KR101824640B1 - Method for rapidly and quantatively analyzing beta-lactam antibiotic resistance and method for evaluating resistance using the same - Google Patents

Method for rapidly and quantatively analyzing beta-lactam antibiotic resistance and method for evaluating resistance using the same Download PDF

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Abstract

본 발명은 (a) 베타-락탐계 항생제에 내성인 균주 및 상기 항생제에 감수성인 균주를 배양한 후, 상기 배양된 균주를 베타-락탐계 항생제에 노출시킨 다음, 여과하는 단계를 포함하는 전처리 단계, 및 (b) 액체크로마토그래피(LC)에 두 개의 매스 스펙트로미터(MS)가 연결되어 되어 있는 LC-MS/MS를 이용하여 상기 전처리된 균주의 베타-락탐계 항생제에 대한 내성을 측정하는 단계를 포함하는 베타-락탐계 항생제 내성의 분석방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for producing a microorganism which comprises (a) culturing a strain resistant to a beta-lactam antibiotic and a strain susceptible to the antibiotic, exposing the cultured strain to a beta-lactam antibiotic, , And (b) measuring the resistance of the pretreated strain to a beta-lactam antibiotic using LC-MS / MS with two mass spectrometry (MS) connected to liquid chromatography (LC) Beta] -lactam antibiotic resistance.

Description

신속한 베타-락탐계 항생제 내성 정량 분석법 및 이를 이용한 내성 평가 방법{Method for rapidly and quantatively analyzing beta-lactam antibiotic resistance and method for evaluating resistance using the same} [0001] The present invention relates to a method for quantitatively analyzing resistance to beta-lactam antibiotics and a method for evaluating resistance using the same,

본 발명은 신속한 베타-락탐계 항생제 내성의 분석방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 (a) 베타-락탐계 항생제에 내성인 균주 및 상기 항생제에 감수성인 균주를 배양한 후, 상기 배양된 균주를 베타-락탐계 항생제에 노출시킨 다음, 여과하는 단계를 포함하는 전처리 단계, 및 (b) 액체크로마토그래피(LC)에 두 개의 매스 스펙트로미터(MS)가 연결되어 되어 있는 LC-MS/MS를 이용하여 상기 전처리된 균주의 베타-락탐계 항생제에 대한 내성을 측정하는 단계를 포함하는 베타-락탐계 항생제 내성의 분석방법에 관한 것이다.More particularly, the present invention relates to (a) a strain resistant to a beta-lactam antibiotic and a strain susceptible to the antibiotic, and then cultivating the strain Beta-lactam antibiotic, followed by filtration, and (b) LC-MS / MS with two mass spectrometry (MS) connected to liquid chromatography (LC) And measuring the resistance of the pretreated strain to a beta-lactam antibiotic. The present invention also relates to a method for analyzing resistance to beta-lactam antibiotics.

현재 항생제 내성 평가 및 모니터링하는 방법은 항생제 감수성 테스트 중 최소억제농도(MIC)를 주로 이용한다. 상기 MIC는 단계적으로 희석된 농도별로 항생제를 첨가한 배지에 세균을 배양하여 세균의 증식 여부를 육안 등으로 판단해 증식억제 농도로 항생제 내성을 평가하는 방법이다. Current antibiotic resistance assessment and monitoring methods use minimal inhibitory concentration (MIC) during antibiotic susceptibility testing. The MIC is a method in which bacteria are cultured in a medium supplemented with antibiotics at a diluted concentration step by step, and the antibiotic resistance is assessed by determining the proliferation of bacteria by visual observation or the like.

상기 방법은 비교적 간단하지만, 내성 판정을 위해 최소 18~24 시간이 소요된다. 또한 육안으로 세균의 증식 여부를 판단하기 때문에, 정확한 내성도 측정 및 실험자간 오차가 많이 존재하는 단점이 있다.Although the above method is relatively simple, it takes at least 18 to 24 hours for the resistance determination. In addition, since bacterial growth is judged by the naked eye, there is a disadvantage in that there is a lot of accurate tolerance measurement and laboratory error.

또한, 항생제 내성 미생물에 의해 형성된 색상 변화를 이용하여 시험 시료 중에서의 미생물의 항생제에 대한 내성을 분석하는 방법이 개시되어 있으나 (한국공개특허 제10-1989-0010212호), 이는 정성적인 방법에 불과하여 항생제 내성을 정량적으로 분석하기에는 한계가 있다.In addition, a method of analyzing the resistance of a microorganism to an antibiotic in a test sample using color change formed by an antibiotic resistant microorganism has been disclosed (Korean Patent Publication No. 10-1989-0010212), but this is only a qualitative method There is a limit to the quantitative analysis of antibiotic resistance.

최근 국제 항생제내성학회, 세계질량분석학회 및 전문저널 등에 분석기기를 이용한 항생제 내성측정에 관련된 내용이 소개되고 있다. MALDI-TOF를 이용한 세균의 분리동정은 이미 상용화되었으며, 최근에는 항생제 내성을 측정하는 방법도 보고되고 있다. Recently, contents related to antibiotic resistance measurement using analytical instruments have been introduced in the International Antibiotic Resistance Society, the World Mass Spectrometry Society and the Professional Journal. The identification of bacterial isolates using MALDI-TOF has already been commercialized, and recently, methods for measuring antibiotic resistance have also been reported.

이는 분석 기기를 이용하여 항생제 내성을 측정할 경우, 비교적 빠른 시간내에 결과를 확인할 수 있고, 고내성, 저내성 등 내성도의 크기를 분석할 수 있는 장점이 있기 때문이다. This is because, when the antibiotic resistance is measured using the analyzer, it is possible to confirm the result within a relatively short period of time and to analyze the magnitude of resistance such as high resistance and low resistance.

상기 분석 기기를 이용하여 항생제 내성을 측정하는 방법에 대해서는 외국 저널(J. Clin. Microbiol. 2012, 50(5):1727. DOI:10.1128/JCM.00047-12)에 소개된바 있으나, 이는 항생제 및 내성균에 의해 가수분해된 항생제, 예컨대 페니실로산(penicilloic acid)에 대한 정량을 하지 않고, 단순히 LC-MS/MS 반응 크기로 내성을 평가하였는데, 이럴 경우 세균수, 항생제 농도, 특히 LC-MS/MS 기기에 따라 내성 평가값이 달라질 수 있는 문제점이 있다.Methods for measuring antibiotic resistance using the above analyzer have been introduced in the foreign journal (J. Clin. Microbiol. 2012, 50 (5): 1727. DOI: 10.1128 / JCM.00047-12) MS / MS reaction size without assaying for antibiotics hydrolyzed by resistant bacteria, such as penicillic acid, in which case bacterial counts, antibiotic concentrations, especially LC-MS / MS device, there is a problem that the immunity evaluation value may be changed.

따라서, 좀 더 간편한 방법으로 국내 사용량, 잔류 위반율 및 내성 보고율이 높은 베타-락탐계 항생제 및 비활성화된 항생제를 동시에 정량 분석하여 내성을 측정하는 방법의 개발이 절실히 요구되고 있는 실정이다.
Therefore, there is a desperate need to develop a method for simultaneously measuring quantitative analysis of beta-lactam antibiotics and inactivated antibiotics, which have a high level of domestic consumption, residual rate of breakdown, and tolerance report rate in a more convenient manner.

본 발명자들은 상기와 같은 종래기술의 문제점을 해결하기 위한 연구를 수행하여, 베타-락탐계 항생제에 내성을 나타내는 세균의 주요 메카니즘인 ß베타-락타메이즈(ß-lactamase)의 작용으로 비활성화된 항생제의 농도를 LC-MS/MS로 측정하여 베타-락탐계 항생제의 내성을 분석할 수 있음을 알아내고 본 발명을 완성하였다. The inventors of the present invention conducted studies to solve the problems of the prior art as described above and found that the antibiotics deactivated by the action of ß-lactamase, which is the main mechanism of the bacteria showing resistance to the β-lactam antibiotics, The concentration of the test compound was measured by LC-MS / MS, and the resistance of the test compound to beta-lactam antibiotics could be analyzed, thereby completing the present invention.

따라서, 본 발명은 항생제 감수성 테스트인 MIC 등 종래의의 바이오 어세이(bioassay)법의 결과 판정의 모호함을 개선하고, 소요 시간(18~24시간)을 단축시키고자, 정밀 정량 분석기기인 LC-MS/MS를 이용한 ß-lactam계 항생제 내성의 측정방법을 제공하는 것이다.Therefore, in order to improve the ambiguity of the result of the conventional bioassay method such as MIC, which is an antibiotic susceptibility test, and to shorten the time required (18 to 24 hours), the present invention provides a precision quantitative analyzer LC- / MS. ≪ / RTI >

본 발명의 다른 목적은 상기 방법에 의해 분석한 베타-락탐계 항생제 내성의 농도를 이용하여 종래의 내성 평가법과 완벽히 상관 관계가 있는 내성 평가의 지표로 이용하는 방법을 제공한다.Another object of the present invention is to provide a method of using the concentration of the beta-lactam antibiotic resistance analyzed by the above method as an index of resistance evaluation perfectly correlated with the conventional resistance evaluation method.

본 발명은 상기의 목적을 달성하기 위하여, (a) 베타-락탐계 항생제에 내성인 균주 및 상기 항생제에 감수성인 균주를 배양한 후, 상기 배양된 균주를 베타-락탐계 항생제에 노출시킨 다음, 여과하는 단계를 포함하는 전처리 단계, 및 (b) 액체크로마토그래피(LC)에 두 개의 매스 스펙트로미터(MS)가 연결되어 되어 있는 LC-MS/MS를 이용하여 상기 전처리된 균주의 베타-락탐계 항생제에 대한 내성을 측정하는 단계를 포함하는 베타-락탐계 항생제 내성의 분석방법을 제공한다.(A) a strain resistant to a beta-lactam antibiotic and a strain susceptible to the antibiotic are cultured, the cultured strain is exposed to a beta-lactam antibiotic, (B) determining the concentration of the beta-lactam-based compound in the pretreated strain using LC-MS / MS with two mass spectrometry (MS) connected to liquid chromatography (LC) And a step of measuring resistance to an antibiotic agent.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 분석한 베타-락탐계 항생제 내성의 농도를 베타-락탐계 항생제 내성 지표(antibiotic resistant index; ARI)로 이용하는 방법을 제공한다. In addition, the present invention provides a method of using a beta-lactam antibiotic resistance concentration assayed by the above method as an antibiotic resistant index (ARI) as a beta-lactam antibiotic.

본 발명에 의하면, 정량 분석기기인 LC-MS/MS를 사용하여 베타-락탐계 내성 유도체를 측정함으로써, 항생제 내성을 정량화 할 수 있으며, 간단한 전처리법으로 2시간 이내로 내성을 측정할 수 있다.According to the present invention, antibiotic resistance can be quantified by measuring a beta-lactam-resistant derivative using a quantitative analyzer, LC-MS / MS, and resistance can be measured within 2 hours by a simple pretreatment.

또한, LC-MS/MS의 다중 반응 검지법(multiple reaction monitoring; MRM)을 이용하여 여러 가지 베타-락탐계 항생제의 내성 유무를 단 한 번의 분석(one single run)으로 판정할 수 있다.In addition, multiple reaction monitoring (MRM) of LC-MS / MS can be used to determine the resistance of several beta-lactam antibiotics to one single run.

한편, 종래의 항생제 내성 평가법과 완벽하게 상관 관계가 있는 항생제 내성 평가 지표(ARI)를 이용하여 세균별 내성의 순위를 평가할 수 있다. On the other hand, the antibiotic resistance index (ARI), which is perfectly correlated with the conventional antibiotic resistance evaluation method, can be used to rank the resistance of bacteria.

도 1은 베타-락탐계 항생제 내성의 주요 기전인 베타-락타메이즈의 작용 원리를 나타낸 것이다.
도 2는 LC-MS/MS 분석을 위한 빠르고 간편한 전처리법의 모식도를 나타낸 것이다.
도 3은 베타-락탐계 항생제 내성을 분석하기 위한 액체크로마토그래피(LC)의 이동상(mobile phase) 및 매스 스펙트로미터/매스 스펙트로미터(MS/MS)의 분석 조건, 액체크로마토그래피(LC) 이동상의 농도구배(샘플당 10분) 조건 및 매스 크로마토그래피(mass chromatography)의 조건으로서, 다중 반응 검지법(MRM)의 조건을 나타낸 것이다.
도 4는 페니실린계 항생제인 페니실린(penicillin) G, 앰피실린(ampilcillin) 및 아목시실린(amoxicillin)과, 페니실린 G의 페니실로산, 앰피실린의 페니실로산 및 아목시실린의 페니실로산의 LC-MC/MC 동시다제 분석조건 및 LC-MS/MS 분석 크로마토그램을 나타낸 것이다.
도 5는 감수성(susceptible) 균주 및 내성(resistant) 균주의 항생제 내성 LC-MC/MC 분석 크로마토그램을 나타낸 것이다.
도 6은 상기 항생제 내성 분석법 및 내성 지표를 이용하여 국내 농장에서 분리된 야외분리 균주의 항생제 내성 평가 및 종래의의 MIC 법과의 상관관계를 비교한 결과를 나타낸 것이다.FIG. 1 shows the principle of action of beta-lactamase, which is the main mechanism of beta-lactam antibiotic resistance.
Figure 2 is a schematic diagram of a quick and easy pre-treatment method for LC-MS / MS analysis.
Figure 3 shows the analytical conditions of the mobile phase and mass spectrometer / mass spectrometer (MS / MS) of liquid chromatography (LC) for analyzing beta-lactam antibiotic resistance, liquid chromatography (LC) The condition of the multiple reaction detection method (MRM) is shown as a concentration gradient (10 minutes per sample) and conditions of mass chromatography.
FIG. 4 is a graph showing the effect of penicillin antibiotics penicillin G, ampilcillin, and amoxicillin on penicillin antibiotics, penicillin G of penicillin G, penicillin of ampicillin and penicillin acid of amoxicillin LC-MC / MC Simultaneous multi-assay conditions and LC-MS / MS analytical chromatogram.
Figure 5 shows an antibiotic resistance LC-MC / MC analysis chromatogram of susceptible strains and resistant strains.
FIG. 6 shows the results of comparing the antibiotic resistance evaluation of the isolated field isolates isolated from domestic farms with the conventional MIC method using the antibiotic resistance analysis method and the resistance index.

본 발명은 (a) 베타-락탐계 항생제에 내성인 균주 및 상기 항생제에 감수성인 균주를 배양한 후, 상기 배양된 균주를 베타-락탐계 항생제에 노출시킨 다음, 여과하는 단계를 포함하는 전처리 단계, 및 (b) 액체크로마토그래피(LC)에 두 개의 매스 스펙트로미터(MS)가 연결되어 되어 있는 LC-MS/MS를 이용하여 상기 전처리된 균주의 베타-락탐계 항생제에 대한 내성을 측정하는 단계를 포함하는 베타-락탐계 항생제 내성의 분석방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for producing a microorganism which comprises (a) culturing a strain resistant to a beta-lactam antibiotic and a strain susceptible to the antibiotic, exposing the cultured strain to a beta-lactam antibiotic, , And (b) measuring the resistance of the pretreated strain to a beta-lactam antibiotic using LC-MS / MS with two mass spectrometry (MS) connected to liquid chromatography (LC) Beta] -lactam antibiotic resistance.

베타-락탐계 항생제중 페니실린계(penicillin G, ampicillin, amoxicillin 등)는 가장 오래 사용되고 있으며, 현재까지도 국내에서 테트라싸이클린계 다음으로 많이 판매되고 있다 (국내 동물용항생제 판매량, 한국동물약품협회, 2013). Penicillin (ampicillin, ampicillin, amoxicillin, etc.) among beta-lactam antibiotics has been used for the longest time.

또한, 잔류 위반율 및 내성 발생율이 가장 높은 편이다 (국가잔류물질검사프로그램, 농림축산검역본부, 2013 및 항생제 사용 및 내성 모니터링, 농림축산검역본부, 2013). In addition, the rate of residual violation and incidence of resistance is the highest (national residue testing program, agriculture, forestry and livestock quarantine headquarters, 2013 and antibiotic use and tolerance monitoring, agriculture, forestry and livestock quarantine headquarters, 2013).

이러한 페니실린계 항생제에 대한 내성의 발생은 Staphylococcus aureus , Escherichia coli , Salmonella typhimurium 세균에서 주로 보고되고 있으며, 이들의 주요 내성 기전은 베타-락타메이즈(ß-lactamase)의 생성으로 인한 항생제의 비활성화이다. The incidence of resistance to penicillin antibiotics was higher in Staphylococcus aureus , Escherichia coli , Salmonella typhimurium bacteria, and their major resistance mechanism is the inactivation of antibiotics due to the production of beta-lactamases.

도 1은 베타-락탐계 항생제 내성의 주요 기전인 베타-락타메이즈의 작용 원리, 즉 상기 베타-락탐계 중에서 페니실린계 주요 항생제인 페니실린 G, 앰피실린 및 아목시실린 구조와 내성 유도체인 베타-락타메이즈가 베타-락탐 구조를 가수분해하는 기전을 나타낸 것이다.FIG. 1 shows the principle of action of beta-lactamase, which is the main mechanism of beta-lactam antibiotic resistance, that is, penicillin G, amphicillin and amoxicillin structure and beta-lactamase, The mechanism of hydrolyzing the beta-lactam structure is shown.

도 1에서 보는 바와 같이, 베타-락타메이즈는 항생제에 노출되었을 경우 이들 세균이 생성하는 효소로 항생제의 베타-락탐 고리(ß-lactam ring)를 파괴시켜 해당 항생제를 무력화시키는데, 이 과정에서 물분자(H2O)가 붙고, 이로 인해 항생제의 분자량이 18 amu 정도 늘어나게 된다. As shown in FIG. 1, when beta-lactamase is exposed to antibiotics, the enzyme produced by these bacteria destroys the beta-lactam ring of the antibiotic to neutralize the antibiotic. In this process, (H 2 O), which increases the molecular weight of the antibiotic by 18 amu.

본 발명에 의한 상기 분석방법은 이상기와 같은 원리를 이용하여 LC-MS/MS로 노출된 항생제 및 비활성화된 항생제의 농도를 측정함으로써, 항생제에 대한 내성을 분석할 수 있다. The analysis method according to the present invention can analyze the resistance to antibiotics by measuring the concentrations of antibiotics and inactivated antibiotics exposed to LC-MS / MS using the same principle as that of the phase shifter.

본 발명의 상기 분석방법에 있어서, 상기 배양은 사용한 각각의 균주 특성에 따라 공지의 방법에 의해 배양하는 것으로 족하므로, 상기 배양 방법에 대한 성세한 설명은 생략하기로 한다.In the above assay method of the present invention, the culture may be carried out by a known method depending on the characteristics of each strain used. Therefore, detailed description of the culture method will be omitted.

본 발명의 상기 분석방법에 있어서, 상기 베양은 베타-락탐계 항생제에 내성인 균주 및 상기 항생제에 감수성인 균주를 균수가 108 cfu/mL 내지 109 cfu/mL가 되도록 배양하는 것이 바람직하다. In the assay method of the present invention, it is preferable that the strain is cultured so that the strain resistant to the beta-lactam antibiotic and the strain susceptible to the antibiotic are in the range of 10 8 cfu / mL to 10 9 cfu / mL.

본 발명의 상기 분석방법에 있어서, 상기 배양된 균주를 베타-락탐계, 예컨대 페니실린계 항생제 10 ppm에 37℃의 온도에서 90분간 노출시킬 수 있다. In the assay method of the present invention, the cultured strain may be exposed to 10 ppm of a beta-lactam-based antibiotic such as a penicillin for 90 minutes at a temperature of 37 ° C.

본 발명의 상기 분석방법에 있어서, 상기 여과는 0.2㎛의 폴리비닐리덴디플루오라이드(PVDF) 필터, 예컨대 폴리비닐리덴디플루오라이드 시린지리스 필터(PVDF syringeless filter)를 이용하여 수행할 수 있다.In the above analysis method of the present invention, the filtration can be performed using a polyvinylidene difluoride (PVDF) filter such as a polyvinylidene difluoride syringeless filter of 0.2 m.

본 발명의 상기 분석방법에 있어서, 상기 베타-락탐계 항생제는 베타-락타메이즈에 의해 베타-락탐 링이 파괴되어 항생 작용을 상실하는 항생제라면 제한없이 포함될 수 있다. In the above assay method of the present invention, the beta-lactam antibiotic may be included without limitation as long as it is an antibiotic that has lost antibiotic action due to beta-lactam ring degradation by beta-lactamase.

본 발명의 상기 분석방법에 있어서, 상기 베타-락탐계 항생제는 페니실린계 항생제 또는 세팔로스포린계 항생제일 수 있다.In the assay method of the present invention, the beta-lactam antibiotic may be a penicillin antibiotic or a cephalosporin antibiotic.

본 발명의 상기 분석방법에 있어서, 상기 페니실린계 항생제로는 페니실린 G, 앰피실린, 아목시실린 등을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.In the above assay method of the present invention, the penicillin antibiotics may include, but are not limited to, penicillin G, ampicillin, and amoxicillin.

본 발명의 상기 분석방법에 있어서, 상기 세팔로스포린계 항생제로는 세프티오퍼, 세팔렉신, 세포퀴놈 등을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.In the above assay method of the present invention, examples of the cephalosporin antibiotic include ceftiofur, cephalexin, cell quinome, and the like, but the present invention is not limited thereto.

본 발명의 상기 분석방법에 있어서, 상기 균주는 베타락타메이즈를 생성하여 항생제를 무력화시킬 수 세균이라면 모두 포함될 수 있다. In the assay method of the present invention, the strain may include any bacteria capable of producing beta lactamase and neutralizing the antibiotic.

본 발명의 상기 분석방법에 있어서, 상기 균주의 예로는 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 에쉐리치아 콜라이(Escherichia coli), 살로넬라 타이피무이움(Salmonella typhimurium) 등을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.In the above assay method of the present invention, examples of the strain include Staphylococcus ( Staphylococcus aureus) aureus ), Escherichia coli ), Salmonella typhimurium ( Salmonella typhimurium ), but the present invention is not limited thereto.

상기 액체크로마토그래피의 이동상은, 0.1%(w/w)의 포름산이 함유된 증류수 및 0.1%(w/w)의 포름산이 함유된 아세토니트릴로 구성되고, 상기 0.1%(w/w)의 포름산이 함유된 증류수 25~90 중량% 및 0.1%(w/w)의 포름산이 함유된 아세토니트릴 10~75 중량%로 구성될 수 있다. The mobile phase of the liquid chromatography consisted of distilled water containing 0.1% (w / w) formic acid and acetonitrile containing 0.1% (w / w) formic acid, and 0.1% (w / w) 25 to 90% by weight of distilled water and 10 to 75% by weight of acetonitrile containing 0.1% (w / w) formic acid.

본 발명의 상기 분석방법에 있어서, 상기 액체크로마토그래피의 이동상의 조건은, 0.1%(w/w)의 포름산이 함유된 증류수(A) 및 0.1%(w/w)의 포름산이 함유된 아세토니트릴(B)로 구성되고, 상기 (A)와 (B)의 중량% 비율이 9분까지는 90:10 내지 40:60이고, 15분까지는 25:75이며, 15.1분까지 90:10이고, 20분까지는 90:10일 수 있다. In the above analysis method of the present invention, the liquid phase chromatography conditions are as follows: distilled water (A) containing 0.1% (w / w) formic acid and acetonitrile containing 0.1% (w / (A) and (B) is 90:10 to 40:60 by 9 minutes, 25:75 by 15 minutes, 90:10 by 15.1 minutes, and 20 minutes by weight May be 90:10.

본 발명의 상기 분석방법에 있어서, 상기 매스 스펙트로미터 분석을 위한 다중 반응 검지법(multiple reaction monitoring)의 조건은, 전구체 이온(precursor ion)에 대한 상기 베타-락탐계 항생제의 질량이 335.3 내지 384 m/z이고, 정량 이온(quantification ion)에 대한 상기 베타-락탐계 항생제의 질량이 106 내지 189 m/z이며, 확인 이온(confirmation ion)에 대한 상기 베타-락탐계 항생제의 질량이 160 내지 323 m/z일 수 있다. In the analysis method of the present invention, the conditions of the multiple reaction monitoring for the mass spectrometric analysis are that the mass of the beta-lactam antibiotic against the precursor ion is 335.3 to 384 m / z, wherein the mass of the beta-lactam antibiotic to the quantification ion is 106 to 189 m / z and the mass of the beta-lactam antibiotic to the confirmation ion is 160 to 323 m / z. < / RTI >

본 발명의 상기 분석방법에 있어서, 상기 매스 스펙트로미터 분석을 위한 다중 반응 모니터링법(MRM, multiple reaction monitoring)의 조건은 베타-락탐계 항생제의 전구 이온(precursor ion)의 분자량이 페니실린 G는 335.3이고, 페니실로산-페니실린G는 353.4이며, 앰피실린은 350.2이고, 페니실로산-앰피실린은 368.4이며, 아목시실린은 366.2이고, 페니실로산-아목시실린은 384.0 m/z일 수 있다. In the analysis method of the present invention, the conditions of the multiple reaction monitoring (MRM) for the mass spectrometric analysis are as follows: the molecular weight of the precursor ion of the beta-lactam antibiotic is the penicillin G is 335.3 , Penicillosic acid-penicillin G is 353.4, amphicillin is 350.2, penicillic acid-amphicillin is 368.4, amoxicillin is 366.2, and penicillosic-amoxicillin is 384.0 m / z.

또한, 본 발명의 상기 분석방법에 있어서, 상기 매스 스펙트로미터 분석을 위한 다중 반응 모니터링법(MRM, multiple reaction monitoring)의 조건은 정량 이온(quantification ion)의 분자량이 페니실린 G는 176이고, 페니실로산-페니실린G는 174이며, 앰피실린은 106이고, 페니실로산-앰피실린은 106이며, 아목시실린은 114이고, 페니실로산-아목시실린은189 m/z일 수 있다. In the analysis method of the present invention, the condition of the multiple reaction monitoring (MRM) for the mass spectrometric analysis is that the molecular weight of the quantification ion is penicillin G 176, - penicillin G is 174, ampicillin is 106, penicillosic acid-amphicillin is 106, amoxicillin is 114, and penicillosic acid-amoxicillin can be 189 m / z.

또한, 본 발명의 상기 분석방법에 있어서, 상기 매스 스펙트로미터 분석을 위한 다중 반응 모니터링법(MRM, multiple reaction monitoring)의 조건은 정성 이온(confirmation ion)의 분자량이 분자량이 페니실린 G는 160이고, 페니실로산-페니실린G는 309이며, 앰피실린은 160이고, 페니실로산-앰피실린은 309이며, 아목시실린은 349이고, 페니실로산-아목시실린은 323 m/z일 수 있다.In the analysis method of the present invention, the condition of the multiple reaction monitoring (MRM) for the mass spectrometric analysis is that the molecular weight of the confirmation ion is the molecular weight, the penicillin G is 160, The siloxane-penicillin G is 309, the ampicillin is 160, the penicillic acid-amphicillin is 309, the amoxicillin is 349, and the penicillo- acid-amoxicillin is 323 m / z.

본 발명의 상기 분석방법에 있어서, 단위 “m/z”은 “질량/이온”을 의미한다.In the above analysis method of the present invention, the unit "m / z" means "mass / ion".

또한, 본 발명은 상기의 방법에 의해 분석한 베타-락탐계 항생제의 농도를 이용하여 베타-락탐계 항생제의 내성 지표로 이용하는 방법에 관한 것이다.The present invention also relates to a method for using the concentration of a beta-lactam antibiotic analyzed by the above method as a resistance index of a beta-lactam antibiotic.

본 발명의 상기 베타-락탐계 항생제의 내성 지표로 이용하는 방법에 있어서, 상기 베타-락탐계 항생제는 페니실린계 항생제 또는 세팔로스포린계 항생제일 수 있다.In the method of using the beta-lactam antibiotic of the present invention as a resistance index, the beta-lactam antibiotic may be a penicillin antibiotic or a cephalosporin antibiotic.

본 발명의 상기 베타-락탐계 항생제의 내성 지표로 이용하는 방법은 상기 페니실린계 항생제의 노출 농도와 내성균에 의해 변화된 항생제인 페니실로산의 농도의 비로 내성의 경중을 평가하는 것일 수 있다.The method of using the beta-lactam antibiotic of the present invention as a resistance index may be to evaluate the severity of tolerance by the ratio of the exposure concentration of the penicillin antibiotic and the concentration of penicillin acid, which is an antibiotic changed by resistant bacteria.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명하고자 하나, 하기의 실시예는 단지 설명의 목적을 위한 것으로 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to the following examples. However, the following examples are for illustrative purposes only and are not intended to limit the present invention.

<< 실시예Example 1> 항생제 내성  1> Antibiotic resistance LCLC -- MSMS // MSMS 측정을 위한 전처리법 개발 Development of pretreatment method for measurement

도 2는 LC-MS/MS 분석을 위한 빠르고 간편한 전처리법의 모식도를 나타낸 것이다.Figure 2 is a schematic diagram of a quick and easy pre-treatment method for LC-MS / MS analysis.

도 2에서 보는 바와 같이, 분석을 위한 전처리법은 각각의 세균 특성에 맞게 배양한 후, 상기 배양된 균주를 페니실린계 항생제(페니실린 G, 앰피실린 및 아목시실린) 10 ppm에 37°C의 온도에서 90분간 노출시켰다. 이때, 상기 배양된 각 균주의 균수는 약 109 cfu/mL이었다.As shown in FIG. 2, the pretreatment method for analysis was carried out in accordance with the characteristics of each bacterium. Then, the cultured strain was cultured in 10 ppm of penicillin antibiotics (penicillin G, ampicillin and amoxicillin) Lt; / RTI &gt; At this time, the number of cultivated strains was about 10 9 cfu / mL.

그 후, 0.2 PVDF syringeless filter로 여과하여 분석하였다. Thereafter, it was filtered and analyzed with a 0.2 PVDF syringeless filter.

상기 전처리법을 이용하면 항생제 내성 측정 시간은 세균배양 후 최대 2시간이 소요되며, 종래의의 MIC 등 바이오 어세이에 비해 최대 16~22 시간이 단축된다.
When the pretreatment method is used, the antimicrobial resistance measurement time is up to 2 hours after culturing the bacteria, and the maximum 16-22 hours is shortened compared with the conventional bioassay such as MIC.

<< 실시예Example 2> 페니실린계 항생제 및  2> penicillin antibiotics and 페니실로산Penicillosan 폼의  Form LCLC -- MSMS // MSMS 동시다제분석Simultaneous multi-agent analysis 조건 및  Conditions and 크로마토그램Chromatogram

페니실린 G, 앰피실린 및 아목시실린의 표준품(Sigma aldrich에서 구매) 및 베타-락타메이즈에 의한 가수분해된 페니실린 G의 페노실로산(penicilloic acid of penicillin), 앰피실린의 페노실로산(penicilloic acid of ampicillin) 및 아목시실린의 페노실로산(penicilloic acid of amoxicillin)의 표준품(LGC Standards)을 구매하여 LC-MS/MS를 이용한 최적의 LC 및 mass 조건을 개발하였다(도 3 및 도 4 참조).Penicillin G, ampicillin and amoxicillin (purchased from Sigma Aldrich) and hydrolyzed Penicillin G penicillic acid by penicillic acid by penicillic acid, penicillic acid of penicillin acid ampicillin and penicilloic acid of amoxicillin (LGC Standards) were purchased to develop optimal LC and mass conditions using LC-MS / MS (see FIGS. 3 and 4).

이때, 사용된 분석 기기는 Waters사의 micromass 모델 기준으로 LC 및 MRM(multiple reaction monitoring) 분석 조건을 확립하였다. At this time, the analytical instruments used were LC and MRM (multiple reaction monitoring) analysis conditions based on Waters micromass model.

LC 조건을 위한 이동상은 0.1% 포름산이 함유된 증류수와 아세토니트릴을 사용하였으며, 샘플당 20분의 구배(gradient) 조건으로 개발하였다. The mobile phase for the LC condition was developed using 0.1% formic acid in distilled water and acetonitrile, with a gradient of 20 minutes per sample.

컬럼은 본 실험에서 분리능이 우수하다고 판단되는 YMC사의 Triart C18(2.0x50 mm, 3)를 사용하였다. 검출기(detector)인 mass로 분석하기 위해 6개의 물질 각각의 전구체 이온 1개 및 프로덕트(product) 이온 2개씩을 찾는 등의 MRM 조건을 확립하였다(도 3 참조). The column used was Triart C18 (2.0x50 mm, 3) from YMC, which is considered to have excellent resolution in this experiment. MRM conditions such as finding one precursor ion and two product ions for each of the six substances were established to analyze the mass as a detector (see FIG. 3).

도 4는 페니실린계 항생제인 페니실린 G, 앰피실린 및 아목시실린과, 상기 페니실린 G의 페니실로산, 앰피실린의 페니실로산 및 아목시실린의 페니실로산의 LC-MC/MC 동시다제 분석조건 및 LC-MS/MS 분석 크로마토그램을 나타낸 것이다.
Figure 4 shows the LC-MC / MC simultaneous multi-assay analysis of penicillin antibiotics penicillin G, ampicillin and amoxicillin, penicillin G, penicillin acid, ampicillin, and amoxicillin, / MS analysis chromatogram.

<< 실시예Example 3>  3> LCLC -- MSMS // MSMS 를 이용한 항생제 내성 분석Antibiotic resistance analysis

페니실린 G에 내성이 보고된 Staphylococcus aureus 야외 균주 및 감수성 균주(negative control strain), 앰피실린 내성인 Escherichia coli 야외 균주 및 감수성 균주, 아목시실린 내성 야외 균주 Salmonella typhimurium 및 감수성 균주의 항생제 내성을 LC-MS/MS로 측정한 크로미터그램을 도 5에 나타내었다. Staphylococcus with resistance to penicillin G aureus Outdoors strains and negative control strains , ampicillin resistant strains Escherichia coli Outdoors strains and susceptible strains, Amoxicillin resistant strains Salmonella typhimurium And The antimicrobial resistance of the susceptible strain was measured by LC-MS / MS and the chromogram was shown in Fig.

도 5를 참조하면, Staphylococcus aureus 균주의 페니실린 G 항생제 내성을 분석한 결과, 감수성 균주에서는 노출된 페니실린 G가 측정되었으나, 페노실로산은 거의 측정되지 않았다. Referring to Figure 5, Staphylococcus aureus Analysis of the penicillin G antibiotic resistance of the strain revealed that the penicillin G was measured in the susceptible strains but the phenosylic acid was almost not measured.

그러나, 내성 균주에서는 노출된 페니실린 G가 측정되지 않고 페노실로산만 측정되었다. Escherichia coli 균주에 대한 앰피실린 및 Salmonella typhimurium에 대한 아목시실린 항생제 내성 또한 도 5에 나타낸 바와 같은 결과를 나타내었다.
However, in penicillin-resistant strains, penicillin acid was not measured but penicillin acid was measured. Escherichia coli and Salmonella strains appeared to Amphitheater Amoxicillin antibiotic resistance to typhimurium also showed the results shown in Fig.

<< 실시예Example 4> 항생제 내성 지표( 4> Antimicrobial resistance index ( ARIARI )의 개발) Development

베타-락탐계 항생제중 페니실린계 항생제(penicillin G, ampicillin 및 amoxicillin) 내성을 LC-MS/MS로 측정해 보면, 항생제 감수성 균주일수록 노출된 항생제가 높게 측정되며 ß-lactamase에 의해 가수분해된 페니실로산 형태의 항생제는 낮게 측정된다. 이를 바탕으로 하기 수학식 1과 같은 항생제 내성도를 평가할 수 있는 새로운 내성 평가 지표를 개발하였다.The sensitivity of penicillin antibiotics (penicillin G, ampicillin, and amoxicillin) to beta-lactam antibiotics was measured by LC-MS / MS. Antibiotic sensitivity was higher in antibiotic susceptible strains. Penicillin hydrolyzed by β-lactamase Antibiotics in acid form are measured low. Based on this, a new resistance evaluation index capable of evaluating antibiotic resistance as shown in Equation (1) was developed.

Figure 112015007844812-pat00001
Figure 112015007844812-pat00001

상기 식 1과 같은 항생제 내성 지표(ARI)로 평가할 경우, 균주에 따른 항생제 내성의 정도 증 내성도를 평가할 수 있는 장점이 있다. 종래의 MIC 등과 같은 방법은 내성의 유무에 초점이 맞춰져 있으나, 본 발명의 상기 ARI 평가법을 이용하면 감수성에서 고내성까지 내성의 정도를 수치화하여 순위를 평가할 수 있다.When evaluated with the antibiotic resistance index (ARI) as shown in the above formula 1, there is an advantage that the degree of tolerance to the antibiotic resistance according to the strain can be evaluated. Conventional methods such as MIC focus on the presence or absence of immunity. However, by using the ARI evaluation method of the present invention, the degree of resistance from sensitivity to high immunity can be quantified to evaluate the ranking.

<< 실시예Example 5> 항생제 내성 분석방법 및 종래의 분석방법의 비교 5> Comparison of antibiotic resistance analysis method and conventional analysis method

농림축산검역본부에서 국내 농장에서 분리된 도 6에 기재되어 있는 바와 같은 야외균주 23종을 분양받아, 항생제 내성을 평가하는 MIC법으로 감수성 및 내성유무를 판별한 결과, Staphylococcus aureus 8종 중에서, 4종이 페니실린 G 감수성 이었고, 4종이 페니실린 G 내성을 보였다. After a quarantine livestock agriculture, forestry and in central receiving pre-sale outdoor strain 23 species, such as described in Figure 6 away from the domestic farm, determine the sensitivity and resistance to the MIC method of evaluating whether or not the antibiotic resistance, Staphylococcus aureus Of the eight, four were penicillin G susceptible and four were penicillin G resistant.

또한, Escherichia coli 7종 중에서, 5종이 앰피실린 감수성, 2종이 앰피실린 내성을 보였고, Salmonella typhimurium 8종 중에서, 5종이 아목시실린 감수성, 3종이 아목시실린 내성을 보이는 것으로 판정되었다 (CLSI break point로 판정). In addition, Escherichia Of the seven strains of coli , five were susceptible to ampicillin and two were resistant to ampicillin, and Salmonella typhimurium Of the 8 species, 5 were judged to have amoxicillin susceptibility and 3 to show amoxicillin resistance (determined as a CLSI break point).

한편, 상기 실시예 1 내지 실시예 3에 의한 분석방법을 이용하여 상기 23종의 균주들에 대한 항생제 내성 및 상기 실시예 4에 의한 내성 지표로 평가한 결과, 감수성으로 판정된 Staphylococcus aureus, Escherichia coli 및 Salmonella typhimurium 14종 모두 ARI 1 이하로 나타났으며, 9종의 내성 균주들은 모두 1 이상으로 평가되었다(도 6 참조).On the other hand, the antimicrobial resistance against the 23 strains and the resistance index according to Example 4 were evaluated using the analytical methods according to Examples 1 to 3, and as a result, the susceptibility of Staphylococcus aureus , Escherichia coli and 14 species of Salmonella typhimurium ARI 1, and all 9 resistant strains were evaluated as 1 or more (see FIG. 6).

상기에서, ARI 1은 노출된 항생제의 농도와 페노실로산의 농도가 같아지는 지점으로 이론적인 내성 브레이크 포인트(break point)로 생각할 수 있기 때문에, ARI가 1 이하인 경우는 감수성, ARI가 1 이상인 경우는 내성으로 평가했을 때, 현재 사용되고 있는 MIC 방법의 내성 평가 결과와 100% 일치하였다. In the above, since ARI 1 can be regarded as a theoretical tolerance break point at the point where the concentration of the exposed antibiotic and the concentration of penenosylic acid are the same, when the ARI is 1 or less, the sensitivity, ARI Were 100% consistent with those of the MIC method currently in use when assessed for resistance.

또한, 도 6에서와 같이, Salmonella typhimurium 중 아목시실린의 내성도가 가장 높은 균주는 Salmonella typhimurium 202 이고, 가장 내성도가 낮은(감수성)은 Salmonella typhimurium V05-13-A03-001-009 이었다, Further, as shown in FIG. 6, Salmonella Among the typhimuriums , the highest resistance to amoxicillin was Salmonella typhimurium 202 and the lowest resistance (susceptibility) was Salmonella typhimurium V05-13-A03-001-009,

이와 같이, 본 발명에 의한 항생제 내성 분석방법 및 항생제 내성 지표(ARI)를 이용하며, 미지의 균주에 대한 감수성 혹은 내성 판정을 할 수 있고, 또는 감수성 및 내성 정도의 순위를 정할 수 있다.As described above, the antibiotic resistance analysis method and the antibiotic resistance index (ARI) according to the present invention can be used to determine susceptibility or tolerance to an unknown strain or to rank the susceptibility and tolerance.

이상에서 구체적인 실시예를 들어 본 발명을 상세하게 설명하였으나, 본 발명은 상술한 실시예에 한정되지 않으며, 본 발명의 기술적 사상의 범위 내에서 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 많은 변형이 가능함은 자명할 것이다.While the present invention has been particularly shown and described with reference to exemplary embodiments thereof, it is to be understood that the present invention is not limited to the disclosed exemplary embodiments, but many variations and modifications can be made by those skilled in the art within the technical scope of the present invention. Will be self-evident.

본 발명의 LC-MS/MS를 이용한 베타-락탐계 항생제 내성 정량 분석법 및 내성지표를 이용한 내성 평가법은 빠르고 정확하게 내성의 유무 및 정도를 판정할 수 있기 때문에, 대규모 모니터링 사업 등에 유용하게 사용될 수 있다.The beta-lactam antibiotic resistance assay using the LC-MS / MS of the present invention and the resistance evaluation method using the resistance index can be used for large-scale monitoring projects because they can quickly and accurately determine the presence or absence of resistance.

실제로 민관 검사기관 대부분이 LC-MS/MS를 보유하고 있어, 단시간에 수많은 데이터를 생산이 가능하다. 그리고 베타-락탐계 항생제 내성 생성에 대한 카키네틱(kinetic) 연구 등이 가능하기 때문에, 내성 연구에 기초 자료로 활용될 수 있다.In fact, many public inspection agencies have LC-MS / MS, so it is possible to produce a lot of data in a short time. And kinetic studies on the production of beta-lactam antibiotics resistance, and so can be used as basic data for resistance studies.

Claims (12)

(a). 페니실린 G 10 ppm에 내성인 균주 및 상기 페니실린 G에 감수성인 균주를 균수가 109 cfu/mL이 되도록 배양한 후, 상기 배양된 균주를 상기 페니실린 G 10 ppm에 37℃의 온도에서 90분간 노출시킨 다음, 0.2㎛의 폴리비닐리덴디플루오라이드(PVDF) 시린지리스 필터(0.2㎛ PVDF syringeless filter)를 이용하여 여과하는 단계를 포함하는 전처리 단계; 및
(b). 액체크로마토그래피(LC)에 두 개의 매스 스펙트로미터(MS)가 연결되어 되어 있는 LC-MS/MS를 이용하여 상기 전처리된 균주의 페니실린 G에 대한 내성을 측정하는 단계를 포함하는 페니실린 G 내성의 분석방법으로서,
상기 균주가 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)이고,
상기 액체크로마토그래피의 이동상의 조건은, 0.1%(w/w)의 포름산이 함유된 증류수(A) 및 0.1%(w/w)의 포름산이 함유된 아세토니트릴(B)로 구성되고, 상기 (A)와 (B)의 중량% 비율이 9분까지는 90:10 내지 40:60이고, 15분까지는 25:75이며, 15.1분까지 90:10이고, 20분까지는 90:10이며,
상기 페니실린 G의 매스 스펙트로미터 분석을 위한 다중 반응 모니터링법(MRM, multiple reaction monitoring)의 조건은, 상기 페니실린 G의 전구 이온(precursor ion)의 분자량이 335.3 m/z이고, 정량 이온(quantification ion)의 분자량이 176 m/z이며, 정성 이온(confirmation ion)의 분자량이 160 m/z이고,
상기 페니실린 G가 변성된 페니실로산-페니실린G의 전구 이온의 분자량이 353.4 m/z이며, 정량 이온의 분자량이 174 m/z이고, 정성 이온의 분자량이 309 m/z인 것을 특징으로 하는 페니실린 G 내성의 분석방법.(a). A strain resistant to 10 ppm of penicillin G and a strain susceptible to penicillin G were cultured to a bacterial count of 10 9 cfu / mL. The cultured strain was exposed to 10 ppm of penicillin G at a temperature of 37 ° C for 90 minutes Next, a pre-treatment step comprising filtration using a 0.2 μm polyvinylidene difluoride (PVDF) syringeless filter (0.2 μm PVDF syringeless filter); And
(b). An analysis of penicillin G resistance comprising measuring the resistance of the pretreated strain to penicillin G using LC-MS / MS with two mass spectrometry (MS) connected to liquid chromatography (LC) As a method,
Wherein said strain is Staphylococcus aureus ,
The mobile phase conditions of the liquid chromatography consisted of distilled water (A) containing 0.1% (w / w) formic acid and acetonitrile (B) containing 0.1% (w / w) formic acid, A) and (B) is 90:10 to 40:60 up to 9 minutes, 25:75 up to 15 minutes, 90:10 up to 15.1 minutes, 90:10 up to 20 minutes,
The condition of the multiple reaction monitoring (MRM) for the mass spectrometric analysis of the penicillin G is that the precursor ion of the penicillin G has a molecular weight of 335.3 m / z and a quantification ion, Of 176 m / z, a molecular weight of the confirmation ion of 160 m / z,
Wherein the penicillin G-modified penicillinic acid-penicillin G precursor has a molecular weight of 353.4 m / z, a quantitative ion molecular weight of 174 m / z and a qualitative ion molecular weight of 309 m / z. Methods for analysis of G resistance. 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 제1항의 방법에 의해 분석한 페니실린 G의 농도를 이용하여 페니실린 G의 내성 지표로 이용하는 방법으로서,
상기 페니실린계 G의 노출 농도에 대한, 내성균에 의해 변화된 항생제인 페실로산-페니실린 G의 농도의 값을 항생제 내성 지표(ARI)로 하며, 상기 항생제 내성 지표가 1 이상일 경우 항생제 내성으로 진단하고, 상기 항생제 내성 지표가 높을수록 고내성균으로 진단하는 것을 특징으로 하는 방법.A method for using as a resistance index of penicillin G using the concentration of penicillin G analyzed by the method of claim 1,
Wherein the value of the concentration of the penicillin-penicillin G, which is an antibiotic changed by the resistant bacteria against the exposure level of the penicillin G, is defined as an antibiotic resistance index (ARI). When the antibiotic resistance index is 1 or more, Wherein the higher the antibiotic resistance index is, the more the diagnosis is made as a high resistant strain. 삭제delete 삭제delete
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