 처리 후 16시간에 대식세포 배양상등액을 취하여, IL-1β(Interlukine-1β)의 분비 여부 및 농도를 ELISA(Enzyme linked immuno solvent assay)로 분석하였다.16 hours after the sample treatment, the supernatants of the macrophage culture were taken and the secretion and concentration of IL-1β (Interlukine-1β) were analyzed by ELISA (enzyme linked immuno solvent assay).
분석 결과, LPS, 참깨생물전환물 및 참깨생물전환물 다당체분획물 모두 농도와 관계없이 현저히 낮은 수치로 나타나거나, 수치가 전혀 나오지 않는 양상을 나타내었다 (미도시). As a result, the LPS, sesame bioconversion, and sesame bioconversion polysaccharide fractions exhibited a remarkably low value or no value at all, regardless of their concentrations (not shown).
(4) IL-4 분비량 평가(4) Evaluation of IL-4 secretion amount
시료 처리 후 16시간에 대식세포 배양상등액을 취하여 IL-4(Interlukine-4)의 분비 여부 및 농도를 ELISA(Enzyme linked immuno solvent assay)로 분석하였다.At 16 hours after the sample treatment, the supernatant of macrophage culture was taken and the secretion and concentration of IL-4 (Interlukine-4) were analyzed by ELISA (enzyme linked immuno solvent assay).
분석 결과, LPS, 참깨생물전환물 및 참깨생물전환물 다당체분획물 모두 농도와 관계없이 현저히 낮은 수치로 나타나거나, 수치가 전혀 나오지 않는 양상을 나타내었다 (미도시). As a result, the LPS, sesame bioconversion, and sesame bioconversion polysaccharide fractions exhibited a remarkably low value or no value at all, regardless of their concentrations (not shown).
(5) IL-5 분비량 평가(5) Evaluation of IL-5 secretion amount
시료 처리 후 16시간에 대식세포 배양상등액을 취하여 IL-5(Interlukine-5)의 분비 여부 및 농도를 ELISA(Enzyme linked immuno solvent assay)로 분석하였다.16 hours after the sample treatment, the supernatant of macrophage culture was taken and the secretion and concentration of IL-5 (Interlukine-5) were analyzed by ELISA (enzyme linked immuno solvent assay).
분석 결과, LPS, 참깨생물전환물 및 참깨생물전환물 다당체분획물 모두 농도와 관계없이 현저히 낮은 수치로 나타나거나, 수치가 전혀 나오지 않는 양상을 나타내었다 (미도시). As a result, the LPS, sesame bioconversion, and sesame bioconversion polysaccharide fractions exhibited a remarkably low value or no value at all, regardless of their concentrations (not shown).
(6) IL-6 분비량 평가(6) Evaluation of IL-6 secretion amount
시료 처리 후 16시간에 대식세포 배양상등액을 취하여 IL-6(Interlukine-6)의 분비 여부 및 농도를 ELISA(Enzyme linked immuno solvent assay)로 분석하였다.Sixteen hours after the sample treatment, the culture supernatant of macrophages was collected and the secretion and concentration of IL-6 (Interlukine-6) were analyzed by ELISA (enzyme linked immuno solvent assay).
분석 결과는 도 23과 같았다. 참깨생물전환물의 경우, 처리농도 0.8 ㎍/mL에서부터 IL-6가 분비되기 시작하여 8 ㎍/mL에서 IL-6의 분비량이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. The results of the analysis are shown in FIG. In the case of sesame bioconversion, IL-6 secretion started from the treatment concentration of 0.8 ㎍ / mL, and the secretion of IL-6 was increased at 8 ㎍ / mL.
참깨생물전환물 다당체분획물의 경우 0.01 ㎍/mL의 농도에서부터 IL-6가 소량 분비되기 시작하여 처리농도가 증가함에 따라 IL-6의 분비량도 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 참깨생물전환물과 참깨생물전환물 다당체분획물의 농도가 증가할수록 IL-6 분비량이 유사한 분비량을 보임을 확인하였다. In the sesame bioconverted polysaccharide fraction, the amount of IL-6 secretion increased as the concentration of IL-6 started to increase from 0.01 ㎍ / mL. In addition, it was confirmed that the IL-6 secretion amount showed a similar amount as the concentration of sesame bioconversion and sesame bioconversion polysaccharide fraction increased.
이를 통해 참깨생물전환물에 함유된 여러 물질들 중에서 다당체 성분이 대식세포의 특이수용체에 인식되어 신호전달을 매개하여 IL-6를 분비하게 만드는 유효성분임을 확인할 수 있었다. It was confirmed that among the various substances contained in the sesame bioconversion, the polysaccharide component was recognized as a specific receptor of macrophages, and thus, it was confirmed to be effective for mediating signal transduction and secretion of IL-6.
참깨생물전환물 다당체 분획물과 LPS의 IL-6 분비량을 비교하였을 때, 0.1 ㎍/mL 및 1 ㎍/mL의 농도에서는 LPS에 의한 IL-6의 분비량이 조금 낮게 나타났다.When the IL-6 secretion level of the sesame bioconverted polysaccharide fraction was compared with that of LPS, the level of IL-6 secretion by LPS was slightly lower at the concentrations of 0.1 ㎍ / mL and 1 ㎍ / mL.
(7) IL-10 분비량 평가(7) Evaluation of IL-10 secretion amount
시료 처리 후 16시간에 대식세포 배양상등액을 취하여 IL-10(Interlukine-10)의 분비 여부 및 농도를 ELISA(Enzyme linked immuno solvent assay)로 분석하였다.16 hours after the sample treatment, the supernatant of macrophage culture was taken and the secretion and concentration of IL-10 (Interlukine-10) were analyzed by ELISA (enzyme linked immuno solvent assay).
분석 결과는 도 23과 같았다. 참깨생물전환물의 경우, 8 ㎍/mL에서 IL-10의 분비량이 측정되는 것을 확인할 수 있었다. 참깨생물전환물 다당체분획물의 경우 1 ㎍/mL에서 IL-10의 분비량이 측정되었다. The results of the analysis are shown in FIG. In sesame bioconversion, the amount of IL-10 secretion was measured at 8 ㎍ / mL. In the sesame bioconversion polysaccharide fraction, the secretion amount of IL-10 was measured at 1 ㎍ / mL.
참깨생물전환물과 참깨생물전환물 다당체분획물의 IL-10 분비량이 고농도에서 유사하게 측정된 것을 확인하였다. 이를 통해 참깨생물전환물에 함유된 여러 물질들 중에서 다당체 성분이 대식세포의 특이수용체에 인식되어 신호전달을 매개하여 IL-10을 분비하게 만드는 유효성분임을 확인할 수 있었다. It was confirmed that IL-10 secretion levels of sesame bioconversion and sesame bioconversion polysaccharide fractions were similarly measured at high concentrations. It was confirmed that polysaccharide component of various substances contained in sesame bioconversion is recognized as a specific receptor of macrophages, and thus, it is an efficacy that mediates signal transduction and secretes IL-10.
LPS의 IL-10 분비량을 비교하였을 때, 0.01 ㎍/mL의 처리농도에서부터 IL-10이 분비되기 시작해서 0.1 ㎍/mL, 1 ㎍/mL로 처리농도가 증가함에 따라 IL-10의 분비량이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 참깨생물전환물 다당체분획물과 비교하여 1 ㎍/mL에서 LPS와 참깨생물전환물 다당체분획물에서 IL-10의 분비량이 서로 비슷한 정도로 나타났다.When IL-10 secretion level of LPS was compared, IL-10 secretion increased from 0.01 ㎍ / mL to 0.1 ㎍ / mL and 1 ㎍ / mL, and IL-10 secretion increased . Compared with the sesame bioconversion polysaccharide fraction, the amount of IL-10 secretion in the polysaccharide fraction of LPS and sesame bioconvert at 1 ㎍ / mL was similar to that of the polysaccharide fraction.
(8) IL-12p70 분비량 평가(8) Evaluation of secretion of IL-12p70
시료 처리 후 16시간에 대식세포 배양상등액을 취하여 IL-12p70(Interlukine-12p70)의 분비 여부 및 농도를 ELISA(Enzyme linked immuno solvent assay)로 분석하였다.16 hours after the sample treatment, the supernatant of the macrophage culture was taken and the secretion and concentration of IL-12p70 (Interlukine-12p70) were analyzed by ELISA (enzyme linked immuno solvent assay).
분석 결과, LPS, 참깨생물전환물 및 참깨생물전환물 다당체분획물 모두 농도와 관계없이 현저히 낮은 수치로 나타나거나, 수치가 전혀 나오지 않는 양상을 나타내었다 (미도시).As a result, the LPS, sesame bioconversion, and sesame bioconversion polysaccharide fractions exhibited a remarkably low value or no value at all, regardless of their concentrations (not shown).
(9) IFN-β 분비량 평가(9) Evaluation of IFN-beta secretion amount
시료 처리 후 16시간에 대식세포 배양상등액을 취하여 IFN-β(Interferon-β)의 분비 여부 및 농도를 ELISA(Enzyme linked immuno solvent assay)로 분석하였다.At 16 hours after the sample treatment, the supernatant of the macrophage culture was taken and the secretion and concentration of IFN-β (Interferon-β) were analyzed by ELISA (enzyme linked immuno solvent assay).
분석 결과는 도 23과 같았다. 참깨생물전환물의 경우 처리농도 0.08 ㎍/mL에서부터 IFN-β가 분비되는 것을 확인할 수 있었고, 처리농도가 증가함에 따라 IFN-β의 분비량도 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 참깨생물전환물 다당체분획물의 경우 0.01 ㎍/mL의 처리농도에서부터 IFN-β가 분비되기 시작해서 0.1 ㎍/mL, 1 ㎍/mL로 처리농도가 증가함에 따라 IFN-β의 분비량이 증가하는 것을 확인할 수 있었으며, 분비량 정도는 회수율을 근거로 설정한 농도에서의 참깨생물전환물의 IFN-β 분비량과 비슷한 수치를 나타내었다. 또한, 참깨생물전환물과 참깨생물전환물 다당체분획물의 IFN-β 분비량이 농도가 증가할수록 유사하게 증가함을 확인하였다. The results of the analysis are shown in FIG. In the sesame bioconversion, IFN-β was secreted from 0.08 ㎍ / mL at the treatment concentration, and the secretion of IFN-β was also increased with increasing treatment concentration. In sesame bioconversion polysaccharide fractions, the secretion of IFN-β increased from 0.01 μg / mL to 0.1 μg / mL and 1 μg / mL, indicating that the secretion of IFN-β increased And the amount of secretion was similar to the amount of IFN-β secreted from the sesame bioconversion at the concentration set based on the recovery rate. In addition, it was confirmed that the IFN-β secretion level of the sesame bioconversion and sesame bioconversion polysaccharide fractions increased similarly as the concentration increased.
이를 통해 참깨생물전환물에 함유된 여러 물질들 중에서 다당체 성분이 대식세포의 특이수용체에 인식되어 신호전달을 매개하여 IFN-β를 분비하게 만드는 유효성분임을 확인할 수 있었다. LPS의 IFN-β 분비량을 비교하였을 때 농도 의존적으로 분비량이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 참깨생물전환물 다당체분획물과 비교하여 LPS가 상대적으로 약간 높게 나타났다.It was confirmed that the polysaccharide component was recognized as a specific receptor of macrophages among the various substances contained in the sesame bioconversion, and thus it was confirmed that it is effective to secrete IFN-β by mediating signal transduction. When the amount of IFN-beta secreted by LPS was compared, it was confirmed that the amount of secretion increased in a concentration-dependent manner. The LPS was slightly higher than the sesame bioconversion polysaccharide fraction.
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(10) 결과 분석(10) Analysis of results
참깨생물전환물의 면역활성 관련 사이토카인을 분석한 결과, TNF-α, IL-6, IL-10 및 IFN-β가 발현되는 것을 확인할 수 있었으며, 참깨생물전환물의 상기 면역활성은 다당체분획물에 기인한 것임을 확인할 수 있었다. TNF-α, IL-6, IL-10 and IFN-β were expressed in the sesame bioconversion. As a result, the immunological activity of the sesame biotransformant was confirmed by the polysaccharide fraction .
비교물질인 LPS와 비교평가 시, LPS에서도 TNF-α, IL-6, IFN-β의 cytokine 분비패턴 양상이 참깨생물전환물 다당체분획물과 유사함은 물론 IL-1β, IL-4, IL-5, IL-12p70도 함께 분비되지 않음을 확인할 수 있었다. In comparison with LPS, the cytokine secretion patterns of TNF-α, IL-6 and IFN-β in LPS were similar to those of sesame bioconvert polysaccharide fractions and IL-1β, IL-4 and IL-5 , And IL-12p70 were not secreted together.
LPS는 TLR4(Toll-loke receptor4)에 인식되는 물질로 잘 알려져 있는 바, 이를 통해 참깨생물전환물 다당체분획물이 TLR4에 인식되어 신호를 매개할 것이라 유추해석 할 수 있었다. LPS is well known as TLR4 (Toll-lokreceptor4), and it can be interpreted as a polysaccharide fraction of sesame biotransformers recognized by TLR4 and mediating signals.
한편, TNF-α는 탐식작용 시 대식세포와 단핵세포 등에서 분비되며, 유도성 NO (inducible nitric oxide; NO)와 함께 독감바이러스 등의 다양한 바이러스에 대하여 항바이러스 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 또한, IL-6는 항원 특이 면역반응, 염증반응, 급성반응에서의 주요 중개자(mediator)이며, 생체내 방어체계에서 핵심역할을 담당하는 대표적 사이토카인이다. IFN-β는 IFN-α와 함께 타입 I 인터페론으로 항균, 항바이러스 효과가 있으며, 특히 Th1 세포의 분화에 기여하여 Th1 면역반응을 유도하는 대표적인 사이토카인으로 Th1 면역반응을 유도하는 반면, Th2 및 Th17 면역반응을 억제하는 면역조절 기능이 있는 사이토카인이다. On the other hand, TNF-α is secreted from macrophages and mononuclear cells during phagocytosis and is known to have an antiviral effect against various viruses such as influenza virus along with inducible nitric oxide (NO). In addition, IL-6 is a major mediator in antigen-specific immune responses, inflammatory responses, and acute responses, and is a representative cytokine that plays a key role in the in vivo defense system. IFN-β is a type I interferon in combination with IFN-α and has antiviral and antiviral effects. In particular, it induces Th1 immune response as a typical cytokine which induces Th1 immune response by contributing to Th1 cell differentiation, while Th2 and Th17 It is a cytokine with an immunoregulatory function that suppresses the immune response.
결론적으로 활성화시킨 대식세포에서 인터페론-β의 생성이 유도됨을 확인하여 Th1 면역반응을 특이적으로 활성화시킬 수 있는 소재로 판단되며, 이들의 면역활성은 모두 고분자 다당체분획물에 의해 나타남을 확인할 수 있었다.In conclusion, it was confirmed that the production of interferon-β was induced in the activated macrophages, and it was judged that the Th1 immune response could be specifically activated. All of these immunological activities were confirmed by the polysaccharide fraction of the polymer.
[실험예 18: 수용체(Receptor) 확인][Experimental Example 18: Confirmation of Receptor]
(1) 실험 개요(1) Outline of experiment
현재까지 개발된 많은 면역소재의 경우, 대부분 수용체(receptor)가 확인되고 있지 않으며, 일부 베타글루칸 제품만이 주로 덱틴(dectin)-1 이라는 수용체에 결합한다고 알려져 있다. 하지만, 베타글루칸 제품조차도 불용성소재의 경우 덱틴-1에 결합하는 반면, 수용성소재는 덱틴-1에 결합하지 않는 것으로 알려져 있다. Many of the immunomaterials developed so far have not been identified with receptors, and only some beta glucan products are known to bind to receptors called dectin-1. However, even beta-glucan products are known to bind to Dextin-1 in the case of insoluble materials, while water-soluble materials do not bind to Dextin-1.
수용체가 알려져 있으면, 바이오마커가 확정될 수 있으며, 이를 바탕으로 의약품 및 동물용의약품 개발의 임상시험에 있어서도 바이오마커의 설정에 활용이 가능하다는 장점이 있다. If the receptor is known, the biomarker can be determined, and on the basis of this, there is an advantage that the biomarker can be used in the clinical test for the development of pharmaceuticals and veterinary pharmaceuticals.
앞선 실험결과들을 바탕으로 참깨생물전환물 및 참깨생물전환물 다당체분획물의 수용체가 TLR4임을 유추한 바, 참깨생물전환물 및 참깨생물전환물 다당체분획물이 TLR4에 특이적으로 인식되어 신호를 매개하는 것인지 확인하기 위하여 TLR4에 대한 특이적 저해제인 TAK-242를 사용하여 최종 확인하고자 하였다.Based on the results of previous experiments, it was concluded that TLR4 is a receptor for the sesame bioconversion and sesame bioconversion polysaccharide fractions, and that sesame bioconversion and sesame bioconversion polysaccharide fractions are specific to TLR4 and mediate the signal We used TAK-242, a specific inhibitor for TLR4, to confirm the results.
(2) TNF-α 분비량 평가 (2) Evaluation of TNF-α secretion amount
시료 처리 후 16시간에 대식세포 배양상등액을 취하여 TNF-α(Tumor necrosis factor-α)의 분비 여부 및 농도를 ELISA(Enzyme linked immuno solvent assay)로 분석하였다.Sixteen hours after the sample treatment, the supernatants of the macrophage culture were taken and the secretion and concentration of TNF-α (Tumor necrosis factor-α) were analyzed by ELISA (enzyme linked immuno solvent assay).
분석 결과는 도 24와 같이 나타났다. LPS의 경우, 0.01 ㎍/ml 및 0.1 ㎍/ml의 농도에 있어서, TLR4 저해제인 TAK-242를 처리하였을 때, TNF-α의 분비량이 완전히 차단됨을 확인할 수 있었으며, 1 ㎍/ml의 고농도에 있어서는 매우 크게 대폭 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 참깨생물전환물의 경우에서도 0.08 ㎍/ml의 농도에 있어서, TLR4 저해제인 TAK-242를 처리했을 때, TNF-α의 분비량이 완전히 차단됨을 확인할 수 있었으며, 0.8 ㎍/ml 및 8 ㎍/ml의 고농도에 있어서는 매우 크게 대폭 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 참깨생물전환물 다당체분획물의 경우에 있어서도 0.01 ㎍/ml 및 0.1 ㎍/ml의 농도에 있어서 TAK-242를 처리했을 때, 마찬가지로 TNF-α의 분비량이 완전히 차단됨을 확인할 수 있었으며, 1 ㎍/ml의 고농도에 있어서는 매우 크게 대폭 감소하는 것을 확인할 수 있었다.The results of the analysis are shown in FIG. In the case of LPS, it was confirmed that when the TLR4 inhibitor TAK-242 was treated at a concentration of 0.01 μg / ml and 0.1 μg / ml, the secretion amount of TNF-α was completely blocked. At a high concentration of 1 μg / ml And it was confirmed that the decrease greatly greatly. In the case of the sesame bioconversion, it was confirmed that the TNF-α secretion level was completely blocked when the TLR4 inhibitor TAK-242 was treated at a concentration of 0.08 μg / ml, and a high concentration of 0.8 μg / ml and 8 μg / ml It can be confirmed that the decrease is remarkably greatly reduced. In the case of the sesame bioconversion polysaccharide fraction, it was also confirmed that when TAK-242 was treated at a concentration of 0.01 μg / ml and 0.1 μg / ml, the secretion amount of TNF-α was completely blocked, and 1 μg / ml It was confirmed that the concentration at the high concentration was greatly reduced greatly.
TLR4 저해제인 TAK-242 처리시 TNF-α의 분비가 완전히 차단되거나 매우 크게 대폭 감소되는 결과에 근거하여 참깨생물전환물과 참깨생물전환물의 다당체가 LPS와 마찬가지로 TLR4에 특이적으로 결합, 인식되어 TNF-α 분비 신호가 매개됨을 확인할 수 있었다.Based on the results that the secretion of TNF-α was completely blocked or greatly reduced during treatment with the TLR4 inhibitor TAK-242, polysaccharides of sesame biotransformants and sesame bioconductors were specifically bound to TLR4 and recognized as TNF -α secretion signal was mediated.
(3) IL-6 분비량 평가(3) Evaluation of IL-6 secretion amount
시료 처리 후 16시간에 대식세포 배양상등액을 취하여 IL-6(Interlukine-6)의 분비 여부 및 농도를 ELISA(Enzyme linked immuno solvent assay)로 분석하였다.Sixteen hours after the sample treatment, the culture supernatant of macrophages was collected and the secretion and concentration of IL-6 (Interlukine-6) were analyzed by ELISA (enzyme linked immuno solvent assay).
분석 결과는 도 24와 같이 나타났다. LPS의 경우 3가지 농도 모두에서 TLR4 저해제인 TAK-242를 처리하였을 때, IL-6의 분비가 완전히 차단되는 것을 확인할 수 있었다. 참깨생물전환물의 경우에도 3가지 농도 모두에서 TLR4 저해제인 TAK-242를 처리했을 때, IL-6의 분비가 완전히 차단됨을 확인할 수 있었다. 참깨생물전환물 다당체분획물의 경우에 있어서도, 3가지 농도 모두에서 TAK-242를 처리했을 때, 마찬가지로 IL-6의 분비가 완전히 차단됨을 확인할 수 있었다.The results of the analysis are shown in FIG. In the case of LPS, the TLR4 inhibitor TAK-242 was completely blocked at all three concentrations, confirming that IL-6 secretion was completely blocked. In the case of the sesame bioconversion, it was also confirmed that when the TLR4 inhibitor TAK-242 was treated at all three concentrations, the secretion of IL-6 was completely blocked. In the case of sesame bioconverted polysaccharide fractions, it was confirmed that when TAK-242 was treated at all three concentrations, secretion of IL-6 was completely blocked as well.
TLR4 저해제인 TAK-242 처리시 IL-6의 분비가 완전히 차단되는 결과에 근거하여 참깨생물전환물과 참깨생물전환물의 다당체가 LPS와 마찬가지로 TLR4에 특이적으로 결합, 인식되어 IL-6 분비 신호가 매개됨을 확인하였다. The TLR4 inhibitor, TAK-242, completely blocked the secretion of IL-6, and the polysaccharide of the sesame bioconversion and sesame bioconversion was specifically bound to TLR4 like IL-4, and IL-6 secretion signal Respectively.
(4) IL-10 분비량 평가(4) Evaluation of IL-10 secretion amount
시료 처리 후 16시간에 대식세포 배양상등액을 취하여 IL-10(Interlukine-10)의 분비 여부 및 농도를 ELISA(Enzyme linked immuno solvent assay)로 분석하였다.16 hours after the sample treatment, the supernatant of macrophage culture was taken and the secretion and concentration of IL-10 (Interlukine-10) were analyzed by ELISA (enzyme linked immuno solvent assay).
분석 결과는 도 24와 같았다. LPS의 경우, 3가지 농도 모두에서 TLR4 저해제인 TAK-242를 처리하였을 때, IL-10의 분비가 완전히 차단되는 것을 확인할 수 있었다. 참깨생물전환물의 경우에도 TLR4 저해제인 TAK-242를 처리했을 때, IL-10의 분비가 완전히 차단됨을 확인할 수 있었다. 참깨생물전환물 다당체분획물의 경우에 있어서도, TLR4 저해제인 TAK-242를 처리했을 때, 마찬가지로 IL-10의 분비가 완전히 차단됨을 확인할 수 있었다.The results of the analysis are shown in FIG. In the case of LPS, when the TLR4 inhibitor TAK-242 was treated at all three concentrations, the secretion of IL-10 was completely blocked. In the case of sesame bioconversion, it was also confirmed that when the TLR4 inhibitor TAK-242 was treated, the secretion of IL-10 was completely blocked. In the case of the sesame bioconversion polysaccharide fraction, it was also confirmed that when the TLR4 inhibitor TAK-242 was treated, the secretion of IL-10 was completely blocked as well.
TLR4 저해제인 TAK-242 처리시 IL-10의 분비가 완전히 차단되는 결과에 근거하여 참깨생물전환물과 참깨생물전환물의 다당체가 LPS와 마찬가지로 TLR4에 특이적으로 결합, 인식되어 IL-10 분비 신호가 매개됨을 확인하였다. The TLR4 inhibitor, TAK-242, completely blocked the secretion of IL-10, and the polysaccharide of the sesame bioconversion and sesame bioconversion was specifically bound to TLR4 like IL-10, Respectively.
(5) IFN-β 분비량 평가(5) Evaluation of IFN-beta secretion amount
시료 처리 후 16시간에 대식세포 배양상등액을 취하여 IFN-β(Interferon-β)의 분비 여부 및 농도를 ELISA(Enzyme linked immuno solvent assay)로 분석하였다.At 16 hours after the sample treatment, the supernatant of the macrophage culture was taken and the secretion and concentration of IFN-β (Interferon-β) were analyzed by ELISA (enzyme linked immuno solvent assay).
분석 결과는 도 24와 같았다. LPS의 경우, 3가지 농도 모두에서 TLR4 저해제인 TAK-242를 처리하였을 때, IFN-β의 분비가 완전히 차단되는 것을 확인할 수 있었다. 참깨생물전환물의 경우에도 3가지 농도 모두에서 TLR4 저해제인 TAK-242를 처리했을 때, IFN-β의 분비가 완전히 차단됨을 확인할 수 있었으며, 참깨생물전환물 다당체분획물의 경우에 있어서도 3가지 농도 모두에서 TLR4 저해제인 TAK-242를 처리했을 때, 마찬가지로 IFN-β의 분비량이 완전히 차단됨을 확인할 수 있었다.The results of the analysis are shown in FIG. In the case of LPS, the secretion of IFN-β was completely blocked by treatment with the TLR4 inhibitor TAK-242 at all three concentrations. In the case of sesame bioconversion, the secretion of IFN-β was completely blocked by treatment with the TLR4 inhibitor TAK-242 at all three concentrations. In the sesame bioconversion polysaccharide fraction, When the TLR4 inhibitor TAK-242 was treated, it was confirmed that the secretion amount of IFN-β was completely blocked.
TLR4 저해제인 TAK-242 처리시, IFN-β의 분비가 완전히 차단되는 결과에 근거하여 참깨생물전환물과 참깨생물전환물의 다당체가 LPS와 마찬가지로 TLR4에 특이적으로 결합, 인식되어 IFN-β 분비 신호가 매개됨을 확인하였다. On the basis of the result that the secretion of IFN-β was completely blocked during the treatment with the TLR4 inhibitor TAK-242, the polysaccharide of the sesame bioconversion and the sesame bioconversion was specifically bound to TLR4 similarly to LPS, .
(6) 결과 분석(6) Analysis of results
참깨생물전환물의 대식세포 면역활성은 다당체분획물에 의해 나타남을 확인하였으며, 대식세포 활성화에 의해 나타나는 반응들은 TLR4 특이적 저해제인 TAK242에 의해 모두 억제되어 TLR4가 참깨생물전환물의 수용체임을 확인함으로써, 본 발명에서 추구하는 생물전환공정에 의해 생산된 참깨생물전환물 및 참깨생물전환물 다당체분획물은 TLR4 아고니스트의 활성을 갖고 있음을 확인할 수 있었다.The macrophage immunoactivity of the sesame bioconversion was confirmed by the polysaccharide fraction. The responses induced by macrophage activation were all suppressed by the TLR4-specific inhibitor TAK242, confirming that TLR4 is a receptor for sesame bioconversion, The sesame bioconversion product and the sesame bioconversion polysaccharide fraction produced by the bioconversion process pursued in the present invention have activity of the TLR4 agonist.
Claims (6)
상기 단계 (a) 후, 상기 액상배지에 표고버섯 균사를 접종하고, 배양하여 배양물을 제조하는 단계 (b);
상기 단계 (b)후, 상기 배양물에 섬유소분해효소를 첨가하여 반응시키는 단계 (c); 를 포함하는 과정으로부터 제조되는 참깨생물전환물을 함유하며,
상기 참깨생물전환물은 다당체(polysaccharide)인 것을 특징으로 하는 고지혈증 개선용 식품 조성물.
(A) adding at least one selected from the group consisting of amylase and cellulase to sesame seeds, reacting them, and sterilizing them to prepare a liquid medium;
(B) after the step (a), inoculating the mushroom mycelium into the liquid medium and culturing to produce a culture;
(C) after the step (b), adding the fibrolytic enzyme to the culture and reacting; Which comprises a sesame bioconversion product produced from a process comprising the steps of:
Wherein the sesame bioconversion product is a polysaccharide.
상기 참깨생물전환물은,
중성지방 및 저밀도 콜레스테롤(LDL-cholesterol)의 생성을 억제하고, 고밀도 콜레스테롤(HDL-cholesterol)의 생성을 증가시키는 것을 특징으로 하는 고지혈증 개선용 식품 조성물.
The method according to claim 1,
The sesame bioconversion product,
Wherein said composition inhibits the production of triglyceride and low-density cholesterol (LDL-cholesterol) and increases the production of high-density cholesterol (HDL-cholesterol).
상기 다당체는,
단계 (c)를 통해 수득한 참깨생물전환물에, 증류수를 첨가하여 수용성물질을 추출하는 단계 (가);
상기 수용성물질 추출 후, 원심분리를 통해 잔사를 제거하고, 추출상등액을 분리하는 단계 (나);
상기 추출상등액에, EtOH을 첨가하여 잘 섞어주고, 유지하는 단계 (다);
상기 유지 후, 생성된 침전물을 분리하는 단계 (라);
상기 분리한 침전물에, 증류수를 첨가하여 침전물을 용해시킨 후, 원심분리 또는 여과를 통해 용해되지 않은 물질을 제거하는 단계 (마); 및
상기 원심분리 또는 여과 과정을 거친 침전물용해액에 대해 투석을 수행하는 단계 (바);를 더 포함하는 과정으로부터 수득된 것을 특징으로 하는 고지혈증 개선용 식품 조성물.
The method according to claim 1,
The polysaccharide,
(A) adding distilled water to the sesame bioconversion obtained through step (c) to extract a water-soluble substance;
Removing the residue through centrifugation after extracting the water-soluble substance, and separating the extracted supernatant (B);
Adding EtOH to the extracted supernatant, mixing and maintaining (c);
Separating the resulting precipitate after said holding (d);
Adding distilled water to the separated precipitate to dissolve the precipitate, and then removing undissolved material by centrifugation or filtration; And
(Vi) dialyzing the sediment lysis solution after the centrifugation or the filtration step. [Claim 11] The composition for improving hyperlipemia according to claim 1,
상기 단계 (a) 후, 상기 액상배지에 표고버섯 균사를 접종하고, 배양하여 배양물을 제조하는 단계 (b);
상기 단계 (b)후, 상기 배양물에 섬유소분해효소를 첨가하여 반응시키는 단계 (c); 를 포함하는 과정으로부터 제조되는 참깨생물전환물을 함유하며,
상기 참깨생물전환물은 다당체(polysaccharide)인 것을 특징으로 하는 고지혈증 예방 또는 치료용 약학조성물.
(A) adding at least one selected from the group consisting of amylase and cellulase to sesame seeds, reacting them, and sterilizing them to prepare a liquid medium;
(B) after the step (a), inoculating the mushroom mycelium into the liquid medium and culturing to produce a culture;
(C) after the step (b), adding the fibrolytic enzyme to the culture and reacting; Which comprises a sesame bioconversion product produced from a process comprising the steps of:
Wherein the sesame bioconversion product is a polysaccharide.
상기 참깨생물전환물은,
중성지방 및 저밀도 콜레스테롤(LDL-cholesterol)의 생성을 억제하고, 고밀도 콜레스테롤(HDL-cholesterol)의 생성을 증가시키는 것을 특징으로 하는 고지혈증 예방 또는 치료용 약학조성물.
5. The method of claim 4,
The sesame bioconversion product,
(HDL-cholesterol) by inhibiting the production of triglyceride, triglyceride, and low-density cholesterol (LDL-cholesterol), and increasing the production of high-density cholesterol (HDL-cholesterol).
상기 다당체는,
단계 (c)를 통해 수득한 참깨생물전환물에, 증류수를 첨가하여 수용성물질을 추출하는 단계 (가);
상기 수용성물질 추출 후, 원심분리를 통해 잔사를 제거하고, 추출상등액을 분리하는 단계 (나);
상기 추출상등액에, EtOH을 첨가하여 잘 섞어주고, 유지하는 단계 (다);
상기 유지 후, 생성된 침전물을 분리하는 단계 (라);
상기 분리한 침전물에, 증류수를 첨가하여 침전물을 용해시킨 후, 원심분리 또는 여과를 통해 용해되지 않은 물질을 제거하는 단계 (마); 및
상기 원심분리 또는 여과 과정을 거친 침전물용해액에 대해 투석을 수행하는 단계 (바);를 더 포함하는 과정으로부터 수득된 것을 특징으로 하는 고지혈증 예방 또는 치료용 약학조성물.
5. The method of claim 4,
The polysaccharide,
(A) adding distilled water to the sesame bioconversion obtained through step (c) to extract a water-soluble substance;
Removing the residue through centrifugation after extracting the water-soluble substance, and separating the extracted supernatant (B);
Adding EtOH to the extracted supernatant, mixing and maintaining (c);
Separating the resulting precipitate after said holding (d);
Adding distilled water to the separated precipitate to dissolve the precipitate, and then removing undissolved material by centrifugation or filtration; And
And (ii) dialyzing the sediment lysis solution subjected to centrifugation or filtration. The pharmaceutical composition for preventing or treating hyperlipidemia according to claim 1,
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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JP2000239170A (en) | 1999-02-18 | 2000-09-05 | Toshihiko Osawa | Diabetes meritus-treating agent |
JP2004173692A (en) * | 2002-11-14 | 2004-06-24 | Oubiken:Kk | Method for producing fermented sesame |
JP2007091653A (en) | 2005-09-29 | 2007-04-12 | Rheology Kino Shokuhin Kenkyusho:Kk | Medicinal composition, and medicine and health food containing the composition |
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2017
- 2017-07-10 KR KR1020170087350A patent/KR101853701B1/en active IP Right Grant
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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