KR101848409B1 - Monoclonal Antibody Against Lung Cancer Specific Protein Marker Haptoglobin and Composition for Disgnosing Lung Cancer Comprising the Same - Google Patents

Monoclonal Antibody Against Lung Cancer Specific Protein Marker Haptoglobin and Composition for Disgnosing Lung Cancer Comprising the Same Download PDF

Info

Publication number
KR101848409B1
KR101848409B1 KR1020140111196A KR20140111196A KR101848409B1 KR 101848409 B1 KR101848409 B1 KR 101848409B1 KR 1020140111196 A KR1020140111196 A KR 1020140111196A KR 20140111196 A KR20140111196 A KR 20140111196A KR 101848409 B1 KR101848409 B1 KR 101848409B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
antibody
lung cancer
monoclonal antibody
kctc
cells
Prior art date
Application number
KR1020140111196A
Other languages
Korean (ko)
Other versions
KR20160024458A (en
Inventor
조제열
설경조
조혜심
Original Assignee
(주) 프로탄바이오
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by (주) 프로탄바이오 filed Critical (주) 프로탄바이오
Priority to KR1020140111196A priority Critical patent/KR101848409B1/en
Publication of KR20160024458A publication Critical patent/KR20160024458A/en
Application granted granted Critical
Publication of KR101848409B1 publication Critical patent/KR101848409B1/en

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/03—Peptides having up to 20 amino acids in an undefined or only partially defined sequence; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3023—Lung
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues

Abstract

본 발명은 폐암특이적 단백질마커에 대한 단일클론 항체에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 폐암특이적 단백질 마커 헵토글로빈(HP)에 대한 단일클론 항체 , 이를 생산하는 하이브로도마 세포 및 상기 단일클론 항체를 포함하는 폐암진단용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 기존의 항체를 이용한 진단방법보다 폐암을 정확하고 정밀하게 진단할 수 있다. The present invention relates to a monoclonal antibody against a lung cancer-specific protein marker, and more particularly to a monoclonal antibody against a lung cancer-specific protein marker heptoglobin (HP), a hibroloma cell producing the monoclonal antibody and a monoclonal antibody To a composition for diagnosing lung cancer.
According to the present invention, lung cancer can be accurately and precisely diagnosed as compared with a diagnostic method using existing antibodies.

Description

폐암 특이적 단백질마커 헵토글로빈에 대한 단일클론항체 및 이를 포함하는 폐암 진단용 조성물{Monoclonal Antibody Against Lung Cancer Specific Protein Marker Haptoglobin and Composition for Disgnosing Lung Cancer Comprising the Same}BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention relates to a monoclonal antibody against lung cancer-specific protein marker heptoglobin and a composition for diagnosing lung cancer including the same. 2. Description of the Related Art Monoclonal Antibody Against Lung Cancer Specific Protein Marker Haptoglobin and Composition for Disclosing Lung Cancer

본 발명은 폐암 특이적 단백질마커에 대한 단일클론 항체에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 폐암 특이적 단백질 마커 헵토글로빈(HP)에 대한 단일클론 항체 , 이를 생산하는 하이브로도마 세포 및 상기 단일클론 항체를 포함하는 폐암진단용 조성물에 관한 것이다.
The present invention relates to a monoclonal antibody against a lung cancer-specific protein marker, and more particularly to a monoclonal antibody against a lung cancer-specific protein marker heptoglobin (HP), a hibroloma cell producing the monoclonal antibody and a monoclonal antibody To a composition for diagnosing lung cancer.

암 환자의 체액에 존재하는 다수의 세포성 단백질은 정상인과 비교하여, 증가하거나, 감소하는 경향을 나타낸다. 암 환자에 있어서, 암세포 특이적인 발현양상을 나타내는 단백질의 유무 또는 발현양을 분석함으로써, 암에 대한 진단 및 예후 판정에 이용할 수 있다. Many cellular proteins present in body fluid of cancer patients show a tendency to increase or decrease as compared to normal individuals. By analyzing the presence or expression amount of a protein showing a cancer cell-specific expression pattern in a cancer patient, it can be used for diagnosis and prognosis of cancer.

폐암은 최근 수십년간 그 발생 빈도가 급속히 증가하여, 오늘날에는 서양에서는 남자와 여자 모두에게서 가장 많이 발생하는 악성종양이 되었으며, 우리나라에서도 남자에서는 위암 다음으로 많은 악성종양이고, 최근에는 여성에게서도 그 빈도가 증가하고 있다. 폐암은 증상이 없이 정기검진이나 다른 질환의 검사 시에 우연히 발견되는 경우가 많지만, 폐암의 양상에 따라 다양하게 나타날 수 있다. The incidence of lung cancer has increased rapidly in recent decades, and nowadays it is the most common malignant tumor in both males and females in the western world. In Korea, malignant tumors are the second most common malignancy after malignancy in men, . Lung cancer is often found incidentally at the time of routine screening or examination of other diseases without symptoms, but it can vary according to the pattern of lung cancer.

비소세포 폐암은 소세포 폐암을 제외한 편평상피암, 선암, 대세포암이 포함되는데, 이 세 조직형의 진행 양상이 비슷하고 치료방법도 동일하여 하나로 분류하여 치료하고 있다. T3N0는 어떤 크기의 암종이든 흉벽, 횡경막, 종경동흉막, 벽측심낭을 침습한 경우 또는 기관분지로부터 2cm 이내이 주 기관지가 침습된 경우 또는 전폐에 확산된 무기폐 혹은 폐쇄성 폐암이 있는 경우(T3)를 말하며 국소림프절 전이가 없는 경우(N0)이다.Non-small cell lung cancer includes squamous cell carcinoma, adenocarcinoma, and large cell carcinoma, except small cell lung cancer. These three histologic types are similar to each other and have the same treatment method. T3N0 refers to the case of carcinoma of any size, invasion of the chest wall, diaphragm, sinus plexus, wall pericardium, invasion of the main bronchus within 2cm from the branch of the organism, or presence of atelectic or obstructive lung cancer spread at full volume (T3) And no local lymph node metastasis (N0).

폐암의 병기는 1병기부타 4병기까지로 구분되는데, 로는 1병기는 암이 폐실질에 국한되어 있고 3cm 이하인 경우를 말하고, 2병기는 암이 주위의 림프절에 퍼져있고 늑막까지 퍼져있는 경우, 3병기는 암이 흉벽과 횡경막까지 퍼져 있거나 종격동림프절에 퍼져 있는 경우를 3A 병기라고 하며 3A기 까지 수술이 가능하고, 3B 병기는 종격동의 혈관, 식도, 기관등에 침범한 경우로 수술불가능 경우이다. 4병기는 암이 타장기(간, 뼈, 뇌, 골수)까지 퍼진 경우을 말한다.The stage of lung cancer is divided into 1 stage, but 4 stages. The stage 1 stage refers to the case where the cancer is limited to the lung parenchyma and the stage 3 cm or less. If the stage 2 is spread to the surrounding lymph nodes and spreads to the pleura, The stage is called the 3A stage in which the cancer spreads to the chest wall and the diaphragm or spreads to the mediastinal lymph nodes. The stage 3B is an operation that can not be performed because of involvement in the blood vessels, esophagus, or organs of the mediastinum. 4 Stages refers to cases where cancer has spread to other organs (liver, bone, brain, bone marrow).

폐암의 진단에 가장 중요하고 간편한 검사방법인 흉부 X선 촬영으로 폐의 종괴를 발견할 수 있으며 그밖에 폐렴에 의한 침윤, 기관지폐쇄에 의한 폐허탈, 늑막삼출액유무, 횡격막신경으로의 침범에 의한 횡격막의 상승과 같은 소견을 볼 수 있고 늑골 등 흉곽골격으로의 전이소견을 볼 수 있다. 또한 원발종양의 종격동이나 주위조직으로의 침범 범위를 확인하고 원격전이 등의 발견에 전산화 단층촬영이나 자기공명촬영이 유용하게 이용된다. 그리고 객담내 세포검사, 기관지 내시경 및 기The chest X-ray is the most important and useful diagnostic tool for the diagnosis of lung cancer. The lung mass can be detected. In addition, the lung mass can be detected by pneumonia, bronchopulmonary rupture, pleural effusion, diaphragmatic invasion by diaphragmatic nerve And the appearance of metastasis to the rib cage skeleton can be seen. In addition, CT scan of the primary tumor or range of involvement into the surrounding tissue is useful for the detection of distant metastasis. And sputum cytology, bronchoscopy and bronchoscopy

관지 생검에 의해 조직학적으로 폐암을 확진할 수 있다.By lung biopsy, lung cancer can be confirmed histologically.

그러나 폐암환자의 절반 이상은 발견 당시 이미 수술이 불가능하며 수술이 가능하다고 판단되어 수술을 시행하여도 그중 많은 수에서는 완전절제가 불가능한데, 그 이유는 증상이 있어 병원을 찾는 많은 환자는 이미 병이 진행되어 완치가 불가능한 상태이기 때문이다. 그러므로 폐암의 완치율을 높이기 위해서있는 폐암의 조기 진단 및 치료가 가장 중요하다.However, more than half of the patients with lung cancer were not able to perform surgery at the time of discovery, and it is considered that surgery is possible. In many of them, complete resection is impossible because of the symptoms. This is because the state can not be cured. Therefore, the early diagnosis and treatment of lung cancer is the most important to increase the cure rate of lung cancer.

하지만, 폐암은 세부적인 진단이 어렵다는 문제를 갖는다. 경험이 많은 병리학자들 사이에서도 폐암의 세부 유형에 대한 의견이 엇갈린다는 사실을 봐도 그 어려움을 짐작할 수 있다. 이 같이 폐암의 세부적인 진단이 어려운 이유는 진단에 유용한 표지(marker)가 제한적이기 때문이다. 예를 들어, 백혈병(leukemia)이나 임파종(lymphoma) 같은 혈액암의 경우에는 다양한 표지가 알려져 있어 세부적인 진단이 용이한데 반해 폐암의 경우는 그렇지가 못한 편이다. 대부분의 충실성 종양(solid tumors)의 경우에도 폐암과 유사한 문제가 발견된다.However, lung cancer has a problem that detailed diagnosis is difficult. Experienced pathologists can also be confused by the fact that opinions about the details of lung cancer are mixed. The detailed diagnosis of lung cancer is difficult because the markers useful for diagnosis are limited. For example, in the case of blood cancers such as leukemia or lymphoma, various markers are known to facilitate detailed diagnosis, whereas lung cancer is not. Most solid tumors have similar problems with lung cancer.

따라서, 전혈, 혈장, 혈청, 조직, 세포, 체액, 타액, 객담, 소변 및 대변 등의 생물학적 시료에 존재하는 암 특이적인 마커 및 이들 마커를 이용한 높은 정확도와 정밀도로 암을 진단할 수 있는 방법에 대한 개발 필요성이 절실하다.Therefore, cancer-specific markers existing in biological samples such as whole blood, plasma, serum, tissues, cells, body fluids, saliva, sputum, urine, and feces and a method of diagnosing cancer with high accuracy and precision using these markers The need for development is urgent.

최근 혈청 아밀로이드 A (Serum amyloid A, SAA) 단백질의 유방암, 신장암, 위암, 대장암, 간암, 난소암, 폐암 등의 암환자 유래 샘플에서 발현량을 확인하였을 때, 폐암환자 유래 샘플에서 특이적으로 10배 이상 증가하여, 혈청 아밀로이드 A 단백질이 폐암특이적 마커로 사용될 수 있다고 보고된 바 있으며(Sung, HJ et al., J. Proeome, 10:1383, 2011, Sung HJ et al., J. Proteome, 75:2170, 2012), 헵토글로빈(Hapatoglobin) 또한 폐암환자의 혈청에서 높게 발현된다는 것이 확인되었다(Kang SM. et al, Mol Biosyst. 2011 Apr;7(4):1167-75, Dowling P. et al, Int. J. Cancer, 131:911, 2012).Recently, when the amount of serum amyloid A (SAA) protein was detected in samples derived from cancer patients such as breast cancer, kidney cancer, stomach cancer, colon cancer, liver cancer, ovarian cancer and lung cancer, (Sung, HJ et al. , J. Proeome , 10: 1383, 2011, Sung HJ et al. , J. Am . Proteome, 75: 2170, 2012) , heptyl toggle Robin (Hapatoglobin) was also confirmed that highly expressed in the serum of patients with lung cancer (Kang SM et al, Mol Biosyst 2011 Apr; 7 (4..): 1167-75, Dowling P. et al , Int. J. Cancer, 131: 911, 2012).

이에, 본 발명자들은 폐암을 정확하고 정밀하게 진단할 수 있는 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 폐암환자 유래 샘플에 존재하는 헵토글로빈 특이적 항체를 이용하여, 환자 유래 샘플에서의 헵토글로빈을 검출함으로써 폐암의 진단 정확도와 정밀도가 제고될 수 있다는 사실을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
Therefore, the present inventors have made intensive efforts to develop a method for accurately and precisely diagnosing lung cancer. As a result, they have found that by using a heptoglobin-specific antibody present in a sample derived from a lung cancer patient, heptoglobin The accuracy and accuracy of diagnosis of lung cancer can be improved, and the present invention has been completed.

본 발명의 목적은 폐암특이적 단백질 마커인 헵토글로빈(Haptoglobin, HP)에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 제공하는 데 있다. It is an object of the present invention to provide a monoclonal antibody that specifically binds to a lung cancer-specific protein marker, Haptoglobin (HP).

본 발명의 다른 목적은 상기 헵토글로빈(Haptoglobin, HP)에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포를 제공하는데 있다. Another object of the present invention is to provide a hybridoma cell that produces a monoclonal antibody that specifically binds to the Haptoglobin (HP).

본 발명의 또다른 목적은 상기 단일클론항체를 함유하고, 폐암을 정밀하게 진단할 수 있는 폐암진단용 조성물을 제공하는데 있다. It is still another object of the present invention to provide a composition for diagnosing lung cancer that contains the above monoclonal antibody and is capable of accurately diagnosing lung cancer.

본 발명의 또다른 목적은 상기 폐암진단용 조성물을 이용하여 폐암진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공하는데 있다.
It is still another object of the present invention to provide a method for providing information necessary for diagnosis of lung cancer using the composition for diagnosing lung cancer.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하이브리도마 세포(KCTC 12620BP)에 의해 생산되고, 헵토글로빈(Haptoglobin, HP)에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 11F3을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a monoclonal antibody 11F3 produced by hybridoma cells (KCTC 12620BP) and specifically binding to Haptoglobin (HP).

또한, 본 발명은 하이브리도마 세포(KCTC 12619BP)에 의해 생산되고, 헵토글로빈(Haptoglobin, HP)에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 9B1을 제공한다. In addition, the present invention provides monoclonal antibody 9B1 that is produced by hybridoma cells (KCTC 12619BP) and specifically binds to Haptoglobin (HP).

또한, 본 발명은 하이브리도마 세포(KCTC 12655BP)에 의해 생산되고, 헵토글로빈(Haptoglobin, HP)에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 3D3를 제공한다.The present invention also provides a monoclonal antibody 3D3 produced by hybridoma cells (KCTC 12655BP) and specifically binding to Haptoglobin (HP).

또한, 본 발명은 헵토글로빈(Haptoglobin, HP)에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 11F3를 생산하는 하이브리도마 세포 (KCTC 12620BP)를 제공한다. The present invention also provides a hybridoma cell (KCTC 12620BP) that produces monoclonal antibody 11F3 that specifically binds to Haptoglobin (HP).

또한, 본 발명은 헵토글로빈(Haptoglobin, HP)에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 9B1를 생산하는 하이브리도마 세포 (KCTC 12619BP)를 제공한다.The present invention also provides a hybridoma cell (KCTC 12619BP) that produces monoclonal antibody 9B1 that specifically binds to Haptoglobin (HP).

또한, 본 발명은 헵토글로빈(Haptoglobin, HP)에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 3D3를 생산하는 하이브리도마 세포 (KCTC 12655BP)를 제공한다.
The present invention also provides a hybridoma cell (KCTC 12655BP) that produces monoclonal antibody 3D3 that specifically binds to Haptoglobin (HP).

또한, 본 발명은 상기 단일클론항체 중 어느 하나 이상을 함유하는 폐암 진단용 조성물을 제공한다.Further, the present invention provides a composition for diagnosing lung cancer, which contains any one or more of the above monoclonal antibodies.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 이용하여 환자유래 샘플로부터 폐암진단에 필요한 정보를 제공하는 방법 및 폐암의 진단방법을 제공한다.
The present invention also provides a method for providing information necessary for diagnosing lung cancer from a patient-derived sample using the composition, and a diagnostic method for lung cancer.

본 발명에 따르면, 기존의 단독 항체를 이용한 진단방법보다 폐암을 정확하고 정밀하게 진단할 수 있다.
According to the present invention, lung cancer can be accurately and precisely diagnosed as compared with a diagnostic method using an existing single antibody.

도 1은 본 발명에 따른 11F3 항체(KCTC 12620BP)의 헵토글로빈(HP) 항원 결합 특이성을 확인한 웨스턴 블롯 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에 따른 3D3 항체(KCTC 12655BP) 및 9B1 항체(KCTC 12619BP)의 헵토글로빈(HP) 항원 결합 특이성을 확인한 웨스턴 블롯 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 혈청 샘플군(정상인의 혈청 및 폐암 환자의 혈청)에서 본 발명에 따른 capture 항체로는 11F3(KCTC 12620BP)과 detector항체로는 3D3 항체(KCTC 12655BP)를 pair로 한 sandwich ELISA에서의 헵토글로빈(HP) 항원에 대한 결합 특이성을 확인한 ELISA 결과를 나태낸 것이다.
도 4는 본 발명의 혈청 샘플군(정상인의 혈청 및 폐암 환자의 혈청)에서 본 발명에 따른 3D3 항체(KCTC 12655BP)의 헵토글로빈(HP) 항원에 대한 결합 특이성을 확인한 ELISA 결과를 이용하여, 생산된 단일클론항체의 민감도 및 특이도를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 혈청 샘플군(정상인의 혈청 및 폐암 환자의 혈청)에서 본 발명에 따른 capture 항체로는 11F3(KCTC 12620BP)과 detector항체로는 9B1 항체(KCTC 12619BP)를 pair로 한 sandwich ELISA에서의 헵토글로빈(HP) 항원에 대한 결합 특이성을 확인한 ELISA 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 혈청 샘플군(정상인의 혈청 및 폐암 환자의 혈청)에서 본 발명에 따른 9B1 항체(KCTC 12619BP)의 헵토글로빈(HP) 항원에 대한 결합 특이성을 확인한 ELISA 결과로부터, 생산된 단일클론항체의 민감도 및 특이도를 나타낸 것이다.
도 7은 Multiple-biomarker로서 SAA와 HP에 대한 항체를 모두 사용한 경우와, SAA 또는 HP에 대한 항체만을 사용한 경우의 민감도 및 특이도를 Sandwich ELISA 방법을 이용하여 건강인과 폐암 환자 검체를 테스트하여 민감도 및 특이도를 나타낸 것이다.
(A) SAA에 대한 항체(10G1 항체(KCTC 11833BP) 만을 사용한 경우
(B) HP 특이적인 본 발명에 따른 11F3 항체(KCTC 12620BP) 및 9B1 항체(KCTC 12619BP)를 사용한 경우
(C) SAA에 대한 항체(10G1 항체(KCTC 11833BP)와 HP 특이적인 본 발명에 따른 11F3 항체(KCTC 12620BP) 및 9B1 항체(KCTC 12619BP)를 조합하여 사용한 경우Figure 1 shows Western blot results confirming the heptoglobin (HP) antigen binding specificity of the 11F3 antibody (KCTC 12620BP) according to the present invention.
Figure 2 shows Western blot results confirming the hepatoglobin (HP) antigen binding specificity of 3D3 antibody (KCTC 12655BP) and 9B1 antibody (KCTC 12619BP) according to the present invention.
FIG. 3 is a graph showing the results of a sandwich ELISA (KCTC 12620BP) as a capture antibody according to the present invention and a 3D3 antibody (KCTC 12655BP) as a detector antibody in a serum sample group of the present invention (serum of normal human and lung cancer patients) The results of the ELISA confirmed the binding specificity for the hepatoglobin (HP)
FIG. 4 shows the results of ELISA using the results of confirming the binding specificity of the 3D3 antibody (KCTC 12655BP) according to the present invention to the hepatoglobin (HP) antigen in the serum sample group of the present invention (serum of normal human and lung cancer patients) The sensitivity and specificity of the produced monoclonal antibody are shown.
FIG. 5 is a graph showing the results of a sandwich ELISA (KCTC 12620BP) using 11F3 (KCTC 12620BP) as a capture antibody and 9B1 antibody (KCTC 12619BP) as a detector antibody according to the present invention in the serum sample group of the present invention (serum of normal human and lung cancer patients) The results of ELISA showing the binding specificity to the hepatoglobin (HP)
Figure 6 shows that the ELISA results of the binding specificity of the 9B1 antibody (KCTC 12619BP) according to the present invention to the hepatoglobin (HP) antigen in the serum sample group of the present invention (serum of normal human and lung cancer patients) The sensitivity and specificity of monoclonal antibodies are shown.
Figure 7 shows the sensitivity and specificity of SAA or HP antibodies against SAA or HP alone and the sensitivity and specificity of SAA or HP antibodies by using a sandwich ELISA method in multiple- And specificity.
(A) Antibody against SAA (10G1 antibody (KCTC 11833BP) alone
(B) HP-specific 11F3 antibody (KCTC 12620BP) and 9B1 antibody (KCTC 12619BP) according to the present invention were used
(C) When an antibody against SAA (10G1 antibody (KCTC 11833BP) and HP-specific 11F3 antibody (KCTC 12620BP) and 9B1 antibody (KCTC 12619BP) were used in combination

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법 및 이하에 기술하는 실험 방법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다. Unless otherwise defined, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs. In general, the nomenclature used herein and the experimental methods described below are well known and commonly used in the art.

일 관점에서, 본 발명은 하이브리도마 세포(KCTC 12620BP)에 의해 생산되고, 헵토글로빈(Haptoglobin, HP)에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 11F3, 하이브리도마 세포(KCTC 12619BP)에 의해 생산되고, 헵토글로빈(Haptoglobin, HP)에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 9B1 및 하이브리도마 세포(KCTC 12655BP)에 의해 생산되고, 헵토글로빈(Haptoglobin, HP)에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 3D3에 관한 것이다. In one aspect, the present invention relates to a method of producing a monoclonal antibody 11F3, produced by hybridoma cells (KCTC 12620BP) and produced by hybridoma cells (KCTC 12619BP), which specifically binds to Haptoglobin (HP) Which is produced by monoclonal antibody 9B1 and hybridoma cells (KCTC 12655BP) that bind specifically to Haptoglobin (HP) and which binds specifically to Haptoglobin (HP) ≪ / RTI > antibody 3D3.

본 발명에서의 "11F3 항체" 또는 "단일클론항체 11F3"는 하이브리도마 세포(KCTC 12620BP)에 의해 생산되는 단클론 항체를 의미하며, "9B1 항체" 또는 "단일클론항체 9B1"는 하이브리도마 세포(KCTC 12619BP)에 의해 생산되는 단클론 항체를 의미하고, "3D3 항체" 또는 "단일클론항체 3D3"는 하이브리도마 세포(KCTC 12655BP)에 의해 생산되는 단클론 항체를 의미한다.
In the present invention, "11F3 antibody" or "monoclonal antibody 11F3" refers to a monoclonal antibody produced by hybridoma cells (KCTC 12620BP), "9B1 antibody" or "monoclonal antibody 9B1" refers to hybridoma cells (KCTC 12619BP), and "3D3 antibody" or "monoclonal antibody 3D3" refers to a monoclonal antibody produced by hybridoma cells (KCTC 12655BP).

단일클론항체는 당업자에 알려진 융합에 의한 불멸화된 세포주 생성기술 (Koeher and Milstein, Nature, 256:495 (1975))에 의하여 제조될 수 있다. 그 제조방법을 간단히 설명하면 다음과 같다. 먼저 순수한 단백질을 약 20 ㎍을 얻어서 쥐에 면역화를 시키거나 펩타이드를 합성하여 소혈청 알부민과 결합시켜 쥐에 면역화 시킨다. 그 후 쥐에서 분리된 항원-생산 B 임파구를 인간 또는 마우스의 골수종세포와 융합하여 불멸화된 하이브리도마를 생성한다. 이어, ELISA (Enzymelinked immunosorbent assay)로 하이브리도마 세포의 단일클론항체의 생성여부를 알아보고 양성 클론을 택하여 배양한 후 항체를 분리 정제하거나 쥐의 복강에 주입한 후 복수를 채취한다.Monoclonal antibodies can be prepared by immortalized cell line generation techniques (Koeher and Milstein, Nature, 256: 495 (1975)) by fusion as known to those of skill in the art. The manufacturing method will be briefly described as follows. First, about 20 μg of pure protein is obtained and the mice are immunized or the peptide is synthesized and bound to bovine serum albumin to immunize mice. The antigen-producing B lymphocytes isolated from the mice are then fused with human or mouse myeloma cells to produce immortalized hybridomas. Next, an ELISA (Enzymelinked Immunosorbent Assay) is used to determine whether a monoclonal antibody is produced. Hybridoma cells are cultured in a selective clone. The antibody is separated or purified or injected into the abdominal cavity of a mouse.

상기 단일클론항체를 얻기 위해서, 본 발명의 일 양태에서는, 먼저 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 제조에 필요한 마우스를 면역화시켰다. 구체적으로는, 헵토글로빈(Haptoglobin, HP)을 인산염 완충액(phosphate buffered saline; PBS)에 희석하고 동일한 부피의 프로인트 완전 아주반트(complete Freund's adjuvant, Sigma)와 혼합하여 에멀젼을 제조한 후, 상기 에멀젼을 마우스의 복강 내에 1차 주사한다. 1차 면역화 후 마우스의 면역성을 높이기 위하여 2주 후에 헵토글로빈과 동일한 부피의 프로인트 불완전 아주반트(incomplete Freund's adjuvant, Sigma)를 혼합하여 에멀젼을 제조한 후, 상기 에멀젼을 마우스의 복강 내에 2차 주사한다. 2차 면역화 후 2주 후에 3차 면역화하고, 마지막 면역화한 후 1주일 후에 세포융합 실험을 실시하기 3일 전 헵토글로빈을 마우스의 꼬리 정맥에 부스터(booster) 주사하였다. 상기 면역화된 마우스의 혈청을 채취하여 ELISA 법으로 항체의 역가를 확인하여 항체 생성력이 있음을 확인하고, 면역화된 마우스로부터 비장세포를 적출하였다. 적출된 비장세포와 골수종 세포인 SP2/O 세포를 세포수를 기준으로 10:1의 비율로 혼합하고 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 넣어 세포융합시키고 배양하엿다. To obtain the monoclonal antibody, in one embodiment of the present invention, a mouse required for the preparation of a hybridoma cell producing antibody first was immunized. Specifically, Haptoglobin (HP) was diluted in phosphate buffered saline (PBS) and mixed with an equal volume of complete Freund's adjuvant (Sigma) to prepare an emulsion. The emulsion is first injected into the abdominal cavity of the mouse. In order to increase the immunity of the mice after the primary immunization, two weeks later, the same volume of incomplete Freund's adjuvant (Sigma) as that of heptoglobin was mixed to prepare an emulsion. The emulsion was then injected into the abdominal cavity Inject. Three-fold immunization was performed two weeks after the second immunization, and one week after the last immunization, heptoglobin was booster injected into the tail vein of the mouse three days before the cell fusion experiment. The serum of the immunized mouse was collected and the antibody titer was confirmed by ELISA to confirm that the antibody was produced, and the splenocytes were extracted from the immunized mice. The extracted splenocytes and myeloma cells, SP2 / O cells, were mixed at a ratio of 10: 1 based on the number of cells, and polyethylene glycol (PEG) was added thereto for cell fusion and culture.

상기 융합세포군 중에서 헵토글로빈에만 특이적으로 반응하는 융합세포들을 선별하고, 선별된 융합세포가 단일클론이 되도록 제한 희석법(limiting dilution)을 사용하여 융합세포를 희석한 후, 하나의 세포로부터 증식한 융합세포의 흡광도(O.D 값)를 ELISA로 확인하여 흡광도가 1이 넘는 융합세포만 선택한다. 최종적으로 선택한 융합세포를 각각 "11F3", "9B1" 및 "3D3"로 명명하였으며, 한국생명공학연구원 유전자은행(KCTC)에 각각 2014년 7월 16일자로 기탁하였다(수탁번호: KCTC 12620BP(11F3), KCTC 12619B(9B1) 및 KCTC 12655BP(3D3).Among the fusion cell groups, the fusion cells which specifically react only with heptoglobin are selected, the fusion cells are diluted using limiting dilution so that the selected fusion cell becomes a single clone, Confirm the absorbance (OD value) of the fused cells with an ELISA and select only fused cells with an absorbance higher than 1. The final selected fusion cells were designated as "11F3", "9B1", and "3D3", respectively, and deposited on July 16, 2014 at KCTC, Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology (Accession No .: KCTC 12620BP ), KCTC 12619B (9B1) and KCTC 12655BP (3D3).

상기 얻어진 하이브리도마 세포[KCTC 12620BP(11F3), KCTC 12619B(9B1) 및 KCTC 12655BP(3D3)]를 마우스의 복강 내로 주사하고, 복강이 부풀어 오른 마우스로부터 복수액을 채취한 후, 상기 복수액으로부터 헵토글로빈(HP)에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 분리하였다. The obtained hybridoma cells [KCTC 12620BP (11F3), KCTC 12619B (9B1) and KCTC 12655BP (3D3)] were injected into the abdominal cavity of a mouse and multiple liquids were taken from the abdominal cavity-inflated mouse. A monoclonal antibody that specifically binds to heptoglobin (HP) was isolated.

헵토글로빈(HP)는 정상인의 혈청에서보다 폐암 환자의 혈청에서 발현 수준이 높게 나타나는 폐암특이적 단백질 마커이며, 본 발명의 11F3 항체, 9B1 항체 및 3D3항체를 이용하여 폐암환자에서 헵토글로빈의 발현량을 확인한 결과, 정상인에 비하여 폐암환자에서 헵토글로빈의 발현이 높은 것을 확인하였다. Heptoglobin (HP) is a lung cancer-specific protein marker whose expression level is higher in serum of lung cancer patients than in normal human serum. Using 11F3 antibody, 9B1 antibody and 3D3 antibody of the present invention, As a result, the expression of heptoglobin was found to be higher in lung cancer patients than in normal people.

또한, 본 발명의 하이브리도마 세포 및 이로부터 생산된 단일클론항체는 헵토글로빈(HP)에 대한 결합 특이성이 모두 높음을 확인하였다.In addition, the hybridoma cells of the present invention and monoclonal antibodies produced therefrom were found to have high binding specificity to heptoglobin (HP).

다른 관점에서, 본 발명은 헵토글로빈(Haptoglobin, HP)에 특이적으로 결합하는 11F3 항체를 생산하는 하이브리도마 세포(KCTC 12620BP), 9B1 항체를 생산하는 하이브리도마 세포(KCTC 12619BP) 및 3D3 항체를 생산하는 하이브리도마 세포(KCTC 12655BP)에 관한 것이다. In another aspect, the present invention provides a hybridoma cell (KCTC 12620BP) that produces an 11F3 antibody that specifically binds to Haptoglobin (HP), a hybridoma cell that produces a 9B1 antibody (KCTC 12619BP), and a 3D3 (KCTC 12655BP). ≪ / RTI >

또 다른 관점에서, 본 발명은 상기 단일클론항체 중 어느 하나 이상을 함유하는 폐암 진단용 조성물을 제공한다. In another aspect, the present invention provides a composition for diagnosing lung cancer, which comprises any one or more of the above monoclonal antibodies.

본 발명에서 사용된 용어, "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 폐암 발병 여부를 확인하는 것이다. As used herein, the term "diagnosis" means identifying the presence or characteristic of a pathological condition. For the purposes of the present invention, the diagnosis is to ascertain whether lung cancer develops.

본 발명에서 사용된 용어, "폐암"은 폐에 발생하는 악성종양을 의미하며, 조직학적으로는 폐선암, 편평상피암, 대세포폐암 및 소세포폐암을 모두 포함한다.As used herein, the term "lung cancer " refers to a malignant tumor arising in the lungs, and histologically includes all of lung cancer, squamous cell cancer, large cell lung cancer and small cell lung cancer.

본 발명에서 사용된 용어, "진단 마커"란 암 환자를 건강한 사람과 구분하여 진단할 수 있는 물질로 건강한 사람에 비하여 암이 발병된 개체에서 증가를 보이는 유기 생체 분자를 말한다. 상기 유기 생체 분자로는 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나, 폴리펩타이드, 단백질, 핵산, 지질 , 당지질, 당단백질 및 당 등이 포함된다. 본 발명에서는 바람직하게는, 상기 유기 생체 분자는 단백질 또는 폴리펩타이드를 말한다.As used herein, the term "diagnostic marker" refers to an organic biomolecule capable of differentiating a cancer patient from a healthy individual and showing an increase in the cancer-causing individual as compared to a healthy individual. Such organic biomolecules include, for example, but are not limited to, polypeptides, proteins, nucleic acids, lipids, glycolipids, glycoproteins, sugars and the like. In the present invention, preferably, the organic biomolecule refers to a protein or a polypeptide.

본 발명의 항체를 이용하여 시료, 예를 들면 폐암조직, 폐암환자의 혈액 또는 혈청에 포함된 상기 암마커 폴리펩티드를 분석하는 방법으로는 통상의 항원-항체반응의 분석법을 사용할 수 있다. 예컨대, 면역 검정(측정)법으로는 효소 면역 측정법(ELISA), 형광면역 측정법(FIA), 방사선 면역 측정법(RIA), 발광 면역 측정법, 면역블롯(immunoblot)법, 웨스턴 블롯(western blot)법, 면역 염색법 등이 있다.As a method for analyzing the cancer marker polypeptide contained in a sample such as a lung cancer tissue or a blood or serum of a lung cancer patient using the antibody of the present invention, a conventional assay method of antigen-antibody reaction can be used. Examples of the immunoassay method include enzyme immunoassay (ELISA), fluorescence immunoassay (FIA), radioimmunoassay (RIA), luminescent immunoassay, immunoblot, Western blot, And immunostaining.

웨스턴 블롯(western blot)법은, 생체 시료 중에 존재하는 해당 단백질의 분자량을 알기 위하여 유효한 방법이다. 예를 들어, 장기 조직 유래의 추출액 등의 생체 시료액을 아크릴아미드 겔(gel)전기 영동 시킨 뒤, 멤브레인에에 전사하고, 해당 단백질 또는 해당 펩타이드를 인식하는 항체와 반응시키고, 생성하는 면역 복합체를 표지 제2항체를 이용하고 검출하는 것이다.The western blot method is an effective method for determining the molecular weight of a corresponding protein present in a biological sample. For example, a biological sample liquid such as an extract derived from an organ tissue is electrophoresed on an acrylamide gel, transferred to a membrane, reacted with an antibody recognizing the protein or the peptide, and the resulting immunocomplex And using the labeled second antibody.

면역 염색법은 조직 및 세포에 있어서 대상 폴리펩티드(polypeptide)의 발현 부위를 해석하기 위하여 유효한 방법으로, 예를 들어, 슬라이드 글라스상에 고정되는 조직 절편, 세포 등을 본 발명의 항체와 반응시키고, 생성하는 면역 복합체를 표지제2항체를 이용하고 검출하는 것에 따라 실시한다.Immunostaining is an effective method for analyzing the expression site of a polypeptide of interest in tissues and cells. For example, a tissue fragment, a cell, or the like fixed on a slide glass is reacted with an antibody of the present invention to generate Immunoconjugate is carried out by using and detecting the labeled second antibody.

한편, 생물학적 시료 중에서 특정 단백질의 존재여부는 시료를 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체와 접촉시켜 항원-항체 복합체의 형성여부를 측정함으로써 확인할 수 있다. 본 발명에서 사용된 용어 "항원-항체 복합체"란 생물학적 시료 중의 특정 단백질과 이를 특이적으로 인지하는 항체의 결합물을 의미한다.On the other hand, the presence of a specific protein in a biological sample can be confirmed by contacting the sample with an antibody that specifically binds to the protein and measuring the formation of an antigen-antibody complex. The term "antigen-antibody complex " as used herein refers to a combination of an antibody that specifically recognizes a specific protein in a biological sample.

본 발명에서 사용된 용어 "생물학적 시료" 또는 "시료"는 혈액 및 생물학적 기원의 기타 액상 시료를 말한다. 바람직하게는, 상기 생물학적 시료 또는 시료는 전혈, 혈장, 혈청, 조직, 세포, 체액, 타액, 객담, 소변 및 대변 등에서 선택된 어느 하나일 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 시료는 동물, 바람직하게는 포유동물, 가장 바람직하게는 인간으로부터 수득될 수 있다. 상기 시료는 검출에 사용하기 전에 전처리할 수 있다. 예를 들어, 여과, 증류, 추출, 농축, 방해 성분의 불활성화, 시약의 첨가 등을 포함할 수 있다. 또한, 상기 시료로부터 핵산 및 단백질을 분리하여 검출에 사용할 수 있다.The term "biological sample" or "sample" as used herein refers to other liquid samples of blood and biological origin. Preferably, the biological sample or sample is any one selected from but not limited to whole blood, plasma, serum, tissue, cells, body fluid, saliva, sputum, urine and feces. The sample can be obtained from an animal, preferably a mammal, most preferably a human. The sample can be pretreated prior to use in detection. For example, it may include filtration, distillation, extraction, concentration, inactivation of interfering components, addition of reagents, and the like. Further, nucleic acid and protein can be separated from the sample and used for detection.

본 발명에서 "항체"란 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명에 사용되는 항체는 단클론 또는 다클론 항체, 면역학적으로 활성인 단편(예를 들어, Fab 또는 (Fab)2 단편), 항체 중쇄, 인간화 항체, 항체 경쇄, 유전자 조작된 단일쇄 Fν 분자, 키메릭 항체 등일 수 있다."Antibody" in the present invention means a specific protein molecule directed against an antigenic site. Antibodies used in the present invention may be monoclonal or polyclonal antibodies, immunologically active fragments (e.g., Fab or (Fab) 2 fragments), antibody heavy chains, humanized antibodies, antibody light chains, engineered single chain Fv molecules, Chimeric antibody, and the like.

본 발명의 진단용 조성물은 특이적인 단일클론항체 이외에 면역학적 분석에 사용되는 당업계에 공지된 시약 및 헵토글로빈 등의 폐암 진단 마커에 특이적인 다클론 또는 단클론 항체를 추가로 포함할 수 있다.The diagnostic composition of the present invention may further comprise a polyclonal or monoclonal antibody specific for lung cancer diagnostic markers such as heptoglobin and reagents known in the art to be used for immunological analysis in addition to the specific monoclonal antibody.

상기에서 면역학적 분석은 항원과 항체의 결합을 측정할 수 있는 방법이라면 모두 포함될 수 있다. 이러한 방법들은 당 분야에 공지되어 있으며 비제한적인 예로서, 면역세포화학 및 면역조직화학, 방사선 면역 분석법, ELISA, 면역블롯, 파아르 분석법, 면역침강, 라텍스 응집, 적혈구 응집, 비탁계법, 면역확산법, 카운터-전류 전기영동법, 단일 라디칼 면역확산법, 면역크로마토그래피법, 단백질 칩 및 면역형광법 등이 있다.Immunological analysis may include any method capable of measuring binding between an antigen and an antibody. Such methods are well known in the art and include, but are not limited to, immunocytochemistry and immunohistochemistry, radioimmunoassay, ELISA, immunoblot, Farar assay, immunoprecipitation, latex coagulation, erythrocyte coagulation, , Counter-current electrophoresis, single-radical immunodiffusion, immunochromatography, protein chip and immunofluorescence.

면역학적 분석에 사용되는 시약으로는 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지, 용해제, 세정제가 포함되며, 표지물질이 효소인 경우에는 효소활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다.Reagents used in immunological assays include labels, solubilizers, and detergents capable of producing a detectable signal, and, if the label is an enzyme, a substrate capable of measuring enzyme activity and a quencher .

상기에서 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지는 항원-항체 복합체의 형성을 정성 또는 정량적으로 측정가능하게 하는데, 이의 예로는 효소, 형광물질, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사성 동위원소 등이 있다. 효소로는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제, 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스테라아제, 글루코즈 옥시다아제, 헥소키나제, 말레이트 디하이드로게나아제, 글루코스-6-인산디하이드로게나아제, 인버타아제 등을 사용할 수 있다. 형광물로는 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, 플루오르신이소티옥시아네이트 등을 사용할 수 있다. 리간드로는 바이오틴 유도체 등이 있으며, 발광물로는 아크리디늄 에스테르, 루시페린, 루시퍼라아제 등이 있다. 미소입자로는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등이 있고 레독스 분자로는 페로센, 루테늄 착화합물, 바이올로젠, 퀴논, Ti 이온, Cs 이온, 다이이미드, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논 등이 있다. 방사성 동위원소로는 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125I, 131I, 186Re 등이 있다. 그러나 상기 예시된 것들 외에 면역학적 분석법에 사용할 수 있는 것이라면 어느 것이라도 사용할 수 있다.The marker capable of generating a detectable signal as described above enables the formation of an antigen-antibody complex to be qualitatively or quantitatively measurable. Examples thereof include an enzyme, a fluorescent substance, a ligand, a luminescent material, a microparticle, a redox molecule And radioactive isotopes. Examples of the enzymes include? -Glucuronidase,? -D-glucosidase, urease, peroxidase, alkaline phosphatase, acetylcholinesterase, glucose oxidase, hexokinase, malate dehydrogenase, glucose- Phosphoric acid dehydrogenase, invertase and the like can be used. Examples of the minerals include fluorescein, isothiocyanate, rhodamine, picoeriterine, phycocyanin, allophycocyanin, fluorine synthase, and the like. Examples of the ligand include biotin derivatives, and examples of the luminescent material include acridinium ester, luciferin, and luciferase. Examples of the fine particles include colloidal gold and colored latex. Examples of redox molecules include ferrocene, ruthenium complex, viologen, quinone, Ti ion, Cs ion, diimide, 1,4-benzoquinone, hydroquinone and the like. Radioactive isotopes include 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125I, 131I, and 186Re. However, in addition to those exemplified above, any of them can be used as long as they can be used for immunological assays.

본 발명의 진단용 조성물은 진단의 신속도 및 편리성을 높이기 위해, 공지된 다양한 방법을 이용하여 적합한 담체 또는 지지체상에 고정된 상태로 제공될 수 있다. 적합한 담체 또는 지지체의 예로는 아가로스, 셀룰로즈, 니트로셀룰로즈, 덱스트란, 세파덱스, 세파로즈, 리포솜, 카르복시메틸셀룰로즈, 폴리아크릴아미드, 폴리스테린, 반려암, 여과지, 이온교환수지, 플라스틱 필름, 플라스틱 튜브, 유리, 폴리아민-메틸 비닐-에테르-말레산 공중합체, 아미노산 공중합체, 에틸렌-말레산 공중합체, 나일론, 컵, 플랫 팩(flat packs) 등이 포함된다. 그 외의 다른 고체 기질로는 세포 배양 플레이트, ELISA 플레이트, 튜브 및 폴리머성 막이 있다. 상기 지지체는 임의의 가능한 형태, 예를 들어 구형(비드), 원통형(시험관 또는 웰 내면), 평면형(시트, 시험 스트립)을 가질 수 있다. The diagnostic composition of the present invention may be provided in a fixed state on a suitable carrier or support using various known methods in order to increase the speed and convenience of diagnosis. Examples of suitable carriers or supports are agarose, cellulose, nitrocellulose, dextran, sephadex, sepharose, liposomes, carboxymethylcellulose, polyacrylamide, polysterine, gabapentin, filter paper, , Glass, polyamine-methyl vinyl ether-maleic acid copolymer, amino acid copolymer, ethylene-maleic acid copolymer, nylon, cup, flat packs and the like. Other solid substrates include cell culture plates, ELISA plates, tubes and polymeric membranes. The support may have any possible shape, for example spherical (bead), cylindrical (test tube or well inner surface), planar (sheet, test strip).

바람직하게는, 본 발명의 폐암 진단용 조성물은 진단용 키트 또는 마이크로어레이 형태로 제공될 수 있다. 상기 진단용 키트로는 예를 들면, 시료 중의 특정 단백질을 검출하기 위해 면역크로마토그래피법을 기초로 하는 측방 유동 검정 키트(lateral flow assay kit)의 형태로 제공될 수 있다. 측방 유동 검정 키트는 통상 시료가 적용되는 샘플패드(sample pad), 탐지용 항체가 코팅되어 있는 방출패드(releasing pad), 시료가 이동하여 분리되고 항원-항체 반응이 일어나는 전개용 막(예를 들어 니트로셀룰로스) 또는 스트립, 그리고 흡수패드(absorption pad)로 이루어진다. Preferably, the composition for diagnosing lung cancer of the present invention may be provided in the form of a diagnostic kit or microarray. The diagnostic kit may be provided, for example, in the form of a lateral flow assay kit based on immunochromatography to detect a specific protein in a sample. Lateral flow assay kits typically include a sample pad to which a sample is applied, a releasing pad coated with a detection antibody, a developing membrane that separates the sample and separates the antigen-antibody reaction (for example, Nitrocellulose) or strips, and an absorption pad.

상기 마이크로어레이는 일반적으로 특정 시약으로 처리된 슬라이드글라스 표면 위에 항체를 부착하여 항원-항체 반응에 의해 상기 항체에 특이적으로 부착하는 단백질을 검출할 수 있도록 하는 것이다.The microarray generally attaches an antibody on a surface of a slide glass treated with a specific reagent so that a protein specifically binding to the antibody can be detected by an antigen-antibody reaction.

상기 폐암 마커 폴리펩티드를 인식하는 항체를 이용하는 면역 검정의 바람직한 예로서, ELISA 법을 들 수 있다. 상기 ELISA 법은 일반적인 경합법, 샌드위치법 등의 수법에 따라 실시할 수 있고, 액상계 또는 고체상태계에서도 실시할 수 있다.As a preferable example of the immunoassay using an antibody that recognizes the lung cancer marker polypeptide, ELISA can be mentioned. The ELISA method can be carried out according to a conventional method such as a compaction method, a sandwich method, or the like, and can also be carried out in a liquid-phase system or a solid-state system.

본 발명의 암진단용 키트(kit)는 상기의 폴리클로날 또는 모노클로날 항체를 포함하는 것으로 또한, 상기 진단용 키트는 필요에 따라 면역 반응을 이용하고, 웰, 염색제, 검출용의 효소 표지 항체, 세척액, 항체 희석액, 검체 희석액, 효소 기질, 효소 기질액 희석액, 그밖의 시약을 포함할 수 있다.The kit for cancer diagnosis of the present invention includes the polyclonal or monoclonal antibody described above. The diagnostic kit may further comprise an immunological reaction as needed, and may be used as a well, a stain, an enzyme-labeled antibody for detection, An antibody diluent, a sample diluent, an enzyme substrate, an enzyme substrate solution diluent, and other reagents.

발명에서 사용할 수 이는 진단키트는 폐암 특이적 마커 단백질에 특이적인 항체; 기질과의 반응에 의해서 발색하는 표지체가 접합된 2차항체 접합체 (Conjugate); 상기 표지체와 발색 반응할 발색 기질 용액; 세척액; 및 효소반응 정지용액을 포함할 수 있다.This diagnostic kit, which can be used in the invention, comprises an antibody specific for a lung cancer-specific marker protein; A secondary antibody conjugate (conjugate) conjugated with a labeling substance that reacts with a substrate; A color developing substrate solution to be colored with the label; Washing liquid; And an enzyme reaction stop solution.

또한, 본 발명의 진단키트는 폐암특이 마커 단백질 표준 항원을 포함하는 양성 대조군과 상기 항원이 주입되지 않은 동물의 항혈청을 포함하는 음성 대조군을 추가적으로 포함할 수 있다. In addition, the diagnostic kit of the present invention may further comprise a negative control including a lung cancer-specific marker protein standard antigen and an anti-serum of an animal not infected with the antigen.

본 발명의 진단키트는 항원-항체 결합반응을 통하여 항체 단백질에 대한 항원을 정량분석 또는 정성분석함으로써 폐암을 진단할 수 있으며, 상기 항원-항체 결합반응은 통상의 ELISA, RIA (Radioimmnoassay), 샌드위치 측정법 (Sandwich assay), 폴리아크릴아미드 겔 상의 웨스턴 블롯, 면역 블롯 분석 또는 면역조직화학염색 방법 (Immnohistochemical staining)으로 측정할 수 있다. 예를 들어, 검체 및 대조군을 표면에 코팅시킨 96 웰 마이크로타이터 플레이트 등을 이용하여 재조합 모노클로날 항체 단백질과 반응하는 ELISA를 수행하도록 상기 진단키트를 제공할 수 있다.The diagnostic kit of the present invention can diagnose lung cancer by quantitatively or qualitatively analyzing an antigen against an antibody protein through an antigen-antibody binding reaction, and the antigen-antibody binding reaction can be detected by a conventional ELISA, RIA (radioimmunoassay) (Sandwich assay), Western blotting on polyacrylamide gel, immunoblot analysis or immunohistochemical staining. For example, the diagnostic kit can be provided to perform an ELISA that reacts with a recombinant monoclonal antibody protein using, for example, a 96-well microtiter plate coated with a sample and a control.

항원-항체 결합 반응을 위한 고정체로는 니트로셀룰로오즈 막, PVDF 막, 폴리비닐 (Polyvinyl) 수지 또는 폴리스티렌(Polystyrene) 수지로 합성된 웰 플레이트 (Well plate) 및 유리로 된 슬라이드 글래스 등이 사용될 수 있다. 2차 항체의 표지체는 발색반응을 하는 통상의 발색제가 바람직하며, HRP (Horseradish peroxidase), 염기성 탈인산화효소 (Alkaline phosphatase), 콜로이드 골드 (Coloid gold), FITC (Poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate), RITC(Rhodamine-B-isothiocyanate) 등의 형광물질 (Fluorescein) 및 색소 (Dye) 등의 표지체가 사용될 수 있다. 발색을 유도하는 기질은 발색반응을 하는 표지체에 따라 사용하는 것이 바람직하며, TMB (3,3',5,5'-tetramethyl bezidine), ABTS [2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)], OPD (o-phenylenediamine) 등을 사용할 수 있다. 이 때, 발색제 기질은 완충용액 (0.1 M NaAc, pH 5.5)에 용해된 상태로 제공되는 것이 더욱 바람직하다.As a fixture for the antigen-antibody binding reaction, a nitrocellulose membrane, a PVDF membrane, a well plate synthesized from a polyvinyl resin or a polystyrene resin, and a glass slide glass can be used. The marker of the secondary antibody is preferably a conventional coloring agent that performs a color reaction. Examples of the marker include HRP (Horseradish peroxidase), basic dephosphorylase (Alkaline phosphatase), colloidal gold, FITC (Poly-Lysine-fluorescein isothiocyanate) , Fluorescein such as Rhodamine-B-isothiocyanate (RITC), and coloring matter (Dye) may be used. The substrate that induces color development is preferably used according to the labeling substance that undergoes a color reaction. TMB (3,3 ', 5,5'-tetramethyl bezidine), ABTS [2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline -6-sulfonic acid], and OPD (o-phenylenediamine). At this time, it is more preferable that the color developer substrate is provided in a dissolved state in a buffer solution (0.1 M NaAc, pH 5.5).

TMB와 같은 발색기질은 2차 항체 접합체의 표지체로 사용된 HRP에 의해 분해되어 발색 침적체를 생성하고 그 발색 침적체의 침적 정도를 육안으로 확인함으로써폐암 특이적 마커 단백질 항원의 존재 유무를 검출한다.The chromogenic substrate such as TMB is decomposed by HRP used as a marker of the secondary antibody conjugate to generate a chromogenic precipitate and the presence or absence of a specific marker protein of lung cancer is detected by visually observing the degree of deposition of the chromogenic precipitate .

세척액은 인산염 완충용액, NaCl 및 트윈 20을 포함하는 것이 바람직하며, 0.02 M 인산염 완충용액, 0.13 M NaCl, 및 0.05% 트윈 20 (Tween 20)으로 구성된 완충용액 (PBST)이 더욱 바람직하다. 세척액은 항원-항체 결합반응 후 항원-항체 결합체에 2차 항체를 반응시킨 다음 적당량을 고정체에 첨가하여 3 내지 6회 세척한다. 반응 정지용액은 황산용액(H2SO4)이 바람직하게 사용될 수 있다.The wash liquor preferably comprises phosphate buffered saline, NaCl and Tween 20, more preferably a buffer solution (PBST) consisting of 0.02 M phosphate buffer, 0.13 M NaCl, and 0.05% Tween 20. After the antigen-antibody binding reaction, the washing solution is reacted with the secondary antibody to the antigen-antibody conjugate, and then an appropriate amount of the antibody is added to the solid body and washed 3 to 6 times. The reaction stop solution may preferably be a sulfuric acid solution (H 2 SO 4 ).

아울러, 본 발명의 또 다른 측면은 검체에서폐암 특이적 마커 단백질 마커를 검출하는 방법을 제시할 수 있다. 상기 검출방법은 혈액 내 단백질을 고정화 시키거나 전기영동 (SDS-PAGE)으로 분리시킨 후 니트로셀룰로즈 막으로 전이시키고 특이 항체와 접촉시켜 항원항체 반응을 통해폐암 특이적 마커 단백질의 존재를 간접적으로 확인하는 것을 포함한다. 상기 항원-항체 반응으로서 효소면역측정법 (ELISA), 면역침강법, 형광면역법, 효소기질발색법, 항원-항체응집법 등을 들 수 있다. 검체로서는 혈청, 혈장, 혈액, 체액 및 타액을 사용할 수 있고, 혈청이 가장 바람직하다.
In addition, another aspect of the present invention can suggest a method for detecting a lung cancer-specific marker protein marker in a specimen. The detection method involves immobilizing proteins in the blood or separating them by electrophoresis (SDS-PAGE), transferring them to a nitrocellulose membrane, contacting the antibody with a specific antibody, and indirectly confirming the presence of a lung cancer-specific marker protein through an antigen-antibody reaction . Examples of the antigen-antibody reaction include enzyme immunoassay (ELISA), immunoprecipitation, fluorescence immunoassay, enzyme substrate staining, and antigen-antibody aggregation. As the specimen, serum, plasma, blood, body fluids and saliva can be used, and serum is most preferable.

한편, 폐암마커 단백질에 특이적인 항체를 생물학적 마이크로칩 (Biological microchip) 상에 고정시킨 후 대상자로부터 분리된 검체 시료와 반응시켜 상기 항체 단백질에 대한 항원을 검출할 수 있는 생물학적 마이크로칩 (Biological microchip) 및 자동화된 미세배열 시스템 (Microarray system)을 이용하면, 대량으로 시료를 분석할 수 있다.
On the other hand, a biological microchip capable of detecting an antigen for the antibody protein by immobilizing an antibody specific to a lung cancer marker protein on a biological microchip and reacting with a specimen separated from the subject, Using an automated microarray system, samples can be analyzed in large quantities.

또 다른 관점에서, 본 발명은 상기 폐암 진단용 조성물을 이용하여 환자유래 샘플로부터 폐암진단에 필요한 정보를 제공하는 방법 및 진단 방법에 관한 것이다. In another aspect, the present invention relates to a method and a diagnostic method for providing information necessary for diagnosis of lung cancer from a patient-derived sample using the lung cancer diagnostic composition.

본 발명에 있어서, 상기 샘플은 혈액, 혈장, 혈청, 타액, 객담, 소변 및 대변으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
In the present invention, the sample may be selected from the group consisting of blood, plasma, serum, saliva, sputum, urine, and feces.

본 발명의 일 양태에서는 종양표지자 검사방법인 단클론 항체를 이용하여 구축된 헵토글로빈(HP) 및 혈청 아밀로이드 A(SAA)에 대한 항체(대한민국 특허공개 2012-0078192)가 탑재된 샌드위치 ELISA 시스템을 이용하여 HP 단일클론항체의 정확도 및 민감도를 확인하였다. 상기 두 가지 항체를 이용한 ELISA 시스템으로 정상인의 혈청(80명), 폐암 환자의 혈청(80명) 샘플에서 헵토글로빈(HP)과 혈청 아밀로이드 A(SAA)의 발현 수준을 샌드위치 ELISA 법을 이용하여 분석한 결과, AUC(area under the curve)는 각각 0.795 및 0.736으로 나타났고, 헵토글로빈(HP)과 혈청 아밀로이드 A(SAA)를 조합한 결과는 AUC 값는 0.808로 더 높게 나타났다.
In one embodiment of the present invention, a sandwich ELISA system equipped with an antibody against hepatoglobin (HP) and serum amyloid A (SAA) constructed using a monoclonal antibody as a tumor marker test method (Korean Patent Publication No. 2012-0078192) To confirm the accuracy and sensitivity of HP monoclonal antibodies. The expression levels of heptoglobin (HP) and serum amyloid A (SAA) in serum samples of normal (80) and lung cancer patients (80) were determined by sandwich ELISA using an ELISA system using the two antibodies The area under the curve (AUC) was 0.795 and 0.736, respectively. The combination of heptoglobin (HP) and serum amyloid A (SAA) showed higher AUC value of 0.808.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. It is to be understood by those skilled in the art that these examples are for illustrative purposes only and that the scope of the present invention is not construed as being limited by these examples.

실시예 1: 폐암특이적 단백질 마커 헵토글로빈(HP)에 대한 항원 및 항체의 제조Example 1: Preparation of antigens and antibodies against lung cancer-specific protein marker heptoglobin (HP)

(1) 마우스의 면역화(1) Immunization of mouse

하이브리도마 세포의 제조에 필요한 면역화된 마우스를 얻기 위하여, 헵토글로빈(HP)(30㎍/㎕)를 인산염 완충액(phosphate buffered saline; PBS) 150㎕에 희석하고 동일한 부피의 프로인트 완전 아주반트(complete Freund's adjuvant, Sigma)와 혼합하여 에멀젼을 제조하였다. 상기 에멀젼을 6주령의 암컷 Balb/c 마우스의 복강 내에 1차 주사하였다. 1차 면역화 후 마우스의 면역성을 높이기 위하여 2주 후에 헵토글로빈(HP) 150㎕와 동일한 부피의 프로인트 불완전 아주반트 (incomplete Freund's adjuvant, Sigma)를 혼합하여 에멀젼을 제조한 후, 상기 에멀젼을 6주령의 암컷 Balb/c 마우스의 복강 내에 2차 주사하였다. 2차 면역화 후 2주 후에 3차 면역화하였다. 마지막 면역화한 후 1주일 후에 세포융합 실험을 실시하기 3일 전 헵토글로빈(HP) 10~30㎍/㎕를 마우스의 꼬리 정맥에 부스터 (booster) 주사하였다.To obtain the immunized mice necessary for the preparation of hybridoma cells, heptoglobin (HP) (30 μg / μl) was diluted in 150 μl of phosphate buffered saline (PBS) and the same volume of Freund's complete adjuvant (complete Freund's adjuvant, Sigma) to prepare an emulsion. The emulsion was firstly injected into the abdominal cavity of female Balb / c mice at 6 weeks of age. After the first immunization, two weeks after the first immunization, the emulsion was mixed with 150 쨉 l of the same volume of incomplete Freund's adjuvant (Sigma) as the heptoglobin (HP), and the emulsion was mixed with 6 Week-old female Balb / c mice. The mice were immunized three times after the second immunization. One week after the last immunization, 10-30 μg / μl of heptoglobin (HP) was injected into the tail vein of the mouse three days before the cell fusion experiment.

상기 면역화된 마우스를 에테르로 마취시킨 후 헤파린 처리된 주사기로 심장에서 채혈한 후, 혈액을 4℃에서 하룻밤 정치시키고 원심분리하여 혈청을 분리하였다. 분리된 혈청을 적당히 나누어 -80℃에 보관하였다.
The immunized mice were anesthetized with ether and blood was collected from the heart with a heparinized syringe. The blood was allowed to stand overnight at 4 ° C and centrifuged to separate the serum. The separated serum was appropriately divided and stored at -80 ° C.

(2) 세포 융합(2) Cell fusion

먼저, 세포융합을 위해 골수종 세포(myeloma cell)를 준비하였다. 골수종 세포인 SP2/O 세포(ATCCㄾCRL-1581)를 배양하고, 세포밀도를 2.5~5x104/㎖로 하였다. 세포융합 24시간 전에 SP2/O 세포를 1/3로 희석하여 준비하였다.First, myeloma cells were prepared for cell fusion. SP2 / O cells (ATCC CRL-1581), a myeloma cell, were cultured to give a cell density of 2.5 to 5 x 10 4 / ml. SP2 / O cells were prepared by diluting 1/3 of the cells 24 hours before cell fusion.

상기(1)에서 면역화된 마우스의 혈청에서 ELISA 법으로 항체의 역가를 확인하여 항체 생성력이 있음을 확인한 후, 면역화된 마우스를 에테르로 마취시키고 몸통의 좌측에 위치한 비장세포(spleen cell)를 적출하였다. 적출된 비장세포를 SF-DMEM2(DMEM + 2xAA)로 세척하고 비장세포를 용출시켰다. 세포 현탁액을 수거하여 튜브에 담고 정치시켜 무거운 덩어리들을 가라앉히고 상층액을 새 튜브로 옮긴 다음 1,500rpm으로 5분 동안 원심분리하였다. 원심분리된 비장세포의 상층액을 제거하고 탭핑한(tapping) 후 SF-DMEM2를 채웠다. 비장세포와 골수종 세포인 SP2/O 세포를 각각 원심분리하고 세척한 다음, 세척과정을 1회 더 반복하였다. 세척한 SP2/0 세포의 상층액을 제거하고 탭핑한 후 SF-DMEM2를 채웠다. 또한, 세척한 비장세포의 상층액을 제거하고 탭핑한 후, LB(lysis buffer) 1㎖에 적혈구(RBC, red blood cell)를 넣어 처리한 후 SF-DMEM2를 채웠다. 그 다음, 비장세포와 SP2/O 세포를 각각 원심분리하고, 원심분리된 비장세포와 SP2/O 세포의 상층액을 제거한 다음 탭핑하고 SF-DMEM2 10㎖를 채웠다. 비장세포와 SP2/O 세포를 각각 e-튜브에서 100배로 희석하고 계수하여 농도를 결정하였다[비장세포의 농도(1x108, 8x107, 5x107), SP2/O 세포의 농도(1x107, 8x106, 5x106)]. 비장세포와 SP2/O 세포는 10:1의 비율로 결정하였다. 결정된 농도의 비장세포와 SP2/O 세포를 튜브에 함께 넣고 원심분리하였다. 원심분리된 세포의 상층액을 제거한 후 알콜솜 위에 엎어 놓고 30초~1분 동안 반건조시키고 탭핑하였다. 여기에 PEG(2㎖, 1.5㎖, 1㎖)를 1분 동안 천천히 넣으면서 피펫팅하여 반응시키고 SF-DMEM2를 넣으면서 튜브를 흔들어준 다음 원심분리하였다. 원심분리 후 상층액을 제거하고 탭핑하지 않은 상태에서 HT 배지[HT 50x(HT(sigma) 1 vial + SF-DMEM1 10㎖) 1㎖, FBS 10㎖, SF-DMEM1(DMEM + 1xAA) 30㎖]를 방울방울 떨어뜨리고, 조금씩 속도를 올리면서 50㎖가 되도록 하였다. 이 현탁액을 다시 37℃, 5% CO2 배양기에서 3시간 동안 배양하였다.
The antibody titer was confirmed by ELISA in the serum of the mouse immunized in the above (1), and the immunized mouse was anesthetized with ether and the spleen cell located on the left side of the body was extracted . The harvested spleen cells were washed with SF-DMEM2 (DMEM + 2xAA) and spleen cells were eluted. The cell suspension was collected, placed in a tube, allowed to settle, and the supernatant was transferred to a new tube and centrifuged at 1,500 rpm for 5 minutes. The supernatant of the centrifuged splenocytes was removed and tapping followed by filling of SF-DMEM2. Spleen cells and myeloma cells, SP2 / O cells, were centrifuged and washed, respectively, and the washing procedure was repeated one more time. The supernatant of the washed SP2 / 0 cells was removed, tapped and filled with SF-DMEM2. The supernatant of the washed spleen cells was removed and tapped. Then, 1 ml of LB (lysis buffer) was treated with red blood cells (RBC), and then SF-DMEM2 was filled. Then, spleen cells and SP2 / O cells were centrifuged respectively, centrifuged spleen cells and supernatant of SP2 / O cells were removed, and tapping and 10 ml of SF-DMEM2 were filled. Spleen cells and SP2 / O cell for each was 100-fold diluted in e- tubes and counted to determine the concentration [spleen cell density (1x10 8, 8x10 7, 5x10 7), SP2 / O cell density (1x10 7, 8x10 of the 6 , 5x10 6 )]. Splenocytes and SP2 / O cells were determined at a ratio of 10: 1. The determined concentration of splenocytes and SP2 / O cells were put into tubes and centrifuged. After removing the supernatant from the centrifuged cells, the supernatant was spun down on the alcohol solution, semi-dried and tapped for 30 seconds to 1 minute. Pipetting was performed by slowly adding PEG (2 ml, 1.5 ml, 1 ml) for 1 minute, and the tube was shaken while inserting SF-DMEM2, followed by centrifugation. After centrifugation, the supernatant was removed and 1 ml of HT medium (HT (Sigma) 1 vial + SF-DMEM1 10 ml), FBS 10 ml, SF-DMEM1 (DMEM + 1xAA) 30 ml, Was dropped, and the volume was gradually increased to 50 ml. This suspension was further cultured in a 5% CO 2 incubator at 37 ° C for 3 hours.

(3) 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 선별 및 클로닝(3) Screening and cloning of hybridoma cells producing monoclonal antibodies

상기 (2)에서 제조한 융합세포군 중에서 헵토글로빈(HP)에만 특이적으로 반응하는 융합세포들을 선별하고 항체의 생성여부를 확인하기 위하여, 효소면역방법을 이용하여 스크리닝하였다.Among the fused cell groups prepared in (2) above, fused cells that specifically react with heptoglobin (HP) were selected and screened using an enzyme immunoassay method to confirm the production of antibodies.

세포융합 후 8~9일째에 배지를 교환하고, 96 웰에서부터 24 웰까지 잘 자랄 때까지 cDMEM2에서 배양하였다. 배지를 교환한 후 5~7일째에 색이 변한 웰의 상층액을 거두고 cDMEM2로 채운 후 ELISA 시험을 수행하였다. ELISA 시험 후 웰을 선택하여 24 웰로 옮겨 배양하였다. 24 웰에서 배양한 후 다시 ELISA 시험을 수행하였다. 구체적으로는, 24 웰의 융합세포 농도를 확인하고, 96 웰 플레이트에 0.5 cell/well이 되도록 15㎖의 배양액에 융합세포를 희석하였다. 융합세포 희석액을 각 웰당 150㎕씩 분주하였다. 현미경으로 검경하여 1개의 세포가 들어있는 웰을 체크하였다. 세포가 어느 정도 자란 웰의 상층액을 거두어 ELISA 및 웨스턴 블롯으로 확인하여 1차 스크리닝을 수행하였다. 1차 스크리닝을 토대로 선택된 융합세포를 24 웰로 옮겨 배양하고 원심분리한 후 상층액을 거두어 ELISA 및 웨스턴 블롯으로 확인하여 2차 스크리닝을 수행하였다. 24 웰에서 키운 융합세포의 흡광도(O.D 값)를 ELISA로 확인하고, 흡광도가 1이 넘는 융합세포만 선택하여 25T/C 배양 플라스크로 옮겨 배양하고 원심분리한 후 상층액을 거두어 ELISA 및 웨스턴 블롯으로 확인하여 3차 스크리닝을 수행하였다. 3차 스크리닝을 토대로 선택된 융합세포를 다시 75T/C 배양 플라스크로 옮겨 배양하고 ELISA로 흡광도를 확인하여 흡광도가 1이 넘는 융합세포만 선택하였다. 최종적으로 선택한 융합세포를 각각 "11F3" 및 "9B1", "3D3"로 명명하였으며, 한국생명공학연구원 유전자은행(KCTC)에 각각 2014년 07월 16일자로 기탁하였다(수탁번호 : KCTC 12620BP(11F3), KCTC 12619BP(9B1), KCTC 12655BP(3D3)).
The medium was changed 8-9 days after cell fusion and cultured in cDMEM2 until well grown from 96 well to 24 well. After replacing the medium, the supernatant of the color-changed wells was harvested from day 5 to day 7, filled with cDMEM2, and then subjected to ELISA. After the ELISA test, wells were selected and cultured in 24 wells. 24 wells and then subjected to ELISA again. Specifically, the concentration of the fusion cell in 24 wells was determined, and the fusion cells were diluted in 15 ml of the culture medium so as to be 0.5 cell / well in a 96 well plate. Fusion cell dilutions were dispensed at 150 각 per well. The wells containing one cell were checked by microscopic examination. The supernatant of the wells in which the cells were grown to some extent was collected and subjected to primary screening by ELISA and Western blotting. Fusion cells selected on the basis of the primary screening were transferred to 24 wells, cultured and centrifuged, and the supernatant was collected and subjected to secondary screening by ELISA and Western blotting. (OD value) of the fused cells grown in 24 wells was confirmed by ELISA, and only fused cells having an absorbance of more than 1 were selected, transferred to a 25 T / C culture flask, and cultured. After centrifugation, the supernatant was collected and subjected to ELISA and Western blot And the tertiary screening was carried out. The selected fusion cells were then transferred to a 75T / C culture flask and cultured. The absorbance was checked by ELISA, and only fusion cells with absorbance above 1 were selected. The final selected fusion cells were designated as "11F3", "9B1", and "3D3", respectively, and deposited on July 16, 2014 at KCTC, Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology (Accession No .: KCTC 12620BP ), KCTC 12619BP (9B1), KCTC 12655BP (3D3)).

실시예 2 : 헵토글로빈(HP)에 대한 단일클론항체의 생산 및 정제Example 2: Production and purification of monoclonal antibodies against heptoglobin (HP)

(1) 헵토글로빈(HP)에 대한 단일클론항체의 생산(1) Production of monoclonal antibodies against heptoglobin (HP)

상기 실시예 1에서 선택된 최종 융합세포(하이브리도마 세포, "11F3" 및 "9B1", "3D3")로부터 헵토글로빈(HP)에 대한 단일클론항체를 생산하기 위하여, 7~8 주령의 암컷 Balb/C 마우스 복강(abdominal cavity)에 프리스탄(pristane) 500㎕를 주사하였다. 75T/C 배양 플라스크에서 배양한 융합세포를 수거하여 원심분리한 다음, 상층액을 제거하고 인산염 완충액에 넣고 피펫팅하였다. 프리스탄 투여 7~10일 후 상기 실시예 1에서 선택한 융합세포 [(11F3)KCTC 12620BP, (9B1)KCTC 12619BP, (3D3)KCTC 12655BP]를 각각 8x105 ~ 4x107으로 마우스의 복강 내에 주사하였다. 5~7일 후에 마우스의 복강에 복수(ascites)가 가득찼을 때 18G 주사 바늘을 이용하여 복수를 뽑았다. 복수를 4℃에서 하룻밤 두었다가 다음날 원심분리하여 노란 지방층을 포함한 덩어리 물질을 제거하고 상층액만을 분리하였다. 분리한 상층액은 분주하여 -20℃에 보관하였다.
To produce monoclonal antibodies against heptoglobin (HP) from the final fusion cells selected in Example 1 (hybridoma cells, "11F3" and "9B1", "3D3"), 7-8 week old female 500 μl of pristane was injected into the Balb / C mouse abdominal cavity. Fusion cells cultured in a 75T / C culture flask were collected, centrifuged, and then the supernatant was removed, and the cells were pipetted in a phosphate buffer. The fusion cells [(11F3) KCTC 12620BP, (9B1) KCTC 12619BP, (3D3) KCTC 12655BP] selected in Example 1 were injected intraperitoneally into mice intraperitoneally at 8 × 10 5 to 4 × 10 7 . When ascites was filled in the abdominal cavity of the mice 5 to 7 days later, the ascites was extracted using an 18G injection needle. The ascites was left overnight at 4 ° C and centrifuged the next day to remove lumpy material including yellow fat layer, and only the supernatant was separated. The supernatant was separated and stored at -20 ° C.

(2) 헵토글로빈(HP)에 대한 단일클론항체의 정제(2) Purification of monoclonal antibodies against heptoglobin (HP)

저장액(20% 에탄올)에 저장되어 있는 Protein G Fast Flow Beads를 적당량 컬럼에 채우고 20% 에탄올을 흘려 내린 후, 5 Bed Volum의 결합 완충액(20mM sodium phosphate, pH 7.0)으로 세척하였다. 복수액을 인산염 완충액으로 적당량 희석시킨 후 Protein G 컬럼에 로딩하였다. 3 Bed Volum의 결합 완충액(20mM sodium phosphate, pH 7.0)으로 결합한 후, 3 Bed Volum의 용출 완충액(0.1M glycine buffer, pH 3.0~2.5)으로 0.5㎖씩 분획을 용출하였다(11개의 분획). 각 분획을 35㎕의 중화 완충액(1M Tris-HCl, pH 9.0)으로 중화시켰다. 70% 에탄올로 냉장온도에서 하룻밤 정치시킨 후, 다시 저장액(20% 에탄올)에서 다음 번 사용시까지 냉장 보관하였다. 각 분획의 순도를 확인하기 위하여 SDS-PAGE를 수행하였으며, Ammersharm GE 컬럼으로 탈염(desalting)하였다.
Protein G Fast Flow Beads stored in stock solution (20% ethanol) was filled in an appropriate amount of column, and 20% ethanol was flowed down and washed with 5 Bed Volum binding buffer (20 mM sodium phosphate, pH 7.0). The aliquots were diluted with a suitable amount of phosphate buffer and loaded onto a Protein G column. (20 mM sodium phosphate, pH 7.0) and eluted with 0.5 ml of each elution buffer (0.1 M glycine buffer, pH 3.0 to 2.5) in 3 Bed Volum (11 fractions). Each fraction was neutralized with 35 μl of neutralization buffer (1 M Tris-HCl, pH 9.0). The cells were allowed to stand at 70% ethanol overnight at the refrigeration temperature, and then stored in a refrigerated storage solution (20% ethanol) until the next use. SDS-PAGE was performed to confirm the purity of each fraction and desalting was performed with an Amersharm GE column.

결과는 표 1에 나타내었다.The results are shown in Table 1.

단일클론항체의 정제Purification of monoclonal antibodies 복수액 로딩Multiple liquid loading 단백질 용출액Protein effluent 탈염
(GE 컬럼, Ammersharm)Desalination
(GE Column, Ammersharm) 회수율Recovery rate 1048㎍1048 g 1690㎍1690 g 1112㎍1112 g 10.1%10.1%

표 1에 나타난 바와 같이, 1048㎍의 복수액으로부터 1690㎍의 헵토글로빈(HP)에 대한 단일클론항체가 Protein G 컬럼을 이용하여 정제되었고, GE 컬럼을 이용하여 염이 제거된 헵토글로빈(HP)에 대한 단일클론항체는 1112㎍ 이었다. 회수율은 10.1% 이었다.
As shown in Table 1, a monoclonal antibody against 1690 μg of heptoglobin (HP) from 1048 μg of a plurality of liquids was purified using a Protein G column, and a desalted hemoglobin HP) was 1112 micrograms. The recovery rate was 10.1%.

실험예 1 : 11F3 항체, 9B1 항체 및 3D3 항체의 헵토글로빈(HP) 항원에 대한 결합 특이성 실험 - 웨스턴 블롯Experimental Example 1: Binding specificity test for 11F3 antibody, 9B1 antibody and 3D3 antibody to heptoglobin (HP) antigen - Western blot

본 발명의 하이브리도마 세포(11F3 및 9B1, 3D3)에서 생산된 11F3 항체, 9B1 항체 및 3D3 항체의 헵토글로빈(HP)항원에 대한 결합 특이성을 확인하기 위하여, 본 발명에 따른 11F3 항체, 9B1 항체 및 3D3 항체의 헵토글로빈(HP) 항원에 대한 결합 특이성을 웨스턴 블롯 실험을 통해 확인하였다. In order to confirm the binding specificity of 11F3 antibody, 9B1 antibody and 3D3 antibody produced in the hybridoma cells (11F3 and 9B1, 3D3) of the present invention to the hepatoglobin (HP) antigen, the 11F3 antibody according to the present invention, 9B1 The binding specificity of antibody and 3D3 antibody to the hepatoglobin (HP) antigen was confirmed by Western blot experiments.

그 결과, 도 1 및 도 2에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 11F3 항체, 9B1 항체 및 3D3 항체를 사용한 경우, 약 36kDa 밴드 부근에서 헵토글로빈(HP) 항원의 발현 수준이 시판되는 항체(Abfontier사)보다 높게 나타났다. 따라서, 본 발명11F3 항체, 9B1 항체 및 3D3 항체는 헵토글로빈(HP) 항원에 대한 결합 특이성이 높음을 알 수 있다.
As a result, as shown in Figs. 1 and 2, when the 11F3 antibody, 9B1 antibody and 3D3 antibody according to the present invention were used, the level of expression of the heptoglobin (HP) antigen near the band of about 36 kDa was measured using a commercially available antibody Respectively. Therefore, it can be seen that the inventive 11F3 antibody, 9B1 antibody and 3D3 antibody have high binding specificity for the hepatoglobin (HP) antigen.

실험예 2 : 11F3 항체, 9B1 항체 및 3D3 항체의 혈청 헵토글로빈(HP)항원에 대한 결합 특이성 실험 - 샌드위치 ELISAExperimental Example 2: Binding Specificity Test for Serum Heptoglobin (HP) Antigen of 11F3 Antibody, 9B1 Antibody and 3D3 Antibody-Sandwich ELISA

본 발명에 따른 11F3 항체, 9B1 항체 및 3D3 항체의 헵토글로빈(HP)항원에 대한 결합 특이성을 확인하기 위하여, 정상인의 혈청(120명), 폐암 환자의 혈청(120명) 샘플에서 헵토글로빈(HP)의 발현 수준을 샌드위치 ELISA 법을 이용하여 확인하였다.In order to confirm the binding specificity of the 11F3 antibody, 9B1 antibody and 3D3 antibody according to the present invention to the hepatoglobin (HP) antigen, serum of normal (120), serum (120) (HP) expression level was confirmed by the sandwich ELISA method.

본 발명에 따른 11F3 항체, 9B1 항체 및 3D3 항체의 헵토글로빈(HP)항원에 대한 결합 특이성을 두 가지 ELISA 세트로 실험하였다. 11F3 항체와 3D3 항체의 샌드위치 ELISA법 실험과는 도 3에 나타내었고, 도 3의 샌드위치 ELISA 분석 결과를 이용하여 평가한 민감도 및 특이도는 도 4에 나타내었다. The binding specificity of 11F3 antibody, 9B1 antibody and 3D3 antibody according to the present invention to the hepatoglobin (HP) antigen was tested with two ELISA sets. The sandwich ELISA assay of the 11F3 antibody and the 3D3 antibody is shown in FIG. 3, and the sensitivity and specificity evaluated using the sandwich ELISA analysis result of FIG. 3 are shown in FIG.

그리고 11F3 항체와 9B1 항체의 샌드위치 ELISA법 실험으로 확인한 결과는 도 5에 나타내었고, 도 5의 샌드위치 ELISA 분석결과를 이용하여 평가한 민감도 및 특이도는 도 6에 나타내었다.The results of the sandwich ELISA assay of the 11F3 antibody and the 9B1 antibody are shown in FIG. 5, and the sensitivity and specificity evaluated by the sandwich ELISA assay of FIG. 5 are shown in FIG.

도 3, 도 4와 도 5, 도 6에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 11F3 항체, 9B1 항체 및 3D3 항체는 헵토글로빈(HP) 항원의 발현 수준이 정상인의 혈청에서보다 폐암 환자의 혈청에서 높게 나타남을 확인하였다. 또한, 샌드위치 ELISA 분석 결과를 이용하여 계산한 AUC(area under the curve)는 각각 0.7746, 0.8142로 민감도 및 특이도가 높음을 확인하였다. AUC 값으로 11F3-3D3 ELISA 세트보다는 11F3-9B1 ELISA 세트가 더 좋게 나왔다.
As shown in FIGS. 3, 4, 5 and 6, the 11F3 antibody, 9B1 antibody and 3D3 antibody according to the present invention exhibited higher levels of the hepatoglobin (HP) antigen than the serum of normal, Respectively. In addition, the area under the curve (AUC) calculated using the sandwich ELISA analysis was 0.7746 and 0.8142, respectively, indicating high sensitivity and specificity. The 11F3-9B1 ELISA set was better than the 11F3-3D3 ELISA set with AUC values.

실시예 2: 폐암특이적 단백질 마커 헵토글로빈(HP) 항체가 탑재된 폐암 진단용 조성물을 이용한 폐암의 진단Example 2: Diagnosis of lung cancer using lung cancer-specific composition containing lung cancer-specific protein marker heptoglobin (HP) antibody

종양표지자 검사방법인 단클론 항체를 이용하여 구축된 헵토글로빈(HP) 및 혈청 아밀로이드 A(SAA)에 대한 항체(대한민국 공개특허공보 제2012-78192호에 기재된 10G1 항체(KCTC 11833BP))가 탑재된 샌드위치 ELISA 시스템을 이용하여 실험하였다. (HP) and serum amyloid A (SAA) (10G1 antibody (KCTC 11833BP) described in Korean Patent Laid-Open Publication No. 2012-78192) constructed using a monoclonal antibody, which is a tumor marker test method, Sandwich ELISA system.

두 가지 항체를 이용한 ELISA 시스템으로 정상인의 혈청(120명), 폐암 환자의 혈청(120명) 샘플에서 헵토글로빈(HP)과 혈청 아밀로이드 A(SAA)의 발현 수준을 샌드위치 ELISA 법을 이용하여 결과를 확인하였다. The level of expression of hepatoglobin (HP) and serum amyloid A (SAA) in serum samples from normal (120) and lung cancer patients (120) was determined by sandwich ELISA using an ELISA system using two antibodies Respectively.

헵토글로빈(HP)과 혈청 아밀로이드 A(SAA)의 ELISA 결과를 바탕으로 한 민감도 및 특이도를 도 7(A) 및 도 7(B)에 나타내었다. Sensitivity and specificity based on ELISA results of heptoglobin (HP) and serum amyloid A (SAA) are shown in Figs. 7 (A) and 7 (B).

그리고 헵토글로빈(HP)과 혈청 아밀로이드 A(SAA)를 조합한 결과는 메타 분석법을 이용한 후 민감도 및 특이도를 도 7(C)에 나타내었다. AUC(area under the curve)는 각각 0.795, 0.736으로 나타났고, 헵토글로빈(HP)과 혈청 아밀로이드 A(SAA)를 조합한 결과는 AUC 값는 0.808로 더 높게 나타났다.
The results of the combination of heptoglobin (HP) and serum amyloid A (SAA) are shown in FIG. 7 (C) for sensitivity and specificity after meta-analysis. Area under the curve (AUC) was 0.795 and 0.736, respectively. The combination of heptoglobin (HP) and serum amyloid A (SAA) showed higher AUC value of 0.808.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 통상의 기술자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
Having described specific portions of the present invention in detail, those skilled in the art will appreciate that these specific descriptions are only for the preferred embodiments and do not limit the scope of the present invention. It is therefore intended that the scope of the invention be defined by the claims appended hereto and their equivalents.

한국생명공학연구원Korea Biotechnology Research Institute KCTC12620BPKCTC12620BP 2014071620140716 한국생명공학연구원Korea Biotechnology Research Institute KCTC12619BPKCTC12619BP 2014071620140716 한국생명공학연구원Korea Biotechnology Research Institute KCTC12655BPKCTC12655BP 2014081820140818

Claims (11)

삭제delete 하이브리도마 세포 KCTC 12619BP에 의해 생산되고, 헵토글로빈(Haptoglobin, HP)에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 9B1.
Monoclonal antibody 9B1 produced by hybridoma cell KCTC 12619BP and specifically binding to Haptoglobin (HP).
하이브리도마 세포 KCTC 12655BP에 의해 생산되고, 헵토글로빈(Haptoglobin, HP)에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 3D3.
Monoclonal antibody 3D3 produced by hybridoma cell KCTC 12655BP and specifically binding to Haptoglobin (HP).
제2항의 헵토글로빈(Haptoglobin, HP)에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 9B1를 생산하는 하이브리도마 세포 KCTC 12619BP.
A hybridoma cell KCTC 12619BP that produces monoclonal antibody 9B1 that specifically binds to the Haptoglobin (HP) of claim 2.
제3항의 헵토글로빈(Haptoglobin, HP)에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 3D3를 생산하는 하이브리도마 세포 KCTC 12655BP.
A hybridoma cell KCTC 12655BP producing monoclonal antibody 3D3 that specifically binds to the Haptoglobin (HP) of claim 3.
제2항 또는 제3항의 단일클론항체를 함유하는 폐암 진단용 조성물.
A composition for diagnosing lung cancer, comprising the monoclonal antibody of any one of claims 2 to 3.
제6항에 있어서, 상기 조성물은 하이브리도마 세포 KCTC 12620BP에 의해 생산되는 단일클론항체 11F3을 추가적으로 함유하는 것을 특징으로 하는 폐암 진단용 조성물.
7. The composition for diagnosing lung cancer according to claim 6, wherein said composition further comprises monoclonal antibody 11F3 produced by hybridoma cell KCTC 12620BP.
제6항의 조성물을 이용하여 환자유래 샘플로부터 폐암진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
A method of providing information necessary for diagnosis of lung cancer from a patient-derived sample using the composition of claim 6.
제8항에 있어서, 샘플은 전혈, 혈장, 혈청, 조직, 세포, 타액, 객담, 소변 및 대변으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.

9. The method of claim 8, wherein the sample is selected from the group consisting of whole blood, plasma, serum, tissue, cells, saliva, sputum, urine, and feces.

제7항의 조성물을 이용하여 환자유래 샘플로부터 폐암진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
A method of providing information necessary for diagnosis of lung cancer from a patient-derived sample using the composition of claim 7.
제10항에 있어서, 샘플은 전혈, 혈장, 혈청, 조직, 세포, 타액, 객담, 소변 및 대변으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
11. The method of claim 10, wherein the sample is selected from the group consisting of whole blood, plasma, serum, tissue, cells, saliva, sputum, urine, and feces.
KR1020140111196A 2014-08-26 2014-08-26 Monoclonal Antibody Against Lung Cancer Specific Protein Marker Haptoglobin and Composition for Disgnosing Lung Cancer Comprising the Same KR101848409B1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020140111196A KR101848409B1 (en) 2014-08-26 2014-08-26 Monoclonal Antibody Against Lung Cancer Specific Protein Marker Haptoglobin and Composition for Disgnosing Lung Cancer Comprising the Same

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020140111196A KR101848409B1 (en) 2014-08-26 2014-08-26 Monoclonal Antibody Against Lung Cancer Specific Protein Marker Haptoglobin and Composition for Disgnosing Lung Cancer Comprising the Same

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20160024458A KR20160024458A (en) 2016-03-07
KR101848409B1 true KR101848409B1 (en) 2018-04-11

Family

ID=55539977

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020140111196A KR101848409B1 (en) 2014-08-26 2014-08-26 Monoclonal Antibody Against Lung Cancer Specific Protein Marker Haptoglobin and Composition for Disgnosing Lung Cancer Comprising the Same

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101848409B1 (en)

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Hybridoma. Vol. 8, No. 5, pp. 551-560 (1989)*

Also Published As

Publication number Publication date
KR20160024458A (en) 2016-03-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US8557602B2 (en) Method for detecting and distinguishing intrahepatic cholangiocarcinoma
JP6096813B2 (en) Multi-biomarker set for breast cancer diagnosis, detection method thereof, and breast cancer diagnosis kit including antibody thereto
KR101976219B1 (en) Biomarker for breast cancer
JPWO2012036094A1 (en) Lung cancer differentiation marker
KR101708651B1 (en) Serum amyloid A specific monoclonal antibody and hybridoma cell producing the same
EP1678503A2 (en) Specific method for cancer detection
EP2615110A1 (en) Biomarker for diagnosing cancer and method of isolating cancer cell using the same
CN110684107B (en) Monoclonal antibody (MGd1) against MG7-Ag and use thereof
US10228373B2 (en) Kit and method for diagnosis, prognosis or monitoring of liver disease through measurement of amount of AST
CN110684108B (en) anti-MG 7-Ag monoclonal antibody (CEA37) and application thereof
KR101311717B1 (en) Protein marker melanotransferrin for colon cancer diagnosis and diagnosis kit for colon cancer using antibodies against the same
KR101848409B1 (en) Monoclonal Antibody Against Lung Cancer Specific Protein Marker Haptoglobin and Composition for Disgnosing Lung Cancer Comprising the Same
JP7432578B2 (en) Cancer markers and their uses
JP2014115186A (en) Method for detecting stomach cancer, lung cancer, and/or esophagus cancer
KR101311718B1 (en) Protein marker RPE-spondin for colon cancer diagnosis and diagnosis kit for colon cancer using antibodies against the same
WO2021246153A1 (en) Method and reagent for detecting pancreatic cancers
KR101144323B1 (en) Autoantibodies for breast cancer diagnosis and multi-panel diagnosis kit using one or combination of any of the same
KR102131860B1 (en) Biomarker Composition for Diagnosing Colorectal Cancer Specifically Binding to Arginine-methylated Gamma-glutamyl Transferase 1
KR20110129508A (en) Biomarker for lung cancer
KR101431063B1 (en) Protein marker apolipoprotein c-1 for breast cancer diagnosis, method of detecting the same, and diagnosis kit for breast cancer using antibody against the same
WO2020218121A1 (en) Cancer detection method and detection reagent
WO2021187173A1 (en) Method for detecting gastrointestinal stromal tumor and detection reagent
KR20110115292A (en) Protein marker xage-1d for lung cancer and diagnosis kit for lung cancer using an antibody against the same
KR20130023308A (en) Biomarker for lung cancer
KR101981806B1 (en) Quescin-sulfhydryl oxidase 1 specific antibody, Hybridoma cell producing the same, and Composition for diagnosis of lung cancer having the same

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant