KR101841915B1 - 벤질리덴티아졸-4(5h)-온 유도체 및 이의 용도 - Google Patents

벤질리덴티아졸-4(5h)-온 유도체 및 이의 용도 Download PDF

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장성호
강승규
김정아
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한국화학연구원
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Abstract

본 발명은 신경세포간 신경전달물질 전달 에 중요한 역할을 담당하는 클라트린-매개 엔도시토시스(Clathrin-Mediated Endocytosis, CME)에 대한 억제능이 탁월한 벤질리덴티아졸-4(5H)-온 유도체 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로 클라트린 단백질과 신속하고 정확하게 반응하여, 클라트린 단백질외의 중요 CME 단백질에 대한 상호작용을 차단시켜 CME을 선택적으로 억제시킬 수 있는 후보물질 및 이를 유효성분으로 포함하는 클라트린 단백질 기능 억제 판별용 조성물에 관한 것이다.

Description

벤질리덴티아졸-4(5H)-온 유도체 및 이의 용도{Benzylidenethiazol-4(5H)-one derivatives and use thereof}
본 발명은 벤질리덴티아졸-4(5H)-온 유도체 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로 신경세포간 신경전달물질 전달에 중요한 역할을 담당하는 클라트린-매개 엔도시토시스(Clathrin-Mediated Endocytosis, CME)에 대한 억제능이 탁월한 벤질리덴티아졸-4(5H)-온 유도체 및 이의 용도에 관한 것이다.
클라트린-매개 엔도시토시스(Clathrin-Mediated Endocytosis, CME)는 신경세포간 신경전달물질(Neurotransmitter) 전달 과정에 있어 중요한 역할을 담당 한다. 신경전달물질을 포함하고 있는 시냅스 소낭들은 신경세포의 시냅스 전 말단에서 엑소시토시스(exocytosis)를 통해 신경전달물질을 시냅스 공간으로 분비하는데, 분비된 신경전달물질들은 시냅스 후 말단으로 전달 된다. 이렇게 엑소시토시스 과정을 거친 시냅스 소낭들은 엔도시토시스 과정을 통해 시냅스 전 말단 내로 회수(retrieval) 되어야 하는데, 이때, 클라트린(clathrin)을 통한 엔도시토시스 가 신경세포에서 핵심적인 기전으로 작용한다. 많은 연구를 통해서, CME 외에도 kiss-and-run 또는 bulk endocytosis와 같은 클라트린이 관여하지 않는 엔도시토시스를 통해서도 시냅스낭의 엔도시토시스가 일어날 수 있다고 알려져 있기는 하지만, 실제 CME를 통한 엔도시토시스가 가장 큰 비중을 차지하고 있다.
그 예로, CME과정의 중요성을 알아내기 위해 해마 신경세포에서 RNAi 기법을 이용해 clathrin heavy chain (CHC) 기능을 억제 시켰을 경우, 시냅스 소낭들의 회수 자체가 막히거나 현저하게 감소하는 것으로 나타났다.
신경세포에서 CME는 알츠하이머병의 유발 원인인 베타-아밀로이드 (beta-amyloid, A) 응집 단백질들의 침투 경로로 작용할 수 있다는 보고도 있다. 이런 베타-아밀로이드 단백질들은 신경조직에 대한 파괴나 독성 효과를 나타내며 신경세포의 신호전달에 중요한 축삭돌기를 퇴화시켜 기억 생성 및 저장에 중요한 신경회로를 방해해 알츠하이머병의 주 증상인 기억 상실의 원인으로 작용할 수 있다. 최근 연구 결과에 따르면, 클라트린 저해제로 알려진 Pitstop2로 CME 과정을 차단할 경우 베타-아밀로이드에 의한 신경세포의 축삭 돌기 수 감소를 막을 수 있는 것으로 나타났다.
현재 CME 억제 방법으로는 위에서 언급한대로, RNAi에 의한 유전자 발현 감소나 Pitstop2와 같은 저해제를 처리하고 있다. 하지만 RNAi 기법의 경우, CHC와 같은 특정 유전자 발현이 감소하는데 약 3일 정도 소요되어 그 후 관찰되는 현상이 CME 차단 외에 다른 엔도시토시스 기작이 활성화 되어, 어느 정도 엔도시토시스 기전에 회복되는 것처럼 보일 수 있다는 문제점이 있다. 게다가 상기 Pitstop2의 경우에는, 클라트린과 CME의 중요한 단백질들이 상호작용하는 것을 차단시켜, CME만을 선택적으로 억제시킬 수 있다고 알려져 있었음에도 불구하고, 최근 연구들에서 CME 외에도 클라트린이 관여하지 않는 클라트린-독립성 엔도시토시스(clathrin-independent endocytosis, CIE) 역시 억제 시킨다는 여러 연구 결과가 나오고 있는 상태이다(비특허문헌 1 및 2).
따라서, 관찰되는 어떤 생리학적 현상이 CME에 의해 특정적으로 일어나는가 하는 질문에 답을 찾기 위해서는 CME만을 특정적으로 차단시킬 수 있는 방법이 필요하다. 하지만, 아직까지는 빠른 시간 내에 클라트린을 통한 엔도시토시스 과정을 선택적으로 저해시킬 수 있는 방법은 없으며, 기초 신경/세포 생물학적인 연구와 더불어 알츠하이머병과 같은 신경퇴행성 질환들에 대한 약물을 개발하는데 있어서 클라트린만을 선택적으로 저해할 수 있는 약물 개발이 반드시 필요하다고 할 수 있다.
이에, 본 발명자들은 클라트린 억제에 대한 연구를 거듭한 결과, 신경세포간 신경전달물질 전달 에 중요한 역할을 담당하는 클라트린-매개 엔도시토시스(Clathrin-Mediated Endocytosis, CME)에 대한 억제능이 탁월한 신규의 벤질리덴티아졸-4(5H)-온 유도체 및 이의 용도를 제공하고자 본 발명을 완성하였다.
Dutta D, et al. (2012) Pitstop 2 is a potent inhibitor of clathrin-independent endocytosis. PLos ONE 7(9): e45799 Willox AK, et al. (2014) Non-specificity of Pitstop 2 in clathrin-mediated endocytosis. Biology Open 3(5):326-331
본 발명의 목적은 신규한 벤질리덴티아졸-4(5H)-온 유도체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 벤질리덴티아졸-4(5H)-온 유도체를 유효성분으로 포함하여 클라트린 단백질 기능 억제를 단시간 내에 판별할 수 있을 뿐 아니라 클라트린-매개 엔도시토시스(Clathrin-Mediated Endocytosis, CME)에 대한 선택적 억제능이 탁월한 클라트린 단백질 기능 억제 판별용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 클라트린 단백질 기능 억제 판별용 조성물을 이용하여 클라트린 단백질 기능 억제를 판별하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 신규한 벤질리덴티아졸-4(5H)-온 유도체를 제공한다.
[화학식 1]
Figure 112016099589168-pat00001
[화학식 1에서,
R1은 (C1-C30)알킬, (C1-C30)알콕시, (C2-C30)알케닐, (C2-C30)알키닐, 할로(C1-C30)알킬 또는 할로겐이고;
R2는 수소, (C1-C30)알킬, (C1-C30)알콕시, (C2-C30)알케닐, (C2-C30)알키닐, 할로(C1-C30)알킬 또는 할로겐이다.]
본 발명의 일 실시예에 따른 벤질리덴티아졸-4(5H)-온 유도체는 (C1-C30)알킬, (C1-C30)알콕시, (C2-C30)알케닐, (C2-C30)알키닐, 할로(C1-C30)알킬 및 할로겐에서 선택되는 하나 이상의 치환기로 치환된 아닐린을 벤질리덴티아졸-4(5H)-온의 2번 위치에 가짐에 따라 CME에 대한 억제능이 탁월함을 확인하였다.
본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 벤질리덴티아졸-4(5H)-온 유도체를 포함하는 클라트린 단백질 기능 억제 판별용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 클라트린 단백질 기능 억제 판별용 조성물의 상기 벤질리덴티아졸-4(5H)-온 유도체는 클라트린 단백질과 복합체를 형성하고, 클라트린-독립성 엔도시토시스 억제보다는, 클라트린-매개 엔도시토시스에 대한 높은 선택성을 갖는다.
또한 본 발명은 상기 클라트린 단백질 기능 억제 판별용 조성물을 이용한 클라트린 단백질 기능 억제를 판별하는 방법을 제공한다.
구체적으로, 상기 방법은 생물학적 샘플에 후보물질을 처리하여 클라트린-매개 엔도시토시스 및 클라트린-독립성 엔도시토시스에서의 클라트린 단백질 활성 정도를 측정하는 단계; 및 측정된 클라트린 단백질의 활성 정도를 상기 조성물을 처리한 대조군과 비교하여 후보물질을 선별하는 단계를 포함하는 것일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 따른 클라트린 단백질 기능 억제를 판별하는 방법은 클라트린 단백질 기능 억제용 조성물을 스크리닝하는 방법일 수 있다. 상기의 방법에 의해 선별된 상기 후보물질은 클라트린-매개 엔도시토시스에 대한 클라트린 단백질의 활성 정도가 대조군과 비교하여 감소된 것일 수 있다. 더불어, 상기 후보물질은 클라트린-독립성 엔도시토시스에 대한 클라트린 단백질의 활성 정도가 대조군과 비교하여 동등하거나 증가된 것일 수 있다.
본 발명에 따른 벤질리덴티아졸-4(5H)-온 유도체는 클라트린 단백질 기능 억제에 대한 낮은 작용농도(working concentration)를 가질 뿐 아니라 back ground noise signal을 현저하게 줄일 수 있다. 즉, 본 발명에 따른 벤질리덴티아졸-4(5H)-온 유도체는 클라트린 단백질과 보다 낮은농도에서 단시간 내 복합체를 형성하며, 클라트린 단백질 외 다른 단백질과의 상호작용할 수 있는 기회가 낮아 클라트린-매개 엔도시토시스에 대한 선택성이 탁월하다.
요컨데, 본 발명은 신경/세포 생물학적인 연구와 더불어 알츠하이머병과 같은 신경퇴행성 질환들에 대한 약물을 개발하는데 있어서 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 본 발명에 따른 신규 벤질리덴티아졸-4(5H)-온 유도체와 상기 Pitstop2 간의 농도에 따른 트랜스페린 흡수 정도 비교실험을 통해 클라트린-매개 엔도시토시스의 저해를 나타내고 있는 그래프이다.
도 2는 본 발명에 따른 신규 벤질리덴티아졸-4(5H)-온 유도체와 상기 Pitstop2 간의 선택성 실험 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3은 본 발명에 따른 실시예 8 화합물의 세포독성(DAPI-staining 기법을 사용하여 세포의 핵 모양 변화를 관찰) 결과를 나타낸 것이다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나, 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다. 이하 본 발명에 따른 벤질리덴티아졸-4(5H)-온 유도체 및 이의 용도에 관하여 상세히 설명하기로 한다.
본 발명자들은 RNAi 기법을 이용하여 클라트린 단백질 기능 억제활성을 판별하기 위한 마커를 발굴하기 위하여, 다양한 양태의 벤질리덴티아졸-4(5H)-온 유도체를 실험군 및 대조군(일예, Pitstop2 등)을 선정하고 이로부터 RNA를 추출한 후 마이크로어레이 분석을 통하여 유전자 분석을 수행하였다.
구체적으로, 대조군 대비 우수한 클라트린 단백질 기능 억제활성을 보이는 화합물을 선정하고, 이들 화합물의 공통성을 분석하였다. 그 결과, 하기 화학식 1로 표시되는 벤질리덴티아졸-4(5H)-온 유도체, 즉 벤질리덴의 2번과 4번 위치에 히드록시기를 도입하여, 클라트린 단백질의 binding crevice와의 상호작용을 향상시킬 수 있음을 확인하였다. 더불어, (C1-C30)알킬, (C1-C30)알콕시, (C2-C30)알케닐, (C2-C30)알키닐, 할로(C1-C30)알킬 및 할로겐에서 선택되는 하나 이상의 치환기로 치환된 아닐린을 티아졸온의 2번 위치에 도입됨에 따라 놀랍게도 클라트린-독립성 엔도시토시스 억제보다, 클라트린-매개 엔도시토시스를 더 선택적으로 억제됨을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
[화학식 1]
Figure 112016099589168-pat00002
[화학식 1에서,
R1은 (C1-C30)알킬, (C1-C30)알콕시, (C2-C30)알케닐, (C2-C30)알키닐, 할로(C1-C30)알킬 또는 할로겐이고;
R2는 수소, (C1-C30)알킬, (C1-C30)알콕시, (C2-C30)알케닐, (C2-C30)알키닐, 할로(C1-C30)알킬 또는 할로겐이다.]
본 발명에 기재된 “알킬”, “알콕시” 및 그 외 “알킬”부분을 포함하는 치환체는 직쇄 또는 분쇄 형태를 모두 포함한다.
본 발명에 기재된 단독으로 또는 또다른 기의 일부분으로서 용어 “알케닐”은 2 내지 30개의 탄소 원자 및 1개 이상의 탄소 대 탄소 이중 결합을 함유하는 직쇄, 분지쇄 또는 시클릭 탄화수소 라디칼을 의미한다. 더욱 바람직한 알케닐 라디칼은 2 내지 약 20개의 탄소 원자를 갖는 알케닐 라디칼이다. 가장 바람직한 저급 알케닐 라디칼은 2 내지 약 10개의 탄소 원자를 갖는 라디칼이다. 또한 알케닐기는 임의의 이용가능한 부착지점에서 치환될 수 있다. 알케닐 라디칼의 예로는 에테닐, 프로페닐, 알릴, 프로페닐, 부테닐 및 4-메틸부테닐이 포함된다. 용어 알케닐 및 저급 알케닐 은 시스 및 트란스 배향, 또는 대안적으로, E 및 Z 배향을 갖는 라디칼을 포함한다.
본 발명에 기재된 단독으로 또는 또다른 기의 일부분으로서 용어 “알키닐”은 2 내지 30개의 탄소 원자 및 1개 이상의 탄소 대 탄소 삼중 결합을 함유하는 직쇄, 분지쇄 또는 시클릭 탄화수소 라디칼을 의미한다. 더욱 바람직한 알키닐 라디칼은 2 내지 약 20개의 탄소원자를 갖는 저급 알키닐 라디칼이다. 가장 바람직한 것은 2 내지 약 10개의 탄소 원자를 갖는 저급 알키닐 라디칼이다. 이러한 라디칼의 예로는 프로파르길, 부틴일 등이 포함된다. 또한 알키닐기는 임의의 이용가능한 부착지점에서 치환될 수 있다.
바람직하게 본 발명의 일 실시예에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 벤질리덴티아졸-4(5H)-온 유도체의 R1은 직쇄의 (C1-C30)알킬, 직쇄의 (C1-C30)알콕시 또는 할로겐 등일 수 있으며, 클라트린 단백질과의 높은 반응을 가지는 측면에서, 상기 R1은 직쇄의 (C1-C30)알킬 또는 직쇄의 (C1-C30)알콕시 등이며, 상기 R2는 수소인 것이 본 발명에서 우선되나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 따른 상기 벤질리덴티아졸-4(5H)-온 유도체에 있어서, 상기 R1이 장쇄의 (C5-C30)알킬 또는 (C5-C30)알콕시 등으로 상기 구조에서 페닐의 파라 위치에 치환되거나 R1이 단쇄의 (C1-C4)알킬 또는 (C1-C4)알콕시 등으로 상기 구조에서 페닐의 올쏘 및/또는 메타 위치에 치환될 경우 특히, 클라트린 단백질과의 높은 반응을 보임을 확인하였다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 벤질리덴티아졸-4(5H)-온 유도체는 보다 바람직하게 하기 화학식 2 또는 화학식 3으로 표시되는 것일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
[화학식 2]
Figure 112016099589168-pat00003
[화학식 2에서,
R1은 직쇄의 (C5-C30)알킬 또는 직쇄의 (C5-C30)알콕시이다.]
[화학식 3]
Figure 112016099589168-pat00004
[화학식 3에서,
R1은 직쇄의 (C1-C4)알킬 또는 직쇄의 (C1-C4)알콕시이고;
R2는 수소, (C1-C4)알킬 또는 (C1-C4)알콕시이다.]
본 발명의 일 실시예에 따른 상기 화학식 3에 따른 벤질리덴티아졸-4(5H)-온 유도체에 있어, 상기 R2가 수소이외의 치환체를 가지는 경우 페닐기의 올쏘 또는 메타 위치에 치환되는 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 메타 위치에 치환되는 것이 좋다.
본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 벤질리덴티아졸-4(5H)-온 유도체를 유효성분으로 포함하는 클라트린 단백질 기능 억제 판별용 조성물을 제공한다.
본 발명에서의 용어 “식별 또는 판별”이란, 정량 및/또는 정성 분석을 포함하는 것으로, 존재, 부존재의 검출 및 농도 측정을 포함하는 것으로 이러한 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 당업자라면 본원의 실시를 위해 적절한 방법을 선택할 수 있음은 물론이다.
구체적으로, 본 발명의 일 실시예에 따른 클라트린 단백질 기능 억제 판별용 조성물은 상기 벤질리덴티아졸-4(5H)-온 유도체와 클라트린 단백질과의 복합체 형성으로 클라트린-매개 엔도시토시스를 억제하는 것일 수 있다. 이때, 본 발명에 따른 클라트린 단백질 기능 억제 판별용 조성물은 클라트린-독립성 엔도시토시스 억제보다, 클라트린-매개 엔도시토시스를 더욱 선택적으로 억제하는 것을 특징으로 한다. 즉, 본 발명에 따르면 클라트린-매개 엔도시토시스에 대한 억제 조성물을 선정하기 위한 예측 마커로서 유용하게 활용될 것으로 기대된다.
또한, 본 발명의 일 실시예에 따른 클라트린 단백질 기능 억제 판별용 조성물은 클라트린 단백질과의 반응성이 향상되어, 수시간 내 클라트린 단백질 기능 억제 판별을 가능케 한다. 이때, 본 발명에 따른 클라트린 단백질 기능 억제 판별을 위한 시간은 제한되지는 않으나 0.5 시간 내지 24 시간 이내 일 수 있으며, 바람직하게는 0.5 내지 12 시간, 보다 바람직하게는 0.5 내지 8 시간일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 클라트린 단백질 기능 억제 판별용 조성물은 상기 유효성분 외에 추가적으로 멸균 및 생체에 허용 가능한 첨가제를 1종 이상을 더 포함할 수 있다. 이때, 상기 첨가제의 일예로, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 등의 용매; 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연 당, 옥수수 감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성 검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드 등을 포함하는 결합제; 메틸 셀룰로스, 아가, 벤토니트, 잔탄 검 등의 붕해제; 등을 들 수 있다.
또한, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 통상의 다른 첨가제를 더 첨가할 수 있음은 물론이다.
본 발명의 일 실시예에 따른 클라트린 단백질 기능 억제 판별용 조성물에 사용되는 상기 벤질리덴티아졸-4(5H)-온 유도체는 제한되지는 않으나 전체 조성물 중량을 기준으로, 0.01 내지 5.0 중량%로 포함되는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 상술한 클라트린 단백질 기능 억제 판별용 조성물을 이용하여 클라트린 단백질 기능 억제를 판별하는 방법을 제공한다.
구체적으로, 상기 방법은 생물학적 샘플에 후보물질을 처리하여 클라트린-매개 엔도시토시스 및 클라트린-독립성 엔도시토시스에서의 클라트린 단백질 활성 정도를 측정하는 1단계; 및 측정된 클라트린 단백질의 활성 정도를 상기 조성물을 처리한 대조군과 비교하여 후보물질을 선별하는 2단계;를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 클라트린 단백질 기능 억제를 판별하는 방법에 있어서, 상기 후보물질은 상기 클라트린-매개 엔도시토시스에 대한 클라트린 단백질의 활성 정도가 대조군과 비교하여 감소된 것일 수 있다. 또한, 상기 후보물질은 클라트린-독립성 엔도시토시스에 대한 클라트린 단백질의 활성 정도가 대조군과 비교하여 동등하거나 증가된 것일 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시예에 따른 클라트린 단백질 기능 억제를 판별하는 방법은 해마 신경세포에서 RNAi 기법을 이용해 clathrin heavy chain (CHC) 기능을 억제 시켰을 경우, 시냅스 소낭들의 회수 자체가 막히거나 회수가 현저하게 감소하는 것을 수 시간 내에 신속하게 측정 가능하다.
요컨데, 본 발명에 따른 벤질리덴티아졸-4(5H)-온 유도체는 신경세포간 신경전달물질 전달 에 중요한 역할을 담당하는 클라트린-매개 엔도시토시스에 대한 억제능이 탁월할 뿐 아니라 통계적으로 유의한 경향성을 나타낸다. 즉, 본 발명에 따르면 클라트린-매개 엔도시토시스에 대한 즉각적인 감수성 진단이 가능하여, 향후 적절한 치료가 가능하도록 도울 수 있을 것으로 기대된다.
이하, 실시예를 통해 본 발명을 상세히 설명한다. 단, 하기의 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 제조방법에 의해 제조된 표제화합물은 통상의 추출, 증류, 재결정, 컬럼 크로마토그래피 등으로 추가 정제될 수 있다. 또한, 본 발명에서의 공정, 반응 및 실시예를 기술하는데 사용된 기호 및 규정은 최근의 과학 문헌, 예컨대 문헌 [Journal of the American Chemical Society] 에서 사용되는 것들과 일치한다. 본 발명에서 달리 언급하지 않는 한, 모든 출발물질들은 상업적으로 구입한 것을 추가 정제없이 사용하였으며, 달리 언급하지 않는 한 온도는 모두 ℃ 단위이다. 모든 용매는 달리 언급하지 않는 한 구입한 그대로 사용하였다.
본 발명의 제조방법에 의해 제조된 표제화합물의 구조 분석은 1H 또는 13C-NMR은 제올(Jeol) ECX-400 또는 JNM-LA300 분광계를 이용하여 측정하였다. 화학적 이동은 "ppm(δ 단위)"으로, 결합 상수 (J) 는 "Hz"로 표시하였다. 분리 패턴은 다중도를 나타내며, s(단일), d(2중), t(3중), q(4중), m(다중), br(넓음)로서 표시된다.
또한, 질량 스펙트럼은 하기 기기 중 하나를 이용하여 수득하였다 [Micromass, Quattro LC Triple Quadruple Tandem Mass Spectometer, ESI 또는 Agilent, 1100LC/MSD, ESI].
플래쉬 칼럼 크로마토그래피 분석은 머크(Merck)사의 실리카 겔 60 (230-400 메쉬)를 사용하여 수행하였다. 대부분의 반응은 0.25㎜ 실리카 겔 플레이트(60F-254)의 박층 크로마토그래피 사용하여 5% 에탄올성 포스포몰리브덴산 또는 p-아니스알데하이드 용액을 발색용액으로 사용하거나 UV로 반응의 진행정도를 모니터링하였다.
(실시예 1)
(Z)-5-(2,4-dihydroxybenzylidene)-2-((4-pentylphenyl)amino)thiazol-4(5H)-one (12aj): (KR-67130)
단계1.
Figure 112016099589168-pat00005
상기 화합물 10은 크뇌페나겔 축합 반응(Knoevenagel condensation)을 통해 제조되었다. 화합물 8 (5.0 g, 36.2 mmol, 알데하이드 화합물 8)과 화합물 9(4.2 g, 31.9 mmol, rhodanin 9)을 에탄올(5.0 mL)에 투입하였다. 이에 촉매량의 피페리딘(piperidine)과 DIPEA (0.1 eq, rhodanin 9 1eq 기준)를 투입하였다. 반응 용액을 12시간 동안 환류 교반하였다. 이후 반응 용액을 0 ℃로 하온한 후 헥산 15.0 mL을 반응 용액에 투입하여 침전물을 생성시켰다. 이를 필터한 후 차가운 에탄올을 이용하여 수회 세척하였다. 수득된 고형물을 60 ℃에서, 8시간 동안 건조 한 후 노란색 고체인 화합물 10(5.8 g, 68.3%; Yield)을 수득하였다.
단계2.
Figure 112016099589168-pat00006
상기 단계1에서 수득된 화합물 10 (5.5 g, 21.7 mmol)을 에탄올 4.0 mL에 투입(not soluble)한 후 DIPEA (7.8 mL, 43.4 mmol, 2.0 eq)을 상온(23 ℃)에서 추가 투입하였다(red color precipitate formed). 이후 5분 동안 동일 온도에서 교반하고, iodomethane(1.6 mL, 26.0 mmol, 1.5 eq) 을 천천히 투입하였다. 반응 용액을 12 시간 동안 상온에서 교반하였다. 상기 반응 용액에 헥산 20.0 mL을 투입하여 침전물을 생성시켰다. 이를 필터한 후 차가운 에탄올을 이용하여 수회 세척하였다. 수득된 고형물을 60 ℃에서, 8시간 동안 건조 한 후 노란색 고체인 화합물 11(4.3 g, 74.1%; Yield)을 수득하였다.
단계3.
Figure 112016099589168-pat00007
상기 단계2에서 수득된 화합물 11 (100 mg, 0.3 mmol)을 에탄올 5.0 mL에 투입하고, 4-pentylaniline (73.3 mg, 0.4 mmol)를 추가 투입하였다. 반응 용액을 12 시간동안 환류교반하였다. 상기 반응 용액을 감압증류 한 후 이를 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 분리 정제하였다(Eluent condition: Dichloromethan/Methanol=95:5).
정제된 화합물을 감압증류 한 후 60 ℃에서, 8시간 동안 건조 한 후 노란색 고체인 표제 화합물 12aj(62 mg, 43.3%; Yield)을 수득하였다.
1H- NMR (300 MHz, DMSO- d 6): δ 10.33 (s, 1H), 7.84 (d, 1H, J = 18.9 Hz), 7.66 (s, 1H), 7.21-7.19 (m, 2H), 7.05- 6.94 (m, 2H), 6.40-6.32 (m,2H), 2.53 (d, 2H, J = 8.0 Hz), 1.56 (s, 1H), 1.48-1.29 (m, 4H), 0.86 (s, 3H); 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d 6) δ 161.4 (2C), 159.4, 139.3, 129.7, 129.6 (2C), 129.2, 126.4, 125.4, 121.8, 120.7, 112.9, 108.4, 35.0, 31.4, 31.1, 22.4, 14.3; MS(ESI) m/z Calcd for C21H22N2O3S(M+) Found: 383.0
(실시예 2-13)
표 1에서 나타낸 바와 같이 출발물질을 대체하는 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 공정에 따라 표제화합물을 수득하였으며, 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.
Figure 112016099589168-pat00008
Figure 112016099589168-pat00009
Figure 112016099589168-pat00010
Figure 112016099589168-pat00011
Figure 112016099589168-pat00012
(실시예 14)
상기 실시예 1 내지 실시예 13에서 수득된 표제 화합물을 이용하여 클라트린 단백질 기능 억제 효과를 측정하였다.
1) Primary Screening
Cos-7 세포를 24시간 배양한 후 약물 처리 전 3시간 동안 growth factor-free DMEM(only-DMEM) 미디엄으로 starvation 상태로 유도시켰다. 3시간 후 control 샘플의 경우에는 DMSO 0.1%, 관찰 샘플들의 경우에는 25 μM 농도의 실험 약물을 세포에 30분 동안 처리하였다. 각각의 표제 화합물 처리 후 세포에서 트랜스페린 흡수 정도를 비교하는 transferrin-uptake 실험을 진행하였다. 590~630 nm 형광파장의 Texas-red 형광물질이 달린 트랜스페린을 세포에 처리하여 트랜스페린이 세포 표면 수용체와 결합하도록 유도한 후, 세포 배양 온도에서 20분 동안 세포가 트랜스페린-수용체 복합체를 클라트린-매개 엔도시토시스를 통해 세포내로 들여오게 하였다. 트랜스페린 섭취 과정 후 acid-stripping solution (pH4.5)으로 세포 표면 수용체에 남아 붙어 있는 트랜스페린을 제거시켜준 후 4% paraformaldehye로 세포를 고정시켰다. 이렇게 준비된 세포 샘플에서 형광 현미경을 사용하여 각 세포의 트랜스페린 흡수 정도를 세포면적 100 ㎛2 당 관찰되는 트랜스페린의 수로 분석하였다.
그 결과, 상기 실시예에서 수득된 표제 화합물은 Pitstop2의 작용농도 25μM에서 세포의 트랜스페린 흡수를 억제하는 것을 관찰하였다. 특히, 실시예 1, 4, 8, 10 및 13에서 수득된 표제 화합물의 경우, 트랜스페린 흡수가 효과적으로 억제됨을 확인 할 수 있었다.
2) 농도별 test
25μM에서 세포의 트랜스페린 흡수를 효과적으로 억제하는 상기 실시예 1, 4, 8, 10 및 13에서 수득된 표제 화합물을 선별하고, 이들의 각 농도(2.5, 5, 10, 15, 20 및 25μM) 별 트랜스페린 흡수 억제 정도를 관찰하고, 15μM에서도 억제능이 있는 약물들의 경우에만 IC50를 구하여, 이를 하기 표 1에 도시하였다. 상기 primary screening에서 약물 처리 농도가 추가된 것을 제거하고는 동일한 방법으로 약물의 트랜스페린 흡수 능력을 측정하였다.
그 결과, 도 1에 도시한 바에 따르면, 본 발명에 따른 실시예 8에서 수득된 표제 화합물의 경우, 15μM에서도 트랜스페린 흡수 억제능이 4.3μM로, 그 값이 Pitstop2의 IC50인 12μM보다 현저히 낮은 수치를 보임을 확인하였다. 또한, 상기 실시예 8에서 수득된 표제 화합물의 작용농도를 10μM으로 지정하고 세포에 처리해 봤을 때, 세포독성이 없는 것으로 확인되었으며, 본 발명에 따른 작용농도에서 역시 세포독성이 없는 것으로 확인되었다. 세포독성은 DAPI-staining 기법을 사용하여 세포의 핵 모양 변화를 관찰하여, 하기 도 3에 도시하였다. 이때, 세포독성이 있을 경우의 세포에서는 핵의 모양이 구 모양으로 일정하지 않고 깨져 있는 것으로 나타나며, 세포독성이 없는 경우에는, 핵이 구 모양을 띤다.
도 2는 에 도시한 바에 따르면, 동일 작용농도에서 클라트린-독립 엔도시토시스(CIE) 물질인 MHC1 흡수 정도를 관찰하여 두 그룹간의 CIE에 대한 저해능을 비교한 결과, Pitstop2는 96.43%, 본 발명에 따른 실시예 8에서 수득된 표제 화합물은 34.55%로 확인되었다. 즉, 본 발명에 따르면, 종래 Pitstop2 대비 클라트린-매개 엔도시토시스(CME)에 대한 선택성이 탁월함을 확인할 수 있었다.
(비교예 1)
상기 실시예 14에서 실시예 1 에서 수득된 표제 화합물 대신 하기 구조의 Pitstop2를 사용하는 것을 제외하고는 동일한 방법으로 클라트린 단백질 기능 억제 효과를 측정하였다.
Figure 112016099589168-pat00013
그 결과, Pitstop2는 25 μM에서 세포의 트랜스페린 흡수를 억제하였고, 15 μM에서도 억제능을 보여 IC50를 구한 결과, 그 값이 13.6μM으로 나왔다(하기 표 1 및 도 1 참조). 또한, 클라트린-매개 엔도시토시스(CME)에 대한 선택성에 대한 평가 결과를 하기 도 2에 도시하였다.
Figure 112016099589168-pat00014
요컨데, 본 발명에 따르면 작용농도 내 세포독성을 보이지 않을 뿐 아니라 효과적으로 클라트린 단백질 기능 억제가 가능함과 동시에 이의 억제능이 현저함을 확인할 수 있었다. 또한, 클라트린-매개 엔도시토시스에 대한 선택성에 있어, 종래 Pitstop2 대비 현저하게 향상된 선택성을 보임을 확인 할 수 있었다. 상술된 효과를 가짐에 따라, 본 발명에 따른 벨질리덴티아졸-4(5H)-온 화합물은 신경/세포 생물학적인 연구와 더불어 알츠하이머병과 같은 신경퇴행성 질환들에 대한 약물을 개발하는데 있어서 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

Claims (11)

  1. 하기 화학식 2로 표시되는 화합물.
    [화학식 2]
    Figure 112017108431874-pat00022

    [화학식 2에서,
    R1은 직쇄의 (C5-C30)알킬 또는 직쇄의 (C5-C30)알콕시이다.]
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 시험관(in-vitro) 상의 클라트린 단백질 기능 억제 판별용 조성물.
    [화학식 1]
    Figure 112017108431874-pat00016

    [화학식 1에서,
    R1은 (C1-C30)알킬, (C1-C30)알콕시 또는 할로겐이고;
    R2는 수소, (C1-C30)알킬, (C1-C30)알콕시 또는 할로겐이다.]
  5. 제4항에 있어서,
    상기 화학식 1은 하기 화학식 2로 표시되는 것인 시험관(in-vitro) 상의 클라트린 단백질 기능 억제 판별용 조성물.
    [화학식 2]
    Figure 112017108431874-pat00017

    [화학식 2에서,
    R1은 직쇄의 (C5-C30)알킬 또는 직쇄의 (C5-C30)알콕시이다.]
  6. 제4항에 있어서,
    상기 화학식 1은 하기 화학식 3으로 표시되는 것인 시험관(in-vitro) 상의 클라트린 단백질 기능 억제 판별용 조성물.
    [화학식 3]
    Figure 112017108431874-pat00018

    [화학식 3에서,
    R1은 직쇄의 (C1-C4)알킬 또는 직쇄의 (C1-C4)알콕시이고;
    R2는 수소, (C1-C4)알킬 또는 (C1-C4)알콕시이다.]
  7. 제4항에 있어서,
    상기 벤질리덴티아졸-4(5H)-온 유도체는 클라트린 단백질과 복합체를 형성하고, 클라트린-독립성 엔도시토시스 억제와 무관하게, 클라트린-매개 엔도시토시스를 선택적으로 억제하는 것인 시험관(in-vitro) 상의 클라트린 단백질 기능 억제 판별용 조성물.
  8. 제4항 내지 제7항 중 어느 한 항의 클라트린 단백질 기능 억제 판별용 조성물을 이용하여 시험관(in-vitro)에서 클라트린 단백질 기능 억제를 판별하는 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    생물학적 샘플에 후보물질을 처리하여 클라트린-매개 엔도시토시스 및 클라트린-독립성 엔도시토시스에서의 클라트린 단백질 활성 정도를 측정하는 단계; 및
    측정된 클라트린 단백질의 활성 정도를 상기 조성물을 처리한 대조군과 비교하여 후보물질을 선별하는 단계;를 포함하는 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 후보물질을 선별하는 단계에 있어서,
    클라트린-매개 엔도시토시스에 대한 클라트린 단백질의 활성 정도가 대조군과 비교하여 감소된 후보물질을 선별하는 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 후보물질을 선별하는 단계에 있어서,
    클라트린-독립성 엔도시토시스에 대한 클라트린 단백질의 활성 정도가 대조군과 비교하여 증가된 후보물질을 선별하는 방법.
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