KR101841362B1

KR101841362B1 - 암세포 표적 기능을 갖는 신규 가교 마이셀, 이를 포함하는 약물 전달체 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR101841362B1
Application number: KR1020160138630A
Authority: KR
Inventors: 임권택; 반욱현; 르민콱끙
Original assignee: 부경대학교 산학협력단
Priority date: 2016-10-24
Filing date: 2016-10-24
Publication date: 2018-03-22

Abstract

본 발명은 암세포 표적 기능을 갖는 가교 마이셀, 약물 전달체 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 암세포 표적 기능을 갖는 가교 마이셀 및 약물 전달체는 디엘스-알더 클릭반응에 의하여 간편하게 제조될 수 있고, 암세포를 특이적으로 타겟팅하여, 약물을 방출함으로써, 암세포를 특이적으로 사멸시킬 수 있어, 이를 제약분야에 유용하게 사용할 수 있다.

Description

암세포 표적 기능을 갖는 신규 가교 마이셀, 이를 포함하는 약물 전달체 및 이의 제조방법{Novel cross-linked micelles, drug delivery carrier targeting cancer cell and method for preparing the same}

본 발명은 암세포 표적 기능을 갖는 가교 마이셀, 약물 전달체 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

최근 몇 년간 코어-쉘(core-shell) 구조에 기초한 고분자 마이셀(micelle)은 그것의 장점인 소수성 약물 용해도, 장기간 순환 시간 및 특정 조직 표적성 때문에 광범위하게 연구되어 왔다. 양친매성(amphiphilic)블록 공중합체(block copolymer)의 코어-쉘 형식의 구조는 불용성 코어와 수용성 코로나(corona)로 이루어져 있다. 고분자 마이셀은 통상적으로 크기가 수십 나노미터 범위로서 증진된 투과 및 유지 (Enhanced Permeability and Retention, EPR) 효과에 적합하다. EPR 효과는 40 내지 200 나노미터 범위 크기의 분자들이 정상 세포보다 암세포에 크게 축적되는 특징이다. 다시 말하자면, 정상 세포가 있는 쪽은 혈관과의 경계가 촘촘한데 비하여 빠른 성장을 하는 암세포가 있는 쪽은 혈관과의 경계가 느슨하므로, 이러한 크기의 분자나 입자는 정상 세포 쪽은 뚫지 못하는 반면에 암조직 쪽 혈관벽은 잘 통과해서 암세포로 전달되어 축적이 되는 현상으로 암세포에 대한 약물전달에 효과적으로 활용된다.

그러나 마이셀 고유의 불안정성은 많은 응용에 앞서 상당한 문제점 되어 왔다. 즉, 고분자 마이셀은 혈액순환 도중에 매우 희석된 농도에서 단일체(unimer)로 서로 떨어져 밖으로 빠져나갈 수 있다. 이것은 표적 방출을 이루지 못하고 일반 생체 조직에 독성을 일으킬 수 있다. 따라서 고분자 마이셀의 안정성 향상은 최근 많은 연구가 진행 중인 시급한 문제이다.

마이셀의 가교는 자기조립구조의 안정화를 위한 가장 뛰어난 방법으로 알려져 있다. 최근에 마이셀 가교화 기술의 커다란 발전에 의하여 나노운반체의 안정성을 강화시킬 뿐만 아니라 마이셀의 약물방출을 조절할 수 있다. 친수성 쉘의 가교화는 약물전달 시스템의 잠행에 영향을 미치고 친수성기의 이동성에 영향을 주고, 불필요한 마이셀 간 가교화를 피할 수 없다. 반면에 마이셀의 코어 가교화(Core Cross-Linked, CCL)는 점점 매력적인 방법이 되어가고 있는데, 이것은 산화 환원 환경에서 가교 결합이 역반응 또는 분해가 가능하여 내부 활성 물질의 방출을 향상시킨다. 코어 가교된 마이셀은, 감광성 블록 공중합체의 UV조사와 금속-리간드 배위 결합과 같은 다양한 방법들에 의해 만들어질 수 있다. 이러한 마이셀들은 UV/NIR 광 조사 또는 pH 변화에 따라 약물을 방출할 수 있다.

한편, "클릭화학(click chemistry)" 종류의 한 가지인 디엘스-알더 반응(Diels-Alder reaction)으로서, 매우 낮은 에너지로도 사이클로헥센 고리를 형성할 수 있고 수많은 분자의 형성과 기능화를 가능하게 한다. 디엘스-알더 반응은 탄소-탄소간 결합뿐만 아니라 헤테로원자-헤테로원자간 결합(hetero-Diels-Alder)을 형성할 수 있고 육각고리 합성에 널리 이용된다. 또한 클릭화학 반응은 열가역성 및 온도에 따라 조절이 가능한 고리계 시스템의 분해가 가능한 매력적인 특징을 가지고 있다. 현재 클릭화학 반응은 다양한 분야에 적용되고 있는데, 예를 들면 클릭화학을 이용한 약물 전달 시스템 및 생체 물질의 디자인을 위한 강력한 도구(M Gregoritza, FP Brandl, 등, Eur J Pharm Biopharm. 97: 438-453, 2015); 클릭화학을 이용한 고분자와 생체 물질에의 응용(MA Tasdelen, Polym. Chem. 2.(10): 2133-2145, 2011); 클릭화학을 이용한 탄소 소재 합성과 표면 관능화 등의 연구가 지속적으로 이루어지고 있다.

이와 관련된 특허문헌을 살펴 보면 대한민국 공개특허공보 제2009-0076856호에서 '암의 진단과 치료를 동시에 수행하는 항암제'에 대하여 기재하고 있으며, 대한민국 공개특허공보 제2011-0102995 호에서 '암세포 선택성을 갖고 체내에서 장기 순환하는 미셀형 백금착물 항암제 및 그 제조 방법'에 대하여 기재하고 있다.

대한민국 공개특허 제2009-0076856호 대한민국 공개특허 제2011-0102995호

본 발명의 목적은 암세포 표적 기능을 갖는 가교 마이셀을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 마이셀 및 약물을 포함하는 약물전달체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 약물전달체를 위한 가교제를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 약물전달체의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 일 구현예에서는 친수성 부분 및 소수성 부분을 포함하는 양친매성 고분자 중합체; 및 상기 고분자 중합체와 퓨란기-말레이미드기 화학결합으로 결합되며 이황화결합을 포함하는 가교제;를 포함하는 암세포 표적 기능을 갖는 가교 마이셀을 제공한다.

상기 마이셀은 친수성 쉘; 및 소수성 코어;로 이루어 질 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서,

상기 고분자 중합체는 퓨란기를 포함하고, 상기 가교제는 말레이미드기를 포함하는 것일 수 있고, 반대로 상기 고분자 중합체는 말레이드기를 포함하고, 상기 가교제는 퓨란기를 포함한 것일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예에서,

상기 가교제는 하기 화학식 1로 표시되는 것일 수 있다.

[화학식 1]

n 및 m은 독립적으로 1-20의 정수이다.

본 발명의 다른 구현예에서,

상기 가교제는 다이티오-비스말레이미도에테인(Dithio-bismaleimidoethane;DTME)인 것일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예에서

상기 고분자 중합체의 친수성 부분은 폴리(에틸렌 옥사이드), 폴리(올리고(에틸렌 글리콜)메틸 이터 메타크릴레이트) 및 폴리(2-다이메틸아미노)에틸 메타크릴레이트)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예에서,

상기 고분자 중합체의 소수성 부분은 상기 고분자 중합체의 소수성 부분은 폴리(푸르푸릴 메타아크릴레이트), 폴리(스티렌-alt-말레익 안히드리드), 폴리(α-프로파길 카복실레이트-ε-카프롤락톤), 폴리(α-프로파길-ε-카프롤락톤), 폴리(아자이도 ε-카프롤락톤-co-ε-카프롤락톤), 폴리(아자이도 ε-카프롤락톤), 폴리(γ-프로파길-글루타메이트), 폴리(5-(4-(프로프-2-아인-1-일옥시)벤질)-1,3-다이옥소란-2,4-다이온(티로신(알카인일)-OCA), 폴리(N-(프로프-2-아인-1-일)아크릴아미드), 폴리(N-(3-아자이도프로필)아크릴아미드), 폴리(1-에타인일-4-바이닐벤젠), 폴리(γ-아자이도-프로필-L-글루타메이트) 및 폴리(프로파길 아크릴레이트)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예에서,

상기 고분자 중합체는 퓨란기 또는 말레이미드기를 포함하는 폴리(에틸렌 옥사이드)-b-폴리(푸르푸릴 메타아크릴레이트)인 것일 수 있다.

상기 고분자 중합체는 퓨란기 또는 말레이미드기를 포함하는 폴리(에틸렌 옥사이드)-b-폴리(스티렌-alt-말레익 안히드리드) 인 것일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예에서,

본원 발명의 가교 마이셀; 및 상기 가교 마이셀 내에 도입된 약물을 포함하는 암세포 표적 기능을 갖는 약물 전달체를 제공한다.

상기 약물은 독소루비신(doxorubicin), 프레드니솔론 21-아세테이트(prednisolone 21-acetate), 파클리탁셀(paclitaxel), 레티노익 산(retinoic acid)계열, 시스플라틴(cis-platin), 캄토세신(camptothecin), Fluorouracil(5-FU), 도세탁셀(Docetaxel), 타목시펜(Tamoxifen), 아나스테로졸(anasterozole), 카보플라틴(carboplatin), 토포테칸(topotecan), 베로테칸(belotecan), 이리노테칸(irinotecan), 글리벡(gleevec), 빈크리스틴(vincristine), 아스피린(aspirin), 살리실레이트(salicylates), 이부프로펜(ibuprofen), 나프로센(naproxen), 페노프로펜(fenoprofen), 인도메타신(indomethacin), 페닐부타존(phenyltazone), 메소트렉세이트(methotrexate), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 메클로에타민(mechlorethamine), 덱사메타손(dexamethasone), 프레드니솔론(prednisolone), 셀레콕시브(celecoxib), 발데콕시브(valdecoxib), 니메슐리드(nimesulide), 코르티손(cortisone) 및 코르티코스테로이드(corticosteroid)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.

또한, 본 발명의 다른 구현예에서,

하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 암세포 표적 기능을 갖는 가교 마이셀을 위한 가교제를 제공한다.

[화학식 1]

n 및 m은 독립적으로 1-20의 정수이다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 화합물은 다이티오-비스말레이미도에테인(Dithio-bismaleimidoethane;DTME)인 것인, 가교제를 제공한다.

본 발명의 일 구현예에서,

상기 약물전달체를 제조하는 방법에 있어서,

1)친수성 부분 및 소수성 부분을 포함하며 퓨란기를 포함하는 양친매성 고분자 중합체를 제조하는 단계;

2)상기 고분자 중합체에 약물을 도입하는 단계;

3)이황화 결합 및 말레이미드기를 포함하는 가교제를 제조하는 단계; 및

4)상기 약물이 도입된 고분자 중합체 및 상기 가교제를 혼합하여 반응하는 단계;를 포함하는 암세포 표적 기능을 갖는 약물전달체의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에서,

상기 1)단계는 RAFT 중합반응 또는 ATRP 분자 조절 중합반응을 통하여 고분자 중합체를 제조할 수 있다.

상기 1) 단계에서 친수성 부분은 폴리(에틸렌 옥사이드), 폴리(올리고(에틸렌 글리콜)메틸 이터 메타크릴레이트) 및 폴리(2-다이메틸아미노)에틸 메타크릴레이트)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상이며, 소수성 부분은 폴리(푸르푸릴 메타아크릴레이트), 폴리(스티렌-alt-말레익 안히드리드), 폴리(α-프로파길 카복실레이트-ε-카프롤락톤), 폴리(α-프로파길-ε-카프롤락톤), 폴리(아자이도 ε-카프롤락톤-co-ε-카프롤락톤), 폴리(아자이도 ε-카프롤락톤), 폴리(γ-프로파길-글루타메이트), 폴리(5-(4-(프로프-2-아인-1-일옥시)벤질)-1,3-다이옥소란-2,4-다이온(티로신(알카인일)-OCA), 폴리(N-(프로프-2-아인-1-일)아크릴아미드), 폴리(N-(3-아자이도프로필)아크릴아미드), 폴리(1-에타인일-4-바이닐벤젠), 폴리(γ-아자이도-프로필-L-글루타메이트) 및 폴리(프로파길 아크릴레이트)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서,

상기 2) 단계의 약물은 독소루비신(doxorubicin), 프레드니솔론 21-아세테이트(prednisolone 21-acetate), 파클리탁셀(paclitaxel), 레티노익 산(retinoic acid)계열, 시스플라틴(cis-platin), 캄토세신(camptothecin), Fluorouracil(5-FU), 도세탁셀(Docetaxel), 타목시펜(Tamoxifen), 아나스테로졸(anasterozole), 카보플라틴(carboplatin), 토포테칸(topotecan), 베로테칸(belotecan), 이리노테칸(irinotecan), 글리벡(gleevec), 빈크리스틴(vincristine), 아스피린(aspirin), 살리실레이트(salicylates), 이부프로펜(ibuprofen), 나프로센(naproxen), 페노프로펜(fenoprofen), 인도메타신(indomethacin), 페닐부타존(phenyltazone), 메소트렉세이트(methotrexate), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 메클로에타민(mechlorethamine), 덱사메타손(dexamethasone), 프레드니솔론(prednisolone), 셀레콕시브(celecoxib), 발데콕시브(valdecoxib), 니메슐리드(nimesulide), 코르티손(cortisone) 및 코르티코스테로이드(corticosteroid)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서,

상기 3)단계의 가교제는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물일 수 있으며, 바람직하게는 다이티오-비스말레이미도에테인일 수 있다.

[화학식 1]

n 및 m은 독립적으로 1-20의 정수이다.

본 발명의 암세포 표적 기능을 갖는 약물 전달체는 클릭반응, 특히 디엘스-알더 반응(Diels-Alder reaction)에 의하여 간편하게 제조될 수 있고, 암세포를 특이적으로 타겟팅하여, 약물을 방출함으로써, 암세포를 특이적으로 사멸시킬 수 있어, 이를 제약분야에 유용하게 사용할 수 있다.

도 1은 PEO-b-PFMA-N3 (폴리(에틸렌 옥사이드)-b-폴리(푸르푸릴 메타아크릴레이트)) 블록 공중합체의 합성 및 퓨란기 도입 과정을 나타낸 도이다.
도 2은 PEO-b-PSMA (폴리(에틸렌 옥사이드)-b-폴리(스티렌-alt-말레익 안히드리드)) 블록 공중합체의 합성, 퓨란기 도입, 약물 탑재 과정을 나타낸 도이다.
도 3는 다이티오-비스말레이미도에테인의 1H NMR 스펙트럼을 나타낸 도이다.
도 4는 (a) PEO, (b) PEO-RAFT, (c) PEO-b-PFMA 및 (d) 코어 가교된 PEO-b-PFMA의 FT-IR 스펙트럼 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 (a) PEO, (b) PEO-RAFT, (c) PEO-b-PFMA 및 (d) 코어 가교된 PEO-b-PFMA의 1H NMR 스펙트럼을 나타낸 도이다.
도 6은 (a) 코어가 가교되지 않은 마이셀 및 (b) 코어가 가교된 마이셀의 역학적 직경의 변화를 DLS를 통해 측정한 결과를 나타낸 도이다. 그리고 (c) 코어가 가교되지 않은 마이셀 및 (d) 코어가 가교된 마이셀의 크기와 형태를 TEM을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 코어가 가교된 마이셀(실시예 1의 마이셀) 및 가교되지 않은 마이셀의 용매에서 희석시간에 따른 직경의 변화 분석결과를 나타낸 도이다.
도 8은 서로 다른 DTT 농도와 pH에 따른 실시예 1의 마이셀로부터 시험관내 약물의 방출 그래프를 나타낸 도이다.
도 9는 (a) 빈 마이셀에 대한 HEK293과 (b) PEO-b-PFMA-DOX 마이셀에 대한 HepG2 세포의 24시간 동안 세포 생존율 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 10은 (a-c) 치료받지 않은 세포, (d-f) 8시간 인큐베이션 후의 자유 DOX, (g-i) 8시간 인큐베이션 후의 PEO-b-PFMA-DOX의 마이셀, (j-l) 16시간 인큐베이션 후의 자유 DOX와 (m-o) 16시간 인큐베이션 후의 PEO-b-PFMA-DOX의 세포독성을 평가하기 위하여 24시간 동안 HepG2세포의 세포 생존율 분석 결과를 나타낸 도이다.

이하, 본 발명의 실시형태를 설명한다. 그러나 본 발명의 실시형태는 여러 가지의 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 이하 설명하는 실시형태로만 한정되는 것은 아니다.

본 명세서 전체에서 포함 또는 함유라 함은 어떤 구성 요소를 별다른 제한 없이 포함함을 지칭하며, 다른 구성 요소의 부가를 배제 또는 제외하는 것으로 해석될 수 없다.

본 명세서 전체에서 명시적인 언급이 없는 한, 전문 용어는 단지 특정 구현예를 언급하기 위한 것이며, 본 발명을 한정하는 것을 의도하지 않는다. 또한, 여기서 사용되는 단수 형태들은 문구들이 이와 명백한 반대의 의미를 나타내지 않는 한 복수 형태들도 포함한다.

상기 "퓨란"은 furan을 의미하며 일반적으로 원자간의 삼중결합을 갖는 화합물을 큰 범주에서 지칭하며 이에 한정되지 않는다.

상기 퓨란-말레이미드 화합결합은 클릭 반응, 특히 디엘스-알더 반응(Diels-Alder reaction)으로 결합되나, 이에 한정되지는 않는다.

본 발명의 일 구현예에서,

본 발명의 다른 구현예에서,

상기 가교제는 하기 화학식 1로 표시되는 것일 수 있다.

[화학식 1]

n 및 m은 독립적으로 1-20의 정수이다.

본 발명의 다른 구현예에서,

본 발명의 다른 구현예에서

본 발명의 다른 구현예에서,

또한, 본 발명의 다른 구현예에서,

[화학식 1]

n 및 m은 독립적으로 1-20의 정수이다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 화합물은 다이티오-비스말레이미도에테인(Dithio-bismaleimidoethane;DTME)인 것인, 가교제.

본 발명의 일 구현예에서,

상기 약물전달체를 제조하는 방법에 있어서,

2)상기 고분자 중합체에 약물을 도입하는 단계;

본 발명의 일 구현예에서,

상기 1)단계는 RAFT 중합반응 또는 ATRP 분자 조절 중합반응을 통하여 고분자 중합체를 제조할 수 있다. 상기 RAFT 중합반응은 Reversible Addition-Fragmentation Chain Transfer polymerization을 의미하며, ATRP 분자 조절 중합반응은 atom transfer radical polymerization를 의미한다.

상기 1) 단계에서 친수성 부분은 폴리(에틸렌 옥사이드), 폴리(스티렌-alt-말레익 안히드리드), 폴리(올리고(에틸렌 글리콜)메틸 이터 메타크릴레이트) 및 폴리(2-다이메틸아미노)에틸 메타크릴레이트)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상이며, 소수성 부분은 폴리(푸르푸릴 메타아크릴레이트), 폴리(α-프로파길 카복실레이트-ε-카프롤락톤), 폴리(α-프로파길-ε-카프롤락톤), 폴리(아자이도 ε-카프롤락톤-co-ε-카프롤락톤), 폴리(아자이도 ε-카프롤락톤), 폴리(γ-프로파길-글루타메이트), 폴리(5-(4-(프로프-2-아인-1-일옥시)벤질)-1,3-다이옥소란-2,4-다이온(티로신(알카인일)-OCA), 폴리(N-(프로프-2-아인-1-일)아크릴아미드), 폴리(N-(3-아자이도프로필)아크릴아미드), 폴리(1-에타인일-4-바이닐벤젠), 폴리(γ-아자이도-프로필-L-글루타메이트) 및 폴리(프로파길 아크릴레이트)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서,

[화학식 1]

n 및 m은 독립적으로 1-20의 정수이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예 등을 제시한다. 그러나 하기의 실시예 등은 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예 등에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. PEO(폴리에틸렌옥사이드)-b-PFMA(폴리푸르푸릴메타아크릴레이트)(블록 공중합체), 다이티오-비스말레이미도에테인(가교제) 및 독소루비신(DOX)(약물)을 포함하는 가교 마이셀의 제조

1-1. PEO -b- PFMA 블록 공중합체의 합성

PEO-b-PFMA 블록 공중합체를 PEO-RAFT 매크로 개시제(macro initiator)를 이용한 RAFT를 통해 합성되었다. 일반적인 과정은, PEO-RAFT(1.07 g, 0.20 mmol), FMA(0.354 g, 2.06 mmol), AIBN(0.008 g, 0.05 mmol) 및 틀루엔(toluene; 4.0 mL)을 둥근플라스크에 넣은 뒤 30분간 질소치환하고 90℃의 오일 bath안에서 24시간 동안 교반하였다. 이후, 생성물을 THF에 용해시키고 과량의 에틸 에터(ethyl ether)에 침전시켜 정제하였다. 고분자를 40℃ 진공 오븐에서 밤새 건조시켰다(1.17g, 수율 82%). 상기 PEO-b-PFMA 블록 공중합체의 합성 과정을 도 1에 나타내었으며, 반응조건별로 생성된 중합체의 특성치를 표 1에 정리하였다.

No.	Polymers	Feed ratio^a [M]_FMA/ [M]_PEO _-RAFT	Conversion ^b (%)	M_n,Theo _. (g.mol^-1)	M_n,HNMR (g.mol^-1)	M_n,GPC (g.mol^-1)	PDI (GPC)
1	PEO₁₁₃	-	-	-	-	5000	1.10
2	PEO₁₁₃-RAFT	-	-	-	-	5400	1.09
3	PEO₁₁₃-b-PFMA₉	10:1	82	6800	6800	5800	1.22
4	PEO₁₁₃-b-PFMA₁₈	21:1	88	8400	8300	6000	1.31
5	PEO₁₁₃-b-PFMA₂₇	31:1	89	10000	9800	6900	1.33
6	PEO₁₁₃-b-PFMA₃₆	41:1	90	11300	11 200	7 700	1.37

^a Polymerization was carried out at 90 ^oC for 24h. Molar ratio [PEO₁₁₃-RAFT]:[AIBN]=4:1.

^b Conversion was determined gravimetrically.

1-2.다이티오-비스말레이미도에테인(Dithio-bismaleimidoethane;DTME)(가교제)의 합성

시스타민 다이하이드로클로라이드(Cystamine dihydrochloride)는 메탄올 용액내의 수산화 칼륨에 의하여 다이아민화(diamine)하였다. 시스타민(cystamine)(1.26g, 8.25mmol)은 25mL의 아세톤에 용해되었고 무수 말레인산(maleic anhydride)(1.98g, 20.2mmol)을 혼합물에 첨가하여 1시간 동안 교반하였다. 그 후 트리에틸아마인(triethylamine)(0.75mL, 5.4mmol), 소듐 아세테이트(sodium acetate)(10mg, 0.12mmol)과 아세트산무수물(acetic anhyride)(2.5mL, 26.5mmol)을 반응 혼합물에 첨가하였다. 그리고 온도를 올리고 3시간 동안 환류한 뒤 아세톤을 증발시켰다. 생성물을 컬럼 크로마토그래피(column chromatography)로 정제하였다. 1H NMR (400 MHz, CHLOROFORM-D) δ 6.70 (m, 4H), 3.84 (t, J = 6.7 Hz, 4H), 2.92 (t, J = 6.7 Hz, 4H).

상기 합성된 다이티오-비스말레이미도에테인의 1H NMR 스펙트럼을 도 2에 나타내었다.

1-3. PEO -b- PFMA 블록 공중합체의 약물( DOX ) 담지 마이셀의 제조

먼저, 1:3 몰비율을 가지는 DOX.HCl과 트리에틸아마인을 DMSO에 용해하였다. DOX 용액은 아미노 그룹을 탈 양성자화하기 위하여 하루 동안 교반하였다. 그리고 DOX(100㎕의 용액, 1mg), DTME(0.66mg, 2.12 × 10^- ³ mmol)과 PEO-b-PFMA(6.6mg, furfuryl 잔기의 0.018mmol)를 1mL의 DMSO에 균일하게 용해하였다. 그리고 PBS(pH 7.4, 5.0mL, 10mM)를 1시간 동안 격렬하게 교반하면서 적하하였다. 그 후, 용액은 마이셀 중심부의 가교를 위해 온도를 60℃로 올렸다. 이후 형성된 용액을 투석막 튜브 (MW cutoff, 3 kDa)에 옮기고, 정제수 1L에 넣고 2시간마다 정제수를 갈아주고 하루 동안 투석을 하였다.

실시예 2. PEO(폴리에틸렌옥사이드)-b-PSMA(폴리(스티렌-alt-말레익 안히드리드)) (블록 공중합체), 다이티오-비스말레이미도에테인(가교제) 및 독소루비신(DOX)(약물)을 포함하는 가교 마이셀의 제조

2-1. PEO-b-PSMA 블록 공중합체의 합성

PEO-b-PSMA 블록 공중합체를 PEO-RAFT 매크로 개시제(macro initiator)를 이용한 RAFT를 통해 합성되었다. 일반적인 과정은, P EO-RAFT(0.53g, 0.10 mmol), 스티렌(0.52g, 5 mmol), 말레익 안히드리드(maleic anhydride; 0.49 g, 5mmol), AIBN(0.008 g, 0.05mmol) 및 1,4-디옥산 (1,4-dioxane; 5.0 mL)을 둥근 플라스크에 넣은 뒤 30분간 질소치환하고 60℃의 오일 bath안에서 4시간 동안 교반하였다. 이 후, 생성물을 THF에 용해시키고 과량의 헥산(hexane)에 침전시켜 정제하였다. 고분자를 40℃ 진공오븐에서 12시간 건조시켰다(1.46g, 수율 952%). 반응 조건 별로 생성된 중합체의 특성치를 표 2에 정리하였다.

Entry	Polymer	Feeding ratio ^a [S]/[MA]/[RAFT]	Conversion^b (%)	M_n,Theo _. (g.mol^-1)	M_n,NMR (g.mol^-1)	M_n,GPC (g.mol^-1)	PDI (GPC)
1	PEO-RAFT	-	-	5350	-	9 200	1.06
2	PEO-b-PSMA0	30:30:1	69.9	9 600		17 800	1.19
3	PEO-b-PSMA1	50:50:1	69.2	12 300	12 400	20 500	1.21
4	PEO-b-PSMA2	75:75:1	87.5	19 200		26 400	1.24
5	PEO-b-PSMA3	100:100:1	95.7	24 700		35 100	1.29
6	PEO-b-PSMA4	150:150:1	98	34 800		41 300	1.39

^a Polymerization was carried out at 60 ^oC for 4h. Molar ratio [PEO₁₁₃-RAFT]:[AIBN] = 2:1.

^b Conversion was determined gravimetrically.

2-2. PEO -b- PSMA 블록공중합체의 푸르푸릴 작용기 도입

PEO-b-PSMA 블록공중합체는 푸르푸릴 아민과 히드라진 히드레이트를 사용하여 다음과 같이 기능화 하였다. 푸르푸릴 아민 (furfuryl amine; 0.13 g, 1.3 mmol) 을 DMF (12 mL)에 용해시킨다. PEO-b-PSMA (0.96 g, 말레익 안히드리드 잔기의 2.7 mmol)를 반응기를 50℃의 오일 bath안에서 7시간 동안 교반하였다. 반응물을 상온으로 냉각한 후 히드라진 (hydrazine; 0.11mL,2.8mmol) 을 첨가하고 상온에서 추가적으로 17시간 반응하였다. 푸르푸릴 작용기가 도입된 생성물 (PEO-b-PSMA-FA-H)을 에틸 에터에 침전시켜 정제하였다. 고분자를 40℃ 진공오븐에서 12시간 건조시켰다.

2-3. PEO -b- PSMA 블록 공중합체의 약물( DOX ) 담지 및 가교 마이셀의 제조

DOX.HCl (3mg), DTME(1,25mg, 4x10^-3mmol)) 과 PEO-b-PSMA-FA-H (13.5mg) 을 2 mL의 DMF에 용해하였다. 혼합물을 37℃에서 36시간 동안 교반하였다. 그 후 PBS(pH7.4, 10.0mL, 10mM)를 1시간 동안 격렬하게 교반하면서 적하하였다. 용액을 투석막 튜브(MW cutoff, 3 kDa)에 옮기고, 정제수 1L에 넣고 2시간마다 정제수를 갈아주고 하루동안 투석을 하였다. 탑재되지 않은 DOX를 제거하기 위하여 용액을 2500 rpm에서 20분 동안 초원심 분리하였다. 탑재된 DOX의 질량은 UV-Visible 분광 분석기를 사용하여 485 nm에서의 표준 특성 곡선으로 계산하였다. 약물탑재량 (DLC)와 약물탑재율(DLE)는 다음 식에 의하여 계산하였다.

DLC(%) = (나노입자에 탑재된 약물의 무게 /약물탑재한 나노입자 전체의 무게) x 100

DLE(%) = (나노입자에 탑재된 약물의 무게/사용한 약물의 무게) x 100

상기 DOX 담지된 PEO-b-PSMA 블록 공중합체의 합성 과정을 도 2에 나타내었다.

상기 DOX 담지된 PEO-b-PSMA 블록 공중합체의 DLC 및 DLE 값을 표 2에 나타내었다.

Entry	Type5	Drug feeding (wt %)	DLC (wt %)	DLE (wt %)
1	코어가교마이셀	18.2	14.5	76.3
2	코어가교마이셀	25.0	19.7	73.7
3	코어가교마이셀	40.0	31.2	67.9
4	코어가교마이셀	50.0	38.1	61.7
5	미가교마이셀	18.2	14.4	75.9

실험예 1. 실시예 1의 마이셀에 대한 FT-IR 분광 분석

고분자 합성과 마이셀 형성을 확인하기 위하여 FT-IR 분광 분석을 하였다. (a) PEO, (b) PEO-RAFT, (c) PEO-b-PFMA 및 (d) 코어 가교된 PEO-b-PFMA의 FT-IR 스펙트럼 결과를 도 4에 나타내었다.

도 3에 나타난 바와 같이, RAFT 제제의 잔기는 1730cm^-1의 에스터 바이브레이션 밴드(ester vibration band)에 의해서 식별될 수 있었다. PEO-b-PFMA 공중합체의 퓨란(furan) 고리 바이브레이션 밴드는 600 및 750cm^-1에서 나타났다. 1730-1115cm^-1에서 보이는 흡수 밴드는 PFMA 부분의 에스터(ester)와 에테르(ether)결합의 진동으로 판단된다. 그러나, 이러한 밴드 특징들은 PEO-RAFT 매크로 개시제의 메틸렌 진동과 함께 중첩되어서 FT-IR 스펙트럼에서 독립적으로 관찰할 수는 없다. DA 반응 후, PEO-b-PFMA의 CCL마이셀은 1700cm^-1에서 새로운 흡수 파장대에서 나타났다. 이는 가교제 내에 말레이미드(maleimide) 고리의 밸런스 바이브레이션을 암시한다. 게다가 CCL마이셀의 FT-IR 분광 분석은 750과 600cm^-1에서 나타났던 퓨란 고리의 특성밴드의 강도가 줄어들었음을 확인하였다.

실험예 2. 실시예 1의 마이셀에 대한 1H NMR 스펙트럼 분석

실시예 1의 마이셀 고분자와 블록 고분자의 구조를 1H NMR 스펙트럼을 통해 확인하였다. (a) PEO-RAFT, (b) PEO-b-PFMA 및 (c) 가교된 PEO-b-PFMA의 1H NMR 스펙트럼을 도 4에 나타내었다.

도 5에 나타난 바와 같이, 4.23, 3.62, 3.35 ppm에서 PEO 주사슬의 메틸렌 양성자 피크가 나타났으며, 그리고 3.23, 1.67, 1.29, 0.85 ppm에서의 피크는 RAFT 에이전트 잔기의 메틸렌 (e, f)와 메틸(d, g) 그룹 양성자에 해당된다. 4.89ppm에서 푸르푸릴(furfuryl)의 메틸렌 (r) 양성자에 해당하고 7.39와 6.24 내지 6.48 ppm에서 나타나는 피크는 퓨란 고리(s, t)의 양성자와 일치한다. 비스말레이미드(bismaleimide) 가교제와 퓨란 그룹 사이의 DA 클릭 반응으로 PEO 쉘과 가교된 PFMA의 코어의 구성으로 이루어진 가교된 마이셀이 형성된다. 이것의 1H NMR 스펙트럼에서 마이셀 코어에 존재하는 PFMA 블록의 양성자들은 PEO 코로나에 의해서 자기 공명으로부터 가려져 극히 떨어진 신호를 나타낸다. 그 결과, FMA의 코어 잔기는 PEO 쉘과 비교하여 상당히 감소되었다.

실험예 3. PEO -b- PFMA 블록 공중합체의 임계 마이셀 농도( CMC ) 측정

PEO-b-PFMA 공중합체의 임계 마이셀 농도(critical micelle concentration, CMC)는 소수성 탐침으로 피렌을 사용한 형광 분광 광도계로 측정하였다. 간단히, 아세톤(6.0 × 10^-6M)내의 피렌용액은 튜브에 첨가한 뒤 그리고 아세톤은 60℃에서 완전히 증발되었다. 10 내지 150mg/L의 범위의 농도를 가지는 PEO-b-PFMA 용액은 최종 피렌 농도인 6.0 × 10^- ⁷M만들기 위해서 각각의 튜브에 첨가되었다. 그리고, 용액은 실온에서 밤새 교반하였다. 피렌 형광 분석은 333nm의 여기 파장을 가지는 형광 분광 광도계로 측정하였고 373 및 384nm대역에서 방출 형광을 관찰하였다. 373nm(I₃₇₃)피크에서 384nm(I₃₈₄)피크의 강도 비는 CMC를 계산하기 위하여 분석하였다.

실험예 4. 코어가 가교된 마이셀 ( 실시예 1의 마이셀 ) 및 코어가 가교되지 않은 마이셀에 대한 DLS 및 TEM 측정

가교된 소수성 코어의 추가적인 확인을 위해서 DLS를 통해 코어가 가교된 마이셀 및 코어가 가교되지 않은 마이셀의 역학적 직경의 변화를 측정한 결과를 도 6에 나타내었다. 또한, 코어가 가교된 마이셀 및 코어가 가교되지 않은 마이셀의 크기와 형태를 TEM을 통해 확인한 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6에 나타난 바와 같이, 가교되지 않은 마이셀은 88nm, 가교된 마이셀은 68nm의 입자 크기 분포를 가지고 있음을 확인할 수 있다. 가교 후의 입자 크기는 가교된 구조의 소형화와 조밀화가 강화되어 감소함을 확인하였다.

또한, TEM 사진에서 가교되지 않은 마이셀과 가교된 마이셀 모두 균일한 구형 분포를 보였다. 가교되지 않은 마이셀의 평균 직경은 대략 97nm이고 가교된 마이셀의 평균직경은 약 93nm임을 확인하였다.

실험예 5. 코어가 가교된 마이셀 ( 실시예 1의 마이셀 ) 및 가교되지 않은 마이셀의 용매에서 희석시간에 따른 직경의 변화 분석

코어가 가교된 마이셀 및 가교되지 않은 마이셀을 30배의 용매로 희석시켰다. DMF는 PEO와 PFMA 블록 모두에 대한 양용매로서 선택되었고, 반면 포스페이트 완충 용액 (phosphate buffer solution, PBS)은 PFMA블록에 대한 빈용매로 선택되었다.

도 7에 나타난 바와 같이, 가교되지 않은 마이셀의 직경은 PBS(pH 7.4)와 DMF에 희석됨에 따라 완전히 변화되었다. 30배로 희석시킨 후, 가교되지 않은 마이셀의 유체 역학적 평균 직경은 유니머(unimer) 용액을 나타내는 5nm 이하였다. 이는 블록 공중합체 용액 농도가 단지 30배만 희석되어도 마이셀의 해리를 야기하는 임계 마이셀 농도(CMC)값(58.5mg/L) 이하에 도달한다는 것을 의미한다. 가교되지 않은 마이셀과는 다르게 가교된 마이셀의 입자 크기는 PBS 희석에서 68 내지 73nm로 DMF 희석에서 94nm로 약간 증가하였다. 즉, 가교된 마이셀은 여전히 코어-쉘 구조를 유지하고 있으며 용액 희석을 하더라도 불용성의 코어가 붕괴되지 않고 단지 팽윤된 상태임을 나타낸다.

실험예 6. 다이티오트레이톨 ( DTT ) 내에서의 실시예1의 마이셀의 분해도 분석

마이셀 코어 내의 다이설파이드 가교 구조가 산화 환원 반응에 의하여 분해되는지 여부를 조사하기 위해, DTT(10mM)를 가교된 마이셀의 DMF 용액에 첨가하였다. 그 결과 DMF 용액에서 마이셀의 유체역학적 지름이 유니머 용액을 암시하는 크기인 5 nm 이하대로 관찰되었으며, 이것은 가교구조가 산화 환원 응답성의 결합임을 의미한다. PBS 용액에서, 마이셀의 크기는 눈에 띄게 변하지 않았다. 이것은 다음과 같이 설명될 수 있는데, S-S 결합이 없는 마이셀은 환원제에 영향을 받지 않는 반면 S-S결합이 있는 마이셀은 DTT에 의해 분해되어 해리된다. 가교된 마이셀의 분해율은 시간에 따라 증가하고 마이셀의 코어구조는 느슨해지고, 궁극적으로 응집체의 크기는 비교적 큰 소수성 부분의 형성으로 인하여 증가하였다.

실험예 7. 실시예 1의 마이셀의 약물 탑재 효율 분석

자가 조립된 PEO-b-PFMA 양친매성 공중합체는 PEO 친수성 쉘과 PFMA 소수성 코어로 이루어져있다.

소수성 항암제인 DOX는 PFMA 소수성 코어에 봉합되도록 설정하였다. 약물 담지는 나노침전과 투석 방법으로 쉽게 하였다. 실시예 1의 PFMA 소수성기의 사슬길이에 따른 DLC 및 DLE 값을 표 4에 나타내었다.

표 4에 나타난 바와 같이, 소수성기인 PFMA의 분자량이 커질수록 DLC와 DLE의 값이 크게 나타났다. 그리고 분자량을 고정시키고 약물 투여량을 증가하였을 경우 DLC가 아주 낮게 증가한 반면 DLE는 현저하게 내려갔다. 상기의 결과는 약물 담지능력의 한계를 나타내고 봉합 도중에 약물이 나오는 것임을 알 수 있다.

Entry	Polymers	Drug feeding (wt % )	DLC (wt % )	DLE (wt % )
1	PEO₁₁₃-b-PFMA₉	13.8	7.9	57.4
2	PEO₁₁₃-b-PFMA₁₈	13.8	9.2	66.5
3	PEO₁₁₃-b-PFMA₂₇	13.8	10.7	77.2
4	PEO₁₁₃-b-PFMA₂₇	27.7	11.1	40.1
5	PEO₁₁₃-b-PFMA₂₇	41.5	11.6	28.0

실험예 8. 실시예 1의 마이셀의 약물 방출 양상 분석

CCL 마이셀로부터 시험관내 DOX의 방출은 서로 다른 생리학적 조건하에 환원제가 첨가 또는 없는 상태에서 서로 다른 pH값에 따른 약물 방출을 확인하였다. 이의 결과를 도 8에 나타내었다.

도 8에 나타난 바와 같이, CCL 마이셀로부터 DOX의 누적된 방출은 산 조건하에 뛰어난 용해력을 가져 pH 7.4에서 96시간 뒤 18.6%였다. 그러나 CCL 마이셀로부터 누적된 방출비는 향상되었고 pH 5.0에서 방출의 양은 산성하에 뛰어난 용해력을 가지는 DOX의 특성상 96시간 후에 28.3%로 상승하였다. 동일한 pH 조건하에 가교된 구조의 소형화와 조밀화의 영향으로 CCL 마이셀의 누적된 방출은 가교되지 않은 CCL마이셀보다 낮았다. 그러므로, 티올기의 존재에 따라 pH 5.0에서 DOX의 격렬한 방출하고 DOX 방출의 양은 96시간 후에 초기 탑재 값의 52.2%에 도달했다. 다이설파이드 결합의 분해에 의하여 다량의 DOX가 방출되는데, 이것은 환원 응답성의 DOX 방출 특성을 나타낸다.

실험예 9. 실시예 1의 마이셀의 세포독성 실험

(1)실시예 1의 마이셀의 세포 생존율은 인간 배아 신장 세포주인 HEK293 내에서 블록 공중합체의 세포독성을 평가하였다. 이의 결과를 도 9에 나타내었다.

도 9에 나타난 바와 같이, 빈 CCL 마이셀은 10~150㎍/ml 마이셀 농도에서 어떠한 세포독성도 없었으며, 높은 농도(250, 500㎍/ml)에서 약간의 세포독성이 관찰되었다. 이 결과는 낮은 농도에서 비세포독성을 나타내기 때문에 약물 전달을 위한 나노 운반체로써의 사용이 가능함을 나타낸다.

반면, 0.1 ㎍/ml보다 높은 농도에서 PEO-b-PFMA-DOX 마이셀의 세포독성은 현저한 성장억제를 일으키고 HepG2 세포 생존율이 상당히 감소하였다. PEO-b-PFMA-DOX 마이셀과 같은 농도에서의 자유 DOX는 눈에 띄는 감소효과를 나타냈다. 이는 고분자 마이셀에 탑재된 DOX는 방출하는데 많은 시간을 요구하는 반면에 자유 DOX는 암세포를 즉각적으로 제거가 가능하다는 것을 나타낸다.

24시간 치료 후 PEO-b-PFMA-DOX 마이셀의 세포 사망률은 10㎍/ml에서 43.4%에 달하고 15㎍/ml에서 48.4%에 달한다. 이것은 HepG2 세포에서 PEO-b-PFMA-DOX 마이셀이 세포 사멸을 유도하는 것을 확인하였다.

(2)PEO-b-PFMA-DOX 마이셀의 세포 흡수 효율은 공초점 레이저 형광 현미경(confocal laser fluorescence microscopy)을 통해 측정하였다. HepG2 세포는 일반적인 PEO-b-PFMA-DOX 고분자 및 자유 DOX와 동일한 투여량으로 8시간 또는 16시간 동안 인큐베이션 하였다. DOX-담지된 가교된 마이셀 및 자유 DOX의 존재하에 24시간의 인큐베이션 후에 HepG2세포의 형광사진을 도 10에 나타내었다.

도 10에 나타난 바와 같이, 세포 내 마이셀의 성공적인 담지화를 확인하였고, DOX가 담지된 마이셀 이 처리된 세포에서 DOX의 존재를 적색 형광으로 나타남을 확인하였다. PEO-b-PFMA-DOX 마이셀은 제어된 방식으로 분해된 DOX를 방출하여 엔도솜(endosomal) 운반체 내에 초기에 존재한 것을 확인하였다.

Claims

PEO-b-PFMA-N3 (폴리(에틸렌 옥사이드)-b-폴리(푸르푸릴 메타아크릴레이트)) 블록 공중합체, 및 PEO-b-PSMA (폴리(에틸렌 옥사이드)-b-폴리(스티렌-alt-말레익 안히드리드)) 블록 공중합체로 이루어진 군으로부터 선택되는 친수성 부분 및 소수성 부분을 포함하는 양친매성 고분자;
가교제로서 다이티오-비스말레이미도에테인; 및
약물로서 독소루비신;을 포함하고,
상기 PEO-b-PSMA (폴리(에틸렌 옥사이드)-b-폴리(스티렌-alt-말레익 안히드리드)) 블록 공중합체의 경우 말레익 안히드리드 잔기에 푸르푸릴 아민기가 개환반응으로 추가 도입된 것을 특징으로 하는 암세포 표적 기능을 갖는 약물 전달체.
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1)PEO-b-PFMA-N3 (폴리(에틸렌 옥사이드)-b-폴리(푸르푸릴 메타아크릴레이트)) 블록 공중합체, 및 PEO-b-PSMA (폴리(에틸렌 옥사이드)-b-폴리(스티렌-alt-말레익 안히드리드)) 블록 공중합체로 이루어진 군으로부터 선택되는 친수성 부분 및 소수성 부분을 포함하는 양친매성 고분자를 제조하는 단계;
2)상기 양친매성 고분자에 약물로서 독소루비신을 도입하는 단계;
3)가교제로서 다이티오-비스말레이미도에테인을 준비하는 단계; 및
4)상기 약물로서 독소루비신이 도입된 양친매성 고분자 및 상기 가교제를 혼합하여 반응하는 단계;를 포함하고,
상기 단계 1)의 PEO-b-PSMA (폴리(에틸렌 옥사이드)-b-폴리(스티렌-alt-말레익 안히드리드)) 블록 공중합체의 경우 말레익 안히드리드 잔기에 푸르푸릴 아민기가 개환반응으로 추가 도입된 것을 특징으로 하는 암세포 표적 기능을 갖는 약물전달체의 제조방법.
제 15 항에 있어서, 상기 1)단계는 RAFT 중합반응 또는 ATRP 분자 조절 중합반응을 통하여 양친매성 고분자를 제조하는 것인, 암세포 표적 기능을 갖는 약물전달체의 제조방법.
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