KR101853646B1

KR101853646B1 - 대기압 플라즈마를 이용한 지르코니아 임플란트의 표면처리 방법

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Publication number: KR101853646B1
Application number: KR1020160153724A
Authority: KR
Inventors: 임현필; 이선기; 지민경; 박상원; 이광민; 조훈성
Original assignee: 전남대학교 산학협력단
Priority date: 2016-11-18
Filing date: 2016-11-18
Publication date: 2018-05-02

Abstract

본 발명은 대기압 플라즈마를 이용한 지르코니아 임플란트의 표면처리 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 지르코니아 임플란트의 표면을 상온 대기압 플라즈마를 이용하여 처리함으로써 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis) 세균의 부착을 억제함과 함께 조골세포의 부착능을 향상시킬 수 있는 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 제조방법에 의하면 지르코니아 임플란트의 표면을 상온 대기압 플라즈마를 이용하여 처리함으로써 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis) 세균 부착의 증가를 방지함과 함께 조골세포의 부착능을 향상시킬 수 있는 효과가 있다.

Description

대기압 플라즈마를 이용한 지르코니아 임플란트의 표면처리 방법{Method for treating surface of Zirconia implant using atmospheric pressure plasma}

본 발명은 대기압 플라즈마를 이용한 지르코니아 임플란트의 표면처리 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 지르코니아 임플란트의 표면을 상온 대기압 플라즈마를 이용하여 처리함으로써 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis) 세균의 부착을 억제함과 함께 조골세포의 부착능을 향상시킬 수 있는 제조방법에 관한 것이다.

티타늄과 티타늄 합금은 치과용 임플란트 재료로서 널리 사용되어 왔으나, 티타늄 알레르기 면역 반응과 금속으로 인한 심미적인 불리함으로 인해 새로운 임플란트 재료의 필요성이 대두되고 있다.

지르코니아는 치아와 유사한 색깔, 기계적으로 우수한 성질, 생체적합성, 그리고 낮은 치태 부착성과 같은 특성으로 인하여 임플란트 재료로 적합한 것으로 인식되고 있다.

치아나 구강 점막에 생긴 치면 생물막(biofilm)은 구강 내 임플란트 주변의 감염을 일으키는 임플란트주위염을 포함하여, 치아우식, 치주질환, 구강점막염 등을 일으킨다. 이러한 생물막은 여러가지 세균총으로 이루어져 있으며, 이 중 red complex중 하나인 Porphyromonas gingivalis는 진행성 치주염을 가진 환자의 치주낭에서 흔히 발견되는 세균이다.

이러한 임플란트주위염을 가진 환자의 세균군 변화에 대한 종래 연구에서 P. gingivalis가 임플란트에 집락화된 것을 발견하였으며, 특히 6mm 이상의 임플란트 치주낭을 가진 환자에서 얻어진 세균 DNA를 분석한 결과 P. gingivalis가 존재함을 확인한 연구결과도 존재한다.

따라서 진행된 임플란트주위염의 치료에서 후기 집락균의 감소는 임플란트주위염을 감소시키고, 임플란트의 긍정적인 예후를 기대할 수 있도록 한다.

임플란트주위염을 치료하는 방법에는 기계적인 제거와 소독치료, 그리고 항생제 치료 요법 등이 있다. 소독치료와 항생제등을 이용한 치료는 임플란트주위염을 치료하는데 제한적이며, 표면에 부착된 세균막을 기계적으로 제거하는 술식이 필수적이라는 한계가 있다. 그리고, 기계적으로 제거하는 요법은 임플란트 표면에 손상을 줄 가능성이 높기 때문에 탄소 섬유 큐렛 등 임플란트 표면의 손상을 최소화하는 특수화된 기구를 사용해야 하는 어려움이 있다.

따라서 임플란트주위염의 보다 효과적인 치료법 개발이 요구되고 있는 실정이다.

등록특허번호 제10-1252767호(2013.04.03. 등록)

본 발명자들은 상기와 같은 종래 기술의 제반 단점과 문제점을 해결하기 위해 연구 노력한 결과 지르코니아 임플란트의 표면을 대기압 플라즈마를 이용하여 처리함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis) 세균 부착의 증가를 방지함과 함께 조골세포의 부착능을 향상시킬 수 있는 지르코니아 임플란트의 표면처리 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적은 이상에서 언급한 목적으로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 목적들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 지르코니아 임플란트를 준비하는 단계; 및 대기압 플라즈마를 이용하여 상기 지르코니아 임플란트의 표면을 처리하는 단계;를 포함하며, 상기 대기압 플라즈마를 이용한 표면처리는 60 내지 300 sec 범위의 일정 시간동안 수행하는 것을 특징으로 하는 대기압 플라즈마를 이용한 지르코니아 임플란트의 표면처리 방법을 제공한다.

바람직한 실시예에 있어서, 상기 대기압 플라즈마는 상온 대기압 플라즈마 발생장치를 이용하여 발생시킨다.

바람직한 실시예에 있어서, 상기 지르코니아 임플란트의 표면처리 방법은 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis) 세균 부착의 증가를 방지함과 함께, 조골세포의 부착능을 향상시킨다.

바람직한 실시예에 있어서, 상기 대기압 플라즈마 발생장치는 아르곤 99.2%와 산소 0.8%의 혼합기체를 이용한다.

바람직한 실시예에 있어서, 상기 대기압 플라즈마 발생장치는 300W의 파워에서 10 L/min의 속도로 플라즈마를 발생시켜 처리한다.

바람직한 실시예에 있어서, 상기 지르코니아 임플란트는 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis) 세균에 의해 오염된 지르코니아 임플란트이다.

본 발명은 다음과 같은 우수한 효과가 있다.

본 발명의 제조방법에 의하면 지르코니아 임플란트의 표면을 상온 대기압 플라즈마를 이용하여 처리함으로써 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis) 세균 부착의 증가를 방지함과 함께 조골세포의 부착능을 향상시킬 수 있는 효과가 있다.

도 1 및 도 2는 본 발명의 실험예에 따른 지르코니아 시편의 주사전자현미경(SEM) 사진으로서, 각각 15,000배율과 5,000배율로 촬영한 사진이다.
도 3은 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis) 세균의 부착능 실험에 대한 crystal violet의 값을 보여주는 그래프이다.
도 4는 조골세포의 부착 정도를 보여주는 주사전자현미경사진이다.
도 5는 조골세포 활성화능 평가(24시간 플라즈마 처리)에 대한 XTT assay 결과값을 보여주는 그래프이다.
도 6은 조골세포 활성화능 평가(48시간 플라즈마 처리)에 대한 XTT assay 결과값을 보여주는 그래프이다.
도 7 및 도 8은 조골세포 활성화능 평가(각각 72시간과 96시간 플라즈마 처리)에 대한 XTT assay 결과값을 보여주는 그래프이다.

본 발명에서 사용되는 용어는 가능한 현재 널리 사용되는 일반적인 용어를 선택하였으나, 특정한 경우는 출원인이 임의로 선정한 용어도 있는데 이 경우에는 단순한 용어의 명칭이 아닌 발명의 상세한 설명 부분에 기재되거나 사용된 의미를 고려하여 그 의미가 파악되어야 할 것이다.

이하, 첨부한 도면 및 바람직한 실시 예들을 참조하여 본 발명의 기술적 구성을 상세하게 설명한다.

그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화 될 수도 있다. 명세서 전체에 걸쳐 본 발명을 설명하기 위해 사용되는 동일한 참조번호는 동일한 구성요소를 나타낸다.

먼저, 본 발명은 지르코니아 임플란트의 표면을 처리함에 있어서 대기압 플라즈마를 이용하여 표면을 처리하는 것에 그 기술적 특징이 있다.

따라서, 본 발명의 지르코니아 임플란트의 표면처리 방법은 지르코니아 임플란트를 준비하는 단계; 및 대기압 플라즈마를 이용하여 상기 지르코니아 임플란트의 표면을 처리하는 단계;를 포함하며, 상기 대기압 플라즈마를 이용한 표면처리는 60 내지 300 sec 범위의 일정 시간동안 수행하는 것을 특징으로 한다.

여기서 상기 대기압 플라즈마는 상온 대기압 플라즈마 발생장치를 이용하여 발생시키는데, 60 내지 300 sec 범위의 일정 시간동안 대기압 플라즈마 처리를 수행함으로써 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis) 세균 부착의 증가를 방지함과 함께, 조골세포의 부착능을 향상시킬 수 있다. 후술하겠지만, 대기압 플라즈마 처리를 60초 이내로 수행하면 조골세포의 부착능이 향상되지 않으며, 대기압 플라즈마 처리를 300초 이상으로 수행하면 조골세포의 부착능은 향상되나 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis) 세균의 부착이 유의하게 증가하므로 상기 범위 내에서 대기압 플라즈마 처리를 수행하는 것이 바람직하다.

상기 대기압 플라즈마 발생장치는 아르곤 99.2%와 산소 0.8%의 혼합기체를 이용하며, 300W의 파워에서 10 L/min의 속도로 지르코니아 임플란트의 표면에 플라즈마를 발생시켜 처리한다.

본 발명의 지르코니아 임플란트의 표면처리 방법은 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis) 세균에 의한 임플란트주위염을 가진 지르코니아 임플란트의 치료에도 사용할 수 있는바, 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis) 세균에 의해 오염된 지르코니아 임플란트를 사용할 수 도 있다.

실시예 1

지르코니아 시편 준비

디스크 형태의 예비 소결(1℃/min의 승온 속도로 1040℃까지 올린 다음 90분간 유지 후 로냉)된 지르코니아(Zirmonⓡ, Kuwotech, Korea) 시편을 완전 소결하였다. 소결은 소성로(Kavo therm, Biberach, Germany)에서 5℃/min의 승온 속도로 1450℃까지 상승시킨 후, 2시간 동안 유지 후 천천히 가열로 안에서 냉각하여 완전 소결하였다. 최종적으로 소결된 시편은 직경 15mm, 두께 2.5 mm로 제작하였으며, 이후 동일한 표면 형태를 만들기 위해 연마기(LaboPol-5, Struers Co. UK)를 이용하여 #800 SiC 연마지로 연마하였다. 모든 시편들은 초음파 세척기를 이용하여 세척하였는데, 아세톤과 알코올 그리고 증류수의 순서로 20분 동안 세척하였다. 그 다음 모든 시편들을 상온에서 건조한 후, autoclave(HS-3460SD, Hanshin Medical Co, Korea)을 이용하여 소독하였다. 본 발명의 실시예에서 사용한 지르코니아 시편의 조성은 아래 [표 1]과 같다.

조성	조성비(wt%)
ZrO₂	94.58
Y₂O₃	5.37
Al₂O₃	0.05

인공타액

구강 안과 유사한 상황을 연출하기 위해 돼지 위에서 유래한 mucin(M1778, Sigma-aldrich Inc., Mo, USA)을 구하여 adherence buffer을 이용하여 1% 농도의 mucin을 가진 인공타액을 제조하였다. 제조된 인공타액은 냉장상태로 보관하였으며, 실험직전 37℃의 온수에 2시간 중탕하여 사용하였다. 제조된 인공타액의 조성은 아래 [표 2]과 같다.

조성(Component)	양(Quantity)
KH₂PO₄	10 mM/L
KC	50 mM/L
CaCl₂	1 mM/L
MgCl₂	0.1 mM/L
pH	7.0
Mucin	1%

세균배양

임플란트주위염을 일으키는 세균으로 알려진 그람 음성 간균 혐기성 세균인P. gingivalis(KCOM 2804)은 한국구강미생물자원은행(Korean Collection for Oral Microbiology, KCOM, Gwangju, Korea)에서 구하였다. P. gingivalis 균주는 TSB(Tryptic Soy Broth; Becton, Dickinson and Company, Washington DC, USA)배지에서 37℃의 혐기성 조건하에 배양하였다. 배양된 세균의 흡광도를 측정하여 1.5 X 10⁷ CFU/ml의 세균농도로 희석한 후 사용하였다.

조골세포 배양

조골세포주인 osteoblastic-like cell(MC3T3-E1)은 10% fetal bovine serum (FBS)과 100 U/ml penicillin/streptomycin이 포함된 alpha minimum essential medium(α-MEM; Gibco-BRL, Grand Island, NY, USA) 배지와 함께 37℃, 5% CO₂를 유지하는 이산화탄소 배양기에서 배양하였다. 배양배지는 2일에 한 번씩 교체하였으며, Trypsin-EDTA 용액을 이용하여 세포를 배양하였다.

대기압 플라즈마 처리

대기압 플라즈마 발생장치(PGS-200, Expantech Co, Korea)는 Ar(99.2%)/O₂(0.8%) 조성의 혼합 기체를 이용하였으며, 300W의 파워에서 10 L/min의 속도로 지르코니아 시편에 적용하여 처리하였다. 대기압 플라즈마 적용 시 불꽃의 길이는 20mm로 유지하였다. 지르코니아 시편은 원형의 지그(jig)를 이용하여 고정하였으며, 300rpm으로 회전하도록 하였다. 시편이 회전함과 동시에 플라즈마가 좌우측으로 왕복 이동하여 지르코니아 시편에 고르게 대기압 플라즈마가 적용될 수 있도록 하였다. 왕복은 1회당 10초로 설정하였으며, 각 플라즈마 적용시간에 부합되도록 자동 반복하였다. 본 발명의 실시예에서 사용한 대기압 플라즈마 발생장치의 파라미터는 아래 [표 3]와 같다.

파라미터(Parameter)	값(Value)
Average working power (W)	300
Voltage (V)	27
Frequency (MHz)	900
Atmospheric pressure (Torr)	760
Electrode type	Electrodeless
Cooling type	Air cooled
Plasma density	10¹⁵/cm³
Primary gas, Ar (%)	99.2
Secondary gas, O2 (%)	0.8
SLPM* (L/min)	10
Rotation speed (rpm)	300
Plasma spray distance (mm)	20

*: Standard liter per minute

표면 특성평가

시편의 표면 원소변화를 평가하기 위해 에너지 분산형 엑스선 분석(EDX:energy-dispersive x-ray spectroscopy, S-4700, Hitachi, Japan)과 X선 광전자분광법(XPS: x-ray photo electron spectroscopy, VG Mulrilab 2000, Thermo scientific, UK)을 시행하였다. 친수성 변화에 대한 평가는 시편의 표면에 증류수를 4㎕ 떨어뜨린 후, 10초 후 물방울과 표면이 이루는 각도를 접촉각 측정기(Phoenix 300ⓡ, SEO Inc, Korea)를 이용하여 각각 3번에 걸쳐 측정 후 분석하였다(Surfaceware9 softwareⓡ, SEO Inc., Korea).

분석결과, 지르코니아 표면에 대기압 플라즈마 처리를 통한 군(60s군, 120s군, 180s군)에서 대기압 플라즈마를 처리하지 않는 군(대조군)에 비해 접촉각이 감소한 것을 관찰하였다(아래 [표 4] 참조).

	대조군	60s	120s	180s
시편 1	52.7352.73	24.98	24.85	20.28
시편 2	56.43	18.84	23.10	25.00
시편 3	52.32	34.11	21.92	18.85
평균(Mean±SD^*)	53.83±1.85	25.98±6.27	23.29±1.20	21.56±2.57

(*: 표준편차, Standard Deviation)

대조군의 평균 접촉각은 53.83°이었으며, 60s군, 120s군, 180s군에서는 각각 평균 25.98°, 23.29°, 21.56°의 접촉각을 보였다. 특히, 300초 이상 플라즈마 처리 시 증류수를 시편에 접촉시키자마자 즉시 퍼지는 것을 확인하였다.

대기압 플라즈마 처리 후 세균 부착능 평가

모든 시편은 멸균처리 하였으며 이중 40개는 대기압 플라즈마 처리 시간(0초, 60초, 300초, 600초)에 따라 10개씩 총 4개의 군(대조군, 60s군, 300s군, 600s군)으로 나누었다(아래 [표 5] 참조). 모든 시편은 12 well plate내에 넣고 인공타액을 1 ml씩 분주한 후 실온에서 2시간동안 교반하여 반응시켰다. 반응 후 인공타액을 흡인 제거하고 15분간 자연건조 하였다. 각 군에 1.5 X 10⁷ CFU/ml의 세균 농도로 희석한 P. gingivalis를 100 ㎕ 분주하여, 접촉하도록 하고, 이후 각 well에 액체배지 900㎕를 첨가하고 혐기성 조건하에 48시간 배양하였다. 48시간 배양 후 12 well plate내의 시편을 PBS 세척 후, 지르코니아 시편에만 부착된 P. gingivalis의 양을 측정하기 위해 새로운 24 well plate에 조심히 옮긴 후 PBS로 다시 세척하였다. 이후 0.3% crystal violet solution으로 10분간 염색한 후 흡인 제거하였으며, PBS를 이용하여 2회 세척하였다. 그 다음 80%의 에탄올과 20% 아세톤으로 만들어진 destaining solution 400 ㎕로 10분간 탈염색한 후, 이 용액 200 ㎕을 피펫을 이용하여 96-well plate에 옮겼다. 마지막으로 마이크로플레이트 리더기(VersaMaxTM. Molecular Device LLC,, CA, USA)에서 550 nm로 측정하였다.

그룹	플라즈마 처리 시간	개수
대조군	0 sec	10
60s	60 sec	10
300s	300 sec	10
600s	600 sec	10

P. gingivalis 및 조골세포 부착과 형태 관찰

세균 및 세포의 부착 및 형태를 관찰하기 위해 각 군별 시편에 있는 배지를 제거 후 phosphate-buffer saline (PBS)용액으로 세척하였다. 1차 고정액으로 2.5% glutaraldehyde 와 2% paraformaldehyde로 실온에서 2시간 동안 고정하였다. 고정 후 PBS를 이용하여 10분 동안 세척하였으며, 2차 고정액으로 1%OsO₄ 용액으로 30분간 고정하였다. 이후 PBS를 이용하여 10분씩 3회 세척하였다. 탈수화를 위해 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 에탄올 순으로 각 5분씩 1회 시행하였고, 100% 에탄올에서 5분씩 2회의 과정을 거쳐, 100% 에탄올에 냉장 보관 후, hexamethyldisilazane에 15분간 침지 후에 2시간 건조하였다. 건조된 각 시편은 Cressinton sputter coater(108 auto, Cressington Scientific Instrument Ltd, England)를 이용하여, 금-팔라디움 합금 코팅 후 주사전자현미경(S-4700, Hitachi, Japan)을 이용하여 부착 및 형태를 관찰하였다.

통계처리

모든 통계 분석은 SPSS 21.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA)를 이용하여 실시하였다. Crystal violet assay와 24시간의 XTT assay는 Levene’s 검정에 의해 등분산 되었고, 정규성을 만족하였기 때문에 모수 방법인 일원배치 분산분석(1-way ANOVA)으로 통계 분석하였으며, Tukey test로 사후 검정 하였다. 모든 결과는 P < 0.05 수준에서 유의성을 검정하였다. 48시간, 72시간, 96시간의 XTT assay 값은 Levene’s 검정에 의해 등분산이 가정되지 않고, 정규성을 만족하지 못하였으므로 비모수 방법인 Kruskal WallisH로 통계 분석하였고, Bonferroni Correction Method로 사후 검정하였다. 모든 결과는 P < 0.017 수준에서 유의성을 검정하였다.

도 1 및 도 2는 본 발명의 실험예에 따른 지르코니아 시편의 주사전자현미경(SEM) 사진으로서, 각각 15,000배율과 5,000배율로 촬영하였으며, 지르코니아 시편에 분주된 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis) 세균의 부착여부 및 형태를 관찰하였다.

도 1을 참조하면, 세균 배양 48시간 후 지르코니아 시편에서 관찰된 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis) 세균의 형태는 타원형으로 간균의 형태를 보였다. 대기압 플라즈마의 적용시간에 관계없이 비슷한 형태로 관찰되었으며, 크기는 약 5㎛로 거의 동일한 것으로 관찰되었다.

도 2를 참조하면, 300s 군(c)과 600s 군(d)의 경우 대조군(a)과 60s 군(b)에 비해 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis) 세균이 밀집되어 시편에 부착되어 있음을 확인할 수 있다. 또한, 대조군(a)과 60s 군(b)에서는 지르코니아 시편이 부착된 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis) 세균 사이로 관찰되었으나. 300s 군(c)과 600s 군(d)에서는 지르코니아 시편이 거의 관찰되지 않음을 알 수 있다. 이는 지르코니아 임플란트의 표면에 대기압 플라즈마 처리를 300sec 이상 동안 수행할 경우 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis) 세균 부착의 정도가 유의하게 증가함을 보여주는 결과이다.

도 3은 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis) 세균의 부착능 실험에 대한 crystal violet의 값을 보여주는 그래프이다. [표 6]에서는 진지발리스(P. gingivalis) 부착능 실험에 대한 crystal violet의 평균값(mean value) 및 표준편차(SD: standard deviation)를 보여주고 있고, [표 7]에서는 플라즈마 처리 후 crystal violet assay의 One-way ANOVA 테스트 결과값을 보여주고 있다. 도 3, [표 6] 및 [표 7]을 참조하면, 대기압 플라즈마 처리(60 sec) 후 진지발리스(P. gingivalis) 배양의 경우에는 대기압 플라즈마 처리를 하지 않는 대조군과 큰 차이가 없었음을 확인할 수 있다. 반면, 대기압 플라즈마 처리(300 sec) 후 배양의 경우에는 진지발리스(P. gingivalis)의 부착이 유의하게 증가하였음을 확인할 수 있다(P < 0.05).

	대조군	60s	300s	600s
시편 1	0.94	0.98	2.14	2.56
시편 2	0.93	0.90	2.09	2.43
시편 3	0.92	0.89	2.02	1.83
시편 4	0.85	0.87	1.87	1.80
시편 5	0.66	0.82	1.69	1.64
시편 6	0.64	0.82	1.65	1.56
시편 7	0.59	0.63	1.55	1.47
시편 8	0.54	0.62	1.42	1.46
시편 9	0.36	0.62	1.21	1.29
시편 10	0.34	0.54	1.15	1.28
평균(Mean±SD)	0.68±0.22	0.77±0.14	1.68±0.33	1.73±0.42

source of variation	sum of squares	df	mean square	F	P
between groups	9.682	3	3.227	32.782	<0.001
with groups	3.544	36	0.098
Total	13.226	39

세균으로 오염된 시편에 대기압 플라즈마 처리 후 조골세포 활성화능 평가

다른 120개의 시편은 24 well plate 넣고 1.5 × 10⁷ CFU/ml의 세균 농도로 희석한 P. gingivalis를 100㎕ 분주하여 접촉하도록 하고, 이후 각 well에 액체배지 900㎕를 첨가하고 혐기성 조건하에 48시간 배양하였다. 배양 후, 대기압 플라즈마처리 시간(0초, 60초, 120초)에 따라 40개씩 3개의 군(I군, I60s군, I120s군)으로 나누었다(아래 [표 8] 참조). 이후 조골세포(MCT3-E1)는 4 × 10⁴ cells/ml의 농도로 24 well plate에 분주 후 37℃, 5% CO₂를 유지하는 이산화탄소 배양기에서 배양하였다. 배양배지는 48시간마다 한번 씩 교체하였다. 24시간, 48시간, 72시간, 96시간 후 조골세포의 활성화능 여부를 평가하기 위해 XTT assay를 시행하였다. XTT assay는 XTT 표지시약(EZ-Cytox, Itsbio Inc, Seoul, Korea)을 사용하여 시편과 세포액이 담긴 24 well plate의 well당 10㎕의 EZ-Cytox 첨가 후 CO₂ 배양기에서 40분간 교반하였다. 이후 well에서 100㎕의 용액을 채득하여 96 well plate에 분주하고, 마이크로플레이트 리더기를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조되는 파장은 630nm로 설정하였다.

그룹	플라즈마 처리시간	XTT assay time	개수
I	0 sec	24 hr	10
		48 hr	10
		72 hr	10
		96 hr	10
I60s	60 sec	24 hr	10
		48 hr	10
		72 hr	10
		96 hr	10
I120s	120 sec	24 hr	10
		48 hr	10
		72 hr	10
		96 hr	10

(모든 시편은 P. gingivalis에 의해 오염됨)

조골 세포 부착 및 형태의 현미경적 평가

P. gingivalis가 48시간 배양된 지르코니아에 대기압 플라즈마 처리를 하여 조골세포의 부착 정도를 주사전자현미경을 통해 관찰하였으며, 이를 도 4에 나타내었다.

도 4a 내지 도 4c를 참조하면, 대기압 플라즈마 처리직후에는 플라즈마를 처리하지 않은 군(I군)과 비교하여 플라즈마 처리 군(I60s군, I120s군)에서 세균이 파괴된 것을 확인할 수 있었다. 또한, I60초군 보다 I120초군에서 세균의 파괴양상이 두드러지게 관찰되었다.

도 4d 내지 도 4f를 참조하면, 조골세포 분주 후 24시간에서는 플라즈마를 처리한 그룹(I60s군, I120s군)에서 조골세포가 부착한 것을 관찰할 수 있었으며, 플라즈마를 처리하지 않은 그룹(I군)에서는 세균과 세포가 엉켜있는 모습이 관찰되었다.

도 4g 내지 도 4i를 참조하면, 조골세포 분주 후 48시간에서는 플라즈마를 처리한 그룹(I60s군, I120s군)에서 조골세포의 부착이 증가한 것을 관찰할 수 있었으며, 플라즈마를 처리하지 않은 그룹(I군)에서는 세균과 세포가 부착하지 못하고 파괴되는 양상이 관찰되었다.

도 4j 내지 도 4l를 참조하면, 72시간에서는 48시간에서 관찰된 것보다 확연하게 플라즈마를 처리한 그룹(I60s군, I120s군)에서 조골세포의 부착이 더욱 증가한 것을 관찰할 수 있었으며, 플라즈마를 처리하지 않은 그룹(I군)에서는 48시간과 비교하여 세균과 세포가 더 파괴되는 양상이 관찰되었다.

도 4m 내지 도 4o를 참조하면, 96시간에서는 플라즈마를 처리한 그룹(I60s군, I120s군)에서 조골세포가 지르코니아 표면에 왕성하게 분포한 것을 관찰할 수 있었으며, 플라즈마를 처리하지않은 그룹(I군)에서는 세균과 세포 모두 사멸된 양상을 관찰할 수 있었다.

도 4를 통해 조골세포의 전체적인 변화 양상을 정리하면 시간이 갈수록 플라즈마 처리하지 않은 그룹(I군)은 세포와 세균 모두 사멸의 양상을 보여주는 반면, 플라즈마 처리한 그룹(I60s군, I120s군)은 조골세포가 부착되고 왕성히 분포되어 활성화된 양상을 보여주고 있음을 알 수 있다.

P. gingvalis가 접종된 시편에 플라즈마 처리 후 조골세포 활성화능 평가

도 5는 조골세포 활성화능 평가(24시간 플라즈마 처리)에 대한 XTT assay 결과값을 보여주는 그래프이다. [표 9]에서는 조골세포 활성화능 평가(24시간 플라즈마 처리)에 대한 XTT assay의 평균값(mean value) 및 표준편차(SD: standard deviation)를 보여주고 있고, [표 10]에서는 24시간 플라즈마 처리 후 XTT assay의 One-way ANOVA 테스트 결과값을 보여주고 있다.

도 6은 조골세포 활성화능 평가(48시간 플라즈마 처리)에 대한 XTT assay 결과값을 보여주는 그래프이다. [표 11]에서는 조골세포 활성화능 평가(48시간 플라즈마 처리)에 대한 XTT assay의 평균값(mean value) 및 표준편차(SD: standard deviation)를 보여주고 있고, [표 12]에서는 48시간 플라즈마 처리 후 XTT assay의 Kruskal-Wallis 테스트 결과값을 보여주고 있다.

도 7 및 도 8은 조골세포 활성화능 평가(각각 72시간과 96시간 플라즈마 처리)에 대한 XTT assay 결과값을 보여주는 그래프이다. [표 13] 및 [표 15]에서는 조골세포 활성화능 평가(각각 72시간과 96시간 플라즈마 처리)에 대한 XTT assay의 평균값(mean value) 및 표준편차(SD: standard deviation)를 보여주고 있고, [표 14] 및 [표 16]에서는 각각 72시간과 96시간 플라즈마 처리 후 XTT assay의 Kruskal-Wallis 테스트 결과값을 보여주고 있다.

	I	I60s	I120s
시편 1	0.82	0.12	0.14
시편 2	0.69	0.11	0.12
시편 3	0.61	0.13	0.10
시편 4	0.83	0.14	0.12
시편 5	0.81	0.14	0.17
시편 6	0.89	0.18	0.13
시편 7	0.95	0.14	0.12
시편 8	0.99	0.16	0.14
시편 9	1.05	0.17	0.16
시편 10	0.68	0.15	0.16
Mean±SD	0.83±0.14	0.14±0.02	0.13±0.02

source of variation	sum of squares	df	mean square	F	P
between groups	3.201	2	1.601	225.635	<0.001
with groups	0.192	27	0.007
Total	3.393	29

	I	I60s	I120s
시편 1	0.12	0.29	0.09
시편 2	0.10	0.18	0.10
시편 3	0.11	0.24	0.12
시편 4	0.20	0.27	0.12
시편 5	0.13	0.21	0.11
시편 6	0.12	0.20	0.11
시편 7	0.13	0.18	0.11
시편 8	0.13	0.23	0.18
시편 9	0.13	0.19	0.17
시편 10	0.10	0.12	0.09
Mean±SD	0.13±0.03	0.21±0.05	0.12±0.03

source of variation	Total	I/I60s	I60s/I120s	I/I120s
chi square	15.120
df	2
Asymp. sig	0.001	0.001	<0.001	0.436

	I	I60s	I120s
시편 1	0.09	0.19	0.23
시편 2	0.10	0.17	0.22
시편 3	0.09	0.21	0.24
시편 4	0.09	0.27	0.42
시편 5	0.09	0.28	0.50
시편 6	0.09	0.17	0.13
시편 7	0.10	0.26	0.24
시편 8	0.09	0.26	0.28
시편 9	0.16	0.25	0.27
시편 10	0.09	0.37	0.27
Mean±SD	0.10±0.02	0.24±0.06	0.28±0.10

source of variation	Total	I/I60s	I60s/I120s	I/I120s
chi square	19.254
df	2
Asymp. sig	0.001	0.001	0.436	<0.001

	I	I60s	I120s
시편 1	0.09	0.44	0.46
시편 2	0.09	0.45	0.39
시편 3	0.09	0.41	0.46
시편 4	0.09	0.41	0.55
시편 5	0.10	0.25	0.46
시편 6	0.10	0.41	0.39
시편 7	0.09	0.39	0.38
시편 8	0.09	0.42	0.48
시편 9	0.09	0.44	0.47
시편 10	0.10	0.31	0.54
Mean±SD	0.09±0.01	0.39±0.06	0.46±0.06

source of variation	Total	I/I60s	I60s/I120s	I/I120s
chi square	21.104
df	2
Asymp. sig	0.001	0.001	0.052	<0.001

도 5, [표 9] 및 [표 10]을 참조하면, 초기 24시간에서는 플라즈마를 처리하지 않은 군(I군)이 60초 이상 플라즈마를 처리한 군(I60s군, I120s군)과 비교하여 조골세포의 활성도가 다소 높음을 알 수 있다(P < 0.05 ).

도 6, [표 11] 및 [표 12]를 참조하면, 48시간 이후 그 수치가 역전이 되었음을 알 수 있다(P < 0.017 ).

도 7, 도 8, [표 13] 내지 [표 16]을 참조하면, 72시간과 96시간 이후 플라즈마 처리한 군(I60s, I120s)에서 조골세포 활성도가 유의하게 증가하는 것을 알 수 있는데(P < 0.017 ) 특히, 72시간에서는 약 2배, 96시간에서는 약 4배의 활성 차이를 보여주고 있음을 확인할 수 있다.

정리하면, 본 발명의 실시예에 지르코니아 임플란트의 표면처리 방법에 의하면 지르코니아 임플란트의 표면을 대기압 플라즈마를 이용하여 60 내지 300 sec 범위의 일정 시간동안 수행하게 되면, 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis) 세균의 부착을 증가시키지 않을 뿐만 아니라, 조골세포의 부착능을 증가시킬 수 있다. 나아가 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis) 세균에 의한 임플란트주위염을 가진 지르코니아 임플란트의 치료에 있어서도 본 발명의 실시예에 따른 대기압 플라즈마를 이용한 지르코니아 임플란트의 표면처리 방법을 활용할 수 있음을 확인하였다.

이상에서 살펴본 바와 같이 본 발명은 바람직한 실시 예를 들어 도시하고 설명하였으나, 상기한 실시 예에 한정되지 아니하며 본 발명의 정신을 벗어나지 않는 범위 내에서 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 다양한 변경과 수정이 가능하다 할 것이다.

Claims

포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis) 세균에 의해 오염된 지르코니아 임플란트를 준비하는 단계; 및
아르곤 99.2%와 산소 0.8%의 혼합기체를 이용하고 300W의 파워에서 10 L/min의 속도로 플라즈마를 발생시키는 상온 대기압 플라즈마 발생장치를 통해 발생된 대기압 플라즈마를 이용하여 상기 지르코니아 임플란트를 일정속도로 회전시키면서 표면을 처리하는 단계;를 포함하며,
상기 대기압 플라즈마를 이용한 표면처리는 60 내지 300 sec 범위의 일정 시간동안 수행되어 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis) 세균 부착의 증가를 방지함과 함께, 조골세포의 부착능을 향상시키고,
상기 지르코니아 임플란트는 300rpm으로 회전되는 것을 특징으로 하는 대기압 플라즈마를 이용한 지르코니아 임플란트의 표면처리 방법.
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