KR101850953B1 - Electrochemiluminescent probe for detection of homocysteine - Google Patents

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KR101850953B1
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홍종인
신익수
김훈준
이경식
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서울대학교 산학협력단
숭실대학교 산학협력단
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Abstract

The present invention relates to an electrochemiluminescent probe having selectivity for homocysteine which reacts with homocysteine to produce electrochemiluminescence.

Description

호모시스테인 검출용 전기화학발광 프로브{Electrochemiluminescent probe for detection of homocysteine}[0001] The present invention relates to an electrochemiluminescent probe for detection of homocysteine,

본 발명은 호모시스테인 검출용 전기화학발광 프로브에 관한 것으로, 보다 상세하게는 호모시스테인과 반응하여 전기화학발광을 나타내는 호모시스테인 선택성을 갖는 이리듐 착화합물을 포함하는 호모시스테인 검출용 전기화학발광 프로브에 관한 것이다. The present invention relates to an electrochemiluminescent probe for detecting homocysteine, and more particularly, to an electrochemiluminescent probe for detecting homocysteine comprising an iridium complex having homocysteine selectivity which reacts with homocysteine to exhibit electrochemiluminescence.

호모시스테인(homocysteine; Hcy)은 메티오닌의 탈메틸화에 의해 생성되는 자연 발생적인 황 함유 아미노산으로, 동물과 식물 단백질에서 모두 발견되는 필수 아미노산이다. 혈장 내에서 5-15 μM 사이의 호모시스테인 농도는 일반적으로 정상으로 간주되고 있다. 호모시스테인의 농도가 증가하면 심혈관질환, 알츠하이머, 신경관 결함 및 골다공증의 원인이 된다. 미국인의 호모시스테인 농도는평균 8μM 이었으며, 1991-2004년 동안 호모시스테인 농도 증가(>13μM)로 60세 이상의 고령자들의 20~30%가 고통받았다고 보고되었다. Homocysteine (Hcy) is a naturally occurring sulfur - containing amino acid produced by the demethylation of methionine, an essential amino acid found in both animal and plant proteins. Homocysteine concentrations between 5 and 15 μM in plasma are generally considered normal. Increased concentrations of homocysteine cause cardiovascular disease, Alzheimer's, neural tube defects and osteoporosis. The average homocysteine concentration in the Americans was 8 μM, and it was reported that 20-30% of elderly people aged 60 years or older suffered from an increase in homocysteine concentration (> 13 μM) over the period 1991-2004.

호모시스테인 농도를 결정하는 방법으로 고속 액체 크로마토그래피(HPLC), 비색분석, 방사성 분석, 광발광(photoluminescence; PL) 면역 검정법 및 형광 분자센서와 같은 방법이 제시되었다[(a) Clin. Chem. 48, 941-944; (b) J. Am. Chem. Soc. 126, 438-439; (c) Lipid Res. 39, 925-933; (d) Inorg. Chem. 46, 11075-11108]. 상기와 같은 방법들은 호모시스테인 농도의 측정에 대해 우수한 성능을 나타내나, 이러한 접근법들은 부피가 큰 광원과 결합된 분광계측을 필요로 하는 단점이 있다. Methods such as high performance liquid chromatography (HPLC), colorimetric analysis, radioimmunoassay, photoluminescence (PL) immunoassay and fluorescent molecule sensor have been proposed as methods for determining homocysteine concentration [(a) Clin. Chem. 48, 941-944; (b) J. Am. Chem. Soc. 126, 438-439; (c) Lipid Res. 39, 925-933; (d) Inorg. Chem. 46, 11075-11108]. Such methods exhibit excellent performance in measuring homocysteine concentration, but these approaches have the disadvantage of requiring spectrometry coupled with a bulky light source.

전기화학적 발광은 전기화학적으로 생성된 라디컬들 사이의 전자 전달을 통한 발광과정을 의미하며, 별도의 광원이나 부피가 큰 장비를 필요로 하지 않기 때문에 장비의 소형화가 용이하고, 높은 감도를 가지므로 현장 진단 검출 시스템에 최적화되어 있다고 할 수 있다. 지금까지 발표된 대부분의 전기화학적 발광 시스템 기반의 센서들은 면역분석법에 그 기반을 두고 있으며, 이중 몇몇은 실제로 상용화되어 다양하게 활용되고 있다. 지금까지 발표된 면역분석법 기반의 ECL 센서들은 항원-항체 반응이나 DNA 혼성화와 같은 특정 생물학적 결합에 의존하기 때문에 분석대상이 단백질이나 일부 효소 또는 이들과 관련된 일부 단분자들로 제한되어 있다는 한계점이 있다. 또한, 이러한 생물학적 기반의 분석법은 대부분 신호 물질의 표지 여부에 의한 신호의 유무를 통해 특정 물질을 분석하기 때문에 떨어져 나간 신호 물질들을 씻어내 주기 위한 별도의 추가적인 세척 과정을 필요로 한다. 이에 대한 대안으로 특정 수용체를 가진 형광 단분자 화학 센서에 대한 연구가 꾸준히 진행되어 왔지만, 형광 기반 센서의 경우 신호 변화 확인을 위해 별도의 광원을 통한 분자 여기(excitation) 과정이 필요하여 장비의 소형화 및 기기 가격 인하가 어렵다는 한계점이 있다. 또한, 상기와 같은 방법들은 전문가가 아닌 일반인이 분석기기를 다루거나 데이터를 해석하는 것이 용이하지 않으므로, 누구나 간편하고, 상시적으로 질병을 진단할 수 있는 개념의 현장 진단용 장비에 활용하기는 어렵다는 한계를 가진다. Electrochemical luminescence refers to a luminescence process through electron transfer between electrochemically generated radicals. Since it does not require a separate light source or bulky equipment, it is easy to miniaturize the equipment and has high sensitivity It can be said that it is optimized for on-site diagnostic detection system. Most of the electrochemiluminescent system based sensors that have been published so far are based on immunoassay, and some of them are actually commercialized and used variously. Immunoassay-based ECL sensors have been limited to specific proteins or some enzymes or some monomers associated with them because they depend on specific biological interactions such as antigen-antibody reaction or DNA hybridization. In addition, most of these biological-based assays require separate additional washing steps to wash off the signal material, since the analysis of a specific substance is based on the presence or absence of the signal by the signal substance. As an alternative to this, studies have been made on fluorescent single-molecule chemical sensors with specific receptors, but fluorescence-based sensors require a molecular excitation process through a separate light source in order to confirm signal changes, There is a limit to the difficulty of price cuts. In addition, since the above-described methods are not easy for an ordinary person, such as an expert, to handle analytical instruments or interpret data, it is difficult for anyone to easily use the system for field diagnosis of a concept that can diagnose diseases at all times .

따라서, 심혈관 질환 등에 대하여 누구나, 쉽고, 경제적으로 심혈관 질환을 조기에 진단할 수 있도록 간단하고 쉬운 분석법을 통해 호모시스테인의 농도를 측정할 수 있는 방법이 요구된다.Therefore, a method for measuring the concentration of homocysteine through a simple and easy analysis method is needed so that anyone can easily and economically diagnose cardiovascular disease early.

본 발명이 해결하고자 하는 첫 번째 과제는 호모시스테인의 농도를 정성적 또는 정량적으로 측정할 수 있는 호모시스테인 검출용 전기화학발광 프로브를 제공하는 것이다. The first problem to be solved by the present invention is to provide an electrochemiluminescent probe for detecting homocysteine capable of qualitatively or quantitatively measuring the concentration of homocysteine.

본 발명이 해결하고자 하는 두 번째 과제는 호모시스테인 검출용 전기화학발광 프로브를 이용한 호모시스테인의 검출방법을 제공하는 것이다. A second object of the present invention is to provide a method for detecting homocysteine using an electrochemiluminescent probe for detecting homocysteine.

본 발명이 해결하고자 하는 세 번째 과제는 호모시스테인 검출용 전기화학발광 프로브를 포함하는 전기화학발광 센서를 제공하는 것이다.A third problem to be solved by the present invention is to provide an electrochemiluminescence sensor including an electrochemiluminescent probe for detecting homocysteine.

특정 수용체나 반응자리에 발광체를 도입함으로써 특정 분석물과 결합 또는 반응시 선택적으로 신호 변화를 유발하는 단분자 화학센서는 분석 대상의 제한이 없고, 특히 분석물의 존재 여부에 따라 분자의 특성이 자체적으로 변화함으로써 신호의 변화를 유발하기 때문에 세척 등의 추가적인 분석 과정이 전혀 필요하지 않는다는 장점이 있다. Unimolecular chemical sensors that selectively cause signal changes upon binding or reacting with specific analytes by introducing a light receptor into a specific receptor or reactive site have no limitations on the object to be analyzed, The change of the signal causes change, so there is an advantage that no additional analysis process such as washing is required.

전기화학발광(electrochemiluminescence; ECL)과 결합된 화학요법 접근법은 기존의 분석 기술에 비해 여러 가지 이점이 있다. 전기화학은 부피가 큰 장비, 추가 시약 또는 동위원소를 필요로 하지 않으며, 간단하고 경제적인 화학분석을 가능하게 한다. 발광은 전기화학적으로 유발된 화학 발광 과정을 통해서만 생성될 수 있기 때문에 배경(background) 형광 방출 없이 매우 민감하다. 또한 화학적인 방법은 합성 프로브와 표적 분자 사이의 비가역적인 화학반응으로 인해 표적분자를 우수하게 선택적으로 인식하고 감지할 수 있다. Chemotherapy approaches combined with electrochemiluminescence (ECL) have several advantages over traditional analytical techniques. Electrochemistry does not require bulky equipment, additional reagents or isotopes, and allows for simple and economical chemical analysis. Since luminescence can only be generated through an electrochemically induced chemiluminescence process, it is highly susceptible to background fluorescence emission. In addition, chemical methods can selectively recognize and detect the target molecule due to the irreversible chemical reaction between the synthetic probe and the target molecule.

본 발명의 발명자들은 고리형 이리듐 착화합물 기반의 단분자와 호모시스테인의 선택적 반응과 전기화학발광 기법을 통해 호모시스테인의 양을 정량적 또는/및 정성적으로 검출할 수 있는 전기화학발광 프로브를 개발하였으며, 이를 이용하여 다양한 심혈관계 질환 등의 조기 진단에 활용할 수 있는 가능성을 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다.
The inventors of the present invention have developed an electrochemiluminescent probe capable of quantitatively and / or qualitatively detecting the amount of homocysteine through the selective reaction of monomolecular based on cyclic iridium complex and homocysteine and electrochemiluminescence Thereby confirming the possibility of early diagnosis of various cardiovascular diseases and the like, thereby completing the present invention.

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 호모시스테인 검출용 전기화학발광 프로브를 제공한다:The present invention provides an electrochemiluminescent probe for detecting homocysteine comprising a compound represented by the following Formula 1:

[화학식 1][Chemical Formula 1]

Figure 112017063605620-pat00001
Figure 112017063605620-pat00001

상기 화학식 1에서, In Formula 1,

L는 비발광성 리간드이며;L is a non-luminescent ligand;

A는 N 및 Z1을 포함하는 2 내지 3환의 축합헤테로아릴이며; 상기 축합헤테로아릴은 퀴놀린, 벤조이소퀴놀린, 페난트리딘, 벤조티아졸, 벤조옥사졸 및 벤조이미다졸 중에서 선택되고; 상기 축합헤테로아릴은 비치환되거나, 또는 C1 - 10알킬, C3 - 8시클로알킬, C1 - 10알킬옥시, 니트로 및 시아노 중에서 선택되는 1 내지 3개로 치환되며;A is a fused to 2-to 3-ring heteroaryl containing N and Z < 1 >; Wherein said condensed heteroaryl is selected from quinoline, benzoisoquinoline, phenanthridine, benzothiazole, benzoxazole and benzoimidazole; The condensed heteroaryl is unsubstituted, or C 1 - 10 alkyl, C 3 - 8 cycloalkyl, C 1 - 10 alkyloxy, nitro, and cyano is substituted with one to three is selected from;

R1, R2 및 R3은 서로 동일하거나 또는 상이하고, 각각 독립적으로 전자 공여체(electron donationg group)일 수 있으며, 바람직하게는 H, 히드록시, 시아노, C1-10알킬, C3-12시클로알킬, C5-12아릴, C1-10알킬옥시 및 C5-12아릴옥시 중에서 선택되고; 상기 C1 - 10알킬 또는 상기 C1 - 10알킬옥시는 비치환되거나, C5 - 12아릴로 치환되고; 상기 C5 - 12아릴 또는 C5 - 12아릴옥시는 비치환되거나 C1 - 6알킬 또는 C1 - 6알킬옥시로 치환되고;R 1 , R 2 and R 3 may be the same or different and each independently may be an electron donation group, preferably H, hydroxy, cyano, C 1-10 alkyl, C 3- 12 cycloalkyl, C 5-12 aryl, C 1-10 alkyloxy and C 5-12 aryloxy; The C 1 - 10 alkyl or said C 1 - 10 alkyloxy is unsubstituted, C 5 - 12 aryl which is substituted by; The C 5 - 12 aryl or C 5 - 12 aryl-oxy are unsubstituted or C 1 - 6 alkyl or C 1 - 6 alkyl being substituted with aryloxy;

Z1은 O, S 및 NRa 중에서 선택되며; Ra는 H 또는 C1 - 10알킬이다.Z 1 is selected from O, S and NR a ; R a is H or C 1 - 10 is alkyl.

본 발명에 있어서, 상기 A는 호모시스테인과의 반응에 영향을 주지 않으면서도 화학식 1의 화합물이 가지는 LUMO 에너지 레벨을 낮추는데 기여하는 구조로서, 호모시스테인과의 반응에도 전기화학발광을 방출할 수 있는 것이면 제한없이 이용이 가능하며, 바람직하게는 N 및 Z1을 포함하는 2 내지 3환의 축합헤테로아릴 화합물이고, 보다 바람직하게는 하기 구조로부터 선택되는 것일 수 있다.In the present invention, A is a structure that contributes to lowering the LUMO energy level of the compound of Chemical Formula 1 without affecting the reaction with homocysteine, and may be any compound capable of releasing electrochemiluminescence even in the reaction with homocysteine. Preferably a 2 to 3 ring condensed heteroaryl compound containing N and Z < 1 >, and more preferably may be selected from the following structures.

Figure 112017063605620-pat00002
Figure 112017063605620-pat00003
Figure 112017063605620-pat00004
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Figure 112017063605620-pat00007

상기 화학식에서, In the above formulas,

R4는 수소, C1 - 10알킬, C3 - 8시클로알킬, C1 - 10알킬옥시, 니트로 및 시아노 중에서 선택되고,R 4 is hydrogen, C 1 - is selected from the 10 alkyloxy, nitro, and cyano, - 10 alkyl, C 3 - 8 cycloalkyl, C 1

m은 0 내지 3의 정수이며, m is an integer of 0 to 3,

Z1은 O, S 및 NRa 중에서 선택되며; Ra는 H 또는 C1 - 10알킬이다.Z 1 is selected from O, S and NR a ; R a is H or C 1 - 10 is alkyl.

A가 상기와 같은 구조를 가지는 경우, 제조되는 화학식 1의 화합물의 LUMO 에너지 레벨이 안정화되어, 낮은 LUMO 에너지 레벨을 가지며, 호모시스테인과의 반응 이후에도, 안정적으로 전기화학발광을 방출할 수 있다. 특히, 퀴놀린 또는 페난트리딘의 구조를 가지는 경우, 호모시스테인과의 반응에서 높은 전기화합발광 효율을 나타내는 것을 확인하였다. When A has the above structure, the LUMO energy level of the compound of formula (1) to be produced is stabilized, has a low LUMO energy level, and can release stably electrochemiluminescence even after reaction with homocysteine. Particularly, when it has a structure of quinoline or phenanthridine, it has been confirmed that it exhibits high electroluminescent emission efficiency in reaction with homocysteine.

본 발명에 있어서, 상기 R1, R2 및 R3은 전자 공여체(electron donationg group)일 수 있다. 상기 치환기는 이리듐 착화합물의 리간드장 안정화 에너지(ligand field stabilization energy; LFSE)에 영향을 미치며, 호모시스테인과의 반응속도를 향상시키는데 기여할 수 있다. 구체적으로 상기 R1 및 R2가 메톡시인 이리듐 착화합물은 적색 편이된 방출 및 높은 HOMO 수준을 나타내었으며, 반응속도가 비약적으로 향상되는 결과를 얻었다. 본 발명에 의하면, R1이 메톡시이고, R2가 수소인 이리듐 착화합물은 R1과 R2가 모두 수소인 이리듐 착화합물과 유사한 특성을 나타내었으며, R1이 수소이고, R2가 메톡시인 이리듐 착화합물은 위의 두 이리듐 착화합물보다 빠른 반응속도 및 낮은 검출 한계를 나타내었다.In the present invention, R 1 , R 2 and R 3 may be an electron donation group. The substituent affects the ligand field stabilization energy (LFSE) of the iridium complex, and may contribute to an improvement in the rate of reaction with homocysteine. Specifically, the iridium complex in which R 1 and R 2 are methoxy exhibited red-shifted emission and a high HOMO level, and the reaction rate was remarkably improved. According to the present invention, R 1 is methoxy, R 2 is showed a hydrogen iridium complex is R 1 and R 2 are both similar properties and are hydrogen iridium complex, and R 1 is hydrogen, R 2 is methoxy The iridium complexes showed faster reaction rate and lower detection limit than the two iridium complexes.

본 발명에 있어서, 상기 L은 이리듐 착물을 제조하는데 이용되는 리간드이면 제한은 없으나, 바람직하게는 비발광성 리간드이고, 보다 바람직하게는 호모시스테인과의 반응성에 직접적인 영향을 나타내지 않으면서, 동시에 전기화학발광 변화에 영향을 주지 않는 구조인 것일 수 있으며, 가장 바람직하게는 하기 구조로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. In the present invention, L is not limited as long as it is a ligand used for preparing an iridium complex, but is preferably a non-luminescent ligand. More preferably, L does not have a direct effect on reactivity with homocysteine, And most preferably may be selected from the following structures, but the present invention is not limited thereto.

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Figure 112017063605620-pat00009
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Figure 112017063605620-pat00012

상기 화학식에서, In the above formulas,

R6, R7, R8, R9, R10, R11 및 R12는 서로 동일하거나 또는 상이하고, 각각 독립적으로 수소, C1 - 10알킬, 할로C1 - 6알킬 및 C5 - 12아릴 중에서 선택된다. R 6, R 7, R 8 , R 9, R 10, R 11 and R 12 are the same or different and are each independently hydrogen, C 1 - 10 alkyl, halo C 1 - 6 alkyl and C 5 - 12 Aryl.

본 발명에 있어서, 상기 리간드를 구체적으로 예시하면 하기와 같다.In the present invention, the ligand is specifically exemplified as follows.

Figure 112017063605620-pat00013
Figure 112017063605620-pat00014
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본 발명에 있어서, 상기 화학식 1의 화합물은 호모시스테인과 선택적으로 반응하여 전기화학발광 신호를 증가시키는 것일 수 있으며, 바람직하게는 상기 화학식 1의 화합물의 포밀기와 호모시스테인이 반응하여 육각 고리를 형성하며, 전기화학발광 신호를 증가시키는 것일 수 있다. In the present invention, the compound of Formula 1 may selectively react with homocysteine to increase the electrochemiluminescence signal. Preferably, the compound of Formula 1 reacts with homocysteine to form a hexagonal ring, May be to increase the electrochemiluminescent signal.

보다 바람직하게는, 본 발명에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 이리듐 착화합물로서, 호모시스테인과 반응하여 서로 고리를 형성한다. 구체적으로 하기 반응식 1에 나타낸 바와 같이, 상기 화학식 1의 포밀기가 호모시스테인과 반응하여 1,3-티아지내인(thiazinane) 고리를 형성하게 되며, 이때, 강한 전기화학발광(electrochemiluminescence; ECL)을 나타내게 된다. More preferably, the compound represented by Formula 1 according to the present invention is an iridium complex, which reacts with homocysteine to form a ring with each other. Specifically, as shown in Reaction Scheme 1 below, the formyl group of Formula 1 reacts with homocysteine to form a 1,3-thiazinane ring. At this time, strong electrochemiluminescence (ECL) do.

상기 전기화학발광은 화학식 1의 화합물과 호모시스테인의 반응 생성물의 LUMO 에너지 레벨이 전기화학발광 공반응물의 HOMO 에너지 레벨보다 낮기 때문에 발생되는 것일 수 있다. The electrochemiluminescence may be generated because the LUMO energy level of the reaction product of the compound of formula (I) and homocysteine is lower than the HOMO energy level of the electrochemiluminescent compound.

종래 기술에 따른 이리듐 착화합물, 예를 들어, 두 개의 2-페닐피리딘과 한 개의 4-(2-피리딜)벤즈알데히드 기반의 이리듐 착화합물(프로브 2), 또는 두 개의 4-(2-피리딜)벤즈알데히드와 한 개의 아세틸아세토네이트 기반의 이리듐 착화합물(프로브 3)은 LUMO 에너지 레벨이 높기 때문에, 호모시스테인과 반응하는 경우에 전기화학발광(ECL)이 오히려 감소하는 양상을 나타낸다. 따라서, 상기와 같은 이리듐 착화합물은 전기화학발광 프로브로서 이용이 불가능하였다. An iridium complex according to the prior art, for example, an iridium complex (probe 2) based on two 4- (2-pyridyl) benzaldehyde and two 4- (2-pyridyl) benzaldehyde And an acetylacetonate-based iridium complex (probe 3) exhibit a decrease in electrochemiluminescence (ECL) when reacting with homocysteine because of a high LUMO energy level. Therefore, the iridium complex can not be used as an electrochemiluminescent probe.

다른 한편으로, 전기화학적 관점에서 살펴보면, 반응에 의해 화합물에서 강한 전자 구인성 성질을 가지고 있는 포밀기가 사라지게 되면 LUMO 에너지 레벨이 불안정해지고, 환원 전위는 더 큰 음의 값을 가지게 된다. 이때, 환원 전위가 큰 음의 값을 가지게 되면, 전기화학발광 공반응물의 LUMO 에너지 레벨로의 전자 전달과정이 어려워져, 분자의 들뜬 상태를 형성하기 어려운 문제점이 있다.On the other hand, when viewed from an electrochemical point of view, the LUMO energy level becomes unstable and the reduction potential becomes larger negative value when the formulator having strong electron-attracting property disappears due to the reaction. At this time, if the reduction potential has a large negative value, the electron transfer process to the LUMO energy level of the electrochemiluminescent hole reactant becomes difficult, and it is difficult to form the excited state of the molecule.

그러나, 본 발명에 따른 상기 화학식 1의 화합물은 LUMO 에너지 레벨이 현저하게 낮도록 설계되었기 때문에 호모시스테인과의 반응으로 포밀기가 사라지면서 LUMO 에너지 레벨이 증가하더라도 전기화학발광 전자 전달 과정을 방해하지 않는 것이 특징이다.However, since the compound of Formula 1 according to the present invention is designed so that the LUMO energy level is remarkably low, even when the LUMO energy level is increased due to the reaction with homocysteine, the compound does not interfere with the electrochemiluminescent electron transfer process Feature.

[반응식 1][Reaction Scheme 1]

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상기 반응식 1에서 1은 본 발명에 따른 화학식 1의 화합물이며, 2는 종래기술에 따른 이리듐 착화합물(프로브 2)이다. In the above Reaction Scheme 1, 1 is the compound of Formula 1 according to the present invention, and 2 is the iridium complex (probe 2) according to the prior art.

본 발명에 있어서, 전기화학발광 공반응물은 트리프로필아민 또는 2-(디부틸아미노)에탄올일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. In the present invention, the electrochemiluminescent coactivator may be tripropylamine or 2- (dibutylamino) ethanol, but is not limited thereto.

한편, 본 발명은 상기 전기화학발광 프로브를 이용하는, 생체 내 호모시스테인의 검출 방법을 제공한다. Meanwhile, the present invention provides a method for detecting homocysteine in vivo using the electrochemiluminescent probe.

상기 생체는 인간의 생체거나 또는 인간이 아닌 것의 생체 내일 수 있다. The living body may be a living body of a human being or a living thing which is not a human being.

또한, 본 발명은 전기화학발광 프로브를 포함하는 전기화학발광 센서를 제공한다. The present invention also provides an electrochemical luminescent sensor including an electrochemiluminescent probe.

상기 전기화학발광 센서를 이용하여 생체 외 검출시료의 호모시스테인의 레벨의 검출에 이용할 수 있다. The electrochemiluminescence sensor can be used to detect the level of homocysteine in the ex vivo detection sample.

본 발명에 따르면, 상기 전기화학발광 프로프를 포함하는 전기화학발광 센서는 호모시스테인과의 반응에 의해 청색 이동된 영역에서 전기화학발광의 변화가 나타나는 것일 수 있다. According to the present invention, the electrochemiluminescence sensor including the electrochemiluminescent probe may exhibit a change in electrochemiluminescence in a blue-shifted region due to a reaction with homocysteine.

또한, 본 발명은 4-포밀페닐보로닉산과 1-할로이소퀴놀린을 반응하여, 4-(이소퀴놀린-1-일)벤즈알데히드를 제조하는 단계; 4-(이소퀴놀린-1-일)벤즈알데히드를 이리듐 클로라이드 하이드레이트와 반응하여 금속고리화된 이리듐(III) 클로로로 연결된 이량체를 제조하는 단계; 및 상기 금속고리화된 이리듐(III) 클로로로 연결된 이량체, 탄산나트륨 및 아세틸아세톤을 반응시켜 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 제조하는 단계;를 포함하는, 호모시스테인 검출용 전기화학발광 프로브의 제조방법을 제공한다.The present invention also relates to a process for producing 4- (isoquinolin-1-yl) benzaldehyde by reacting 4-formylphenylboronic acid with 1-haloisoquinoline; Reacting 4- (isoquinolin-1-yl) benzaldehyde with iridium chloride hydrate to produce a metal-linked iridium (III) chloro-linked dimer; And reacting the metal cyclized iridium (III) chloride-linked dimer, sodium carbonate and acetylacetone to prepare a compound represented by the formula (1). to provide.

본 발명에 따른 전기화학발광 프로브는 전기화학발광 기반의 분석시스템과 단분자 화학센서를 융합시킨 것으로서, 호모시스테인에 대해 높은 선택성과 민감도를 동시에 가진다. 구체적으로 본 발명의 프로브는 수용액상에서 호모시스테인이 존재할 때 전기적인 트리거링(triggering)에 의해 강한 전기화학발광을 나타낸다. 본 발명에 따른 전기화학발광 프로브는 호모시스테인에 대한 선택성이 매우 우수하여, 여러 가지 다른 아미노산과 구별되는 현저한 전기화학발광을 나타내므로, 호모시스테인의 양을 정량적으로 용이하게 분석할 수 있다.The electrochemiluminescent probe according to the present invention is a combination of an electrochemiluminescence-based analysis system and a monomolecular chemical sensor, and has high selectivity and sensitivity to homocysteine. Specifically, the probe of the present invention exhibits strong electrochemiluminescence by electrical triggering when homocysteine is present in an aqueous solution. The electrochemiluminescent probe according to the present invention has excellent selectivity for homocysteine and exhibits remarkable electrochemiluminescence distinct from various other amino acids, so that it is possible to quantitatively and easily analyze the amount of homocysteine.

체내에 존재하는 호모시스테인의 양은 심혈관 질환과 직접적으로 관련이 되어 있는 것으로 잘 알려져 있는 바, 본 발명에 따른 전기화학발광 프로브를 이용하면, 종래기술에 비해 간단하면서도 빠르고, 정확한 방법으로 체내에 있는 호모시스테인의 양을 정량할 수 있으므로, 현장 진단용 장비로 적용이 가능하기 때문에 산업상 유용하다. It is well known that the amount of homocysteine present in the body is directly related to cardiovascular disease. When the electrochemiluminescence probe according to the present invention is used, it is possible to obtain a homocysteine Since the quantity can be quantified, it is industrially useful because it can be applied as equipment for field diagnosis.

도 1은 밀도함수이론(Density functional theory; DFT) 계산으로 얻어진 본 발명의 일 실시예(a) 및 비교예(b)에 따른 프로브의 호모시스테인(Hcy) 감지를 열역학적으로 설명한 도이다.
도 2는 DFT 계산으로 얻어진 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 프로브 1, 프로브 4 및 프로브 5의 Hcy 감지를 열역학적으로 설명한 도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 프로브 1(a), 프로브 4(b) 및 프로브 5(c) (각각 10 μM)를 hcy (5 mM) 존재(파랑)/부재(검정)하에서 측정한 인광 방출 스펙트럼을 확인한 결과이다(H2O/MeCN (1:1 v/v, pH 7.4, 10 mM HEPES). λex= 500 nm. (a)
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 프로브를 이용하여 전기화학발광 특성을 평가한 결과이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 프로브의 호모시스테인 농도에 따른 전기화학발광 특성을 평가한 결과이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 프로브의 호모시스테인 선택성을 평가한 결과이다.
FIG. 1 is a diagram thermodynamically explaining the homocysteine (Hcy) detection of a probe according to an embodiment (a) and a comparative example (b) of the present invention obtained by Density functional theory (DFT) calculation.
FIG. 2 is a view for thermodynamically explaining the Hcy detection of the probe 1, the probe 4, and the probe 5 manufactured according to the embodiment of the present invention obtained by the DFT calculation.
Figure 3 shows the presence (hue) / absence (black) of hcy (5 mM) probe 1 (a), probe 4 (b) and probe 5 (c) a confirming a phosphorescence emission spectrum measurement result under (H 2 O / MeCN (1 :.. 1 v / v, pH 7.4, 10 mM HEPES) λex = 500 nm (a)
4 is a graph showing the results of evaluating electrochemiluminescence characteristics using a probe according to an embodiment of the present invention.
5 is a graph illustrating the electrochemiluminescence characteristics of the probe according to the concentration of homocysteine according to an embodiment of the present invention.
FIG. 6 shows the results of evaluating the homocysteine selectivity of a probe according to an embodiment of the present invention.

이하, 바람직한 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 성명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 의하여 제한되지 않는다는 것은 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to preferred embodiments. It is to be understood by those skilled in the art that these embodiments are for further explanation of the present invention and that the scope of the present invention is not limited thereto.

시약 및 기기Reagents and devices

모든 물질은 시그마-알드리치 또는 TCI에서 구매하였으며 어떤 추가적인 정제과정 없이 사용하였다. NMR을 찍기 위한 중수소화된 용매(deuterated solvent)는 CIL에서 구매하였다. NMR 스펙트럼은 Bruker Advance DPX-300을 이용하여 측정하였다. ESI-MS 자료는 QUATTRO LC Triple Quadrupole Tandem Mass Spectrometer를 이용하여 측정하였으며, m/z 단위로 표기하였다. MALDI-TOF는 Voyager-DE STR Biospectrometry Workstation을 이용하여 측정하였다. 분석용 박막크로마토그래피(thin layer chromatography)는 Kieselgel 60 F254 plate를 Merck에서 구입하여 사용하였다. 컬럼 크로마토그래피(Column chromatography)는 Merck silica gel 60과 Merck aluminium oxide 60을 사용하였다.
All materials were purchased from Sigma-Aldrich or TCI and used without any further purification. A deuterated solvent for NMR was purchased from CIL. NMR spectra were measured using a Bruker Advance DPX-300. ESI-MS data were measured using a QUATTRO LC Triple Quadrupole Tandem Mass Spectrometer and expressed in m / z units. MALDI-TOF was measured using a Voyager-DE STR Biospectrometry Workstation. For analytical thin layer chromatography, a Kieselgel 60 F254 plate was purchased from Merck. Column chromatography was performed using Merck silica gel 60 and Merck aluminum oxide 60.

전기화학 및 전기화학발광 측정Electrochemical and electrochemiluminescence measurement

전기화학 연구는 CH Instruments 650B을 이용하여 측정하였다. CV와 DPV는 전기화학적 산화/환원 특성을 조사하기 위하여 개별의 용액에 대하여 각각 측정하였다. ECL 스펙트럼은 CCD 카메라를 통해 얻었으며, ECL 세기에 대한 정보는 PMT 모듈을 통해 얻었다. 10 mL 사이즈의 ECL cell을 CCD 혹은 PMT 모듈에 직접 연결시켜서 ECL 신호를 측정하였다. 모든 ECL 데이터는 CV 실험과 동시에 수집하였다. ECL 용액은 일반적으로는 10 mM의 TPA(트리프로필아민)를 공반응물(coreactant) 사용하였으며 50% 또는 99.9%의 물이 포함되어 있는 수용액에서 실험하였다. TPA를 공반응물로 이용한 이유는 TPA가 가장 널리 사용되고 전기화학적인 특징들이 가장 잘 연구되어 있기 때문이다. ECL 측정은 실온에서 별다른 처리를 하지 않은 채로 진행되었다. 전기화학 실험들은 유기 용매에서는 Ag/Ag+ 기준 전극을, 수용액에서는 Ag/AgCl 기준 전극을 이용하였다. 페로센(Ferrocene)을 내부기준으로 이용하였으며, 이를 이용하여 다른 물질들의 전기화학적 특성들을 비교하였다. Pt 작업 전극은 0.05 M 알루미나가 뿌려져 있는 패드에 polishing 한 뒤에 5분동안 물과 에탄올에서 sonication 시켜주는 방법을 통해 세척하였다. 하나의 용액은 오직 한 번의 실험에만 사용하였으며 데이터를 얻은 후에는 모두 버려 주었다. 보고한 ECL 값들은 적어도 세번 혹은 다섯 번 이상의 반복 실험을 통해 얻은 평균값으로 높은 신뢰성을 보여주었다.
Electrochemical studies were performed using CH Instruments 650B. CV and DPV were measured for individual solutions to investigate electrochemical oxidation / reduction characteristics. The ECL spectra were obtained by CCD camera, and the ECL intensity was obtained by PMT module. The ECL signal was measured by directly connecting a 10-mL ECL cell to the CCD or PMT module. All ECL data were collected simultaneously with CV experiments. The ECL solution was generally used in an aqueous solution containing 50% or 99.9% water, using 10 mM TPA (tripropylamine) as the coreactant. The reason TPA is used as co-reactant is because TPA is the most widely used and electrochemical characteristics are best studied. ECL measurements were carried out at room temperature without further treatment. The electrochemical experiments used Ag / Ag + reference electrode in organic solvent and Ag / AgCl reference electrode in aqueous solution. Ferrocene was used as an internal standard, and the electrochemical properties of other materials were compared using this. The Pt working electrode was cleaned by poling the pad with 0.05 M alumina and sonication in water and ethanol for 5 minutes. One solution was used for only one experiment and all data was discarded. The reported ECL values were highly reliable with mean values obtained from at least three or more repeated experiments.

실시예 1. 화학식 1의 화합물(프로브 1)의 합성Example 1. Synthesis of Compound 1 (Probe 1)

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실시예 1.1. 4-(이소퀴놀린-1-일)벤즈알데히드(5)의 합성Example 1.1. Synthesis of 4- (isoquinolin-1-yl) benzaldehyde (5)

THF (40 mL) 및 H2O(40 mL)에 4-포밀페닐보로닉산 (1.15 g, 7 mmol), 1-클로로이소퀴놀린 (1.05 g, 7 mmol), Pd(PPh3)4 (404 mg, 0.35 mmol) 및 탄산칼륨 (1.93 g, 14 mmol)의 혼합물을 넣고 24시간 동안 환류시켰다. 다음으로 상온으로 냉각시키고 반응 혼합물을 디클로로메탄(DCM)으로 추출하였다. 유기층은 염수로 세척하고, Na2SO4으로 건조하였다. 용매는 감압하에 증발시켰다. 잔류물을 실리카겔 컬럼크로마토그래피법(에틸아세테이트/헥산=1:5)으로 정제하여 흰색 고체를 수득하였다(1.37 g, 84% 수율). Acid (1.15 g, 7 mmol), 1- chloro-isoquinoline (1.05 g, 7 mmol) 4-formyl-phenyl beam in THF (40 mL) and H 2 O (40 mL), Pd (PPh 3) 4 (404 mg, 0.35 mmol) and potassium carbonate (1.93 g, 14 mmol) was added thereto and refluxed for 24 hours. The reaction mixture was then cooled to room temperature and extracted with dichloromethane (DCM). The organic layer was washed with brine, dried over Na 2 SO 4. The solvent was evaporated under reduced pressure. The residue was purified by silica gel column chromatography (ethyl acetate / hexane = 1: 5) to give a white solid (1.37 g, 84% yield).

300 MHz 1H NMR (chloroform-d): δ 10.15 (s, 1 H), 8.65 (d, 1H, J=6.3 Hz), 8.02-8.08 (m,3H), 7.93 (d, 1H, J=10.1 Hz), 7.89 (d, 2H, J=10.1 Hz), 7.73 (t, 1H, J=7.8 Hz), 7.72 (d, 2H, J=7.1 Hz), 7.58 (t, 1H, J=8.0 Hz).
300 MHz 1 H NMR (chloroform- d): δ 10.15 (s, 1 H), 8.65 (d, 1H, J = 6.3 Hz), 8.02-8.08 (m, 3H), 7.93 (d, 1H, J = 10.1 1H, J = 7.8 Hz), 7.72 (d, 2H, J = 7.1 Hz), 7.89 (d, 2H, J = 10.1 Hz) .

실시예 1.2. 화합물 6의 합성Example 1.2. Synthesis of Compound 6

2-에톡시에탄올 (30 mL) 및 H2O(10 mL)에 실시예 1의 (5) (1 g, 4.29 mmol) 및 이리듐 클로라이드 하이드레이트 (576 mg, 1.93 mmol)을 넣고 12시간 동안 환류하였다. 다음으로 상온에서 냉각시킨 후, 차가운 물을 (~50 mL) 반응 혼합물에 부었다. 생성된 진한 갈색 침전물을 여과하여, 조질(Crude) 금속고리화된 이리듐(III) 클로로로 연결된 이량체(chloro-bridged dimer) 6을 얻었다.
(5 g) of Example 1 (1 g, 4.29 mmol) and iridium chloride hydrate (576 mg, 1.93 mmol) were added to 2-ethoxyethanol (30 mL) and H 2 O . After cooling at room temperature, cold water (~ 50 mL) was poured into the reaction mixture. The resulting dark brown precipitate was filtered to give a crude metal-cyclized iridium (III) chloro-bridged dimer 6.

실시예 1.3. 화합물 1의 합성Example 1.3. Synthesis of Compound 1

2-에톡시에탄올 (10 ml)에 실시예 2의 조질(Crude) 금속고리화된 이리듐(III) 클로로로 연결된 이량체(chloro-bridged dimer) (6, 330 mg, 0.245 mmol), 탄산나트륨 (260 mg, 2.45 mmol) 및 아세틸아세톤 (0.252 mL, 2.45 mmol)을 넣고 8시간 동안 환류하였다. 다음으로 상온에서 냉각시키고, 반응 혼합물을 DCM으로 추출하였다. 유기층을 물로 세척한 뒤, Na2SO4으로 건조하였다. 용매는 감압하여 증발시켰다. 잔류물은 실리카겔 컬럼크로마토그래피법(DCM/메탄올=20:1)으로 정제하였으며, 진한 갈색 고체를 수득하였다. (229 mg, 61% 수율). A chloro-bridged dimer (6, 330 mg, 0.245 mmol), sodium carbonate (260 mg, 0.245 mmol) of Crude metal cyclized iridium (III) of Example 2 was added to 2-ethoxyethanol mg, 2.45 mmol) and acetylacetone (0.252 mL, 2.45 mmol) were added, and the mixture was refluxed for 8 hours. Then cooled to room temperature and the reaction mixture was extracted with DCM. After the organic layer was washed with water, and dried over Na 2 SO 4. The solvent was evaporated under reduced pressure. The residue was purified by silica gel column chromatography (DCM / methanol = 20: 1) to give a dark brown solid. (229 mg, 61% yield).

300 MHz 1H NMR (DMSO-d6): δ 9.59 (s, 2H), 9.06 (d, 2H, J=8.9 Hz), 8.46 (m, 4H), 8.24 (d, 2H, J=7.1 Hz), 7.98 (m, 6H), 7.40 (d, 2H, J=8.3 Hz), 6.70 (s, 2H), 5.28 (s, 1H), 1.70 (s, 6H). 300 MHz 1 H NMR (DMSO- d 6): δ 9.59 (s, 2H), 9.06 (d, 2H, J = 8.9 Hz), 8.46 (m, 4H), 8.24 (d, 2H, J = 7.1 Hz) , 7.98 (m, 6H), 7.40 (d, 2H, J = 8.3 Hz), 6.70 (s, 2H), 5.28 (s, 1H), 1.70 (s, 6H).

75 MHz 13C NMR (CDCl3): δ 193.268, 185.179, 152.895, 151.009, 140.470, 137.315, 135.466, 134.930, 131.164, 129.581, 128.464, 127.605, 126.898, 126.500, 121.723, 121.592, 28.690. 75 MHz 13 C NMR (CDCl 3 ): δ 193.268, 185.179, 152.895, 151.009, 140.470, 137.315, 135.466, 134.930, 131.164, 129.581, 128.464, 127.605, 126.898, 126.500, 121.723, 121.592, 28.690.

HRMS (FAB+, m-NBA): m/z 측정치 756.1602 (계산치 C37H27N2IrO4 [M]+756.1600).
HRMS (FAB + , m-NBA): m / z measurement 756.1602 (calculated C 37 H 27 N 2 IrO 4 [M] + 756.1600).

실시예 2. 프로브 4의 제조Example 2. Preparation of probe 4

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실시예 1과 동일한 방법으로 합성하였으며, 실리카겔 컬럼크로마토그래피법(EA/Hex=1:1)으로 정제하여 검정색 고체의 프로브 4를 제조하였다(31.6 % 수율). Was synthesized in the same manner as in Example 1, and purified by silica gel column chromatography (EA / Hex = 1: 1) to prepare a black solid probe 4 (yield 31.6%).

300 MHz 1H NMR (chloroform-d): δ 10.21(s, 2H); 8.94-8.97 (m, 2H); 8.50 (d, 2H J = 6.3 Hz); 7.99-8.02 (m, 2H); 7.92 (s, 2H); 7.78-7.81 (m, 4H); 7.61 (d, 2H, J = 6.39 Hz); 6.80 (m, 2H); 5.19 (s, 1H); 3.95 (s, 6H), 1.76 (s, 6H).
300 MHz < 1 > H NMR (chloroform-d): [delta] 10.21 (s, 2H); 8.94-8.97 (m, 2H); 8.50 (d, 2H, J = 6.3 Hz); 7.99-8.02 (m, 2H); 7.92 (s, 2H); 7.78-7.81 (m, 4H); 7.61 (d, 2H, J = 6.39 Hz); 6.80 (m, 2H); 5.19 (s, 1 H); 3.95 (s, 6H), 1.76 (s, 6H).

실시예 3. 프로브 5의 제조Example 3. Preparation of probe 5

Figure 112017063605620-pat00022
Figure 112017063605620-pat00022

실시예 1과 동일한 방법으로 합성하였으며, 실리카겔 컬럼크로마토그래피법(EA/Hex=1:1)으로 정제하여 검정색 고체의 프로브 4를 제조하였다(22.7 % 수율). Was synthesized in the same manner as in Example 1 and purified by silica gel column chromatography (EA / Hex = 1: 1) to obtain a black solid probe 4 (yield of 22.7%).

300 MHz 1H NMR (chloroform-d): δ 9.46 (s, 2H); 8.44 (d, 2H J = 6.23 Hz); 8.34 (d, 2H J = 8.24 Hz); 7.94 (t, 2H, J = 7.97 Hz, 7.78 Hz ); 7.60-7.65 (m, 4H); 6.96 (s, 2H); 6.27 (s, 2H); 5.23 (s, 1H); 3.85 (s, 6H), 1.75 (s, 6H).
300 MHz 1 H NMR (chloroform- d): δ 9.46 (s, 2H); 8.44 (d, 2H, J = 6.23 Hz); 8.34 (d, 2H, J = 8.24 Hz); 7.94 (t, 2H, J = 7.97 Hz, 7.78 Hz); 7.60-7.65 (m, 4H); 6.96 (s, 2H); 6.27 (s, 2 H); 5.23 (s, 1 H); 3.85 (s, 6H), 1.75 (s, 6H).

실시예 4. 프로브 6의 제조Example 4. Preparation of probe 6

Figure 112017063605620-pat00023
Figure 112017063605620-pat00023

실시예 1과 동일한 방법으로 프로브 6을 제조하였다.
Probe 6 was prepared in the same manner as in Example 1.

실시예 5. 프로브 7의 제조Example 5. Preparation of probe 7

Figure 112017063605620-pat00024
Figure 112017063605620-pat00024

실시예 1과 동일한 방법으로 프로브 7을 제조하였다.
Probe 7 was prepared in the same manner as in Example 1.

실시예 6. 프로브 8의 제조Example 6. Preparation of probe 8

Figure 112017063605620-pat00025
Figure 112017063605620-pat00025

실시예 1과 동일한 방법으로 프로브 8을 제조하였다.
Probe 8 was prepared in the same manner as in Example 1.

비교예 1. 프로브 2의 합성Comparative Example 1. Synthesis of probe 2

Figure 112017063605620-pat00026
Figure 112017063605620-pat00026

비교예 1.1. 화합물 7의 합성Comparative Example 1.1. Synthesis of Compound 7

THF (40 mL) 및 N2-버블된 H2O (40 mL)에 4-포밀페닐보로닉산 (1.15 g, 7 mmol), 2-브로모피리딘 (0.667 mL, 7 mmol), Pd(PPh3)4 (404 mg, 0.35 mmol) 및 탄산칼륨 (1.93 mg, 14 mmol)을 넣고 24시간 동안 환류시켰다. 다음으로 상온으로 냉각시킨 다음, 반응 혼합물을 DCM으로 추출하였다. 유기층을 물로 세척한 뒤, Na2SO4으로 건조하였다. 용매는 감압하여 증발시켰다. 잔류물은 실리카겔 컬럼크로마토그래피법(에틸아세테이트/헥산=1:5)으로 정제하였으며, 흰색 고체를 수득하였다 (836 mg, 76% 수율).
4-formylphenylboronic acid (1.15 g, 7 mmol), 2-bromopyridine (0.667 mL, 7 mmol), Pd (PPh 3) were added to 40 mL of THF and 40 mL of N 2 -bubbed H 2 O 3 ) 4 (404 mg, 0.35 mmol) and potassium carbonate (1.93 mg, 14 mmol) were added thereto and refluxed for 24 hours. After cooling to room temperature, the reaction mixture was extracted with DCM. After the organic layer was washed with water, and dried over Na 2 SO 4. The solvent was evaporated under reduced pressure. The residue was purified by silica gel column chromatography (ethyl acetate / hexane = 1: 5) to give a white solid (836 mg, 76% yield).

비교예 1.2. 화합물 8의 합성Comparative Example 1.2. Synthesis of Compound 8

2-에톡시에탄올 (45 ml) 및 H2O (15 mL)에 화합물 7 (1 g, 6.44 mmol) 및 이리듐 클로라이드 하이드레이트 (865 mg, 2.90 mmol)을 넣고 12시간 동안 환류시켰다. 다음으로 상온으로 냉각시킨 다음, 반응 혼합물에 차가운 물(~100 mL)을 부었다. 생성된 노란색 침전은 여과하여 조질 금속고리화된 Ir(III) 클로로로 연결된 이량체 (8)을 수득하였다.
Compound 7 (1 g, 6.44 mmol) and iridium chloride hydrate (865 mg, 2.90 mmol) were added to 2-ethoxyethanol (45 ml) and H 2 O (15 mL) and refluxed for 12 hours. After cooling to room temperature, the reaction mixture was poured into cold water (~ 100 mL). The resulting yellow precipitate was filtered to yield a crude metal cyclized Ir (III) chloro-linked dimer (8).

비교예 1.3. 프로브 2의 합성Comparative Example 1.3. Synthesis of probe 2

디글라임 (diglyme) (10 mL) 중의 화합물 7 (360 mg, 2 mmol), 화합물 8 (214 mg, 0.2 mmol) 및 실버 트리플루오로메탄술포네이트 (109 mg, 0.4 mmol)을 반응용기에 넣고 탈기시켰다. 반응 혼합물을 110 ℃로 24시간 동안 계속 교반하면서 가열하였다. 생성된 진한 주황색(dark orange-red) 용액을 실온으로 냉각시킨 뒤, 물을 가하였다. 현탄액을 여과하고, 잔사를 DCM에 용해시켰다. 용액을 실리카겔 컬럼크로마토그래피법으로 정제하여 적색 고체를 수득하였다 (20% yield). Compound 7 (360 mg, 2 mmol), compound 8 (214 mg, 0.2 mmol) and silver trifluoromethanesulfonate (109 mg, 0.4 mmol) in diglyme (10 mL) . The reaction mixture was heated to 110 < 0 > C with continued stirring for 24 hours. The resulting dark orange-red solution was cooled to room temperature and water was added. The present tan solution was filtered and the residue was dissolved in DCM. The solution was purified by silica gel column chromatography to give a red solid (20% yield).

300 MHz 1H NMR (CDCl3): δ 9.71 (s, 1H), 7.99 (d, 1H, J=4.4 Hz), 7.92 (d, 2H, J=4.4 Hz), 7.77 (d, 1H, J=8.7 Hz), 7.69 (m, 6H), 7.51 (d, 1H, J=8.4 Hz), 7.48 (d, 1H, J=8.7 Hz), 7.31 (d, 1H, J=9.5 Hz), 7.01 (t, 2H, J=6.7 Hz), 6.96 (m, 7H), 6.79(d, 1H, J=7.4 Hz). 300 MHz 1 H NMR (CDCl 3 ): δ 9.71 (s, 1H), 7.99 (d, 1H, J = 4.4 Hz), 7.92 (d, 2H, J = 4.4 Hz), 7.77 (d, 1H, J = J = 8.7 Hz), 7.69 (m, 6H), 7.51 (d, 1H, J = 8.4 Hz), 7.48 , 2H, J = 6.7Hz), 6.96 (m, 7H), 6.79 (d, 1H, J = 7.4Hz).

75 MHz 13C NMR (CDCl3): δ 194.603, 166.658, 166.593, 165.331, 161.738, 160.245, 159.804, 149.961, 147.505, 147.070, 146.960, 145.799, 143.679, 143.524, 141.489, 137.166, 137.027, 136.469, 136.270, 136.191, 130.925, 130.202. 129.979, 128.840, 124.119, 124.014, 123.310, 122.053, 121.975, 120.330, 120.102, 120.065, 118.966, 118.920. 75 MHz 13 C NMR (CDCl 3 ): δ 194.603, 166.658, 166.593, 165.331, 161.738, 160.245, 159.804, 149.961, 147.505, 147.070, 146.960, 145.799, 143.679, 143.524, 141.489, 137.166, 137.027, 136.469, 136.270, 136.191 , 130.925,130.202. 129.979, 128.840, 124.119, 124.014, 123.310, 122.053, 121.975, 120.330, 120.102, 120.065, 118.966, 118.920.

HRMS (FAB+, m-NBA): m/z observed 683.1538 (calculated for C37H27N2IrO4 [M]+683.1548).
HRMS (FAB +, m-NBA): m / z observed 683.1538 (calculated for C 37 H 27 N 2 IrO 4 [M] + 683.1548).

비교예 2. 프로브 3의 준비Comparative Example 2. Preparation of probe 3

실시예 1과 유사한 방법으로 (piq)2Ir(acac)를 합성하였다.(Piq) 2 Ir (acac) was synthesized in a manner similar to that of Example 1.

Figure 112017063605620-pat00027

Figure 112017063605620-pat00027

제조예 1. ECL 프로브의 디자인Manufacturing Example 1. Design of ECL probe

강한 빛을 내는 이리듐 컴플렉스인 비교예 1의 (piq)2Ir(acac)를 프로브 1과 프로브 1과 호모시스테인의 반응물(1-Hcy)에 대한 모델 물질로 선택하였다.(Piq) 2 Ir (acac) of Comparative Example 1, which is a strong light emitting iridium complex, was selected as a model material for probe 1, probe 1, and reactant (1-Hcy) of homocysteine.

밀도함수이론(Density functional theory; DFT) 계산을 통해 프로브 1, 4, 5를 디자인하였다. 계산된 DFT는 하기 도 1, 2 및 표 1에 나타내었다. 산화 전위는 서포트 전해질로서 0.1M 테트라-n-부틸암모늄 퍼클로레이트를 포함한 아세토니트릴 용액에서 주사 속도(scan rate) 0.1 V/s로 순환 전압전류를 사용하여 측정되었고, 값은 표준으로 1 mM 페로센(Fc/Fc+)의 산화에 대해 보정하였고, SCE를 참고하였다. 에너지 갭(△E)는 흡수스펙트럼과 방출스펙트럼 사이의 단면 파장으로부터 계산하였다. Probes 1, 4, and 5 were designed using density functional theory (DFT) calculations. The calculated DFT is shown in Figures 1 and 2 and Table 1 below. The oxidation potential was measured using a cyclic voltammetric current at a scan rate of 0.1 V / s in an acetonitrile solution containing 0.1 M tetra-n-butylammonium perchlorate as a support electrolyte, and the value was 1 mM ferrocene (Fc / Fc +), and reference was made to the SCE. The energy gap (DELTA E) was calculated from the cross-sectional wavelength between the absorption spectrum and the emission spectrum.

구분division E0' ox
(V vs SCE)
E 0 ' ox
(V vs SCE)

HOMO

HOMO

LUMO

LUMO
△E
(HOMO-LUMO)
ΔE
(HOMO-LUMO)
프로브 1Probe 1 0.780.78 -5.57-5.57 -3.39-3.39 2.182.18 프로브 4Probe 4 0.540.54 -5.33-5.33 -3.42-3.42 1.191.19 프로브 5Probe 5 0.700.70 -5.50-5.50 -3.34-3.34 2.162.16

표 1에서 확인할 수 있듯이, 하기 화학식 1의 화합물에서 R1 및 R2은 HOMO 에너지 레벨에는 관여하였으나, LUMO 에너지 레벨에는 관여하지 않았다. 프로브 4는 HOMO-LUMO 에너지 갭 차이가 프로브 1 및 5에 비해 크게 감소하였으며, 광발광(photoluminescence, PL)이 감소하였으며, 적색 편이된 영역에서 전기화학발광을 방출하였다.
As can be seen in Table 1, R 1 and R 2 in the compound of Formula 1 were involved in the HOMO energy level but not in the LUMO energy level. In probe 4, the HOMO-LUMO energy gap difference was greatly reduced compared to probes 1 and 5, photoluminescence (PL) decreased, and electrochemiluminescence was emitted in the red shifted region.

프로브 1은 약 0.74V에서 산화하며 TPA가 있는 조건에서 615 nm 부근에서 강한 주황색(orange-red)의 ECL 발광을 나타내었다. 또한 가장 널리 사용되는 ECL 물질인 Ru(bpy)32+에 비해 약 2배 정도 강한 세기를 나타내었다. 프로브 1은 비교예인 (piq)2Ir(acac)에 비해 주 리간드의 페닐링의 4번 위치에 추가적으로 포밀기(formyl group)를 도입한 형태이며, 포밀기의 강한 전자 구인성(electron-withdrawing) 능력으로 인해 비교예와는 달리 거의 빛이 나지 않고 또한 655 nm 정도의 매우 적색 편이(red-shift)된 영역에서 발광 특성을 나타내었다. 하지만, Hcy을 넣어주면 613 nm 부근에서 원래의 강한 PL을 회복하는 모습을 보였으며, 이는 (piq)2Ir(acac)의 특성과 매우 유사하였다. 청색 편이(Blue-shift)된 영역에서 강한 빛을 보이는 이유는 HOMO-LUMO 에너지 차이가 증가하는 것과 관련이 있다. 즉, 포밀기가 사라짐으로 인해 LUMO 레벨이 급격하게 상승하게 되며, 이로 인하여 에너지 차이 역시 증가하기 때문이다.
Probe 1 was oxidized at about 0.74 V and showed strong orange-red ECL emission near 615 nm under the condition of TPA. In addition, the strength was about twice that of Ru (bpy) 32 +, which is the most widely used ECL material. Probe 1 is a form in which a formyl group is additionally introduced at the 4-position of the phenyl ring of the main ligand as compared with (piq) 2 Ir (acac) of the comparative example, and the strong electron- Unlike the comparative example, the light-emitting layer exhibited almost no light, and exhibited luminescence characteristics in a region of a very red-shifted region of about 655 nm. However, when Hcy was added, the original strong PL was recovered at around 613 nm, which was very similar to that of (piq) 2 Ir (acac). The reason for the strong light in the blue-shifted region is related to the increased HOMO-LUMO energy difference. That is, the LUMO level is rapidly increased due to the disappearance of the former, and the energy difference also increases.

도 3은 프로브 1, 4 및 5의 인광 방출 스펙트럼을 나타낸 것이다. 본 발명에 따른 프로브 4는 hcy 부재하에서는 인광(phosphorescence)을 나타내지 않으며, 프로브 1는 670 nm에서 약한 방출을 나타내었고, 프로브 5는 프로브 1보다 약한 방출을 나타내는 것이 확인되었다. 이는 전자공여기의 도입의 영향으로, 공여기가 R2에 위치할 때, 전자공여기에 의한 이점이 보다 증가되는 것으로 확인되었다.
Fig. 3 shows the phosphorescence emission spectra of probes 1, 4 and 5. Fig. It was confirmed that probe 4 according to the present invention showed no phosphorescence under the absence of hcy, probe 1 showed weak release at 670 nm, and probe 5 showed weaker release than probe 1. It was confirmed that the effect of the electron-hole excitation was further increased when the electron-hole excitation was located at R 2 due to the introduction of the electron-hole excitation.

시험예 1. 프로브 1의 ECL 특성 검증Test Example 1. Verification of ECL characteristics of probe 1

ECL 측정은 50 μM의 프로브 1과 10 mM TPA가 녹아 있는 수용액에서 진행하였다. 프로브 1은 그 자체로는 순환 전압전류법(cyclic voltammetry; CV) 과정 동안 거의 ECL 신호를 보여주지 않았지만, Hcy을 넣어줌에 따라 점차적으로 ECL이 증가하는 양상을 보였다. ECL 발광 증가에 대한 결과는 도 4a에 나타내었다. The ECL measurement was carried out in an aqueous solution containing 50 μM of probe 1 and 10 mM of TPA. Probe 1 itself showed little ECL signal during the cyclic voltammetry (CV) process, but ECL gradually increased with the addition of Hcy. The results for increased ECL emission are shown in Figure 4A.

Hcy가 없을 때에는 발광이 관측되지 않지만, 5 mM의 Hcy을 넣어준 후에는 1.3 V와 1.6 V 부근에서 두 개의 최대(maximum) ECL 피크가 생겨나는 것을 볼 수 있었다. 또한 10 mM의 Hcy을 넣어 주었을 때에는 1.3 V에서의 피크는 사라지고 1.6 V 부근에서의 피크만 점점 증가하면서 관측되는 것을 확인할 수 있었다. 다양한 농도의 Hcy을 첨가하였을 때의 ECL 최대 피크 값을 통해 결합 적정 곡선을 얻을 수 있었으며 이를 도 4b에 나타내었다. 프로브 1의 농도를 50 μM로 유지시킨 상태에서 0-10 mM의 Hcy 농도 범위에서 ECL 신호가 선형적으로 증가하는 것을 확인되었다. 측정된 검출 한계값은 41 μM이다. 한편 동일한 실험조건에서, 프로브 4는 hcy의 부재하에서는 ECL 신호를 전혀 내지 않았지만, Hcy을 넣어줌에 따라 약 1.2 V에서 강렬한 ECL 강도를 나타내었다. 측정된 검출 한계값은 0.44 μM로 매우 우수하였다.No luminescence was observed when there was no Hcy, but after adding 5 mM of Hcy, two maximum ECL peaks were observed near 1.3 V and 1.6 V. In addition, when 10 mM of Hcy was added, the peak at 1.3 V disappears and only the peak near 1.6 V is observed to be observed. The binding titration curve was obtained from the ECL maximum peak value when various concentrations of Hcy were added, which is shown in FIG. 4b. It was confirmed that the ECL signal was linearly increased in the Hcy concentration range of 0-10 mM while the concentration of the probe 1 was maintained at 50 μM. The measured detection limit value is 41 μM. On the other hand, under the same experimental conditions, probe 4 showed no ECL signal in the absence of hcy, but showed intense ECL intensity at about 1.2 V as Hcy was added. The measured detection limit was 0.44 μM, which was very good.

도 4a을 참고하면, ECL 적정 결과 두 개의 발광 피크가 관찰되는 것을 확인할 수 있다. 첫 번째 5 mM의 Hcy를 넣어줄 때까지는 1.3 V와 1.6 V에서 두 개의 피크가 점차적으로 증가하였다. Hcy를 더 넣어주었을 경우에는 1.3 V의 피크가 점차적으로 줄어들고 1.6 V에서의 피크는 계속해서 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 도 4c는 1.3 V와 1.6 V에서의 ECL 피크의 세기의 변화를 나타낸 것이다. 100 당량의 Hcy을 넣어줄 때까지는 1.3 V와 1.6 V에서 두 개의 피크가 점차적으로 증가하며, 그 후에는 1.6 V에서의 피크가 증가하여 200 당량의 Hcy를 넣어주면 포화되는 현상을 보여주었고 1.3 V의 피크는 점점 감소하였다. 프로브 1은 두 개의 포밀기를 가지고 있기 때문에 처음 스테이지에서는 Hcy과 프로브 1이 1:1로 결합하다가 Hcy의 양이 점점 증가함에 따라 1:2 최종 결합물이 생성될 것이라고 예상할 수 있다. 따라서, 1.3 V에서의 피크는 1:1 결합물에 대한 것이고 1.6 V에서의 피크는 1:2 최종 결합물에 대한 것으로 예측된다. 두 가지의 다른 ECL 신호의 비율을 통해 적정 곡선을 그릴 수 있었고, 6-17 mM의 Hcy 농도 범위에서 선형적으로 증가하는 양상을 얻어낼 수 있었으며, 이를 도 4d에 나타내었다. Referring to FIG. 4A, it can be confirmed that two emission peaks are observed as a result of ECL titration. Two peaks at 1.3 V and 1.6 V gradually increased until the first 5 mM of Hcy was added. When Hcy was further added, the peak at 1.3 V gradually decreased and the peak at 1.6 V continued to increase. 4C shows the change in the intensity of the ECL peak at 1.3 V and 1.6 V. FIG. Two peaks at 1.3 V and 1.6 V gradually increased until 100 equivalents of Hcy had been added. Thereafter, the peak at 1.6 V increased and saturates when 200 equivalents of Hcy were added. Of the peak was gradually decreased. Since probe 1 has two formers, it can be expected that the 1: 2 final binding will be produced as the amount of Hcy increases gradually in the first stage when Hcy and probe 1 are combined at a ratio of 1: 1. Thus, the peak at 1.3 V is for a 1: 1 bond and the peak at 1.6 V is predicted for a 1: 2 final bond. The titration curves were plotted through the ratio of the two different ECL signals, and a linearly increasing pattern was obtained in the Hcy concentration range of 6-17 mM, which is shown in FIG. 4d.

혈액 내에 존재하는 Hcy의 양은 일반적으로 5-15 μM 사이이며, 따라서 약 5 μM 정도의 Hcy를 검출할 수 있어야 실제 환자들의 잠재적인 위험 요소를 진단할 수 있다. 본 발명에 따른 프로브 1의 LOD 값 (41 μM)은 Hcy 이상을 진단하기 위해 필요한 검출 한계 값에 비해 더 높은 값을 갖는다. 이에, 본 발명에 따른 프로브 1를 이용하여 Hcy에 대한 검출 한계를 낮출 수 있는지를 증명하기 위하여 25 μL의 양으로도 측정이 가능한 ECL 셀을 추가로 제작하였다. 상기 ECL 셀은 PMT 모듈에 1 mm 정도의 거리만을 두고 바로 맞닿아 있을 수 있도록 설계되었으며, 이를 통해 높은 ECL 민감도(sensitivity)를 가지게 될 것이라고 기대하였다. The amount of Hcy present in the blood is generally between 5 and 15 μM, so that detection of Hcy of about 5 μM can be used to diagnose the potential risk factors of actual patients. The LOD value (41 [mu] M) of the probe 1 according to the present invention has a higher value than the detection limit value required for diagnosing Hcy or more. In order to prove that the detection limit for Hcy can be lowered by using the probe 1 according to the present invention, an ECL cell capable of measuring an amount of 25 μL was further prepared. The ECL cell was designed to be in direct contact with the PMT module with a distance of about 1 mm, and it was expected that it would have a high ECL sensitivity.

새로운 시스템을 이용하여 99.9% 수용액 상에서 0.1 μM의 프로브 1을 다양한 농도에 Hcy을 넣어 주어 ECL을 측정하였으며, 이를 통해 0-40 μM 범위의 Hcy 농도에 대해 선형 증가 곡선을 얻었으며, 이를 도 5에 나타내었다. 상기 농도 범위는 실제 진단에서 요구하는 범위를 거의 포함하고 있으며, 또한 이전에 보고되었던 PL 기반의 Hcy 프로브들과 비교해 보았을 때에도 거의 비슷한 수준을 보여주는 결과이다. 이 실험을 통해 얻은 LOD값은 7.9 μM이었다.
Using a new system, 0.1 μM of probe 1 in 99.9% aqueous solution was added to Hcy at various concentrations and ECL was measured. The linear increase curve was obtained for Hcy concentration in the range of 0-40 μM, Respectively. The concentration range includes almost the range required for actual diagnosis and also shows almost the same level when compared with the previously reported PL-based Hcy probes. The LOD value obtained from this experiment was 7.9 μM.

시험예 2. 선택성 테스트Test Example 2. Selectivity Test

Hcy에 대한 본 발명의 프로브의 선택성을 측정하기 위해, 다른 아미노산들과의 경쟁 결합 실험을 진행하였다. 먼저 프로브 1 50 μM에 10 mM의 다른 아미노산들 또는 글루타티온을 넣어준 후, 추가적으로 5 mM의 Hcy을 넣어주었다. 도 6a에 나타낸 바와 같이, 200 당량의 아미노산을 넣어주었을 때에는 ECL 변화가 거의 없다가 추가적으로 100 당량의 Hcy를 넣어주자 눈에 띄는 ECL 증가를 보였다. 즉, 200 당량의 아미노산이 첨가되어 있는 상태에도 100 당량의 Hcy를 넣어 주었을 때, 아미노산이 없을 때 같은 양의 Hcy을 넣어 주었을 때와 비교하여 54-97% 정도의 ECL 세기를 보여주었다. PL 경쟁 실험 역시 비슷한 결과를 보여주었고, 이를 통해 다른 아미노산들의 존재 하에서도 별다른 방해를 받지 않고 Hcy을 선택적으로 잘 인식한다는 사실을 증명하였다.In order to measure the selectivity of the probe of the present invention against Hcy, competitive binding experiments with other amino acids were conducted. First, 10 μM of other amino acids or glutathione was added to 50 μM of probe 1, followed by addition of 5 mM of Hcy. As shown in FIG. 6A, when 200 equivalents of amino acid were added, there was almost no change in ECL, but when 100 equivalents of Hcy was added, a noticeable increase in ECL was observed. That is, when 100 equivalents of Hcy were added even when 200 equivalents of amino acid was added, the ECL intensity was about 54-97% as compared with when the same amount of Hcy was added when there was no amino acid. PL competition experiments also showed similar results, demonstrating that Hcy selectively recognizes well in the presence of other amino acids without appreciable interference.

한편, 시스테인(Cys)의 경우는 Hcy와의 구조적 유사성에 기인하여 간섭기(interference)로 작용할 수 있기 때문에 이에 대한 영향을 확인하였다. 도 6b에 나타낸 바와 같이, 10 mM의 Cys이 존재하에서 약한 ECL 신호가 관측되었다. 그러나, Hcy에 대해서는 Cys에 비해 3.2배 강한 ECL 세기를 나타내는 것으로 측정되었다. 이는 본 발명의 프로브가 호모시스테인에 대한 선택성이 우수한 것을 입증한다.On the other hand, in the case of cysteine (Cys), the effect on interference was confirmed because it can act as an interference due to the structural similarity with Hcy. As shown in Figure 6b, weak ECL signals were observed in the presence of 10 mM Cys. However, it was measured that ECcy intensity of Hcy was 3.2 times stronger than that of Cys. This proves that the probe of the present invention is excellent in selectivity for homocysteine.

다음으로, 프로브 4에 대한 선택성을 측정하였다. 프로브 4 10 μM에 10 mM의 여러가지 아미노산(Ala, Gly, His, Lys, Phe, Ser), 글루타티온 및 음이온(Br-, I-, OAc-, N3-, NO3 2-, PO4 3- 및 SO3 2-)을 각각 넣어준 후 선택성을 확인하였다. 도 6c 및 6d에 나타낸 바와 같이, 프로브 4는 시스테인, 글루타티온 및 설파이드에서만 유의적이지 않은 수준의 아주 약한 신호의 변화를 보였을 뿐이며, Hcy에 대해서만 강한 ECL 세기를 나타내는 것으로 측정되었다.
Next, the selectivity to probe 4 was measured. Various amino acids 10 mM of the probe 4 10 μM (Ala, Gly, His, Lys, Phe, Ser), glutathione and negative ions (Br-, I-, OAc-, N 3 -, NO 3 2 -, PO 4 3 - And SO 3 2 -), respectively. As shown in FIGS. 6C and 6D, probe 4 showed only a very weak signal change at levels not significantly different from cysteine, glutathione and sulfide, and was measured to exhibit strong ECL intensity only for Hcy.

시험예 3. 다른 이리듐 기반 프로브와 성능 비교Test Example 3. Performance comparison with other iridium-based probes

본 발명에 따른 프로브의 우수성을 확인하기 위하여, 화학식 1로 표시되는 화합물과 구조적으로 유사한 프로브와의 성능을 비교평가 하였다. In order to confirm the superiority of the probe according to the present invention, the performance of a compound represented by the formula (1) and a probe structurally similar to the probe was compared and evaluated.

PL 실험을 통해 Hcy을 검출한 연구들이 다른 연구진들에 의해 이전에 보고된 바 있다. 구체적으로, Huang 그룹에서는 두개의 4-(2-피리딜)벤즈알데히드와 한개의 아세틸아세토네이트 기반의 이리듐 컴플렉스인 (pba)2Ir(acac) (프로브 3)을 개발하여 인광의 증가를 통해 효과적으로 Hcy을 검출했다고 보고한 바 있으며, Schmittel 그룹에서는 비슷한 접근법을 이용하여 Hcy에 대한 PL 센서를 개발하였다고 보고하였으나, ECL 변화는 거의 관측되지 않았다.Studies that detected Hcy through PL experiments have been previously reported by other researchers. Specifically, the Huang Group has developed two acetic acid-based iridium complexes (pba) 2 Ir (acac) (probe 3), two 4- (2-pyridyl) benzaldehyde, , And the Schmittel group reported using a similar approach to develop a PL sensor for Hcy, but little change in ECL was observed.

전기화학적인 관점에서 볼 때, 포밀기의 반응에 의한 프로브의 LUMO 분포의 불안정화는 환원 전위가 보다 더 음수 값으로 이동함을 유발한다. 따라서, 종래 기술에 따른 프로브 3이 Hcy과 반응하였을 경우 생성되는 3-Hcy의 경우 3에 비해 환원 전위가 더 음수 값으로 이동하게 될 것으로 예상된다. 하지만 ECL 과정에 있어서, 환원 전위가 지나치게 음수 값을 가질 경우, TPA 라디컬에서 결합 물질의 LUMO 레벨로의 전자 전달을 힘들게 만들기 때문에 들뜬 상태가 거의 형성되지 못하고 이로 인해 ECL 발광 현상이 잘 일어나지 않게 된다. 2-페닐피리딘을 주 리간드로 가지는 이리듐 컴플렉스는 TPA 라디컬에 비해 조금 더 음수 값의 환원 전위를 가지는 것으로 알려져 있으며, 따라서 3-Hcy의 LUMO 레벨의 상승은 전자 전달을 차단함으로써 오히려 ECL 발광을 더 힘들게 만든다.
From the electrochemical point of view, the destabilization of the LUMO distribution of the probe by the reaction of the bubbler causes the reduction potential to shift to a more negative value. Therefore, it is expected that the reduction potential will be shifted to a negative value in comparison with 3 in case of 3-Hcy generated when the probe 3 according to the prior art reacts with Hcy. However, in the ECL process, when the reduction potential is excessively negative, the electron transfer from the TPA radical to the LUMO level of the bonding material becomes difficult, so that the excited state is hardly formed and the ECL emission phenomenon does not occur well . The iridium complex with 2-phenylpyridine as the primary ligand is known to have a slightly more negative reduction potential than the TPA radical, and thus the increase of the LUMO level of 3-Hcy blocks the electron transfer, It makes it hard.

본 발명에 따른 화학식 1의 화합물을 포함하는 프로브(프로브 1)은 상기와 같은 문제점들을 고려하여 효율적인 Hcy에 대한 ECL 프로브로써 디자인된 것이다. 즉, 피리딘 링을 더 강한 전자 구인성(electron-withdrawing) 성질을 가지는 이소퀴놀린으로 바꿔 줌으로써 LUMO 레벨을 안정화시키고자 하였고, 이를 통해 PL 뿐 아니라 ECL에서도 Hcy 존재 하에 발광이 증가하는 프로브를 개발하였다.The probe (probe 1) comprising the compound of formula (1) according to the present invention is designed as an efficient Hcy ECL probe in consideration of the above problems. That is, the present inventors tried to stabilize the LUMO level by replacing the pyridine ring with isoquinoline having a stronger electron-withdrawing property, thereby developing a probe that increases luminescence in the presence of Hcy in PL as well as in ECL.

밀도함수이론(Density functional theory; DFT) 계산은 1-Hcy의 LUMO 레벨이 TPA 라디컬의 HOMO 레벨보다 낮을 것이라고 예측하고 있고, 이러한 예측을 통해 프로브 1이 Hcy과 반응한 후에 효과적으로 ECL을 생성할 것이라고 기대할 수 있다. 반면에, 프로브 3은 Hcy과의 반응 후에 LUMO 레벨이 급격하게 상승하여 TPA 라디컬의 HOMO 레벨보다도 높아질 것으로 예측되며, 이 경우, TPA 라디컬에서의 전자 전달이 잘 일어나지 않아 ECL 발광 생성 과정이 원활히 일어나지 않을 것으로 예상되었다.
Density functional theory (DFT) calculations predict that the LUMO level of 1-Hcy will be lower than the HOMO level of TPA radicals and that this will effectively produce ECL after probe 1 has reacted with Hcy You can expect. On the other hand, it is predicted that the probe 3 rapidly increases the LUMO level after the reaction with Hcy and becomes higher than the HOMO level of the TPA radical. In this case, the electron transfer in the TPA radical does not occur well, It was expected not to happen.

이러한 예측들을 실제로 실험적으로 증명하기 위해, 두 가지의 이리듐 컴플렉스 2(프로브 2) 및 3(프로브 3)을 합성하였다. 프로브 3은 종래에 Huang 그룹에서 발표했던 물질이고, 프로브 2는 3에 대한 유사체(analogue)로써 프로브 3과 거의 같은 특성을 보여줄 것으로 예상되는 것이다. 프로브 2에 Hcy을 첨가해 주었을 때는 프로브 3과 마찬가지로 PL이 급격하게 증가하는 양상을 보여주었다. 그러나, 예상했던 것과 같이, 프로브 2에 Hcy을 넣어줌에 따라 ECL 세기는 오히려 조금씩 감소하는 양상이 확인되었다. 즉, 50 μM의 프로브 2에 10 mM Hcy를 첨가한 후 0-1.5V의 전압을 걸어주었을 때, 프로브 2가 약한 ECL을 1.2 V 부근에서 보여주는 것에 비해 2-Hcy는 더 약한 ECL 세기를 보여주었다. 프로브 3과 3-Hcy의 ECL 성질 역시 2, 2-Hcy과 거의 유사한 경향을 보여주었다. 하지만, 본 발명에 따른 프로브 1은 PL과 ECL 모두 Hcy을 넣어 주었을 때 비슷한 양상을 보이며 크게 증가하는 것이 관찰되었다. To actually demonstrate these predictions experimentally, two iridium complexes 2 (probe 2) and 3 (probe 3) were synthesized. Probe 3 is the material previously disclosed in Huang Group, and Probe 2 is expected to show almost the same characteristics as Probe 3 as an analogue to 3. When Hcy was added to probe 2, the PL rapidly increased as in probe 3. However, as expected, the ECL intensity was slightly decreased with the addition of Hcy to probe 2. That is, when 10 mM Hcy was added to 50 μM of probe 2 and a voltage of 0-1.5 V was applied, 2-Hcy showed weaker ECL intensity than Probe 2 showing weak ECL near 1.2 V . The ECL properties of probe 3 and 3-Hcy also showed similar tendencies to 2, 2-Hcy. However, it was observed that the probe 1 according to the present invention shows a similar pattern when Hcy is added to both PL and ECL, which is greatly increased.

이와 같은 사실을 보다 확실하게 규명하기 위하여 CV 실험을 실시하였으며, 그 결과를 표 2에 나타내었다. 산화 전위는 서포트 전해질로서 0.1M 테트라-n-부틸암모늄 퍼클로레이트를 포함한 아세토니트릴 용액에서 주사 속도(scan rate) 0.1 V/s로 순환 전압전류를 사용하여 측정되었고, 값은 표준으로 1 mM 페로센(Fc/Fc+)의 산화에 대해 보정하였고, SCE를 참고하였다. 환원 전위(E0' red)값은 여기 에너지(E0 -0) 및 산화 전위(E0' ox)로부터 계산하였다. In order to clarify this fact more clearly, CV experiments were carried out and the results are shown in Table 2. The oxidation potential was measured using a cyclic voltammetric current at a scan rate of 0.1 V / s in an acetonitrile solution containing 0.1 M tetra-n-butylammonium perchlorate as a support electrolyte, and the value was 1 mM ferrocene (Fc / Fc +), and reference was made to the SCE. The reduction potential (E 0 ' red ) value was calculated from the excitation energy (E 0 -0 ) and the oxidation potential (E 0' ox ).


화합물구분

Compound classification
E0' ox
(V vs SCE)
E 0 ' ox
(V vs SCE)
E0' red *
(V vs SCE)
E 0 ' red *
(V vs SCE)
E0 -0 *
(eV)
E 0 -0 *
(eV)
33 0.400.40 -1.66-1.66 2.062.06 3-Hcy3-Hcy 0.370.37 -1.99-1.99 2.362.36 3-Cys3-Cys 0.380.38 -1.98-1.98 2.362.36 1One 0.770.77 -1.04-1.04 1.811.81 1-Hcy1-Hcy 0.740.74 -1.28-1.28 2.022.02 1-Cys1-Cys 0.700.70 -1.32-1.32 2.022.02

표 2에 나타낸 바와 같이, 프로브 3의 환원 전위는 -1.66 V이며, Hcy을 첨가해 준 뒤에는 -1.99V로 이동하는 것을 확인할 수 있다. TPA 라디컬의 환원 전위는 약 -1.7V 정도로 알려져 있으며, 따라서 이러한 데이터는 왜 3-Hcy이 ECL 과정 중에 들뜬 상태를 거의 형성할 수 없는지에 대한 설명의 근거가 될 수 있다. 하지만, 프로브 1의 경우 Hcy과의 반응 후에 생성되는 1-Hcy의 환원 전위가 -1.28 V로써 상대적으로 마일드하며, TPA 라디칼의 환원 전위에 비해 덜한 음수 값을 가지기 때문에 효과적으로 들뜬 상태가 형성될 수 있을 것으로 예상할 수 있다.
As shown in Table 2, it is confirmed that the reduction potential of the probe 3 is -1.66 V, and after the addition of Hcy, the potential shifts to -1.99 V. The reduction potential of TPA radicals is known to be about -1.7V, so this data can serve as a basis for explaining why 3-Hcy can hardly form an excited state during the ECL process. However, in probe 1, the reduction potential of 1-Hcy produced after the reaction with Hcy is -1.28 V, which is relatively mild and has a negative value lower than the reduction potential of the TPA radical, so that an effectively excited state can be formed .

시험예 4. 반응속도 평가Test Example 4. Evaluation of reaction rate

실시예 1 내지 3에 따른 프로브 1, 4 및 5 (10 μM)에 각각 hcy (5 mM)을 첨가하여 반응속도를 측정하였으며, 이를 하기 도 7에 나타내었다. 측정은 H2O/MeCN (1:1 v/v, pH 7.4, 10 mM HEPES) (λex= 500 nm)에서 수행하였다. 프로브 1은 최대인광세기 90%에 도달하는데 170분이 소요되었으며, 프로브 4는 최대강도의 90%에 도달하는데 85분이 채 걸리지 않았다. 또한 프로브 5는 프로브 1보다 조금 빠른 것이 확인되었다. 이는 DFT 계산값과도 일치한다. Hcy (5 mM) was added to the probes 1, 4 and 5 (10 μM) according to Examples 1 to 3, respectively, and the reaction rate was measured. Measurements were performed in H 2 O / MeCN (1: 1 v / v, pH 7.4, 10 mM HEPES) (λex = 500 nm). Probe 1 took 170 minutes to reach a maximum phosphorescence intensity of 90% and probe 4 did not take more than 85 minutes to reach 90% of maximum intensity. It was also confirmed that probe 5 was slightly faster than probe 1. This is consistent with the DFT calculation.

Claims (10)

하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 호모시스테인 검출용 전기화학발광 프로브:
[화학식 1]
Figure 112018004865668-pat00047

상기 화학식 1에서,
L는 비발광성 리간드이며;
R1 및 R2는 각각 독립적으로 수소 및 C1-10알킬옥시 중에서 선택되고, R1가 C1-10알킬옥시이면, R2는 C1-10알킬옥시가 아니고,
R3은 수소이다.
An electrochemiluminescent probe for detecting homocysteine comprising a compound represented by the following formula (1): < EMI ID =
[Chemical Formula 1]
Figure 112018004865668-pat00047

In Formula 1,
L is a non-luminescent ligand;
R 1 and R 2 are each independently selected from hydrogen and C 1-10 alkyloxy, and when R 1 is C 1-10 alkyloxy, R 2 is not C 1-10 alkyloxy,
R 3 is hydrogen.
삭제delete 제1항에 있어서,
비발광성 리간드 L은 하기 구조로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 호모시스테인 검출용 전기화학발광 프로브:
Figure 112017063605620-pat00035
Figure 112017063605620-pat00036
Figure 112017063605620-pat00037
Figure 112017063605620-pat00038
Figure 112017063605620-pat00039

상기 화학식에서,
R6, R7, R8, R9, R10, R11 및 R12는 서로 동일하거나 또는 상이하고, 각각 독립적으로 수소, C1 - 10알킬, 할로C1 - 6알킬 및 C5 - 12아릴 중에서 선택된다.
The method according to claim 1,
Wherein the non-luminescent ligand L is selected from the following structures:
Figure 112017063605620-pat00035
Figure 112017063605620-pat00036
Figure 112017063605620-pat00037
Figure 112017063605620-pat00038
Figure 112017063605620-pat00039

In the above formulas,
R 6, R 7, R 8 , R 9, R 10, R 11 and R 12 are the same or different and are each independently hydrogen, C 1 - 10 alkyl, halo C 1 - 6 alkyl and C 5 - 12 Aryl.
제1항에 있어서,
상기 화학식 1의 화합물은 호모시스테인과 선택적으로 반응하여 전기화학발광 신호를 증가시키는 것을 특징으로 하는, 호모시스테인 검출용 전기화학발광 프로브.
The method according to claim 1,
The electrochemiluminescent probe for detecting homocysteine according to claim 1, wherein the compound of Formula 1 selectively reacts with homocysteine to increase an electrochemiluminescence signal.
제1항에 있어서,
상기 화학식 1의 화합물의 포밀기와 호모시스테인이 반응하여 육각 고리를 형성하며, 전기화학발광 신호를 증가시키는 것을 특징으로 하는, 호모시스테인 검출용 전기화학발광 프로브.
The method according to claim 1,
The electrochemiluminescent probe for detecting homocysteine according to claim 1, wherein the compound of formula (I) reacts with homocysteine to form a hexagonal ring and increase the electrochemiluminescence signal.
제5항에 있어서,
화학식 1의 화합물과 호모시스테인의 반응 생성물의 LUMO 에너지 레벨이 전기화학발광 공반응물의 HOMO 에너지 레벨보다 낮은, 호모시스테인 검출용 전기화학발광 프로브.
6. The method of claim 5,
Wherein the LUMO energy level of the reaction product of the compound of formula (1) and homocysteine is lower than the HOMO energy level of the electrochemiluminescent photoactive reagent.
제6항에 있어서,
전기화학발광 공반응물은 트리프로필아민 또는 2-(디부틸아미노)에탄올인 것을 특징으로 하는, 호모시스테인 검출용 전기화학발광 프로브.
The method according to claim 6,
The electrochemiluminescent probe for detecting homocysteine according to claim 1, wherein the electrochemiluminescent compound is tripropylamine or 2- (dibutylamino) ethanol.
제1항, 제3항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 전기화학발광 프로브를 이용하는, 생체 내 호모시스테인의 검출 방법.A method for detecting homocysteine in vivo using the electrochemiluminescent probe according to any one of claims 1 to 7. 제1항, 제3항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 전기화학발광 프로브를 포함하는 전기화학발광 센서.An electrochemiluminescence sensor comprising an electrochemiluminescent probe according to any one of claims 1 to 7. 제9항에 있어서, 호모시스테인과의 반응에 의해 청색 이동된 영역에서 전기화학발광의 변화가 나타나는 것인, 전기화학발광 센서.10. The electrochemiluminescent sensor according to claim 9, wherein a change in electrochemiluminescence occurs in the blue-shifted region due to the reaction with homocysteine.
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