KR101847734B1 - Primer specific for grass pathogen and diagnostic method of using thereof - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 잔디 병원균 특이적 프라이머 및 이를 이용한 잔디병 진단방법에 대한 것이다.The present invention relates to a grass pathogen-specific primer and a method for diagnosing grass disease using the same.
90여종의 잔디병 원인균 중 세균성인 위조병과 바이러스병을 제외한 부분이 곰팡이성 병원균이다. 대표적인 곰팡이성 잔디병에는 피슘 마름병, 푸사륨 패취, 봄마름병(춘고병, 엽고병), 라이족토니아 잎마름병(갈색퍼짐병, 라지 패취, 브라운 패취), 노균병 및 동전마름병(달라 스팟) 등 64종이 알려져 있다. 잔디에 병을 일으키는 병원균의 진단에 있어서, 신품종 한난지형 잔디 도입과 이상기온 등에 의한 병 발생 다양성, 복합감염 등으로 육안 혹은 현미경 관찰만으로는 원인균의 명확한 파악에 어려움이 있다. Of the more than 90 kinds of grass diseases, bacterial fungi and viral diseases are the most common fungal pathogens. 64 kinds of typical moldy turf diseases including pyruvate rot fungus, fusarium spp., Spring blight (Chunchon disease, open sorghum), Lyapunovirus leaf blight (brown spread bottle, large patch, brown patch) It is known. In the diagnosis of pathogenic bacteria causing the disease in grass, it is difficult to clearly identify causative microorganisms only by visual observation or microscopic observation due to the diversity of diseases caused by introduction of new varieties of Korean terrestrial terraces and abnormal temperature, and complex infections.
본 발명자들은 잔디로 분리된 병원균의 유전자 서열을 분석하고 잔디병을 일으키는 균주에서 특이적인 서열을 처음으로 밝히고 이를 이용하여 용이하게 균주를 동정할 수 있다는 것을 알아내고 본 발명을 완성하였다. The present inventors analyzed gene sequences of pathogens isolated from turfgrass and found a specific sequence in a strain causing turf disease for the first time, and can easily identify the strain, thereby completing the present invention.
본 발명은 서열번호 3의 서열를 포함하는 Rhizoctonia solani AG 2-2 병원균 진단용 프라이머를 제공하고자 한다.The present invention relates to a method for producing Rhizoctonia < RTI ID = 0.0 > solani AG 2-2 pathogen detection primer.
본 발명은 서열번호 10의 서열를 포함하는 Rhizoctonia solani AG 1-1A 병원균 진단용 프라이머를 제공하고자 한다.The present invention relates to a method for producing Rhizoctonia < RTI ID = 0.0 > solani To provide a primer for the diagnosis of AG 1-1A pathogen.
본 발명의 또다른 목적은 상기 서열번호 3을 이용하여 Rhizoctonia solani AG 2-2 병원균에의한 감염여부를 진단하는 방법을 제공하고자 한다.Another object of the present invention is to provide a method for producing Rhizoctonia solani AG 2-2 pathogen.
본 발명의 또다른 목적은 상기 서열번호 10을 이용하여 Rhizoctonia solani AG 1-1A 병원균에의한 감염여부를 진단하는 방법을 제공하고자 한다.A further object of the present invention is to provide a method for producing Rhizoctonia solani AG 1-1 A method for diagnosing infection by a pathogen.
상기한 목적을 위하여, 본 발명의 제 1 의 형태는 서열번호 3의 서열를 포함하는 Rhizoctonia solani AG 2-2 병원균 진단용 프라이머 또는 분자마커이다. 보다 구체적으로 Rhizoctonia solani AG 2-2 병원균 진단을 위한 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머쌍이다. For the above purpose, a first aspect of the present invention is a method for producing Rhizoctonia comprising the sequence of SEQ ID NO: 3 solani AG 2-2 is a primer or molecular marker for pathogen diagnosis. More specifically, Rhizoctonia SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 for solani AG 2-2 pathogen diagnosis.
본 발명의 제 2 의 형태는 서열번호 10의 서열를 포함하는 Rhizoctonia solani AG 1-1A 병원균 진단용 프라이머 또는 분자마커이다. 보다 구체적으로 Rhizoctonia solani AG 1-1A 병원균 진단을 위한 서열번호 10 및 서열번호 11의 프라이머쌍이다.A second aspect of the present invention is a primer or a molecular marker for the diagnosis of Rhizoctonia solani AG 1-1A pathogen comprising the sequence of SEQ ID NO: 10. More specifically, Rhizoctonia solani SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 11 for diagnosis of AG-1-1A pathogen.
본 발명의 제 3 의 형태는 서열번호 1 내지 9의 프라이머를 포함하는 것을 특징으로 하는 Pythium arrhenomanes, Rhizoctonia solani AG 2-2 , Rhizoctonia cerealis , Sclerotinia homoeocarpa 및 Curvularia spp 에 의한 잔디병원균 감염 동시 진단 키트이다. 본 발명의 서열번호 1 내지 9의 프라이머를 혼합한 튜브를 이용하여 PCR을 수행한 경우에는 Rhizoctonia cerealis 병원균 DNA 마커 200 bp, Rhizoctonia solani AG 2-2 DNA 마커 250 bp, Pythium arrhenomanes DNA 마커 300 bp, Curvularia spp. DNA 마커 650 bp, Sclerotinia homoeocarpa DNA 마커 1000 bp 로 분자크기에 따라 쉽게 분리되어지기 때문에 혼합튜브에서도 어떤 종의 병원균이 감염되었는지 여부를 용이하게 확인할 수 있다. A third aspect of the present invention is a Pythium < RTI ID = 0.0 > arrhenomanes , Rhizoctonia solani AG 2-2, Rhizoctonia cerealis , Sclerotinia homoeocarpa and Curvularia spp Grass pathogens by Infection simultaneous diagnosis kit. When PCR was carried out using a tube containing the primers of SEQ ID NOS: 1 to 9 of the present invention, Rhizoctonia cerealis pathogen DNA marker 200 bp, Rhizoctonia solani AG 2-2 DNA marker 250 bp, Pythium arrhenomanes DNA marker 300 bp, Curvularia spp . DNA marker 650 bp, Sclerotinia Because homoeocarpa DNA marker is easily separated by molecular size at 1000 bp, it is easy to determine which species of pathogen has been infected even in a mixed tube.
본 발명의 제 4 의 형태는 서열번호 3의 서열를 포함하는 Rhizoctonia solani AG 2-2 병원균 감염 여부 진단용 방법를 제공한다. 보다 바람직하게는 상기 진단방법은 서열번호 3의 프라이머 및 서열번호 4의 프라이머를 이용하는 특징으로 하는 Rhizoctonia solani AG 2-2 병원균 진단 방법이다. A fourth aspect of the present invention provides a method for diagnosing infection with Rhizoctonia solani AG 2-2 pathogen comprising the sequence of SEQ ID NO: 3. More preferably, the diagnostic method according to claim Rhizoctonia using a primer and a primer of SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 3 solani AG 2-2 pathogen diagnosis method.
본 발명의 제 5 의 형태는 서열번호 3의 서열를 포함하는 Rhizoctonia solani AG 1-1A 병원균 감염 여부 진단용 방법를 제공한다. 바람직하게는 상기 진단방법은 서열번호 10의 프라이머 및 서열번호 11의 프라이머를 이용하는 특징으로 하는 Rhizoctonia solani AG 1-1A 병원균 진단 방법이다. A fifth aspect of the present invention provides a method for diagnosing infection with Rhizoctonia solani AG 1-1A pathogen comprising the sequence of SEQ ID NO: 3. Preferably, the diagnostic method according to claim Rhizoctonia using a primer and a primer of SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 10 solani AG 1-1A pathogen diagnosis method.
이와 같은 진단은 상기 프라이머를 이용하여 단독으로 수행할 수 있고, 다른 프라이머와의 혼합을 하여 PCR 증폭을 한 후 증폭된 분자량의 크기를 비교하여서 진단할 수 있다. 예를 들어서 본 발명에서 사용하는 서열번호 1 내지 9의 프라이머를 혼합한 튜브를 이용하여 PCR을 수행한 경우에는 Rhizoctonia cerealis 병원균 DNA 마커 200 bp, Rhizoctonia solani AG 2-2 DNA 마커 250 bp, Pythium arrhenomanes DNA 마커 300 bp, Curvularia spp. DNA 마커 650 bp, Sclerotinia homoeocarpa DNA 마커 1000 bp 로 분자크기에 따라 쉽게 분리되어지기 때문에 혼합튜브에서도 어떤 종의 병원균이 감염되었는지 여부를 용이하게 확인할 수 있다. 보다 구체적으로 DNA 중합 효소, 완충용액 및 서열번호 1 내지 9의 프라이머를 포함하는 튜브를 준비하는 단계; 임의의 시료를 상기 튜브와 혼합하는 단계; PCR를 수행하는 단계; 및 전기영동을 수행하여 증폭된 DNA의 크기를 확인하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 Pythium arrhenomanes, Rhizoctonia solani AG 2-2 , Rhizoctonia cerealis , Sclerotinia homoeocarpa 및 Curvularia spp 잔디병원균 감염 동시 진단 방법이다. 증폭된 DNA의 크기를 확인하는 방법은 전기영동 방법으로 한정되지 않는다. 당업자는 다양한 방식으로 DNA의 크기를 확인할 수 있으며, 이와 같은 모든 방법은 본 발명에 이용될 수 있다.Such diagnosis can be performed by using the above primer alone, and it can be diagnosed by comparing with amplified molecular weight after PCR amplification by mixing with other primers. For example, when PCR was carried out using a tube in which the primers of SEQ ID NOS: 1 to 9 used in the present invention were mixed, Rhizoctonia cerealis pathogen DNA marker 200 bp, Rhizoctonia solani AG 2-2 DNA marker 250 bp, Pythium arrhenomanes DNA marker 300 bp, Curvularia spp . DNA marker 650 bp, and Sclerotinia homoeocarpa DNA marker 1000 bp, which are easily separated depending on the molecular size. Therefore, it is easy to determine which species of pathogen has been infected even in a mixed tube. More specifically, the present invention provides a method for preparing a DNA probe, comprising: preparing a DNA polymerase, a buffer solution and a tube containing the primers of SEQ ID NOS: 1 to 9; Mixing an arbitrary sample with the tube; Performing PCR; And Pythium comprising the step of identifying the size of the amplified DNA by performing electrophoresis arrhenomanes , Rhizoctonia solani AG 2-2, Rhizoctonia cerealis , Sclerotinia homoeocarpa and Curvularia spp grass pathogen It is a simultaneous diagnosis method of infection. The method of confirming the size of the amplified DNA is not limited to the electrophoresis method. Those skilled in the art will be able to ascertain the size of the DNA in a variety of ways, and all such methods can be used in the present invention.
본 발명에 따른 프라이머 또는 분자마커는 첫째로 종래 현미경을 통한 병원균의 진단의 오류를 피하고, 진단의 정확성을 높인다. DNA 검출 기술은 99.99% 이상의 적중률을 보이므로 정확도가 훨씬 높다. 또한 복합 튜브에서도 증폭된 DNA 크기를 이용하여 용이하게 병원균을 진단할 수 있다.The primer or molecular marker according to the present invention firstly avoids errors in diagnosis of pathogens through a conventional microscope and improves diagnostic accuracy. DNA detection technology has a higher accuracy than 99.99%. In addition, pathogens can be easily diagnosed by using amplified DNA sizes in complex tubes.
둘째로, 현행 잔디병 분석 시 현미경 관찰 후 원인균 배양 및 잔디 이병부의 최종 관찰 후 병 진단시 10일 정도의 기간이 필요한데 비하여 본 발명은 단일 시료에 대하여 분자표지를 이용할 경우, 2일 이내에 DNA를 추출 후 원인균 확인 및 병 진단이 가능하기에 기존 분석 시간을 80% 이상 단축하여 신속성이 있다.Secondly, in the current grass pest analysis, a period of about 10 days is required for the diagnosis of the causative bacteria after the microscopic observation and the final observation of the grass pustular disease. In comparison with the present invention, Since it is possible to identify pathogenic bacteria and diagnose diseases, it is possible to shorten the existing analysis time by more than 80%.
도 1은 피슘 블라이트 병원균(Pythium arrhenomanes )를 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR 증폭하였 때의 결과를 보인다. M은 100bp의 DNA 마커를 보인다. 여기에서 1번 레인은 Rhizoctonia solani AG 1-1A (Brown patch); 2번 레인은 Pythium arrhenomanes (Pythium Blight); 3번 레인은 Rhizoctonia solani AG 2-2 (라지 패치); 4번 레인은 Curvularia spp. (Leaf Spot); 5번 레인은 Sclerotinia homoeocarpa (Dollar spot); 6번 레인은 Magnaporthe poae(Summer patch)이다.
도 2는 라지패취 병원균(Rhizoctonia solani AG 2-2 )를 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머쌍을 이용하여 PCR 증폭하였을 때의 결과를 보인다. M은 100bp의 DNA 마커를 보인다. 여기에서 1번 레인은 Rhizoctonia solani AG 1-1A (Brown patch); 2번 레인은 Rhizoctonia solani AG 2-2 (Large patch); 3번 레인은 Rhizoctonia cerealis (Spring Dead Spot); 4번 레인은 Curvularia spp. (Leaf Spot); 5번 레인은 Sclerotinia homoeocarpa (Dollar spot); 6번 레인은 Magnaporthe poae(Summer patch)이다.
도 3은 춘고병(Rhizoctonia cerealis) 병원균을 서열번호 5 및 서열번호 6의 프라이머쌍을 이용하여 PCR 증폭하였을 때의 결과를 보인다. M은 100bp의 DNA 마커를 보인다. 여기에서 1번 레인은 Rhizoctonia solani AG 1-1A (브라운 패치); 2번 레인은 Rhizoctonia solani AG 2-2 (라지 패치); 3번 레인은 Fusarium oxysporum; 4번 레인은 Fusarium acuminatum; 5번 레인은 Curvularia spp . (Leaf spot); 6번 레인은 Fusarium longipes; 7번 레인은 Rhizoctonia cerealis(Spring Dead Spot); 8번 레인은 Pythium arrhenomanes (Pythium Blight)이다.
도 4는 달라스팟 병원균(Sclerotinia homoeocarpa)을 서열번호 7의 단일 프라이머를 이용하여 PCR 증폭하였을 때의 결과를 보인다. M은 100bp의 DNA 마커를 보인다. 여기에서 1번 레인은 Rhizoctonia solani AG 1-1A (브라운 패치); 2번 레인은 Rhizoctonia solani AG 2-2 (라지 패치); 3번 레인은 Pythium arrhenomanes (Pythium Blight); 4번 레인은 Rhizoctonia cerealis (Spring Dead Spot ); 5번 레인은 Sclerotinia homoeocarpa ( Dollar Spot); 6번 레인은 Waitea circinata (Waitea Ring patch); 7번 레인은 Curvularia spp.( Leaf Spot)이다.
도 5는 엽고병 병원균 (Curvularia spp.)을 서열번호 8 및 서열번호 9의 프라이머쌍을 이용하여 PCR 증폭하였을 때의 결과를 보인다. M은 100bp의 DNA 마커를 보인다. 여기에서 1번 레인은 Rhizoctonia solani AG 1-1A (Brown patch); 2번 레인은 Rhizoctonia solani AG 2-2 (Large patch); 3번 레인은 Pythium arrhenomanes (Pythium Blight); 4번 레인은 Rhizoctonia cerealis (Spring Dead Spot ); 5번 레인은 Curvularia spp .( Leaf Spot); 6번 레인은 Waitea circinata (Waitea Ring patch)이다.
도 6은 브라운패취 병원균(Rhizoctonia solani AG 1-1A)을 서열번호 10 및 서열번호 11의 프라이머쌍을 이용하여 PCR 증폭하였을 때의 결과를 보인다. M은 100bp의 DNA 마커를 보인다. 여기에서, 1번 레인은 Rhizoctonia solani AG 1-1A (Brown patch); 2번 레인은 Rhizoctonia solani AG 2-2 (Large patch); 3번 레인은 Pythium arrhenomanes (Pythium Blight); 4번 레인은 Rhizoctonia cerealis (Spring Dead Spot ); 5번 레인은 Curvularia spp.( Leaf Spot)이다. Figure 1 is a graph showing the effect of Pythium & arrhenomanes ) were PCR-amplified using the primer pairs of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2. M shows a DNA marker of 100 bp. Here
Fig. 2 shows the results of a comparison of Rhizoctonia solani AG 2-2) was amplified by PCR using the primer pairs of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4. M shows a DNA marker of 100 bp. Here
Figure 3 is a graph cerealis ) pathogens using the primer pairs of SEQ ID NOS: 5 and 6, respectively. M shows a DNA marker of 100 bp. Here
FIG. 4 is a graph showing the distribution of Sclerotinia homoeocarpa ) was subjected to PCR amplification using a single primer of SEQ ID NO: 7. M shows a DNA marker of 100 bp. Here
FIG. 5 shows the results of PCR amplification of Curcuma spp . ( Curvularia spp .) Using the primer pairs of SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 9. M shows a DNA marker of 100 bp. Here
Figure 6 is a graph showing the distribution of the Rhizoctonia solani AG 1-1A) was PCR amplified using the primer pairs of SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 11. M shows a DNA marker of 100 bp. Here,
<< 실시예Example 1> 1> 곰팡이성Mold 잔디병Grass bottle 균주의 분리 및 동정 Isolation and Identification of Strain
전국의 잔디병으로부터 시료를 채취하였고, 잔디 조직 등에서 이들 곰팡이성 병원균을 현미경을 통하여 분리동정하였다. Samples were collected from turf diseases in Korea, and these fungal pathogens were isolated and identified in the lawn tissues through a microscope.
<< 실시예Example 2> 2> 잔디병Grass bottle 원인균의 DNA 정보 분석을 통한 분자표지 확인 Identification of molecular markers by analysis of DNA information of causative bacteria
전국의 잔디병으로부터 시료를 채취하였고, 잔디 조직 등에서 이들 곰팡이성 병원균을 현미경을 통하여 분리동정한 후 DNA 분석을 실시하였다. DNA를 추출 후, 유전자 서열 분석을 하여 병원균 곰팡이의 ITS 부분을 분석하였고 특이적인 프라이머쌍을 찾아내었고 이를 표 1에 나타내었다. Samples were collected from turf diseases in Korea, and these fungal pathogens were isolated and identified through a microscope. After DNA extraction, the gene sequence analysis was performed to analyze the ITS portion of the pathogenic fungus, and specific primer pairs were found and shown in Table 1.
라지패치로부터 분리된 서열번호 3 의 프라이머 서열 및 브라운패치로부터 분리된 서열번호 10의 프라이머 서열이 NCBI의 데이타와 비교한 결과 신규한 서열로 확인이 되었다. 서열번호 3의 프라이머 서열은 처음 2개의 서열이 상이하였고, 서열번호 10의 프라이머 서열은 10번째의 서열이 상이 하였다. 상이한 서열부분을 표 1에서 붉은색으로 표시하였다. The primer sequence of SEQ ID NO: 3 isolated from the large patch and the primer sequence of SEQ ID NO: 10 isolated from the brown patch were compared with the data of NCBI and confirmed as a novel sequence. The primer sequence of SEQ ID NO: 3 was different from the first two sequences, and the primer sequence of SEQ ID NO: 10 was different from the 10th sequence. The different sequence portions are indicated in red in Table 1.
<< 실시예Example 3> 병원성 곰팡이의 진단 3> Diagnosis of pathogenic fungi
잔디병 원인균의 DNA 정보 분석을 위한 분자표지 확인 과정은 다음과 같다. 이병 잔디 조직 등을 현미경 관찰 후 배지에서 곰팡이 원인균을 분리동정하였다. 동정 후 배양된 원인균에서 DNA를 추출하여 재확인 절차를 걷쳤다. 만약에 원인균 배양이 불가능할 경우 감염된 시료에서 DNA를 추출하였다. The molecular marking confirmation process for DNA information analysis of the causative bacteria of grass diseases is as follows. The microorganism was isolated and identified in the medium. After the identification, DNA was extracted from the cultured causative bacteria and the procedure was reaffirmed. If the causative organism was not possible, DNA was extracted from infected samples.
유전자 증폭기를 이용하여 DNA별 분자표지의 증폭정도를 확인하고, 궁극적으로는 각각의 증폭량을 수치화하여 원인균 밀도 변화량을 확인하였다(도 1 내지 6 참조). The degree of amplification of the molecular markers for each DNA was confirmed using a gene amplifier, and ultimately, the amplification amount of each DNA was quantified to confirm the change in the causative bacteria density (see FIGS. 1 to 6).
<110> Samsung C & T corporation <120> Primer specific for grass pathogen and diagnostic method of using thereof <130> PN160060 <160> 11 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pythium arrhenomanes forward primer <400> 1 acgaaggttg tccgcaagtg 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pythium arrhenomanes backward primer <400> 2 gaaagtgcaa tgtgcgttca 20 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Rhizoctonia solani AG 2-2 forward primer <400> 3 agcaaagggt attttggttg t 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Rhizoctonia solani AG 2-2 backward primer <400> 4 agccaagaga tccgttgttg a 21 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Rhizoctonia cerealis forward primer <400> 5 tgaatgtaga gtcggttgta g 21 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Rhizoctonia cerealis backward primer <400> 6 agccaagaga tccgttgttg a 21 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sclerotinia homoeocarpa forward primer <400> 7 agccaagaga tccgttgttg a 21 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Curvularia spp. forward primer <400> 8 tgcaatcagc gtcagtacaa c 21 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Curvularia spp. backward primer <400> 9 gtgctgcgct gcgaaaccag t 21 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Rhizoctonia solani AG 1-1A forward primer <400> 10 tgaggagtta agttgttgct g 21 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Rhizoctonia solani AG 1-1A backward primer <400> 11 agccaagaga tccgttgttg a 21 <110> Samsung C & T corporation <120> Primer specific for grass pathogen and diagnostic method of using the <130> PN160060 <160> 11 <170> KoPatentin 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pythium arrhenomanes forward primer <400> 1 acgaaggttg tccgcaagtg 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pythium arrhenomanes backward primer <400> 2 gaaagtgcaa tgtgcgttca 20 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Rhizoctonia solani AG 2-2 forward primer <400> 3 agcaaagggt attttggttg t 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Rhizoctonia solani AG 2-2 backward primer <400> 4 agccaagaga tccgttgttg a 21 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Rhizoctonia cerealis forward primer <400> 5 tgaatgtaga gtcggttgta g 21 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Rhizoctonia cerealis backward primer <400> 6 agccaagaga tccgttgttg a 21 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sclerotinia homoeocarpa forward primer <400> 7 agccaagaga tccgttgttg a 21 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Curvularia spp. forward primer <400> 8 tgcaatcagc gtcagtacaa c 21 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Curvularia spp. backward primer <400> 9 gtgctgcgct gcgaaaccag t 21 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Rhizoctonia solani AG 1-1A forward primer <400> 10 tgaggagtta agttgttgct g 21 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Rhizoctonia solani AG 1-1A backward primer <400> 11 agccaagaga tccgttgttg a 21
Claims (10)
임의의 시료를 상기 튜브와 혼합하는 단계;
PCR를 수행하는 단계; 및
전기영동을 수행하여 증폭된 DNA의 크기를 확인하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 Pythium arrhenomanes, Rhizoctonia solani AG 2-2 , Rhizoctonia cerealis , Sclerotinia homoeocarpa 및 Curvularia spp 잔디병원균 감염 동시 진단 방법.
A DNA polymerase, a buffer solution, and a primer of SEQ ID NOS: 1 to 9;
Mixing an arbitrary sample with the tube;
Performing PCR; And
Pythium, characterized in that it comprises a step to determine the size of the amplified DNA by performing electrophoresis arrhenomanes , Rhizoctonia solani AG 2-2, Rhizoctonia cerealis , Sclerotinia homoeocarpa and Curvularia spp grass pathogen Simultaneous diagnosis of infection.
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| KR1020160131124A KR101847734B1 (en) | 2016-10-11 | 2016-10-11 | Primer specific for grass pathogen and diagnostic method of using thereof |
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111621590A (en) * | 2020-06-29 | 2020-09-04 | 南京农业大学 | LAMP primer composition for detecting pythium terrestris, kit and detection method thereof |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003519493A (en) | 2000-01-11 | 2003-06-24 | シンジェンタ・パティシペーションズ・アクチェンゲゼルシャフト | PCR based detection of RHIZOCTONACEREALIS |
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Patent Citations (1)
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|---|---|---|---|---|
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Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
| Genbank accession no.AF222793(2000.04.04.) |
| Genbank accession no.HQ877872(2014.01.06.) |
| Genbank accession no.JX913812(2012.12.26.) |
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| Genbank accession no.KR736348(2016.05.31.) |
| Genbank accession no.KT762321(2016.05.05.) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111621590A (en) * | 2020-06-29 | 2020-09-04 | 南京农业大学 | LAMP primer composition for detecting pythium terrestris, kit and detection method thereof |
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