KR101824321B1 - Botulinum toxin type a vaccine comprising heavy chain c-terminal of botulinum toxin type a mutant inhibiting toxic activity and method thereof - Google Patents

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Abstract

본 발명은 보툴리눔 독소 A형의 Heavy Chain C-terminal(Hc) 도메인에 해당하는 트레오닌(Threonine; Thr) 876번부터 루신(Leusine; Leu) 1296번 세포결합 부위에 존재하는 알지닌(Arginine; Arg) 1269번, 타이로신(Tyrosine; Tyr) 1117번, 히스티딘(Histidine; His) 1253번, 트립토판(Tryptophan; Trp) 1266번, 글루탐산(Glutamate; Glu) 1203번을 알라닌(Alanine; Ala)으로 치환하여 독성활성 부위를 제거하고 세포결합력을 억제한 보툴리눔 독소 A형 백신 및 이의 제조방법에 관한 것으로 보툴리눔 독소 A형 중독에 의해 유발되는 질환의 예방 및 치료하기 위한 조성물로 사용될 수 있다.The present invention relates to the use of arginine (Arg) at the cell binding site of Leusine (Leu) 1296 starting from Threonine (Thr) 876 corresponding to the heavy chain C-terminal (Hc) domain of Botulinum toxin type A, 1259, tyrosine (Tyr) 1117, histidine (His) 1253, tryptophan (Trp) 1266 and glutamate (Glu) 1203 were substituted with alanine The present invention relates to a botulinum toxin type A vaccine which is capable of eliminating a site and inhibiting cell binding ability and a method for producing the same, and can be used as a composition for preventing and treating a disease caused by botulinum toxin type A poisoning.

Description

보툴리눔 독소 A형의 중쇄 C말단 도메인 돌연변이로 독성활성이 제거된 보툴리눔 독소 A형을 포함하는 보툴리눔 독소 A형 백신 및 이의 제조방법{BOTULINUM TOXIN TYPE A VACCINE COMPRISING HEAVY CHAIN C-TERMINAL OF BOTULINUM TOXIN TYPE A MUTANT INHIBITING TOXIC ACTIVITY AND METHOD THEREOF}FIELD OF THE INVENTION [0001] The present invention relates to a botulinum toxin type A vaccine comprising a botulinum toxin type A whose toxic activity has been eliminated by a heavy chain C terminal domain mutation of the botulinum toxin type A and a method for producing the same. INHIBITING TOXIC ACTIVITY AND METHOD THEREOF}

본 발명은 보툴리눔 독소 A형의 중쇄 C말단(Heavy Chain C-terminal, Hc) 도메인에 아미노산 치환을 통한 돌연변이를 만듦으로써 독성활성이 제거된 보툴리눔 독소 A형을 포함하는 보툴리눔 독소 A형 백신 및 이의 제조방법에 관한 것이다.The present invention relates to a botulinum toxin type A vaccine comprising a botulinum toxin type A in which the toxic activity is eliminated by making a mutation through amino acid substitution in the heavy chain C-terminal (Hc) domain of the botulinum toxin type A, ≪ / RTI >

보툴리눔 독소는 Clostridium botulinum이라는 박테리아에 의해 생성되는 독소로써 LD50(여기서, LD50은 감염 시에 50%의 치사율을 유도하는 농도를 의미함)이 kg당 1ng 수준으로 현존하는 생물독소 중 가장 강력한 독소로 알려져 있다. 이러한 높은 독성 때문에 미국 질병관리본부(Centers for Disease Control and Prevention, CDC)에서는 위험도, 생산 및 무기화 가능성 등을 고려하여 분류한 생물학 작용제 카테고리중에서 탄저, 페스트 및 두창과 함께 A 등급에 포함되어 규제되고 있다. 이 독소는 다른 생물학 작용제에 해당하는 병원체와 달리 생장이나 감염과의 연관성은 없으나 독소 자체의 살상력이 강력하여 실제 과거 전쟁 등 테러에서 사용된 예가 있다.Botulinum toxin is a toxin produced by a bacterium called Clostridium botulinum , which has a LD 50 (here, LD 50 means a concentration that induces a mortality rate of 50% at infection) of 1 ng per kg, the most potent toxin of existing biotoxins . Because of this high toxicity, the Centers for Disease Control and Prevention (CDC) has been included in Class A along with anthrax, pest, and pancreatic in the category of biologic agents classified by risk, production, and potential for mineralization . This toxin is not related to growth or infection unlike other pathogenic agents of other biological agents, but the toxin itself has a strong killing power and is used in past terrorism such as war.

생물학 무기로 사용하기 위해서 1930년대 초 일본의 731 부대에서 독소에 대한 치사량을 측정하기 위해 포로들을 대상으로 실험한 기록이 있고 1944년 미육군의 세균전 연구소의 산츠(Edward J. Schantz)에 의해 보툴리눔 균을 배양하고 독소를 분리하는 방법을 발견하면서 개발 및 방어에 대한 연구가 시작되었다. 또한 1995년 일본의 옴(Aum) 진리교에서 사린가스와 함께 사용되어 전 세계적으로 이슈화된 적이 있다. 이렇듯 생물학 무기로도 사용될 수 있지만 농경지나 가축 또는 음식물 등에 의한 감염 사례 역시 나타나고 있어 이에 대한 연구가 중요시되고 있다. 현재 미국 등 일부 선진국들에 의해서 보툴리눔에 대한 치료와 예방을 위한 다양한 연구가 진행되고 있지만 사용이 제한적이거나 생산량이 많지 않아 백신 개발이 시급한 실정이다.For use as a biological weapon, there were records of experiments conducted on prisoners to measure the lethal dose of toxins in 731 units of Japan in the early 1930s. In 1944, Edward J. Schantz of the Army's Bacteriological Research Institute And discovered a way to isolate toxins, research on development and defense has begun. It was also used in conjunction with sarin gas in Japan's Aum truth religion in 1995 and has been published worldwide. Although it can be used as a biological weapon, infectious cases such as agricultural land, livestock, or food are also appearing, and research on this is important. Although there are various studies for treatment and prevention of botulism by some developed countries such as USA, there is an urgent need to develop a vaccine due to limited use or production volume.

보툴리눔 독소는 항원 특이성에 따라 7가지 혈청형(A, B, C, D, E, F, G)으로 구분되는데, 그 중 A, B, E형이 주로 인체에 질병을 일으키며, 특히 A형의 경우 인체에서 가장 강한 독성을 나타낸다. 이 독소는 사람사이의 전파는 일어나지 않으며, 독소 유입 경로에 따라 크게 식품 매개, 상처형, 유아형, 흡입형의 4가지 형태로 구분된다. 인위적으로 발생하는 보툴리눔 독소증은 주로 식품 매개나 흡입형으로 쉽게 전파될 수 있다.Botulinum toxin is classified into seven serotypes (A, B, C, D, E, F, and G) according to antigen specificity. Among them, A, B and E cause diseases in human body, It shows the strongest toxicity in human body. This toxin does not propagate between humans, and is divided into four types of food-mediated, wounded, infant-type, and inhalation-type depending on the toxin inflow route. Anthropogenic botulinum toxinosis can be easily spread to food-borne or inhaled forms.

보툴리눔 독소 A형은 약 150kDa 크기의 단백질로 하나의 펩타이드(Peptide)로 구성되어 있고 그 기능에 따라 크게 중쇄 C말단(Heavy Chain C-terminal, Hc), 중쇄 N말단(Heavy Chain N-terminal, Hn), 경쇄(Light Chain, LC) 세 가지의 도메인으로 나눌 수 있다. Botulinum toxin type A is a protein of about 150 kDa in size and consists of one peptide. Depending on its function, the heavy chain C-terminal (Hc), the heavy chain N-terminal, Hn ), And Light Chain (LC).

먼저 중쇄 C말단(Heavy Chain C-terminal, Hc) 부분에 해당하는 도메인은 약 50 kDa의 분자량을 가지고 있으며 콜린성 신경세포에 존재하는 수용체(receptor)에 특이적인 결합에 관여하는 부분으로 폴리사이알로간글리시드(Polysialoganglioside)나 시냅토태그민(synaptotagmin)과 같은 수용체를 인지하는 것으로 알려져 있다. 이러한 수용체와 결합 후 보툴리눔 독소는 세포내로 들어가게 된다.First, the domain corresponding to the heavy chain C-terminal (Hc) region has a molecular weight of about 50 kDa and is involved in a specific binding to a receptor present in the cholinergic neuron, It is known to recognize receptors such as Polysialoganglioside or Synaptotagmin. After binding to these receptors, the botulinum toxin enters the cell.

다음으로는 중쇄 N말단(Heavy Chain N-terminal, Hn) 부분에 해당하는 도메인으로 이 역시 약 50 kDa의 분자량을 가지고 있으며 세포내로 들어온 보툴리눔 독소에서 실제 독성 활성을 띠는 경쇄(Light chain, LC)를 이동시키는 역할을 한다.The light chain (LC), which has a molecular weight of about 50 kDa and has a toxic activity in a botulinum toxin that enters the cell, is the domain corresponding to the heavy chain N-terminal (Hn) .

마지막으로 경쇄(Light Chain, LC)는 활성화 부위에 존재하는 아연(Zinc, Zn2 +)을 매개로 하여 synaptic vesicle 단백질을 가수분해하는 역할을 한다. 보툴리눔 독소 A형의 경우에는 SNAP-25(synaptosomal-associated protein of 25 kDa) 단백질을 분해하여 아세틸콜린의 분비를 방해하고 이로 인해 근수축을 차단함으로써 마비증상을 나타낸다.Finally, Light Chain (LC) acts to hydrolyze the synaptic vesicle protein via zinc (Zinc, Zn 2 + ) present in the active site. In the case of botulinum toxin type A, SNAP-25 (synaptosomal-associated protein of 25 kDa) is degraded to block the secretion of acetylcholine, thereby blocking paralysis and thus causing paralysis.

톡소이드 방식으로 처음 시도된 보툴리눔 백신은 보툴리눔 독소 A형과 B형에 대한 것으로 1946년 미국 국방부(Department of Defense, DoD)에 의해 개발되었으며 이는 충분한 중화항체가를 나타내기는 하였으나 박테리아 단백질 등 불순물을 많이 포함하고 있어 이를 해결하기 위해 정제과정에서 독소를 침전시킬 때 염화칼슘(CaCl2)과 에탄올(EtOH)를 사용한 침전법을 이용하여 순도를 높이는 방법으로 제작하였다.The botulinum toxin first attempted to toxoid was developed by the Department of Defense (DoD) of the United States Department of Defense in 1946 for botulinum toxin types A and B, which, although showing sufficient neutralizing antibody titers, contained many impurities such as bacterial proteins In order to solve this problem, it was prepared by precipitation method using calcium chloride (CaCl 2 ) and ethanol (EtOH) to purify the toxin during purification process.

이를 토대로 보툴리눔 C형, D형, E형 역시 동일한 방식으로 제작하였고 그렇게 만들어진 것이 Pentavalent Botulinum Toxoid(PBT)이다. PBT는 미시간 공중보건부(Michigan Department of Public Health, MDPH)에 의해 처음 개발된 것으로 1971년에 처음 생산되었으며 미국 질병관리분부(CDC)에 의해 IND 161(고위험 직업군)과 IND 3723(군인) 허가를 받아 오늘날까지 생산해오고 있다.Based on this, botulinum type C, D, and E were also made in the same way and Pentavalent Botulinum Toxoid (PBT) was made. PBT was first developed by the Michigan Department of Public Health (MDPH) and was first produced in 1971 and approved by the US Centers for Disease Control (CDC) for IND 161 (high risk occupation) and IND 3723 It has been produced until today.

보툴리눔 독소에 대한 톡소이드 백신은 제작이 간편하고 빠른 시간 안에 생산할 수 있는 장점을 가지고는 있으나 생산량이 매우 적어 많은 양의 배양이 요구되며 많은 양을 생산하더라도 매우 위험하기 때문에 다루는데 어려움이 많다. 그리고 독소 외에 다른 단백질 등에 의해 백신으로 사용되기 위한 충분한 항체가가 나오기 어려울 수 있으며 비활성화 하더라도 약간의 독성이 남아있을 경우 심각한 부작용을 나타낼 수 있기 때문에 광범위한 사용을 위한 제한점이 많다. 이러한 문제점들 때문에 오늘날에는 독소의 일부 서열만 포함하거나 혹은 독성활성을 아미노산 변이 등을 통해 완전히 제거하는 재조합 방식을 응용한 백신 제조 및 개발이 진행되고 있다.Toxoid vaccine against botulinum toxin is easy to produce and has the advantage of being able to produce in a short time. However, it is very difficult to treat because it is very dangerous to produce a large quantity because it requires very large amount of culture. In addition, toxins may be difficult to release enough antibody to be used as a vaccine by other proteins, and even if deactivated, some toxicity may cause severe side effects. Because of these problems, the manufacture and development of vaccines employing recombinant methods that include only partial sequences of toxins or completely eliminate toxic activity through amino acid mutations are under way today.

보툴리눔 독소 A형 재조합 백신으로 rBV A/B(Recombinant Botulinum Toxin A/B Vaccine) 백신은 독성활성은 갖지 않으나 중화항체 생산이 용이한 중쇄 C말단(Heavy Chain C-terminal, Hc) 도메인만을 유전자 재조합을 통해 발현시켜 정제하여 사용한 것이다. 이 백신은 에어로졸에 의한 노출 시 방어를 목적으로 개발된 것으로 처음에는 미육군 전염병의학연구소(US Army Medical Research Institute of Infectious Diseases, USAMRIID)에서 연구를 시작하였으며 현재는 CSC's Dynport Vaccine Company와 MCS-JVAD에 의해 임상3상(NCT01940315)까지 완료되었고 2021년 FDA 승인을 목표로 개발 중에 있다.The recombinant Botulinum Toxin A / B Vaccine (rBV A / B) vaccine is a botulinum toxin type A recombinant vaccine that does not have toxic activity but only recombines the heavy chain C-terminal (Hc) domain, And then purified and used. This vaccine was developed for defense against aerosol exposure and was first initiated by the US Army Medical Research Institute of Infectious Diseases (USAMRIID) and is currently being used by CSC's Dynport Vaccine Company and MCS-JVAD (NCT01940315) and is under development for FDA approval in 2021.

또 다른 보툴리눔 독소 A형 백신으로 BoNT/A HC50 백신은 중쇄 C말단(Heavy chain C-terminal)부위에 존재하는 강글리오시드 부착 모티브(ganglioside binding motif)에 변이를 준 백신으로 세포내로 유입되는 것을 차단하여 만든 것이다. 이 백신은 보툴리눔 독소 A형의 중쇄 C말단(Hc)에 해당하는 865번 내지1296번 아미노산을 재조합하고 이 중 세포 유입에 관여하는 아미노산인 트립토판 1266번을 루신으로 타이로신 1267번을 세린으로 치환하여 세포 내 유입 활성을 억제하였다. 이 외에 경쇄(Light Chain, LC)을 재조합한 백신 연구도 시도되었으며, 이는 보툴리늄 독소 A형의 경쇄(Light Chain, LC) 부분 중 독성활성을 갖는 부위에 존재하는 아미노산 224과 262번 글루타민을 각각 알라닌으로 치환하여 스네어(SNARE) 단백질과의 결합 활성을 억제하여 독성을 제거한 백신이다.Another botulinum toxin type A vaccine, the BoNT / A HC50 vaccine, is a vaccine that has mutated the ganglioside binding motif at the heavy chain C-terminal site, It is made by. This vaccine recombines the 865th to 1296th amino acids corresponding to the heavy chain C terminal (Hc) of the botulinum toxin type A, replaces tryptophan 1266, which is an amino acid involved in cell entry, with serine, tyrosine 1267, And inhibited the infiltration activity. In addition, a vaccine study in which a light chain (LC) was recombinant was also tried. It was confirmed that the amino acids 224 and 262 glutamine existing in the toxic activity region of the light chain (LC) portion of the botulinum toxin type A were replaced with alanine To inhibit the binding activity with the SNARE protein, thereby eliminating toxicity.

이와 같이 다양한 방식으로 보툴리눔 독소 A형 백신 개발을 위한 시도가 진행되고 있으나 현재까지 개발 및 허가가 완료된 백신은 없으며 특히 우리나라의 경우에는 보툴리눔 독소 백신 개발에 대한 시도가 미미하다.There have been attempts to develop a botulinum toxin type A vaccine in a variety of ways. However, there is no vaccine that has been developed and approved until now, and in Korea, attempts to develop a botulinum toxin vaccine are insignificant.

한국등록특허 제10-0594787호 (2006.06.22)Korean Patent No. 10-0594787 (June 22, 2006)

이에 상기와 같은 점을 감안한 본 발명은 컴퓨터 시뮬레이션을 기반으로 하여 보툴리눔 독소 A형의 중쇄 C말단(Heavy Chain C-terminal, Hc) 삼차원구조를 주형으로 다양한 아미노산 변이를 시도함으로써 보툴리눔의 독성제거, 단백질 안정화, 중화항체 결합부위 유지 등을 갖는 새로운 형태의 보툴리눔 독소 A형 백신의 제공에 목적이 있다.In view of the above, the present invention is based on the computer simulation, and attempts to mutate various amino acids using the three-dimensional structure of the heavy chain C-terminal (Hc) of the botulinum toxin type A as a template to remove toxins of botulinum, Stabilizing, maintaining a neutralizing antibody binding site, and the like. The present invention provides a novel type of botulinum toxin type A vaccine.

또한, 상기와 같은 점을 감안한 본 발명의 목적은 보툴리눔 독소 A형에 의해 유발되는 질환의 예방 또는 치료용 백신을 제조할 수 있는 원핵세포 발현벡터를 제조하고, 상기 발현벡터에 의해 형질전환체로부터 보툴리눔 백신을 생산하는 것으로 보툴리눔 독소 A형 백신 제조방법의 제공에 목적이 있다.It is another object of the present invention to provide a prokaryotic cell expression vector capable of producing a vaccine for the prevention or treatment of a disease caused by botulinum toxin type A, The present invention provides a method for producing a botulinum toxin type A vaccine by producing a botulinum vaccine.

본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 제조된 보툴리눔 독소 A형 백신을 통해 보툴리눔 독소 A형에 의해 유발되는 질환 예방 및 치료용 조성물의 제공에 목적에 있다.It is another object of the present invention to provide a composition for preventing and treating diseases caused by botulinum toxin type A through the botulinum toxin type A vaccine.

상기와 같은 목적을 달성하기 위해 본 발명의 보툴리눔 독소 A형 백신은 서열번호 5 내지 서열번호 7 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 C말단(Heavy Chain C-terminal, Hc) 도메인을 포함하여 독성이 제거된 보툴리눔 독소 A형을 포함하는 것을 특징으로 한다.In order to achieve the above object, the botulinum toxin type A vaccine of the present invention comprises a heavy chain C-terminal (Hc) domain comprising the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 5 to 7, Lt; RTI ID = 0.0 > botulinum toxin A < / RTI >

이와 같은 상기 보툴리눔 독소 A형 백신은 서열번호 1의 아미노산 서열 중 N-말단으로부터 1269번째 아미노산이 알라닌(Alanine, Ala)으로 치환되어 서열번호 2로 기재된 아미노산 서열, 또는 서열번호 1의 아미노산 서열 중 N-말단으로부터 1117번째, 1253번째 및 1266번째 아미노산이 알라닌(Alanine, Ala)으로 치환되어 서열번호 3으로 기재된 아미노산 서열, 또는 서열번호 1의 아미노산 서열 중 N-말단으로부터 1203번째, 1253번째 및 1266번째 아미노산이 알라닌(Alanine, Ala)으로 치환되어 서열번호 4로 기재된 아미노산 서열을 갖는 독성이 제거된 보툴리눔 독소 A형을 포함한다.In the botulinum toxin type A vaccine, the 1269th amino acid from the N-terminal of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is substituted with alanine (Alanine, Ala) and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or the amino acid sequence of N -Terminus from the N-terminus of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 substituted by alanine (Alanine, Ala) at positions 1117, 1253, Toxin type A having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 substituted with alanine (Alanine, Ala).

구체적으로 상기 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 독성이 제거된 보툴리눔 독소 A형은 서열번호 5로 기재된 아미노산 서열로 표시된 중쇄 C말단(Heavy Chain C-terminal, Hc) 도메인을 갖고, 상기 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 독성이 제거된 보툴리눔 독소 A형은 서열번호 6로 기재된 아미노산 서열로 표시된 중쇄 C말단(Heavy Chain C-terminal, Hc) 도메인을 가지며, 상기 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 독성이 제거된 보툴리눔 독소 A형은 서열번호 7로 기재된 아미노산 서열로 표시된 중쇄 C말단(Heavy Chain C-terminal, Hc) 도메인을 가질 수 있다.Specifically, the toxin-deleted botulinum toxin type A having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 has a heavy chain C-terminal (Hc) domain represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, The toxin-free botulinum toxin type A having the amino acid sequence has a heavy chain C-terminal (Hc) domain represented by the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6, and the toxin having the amino acid sequence of SEQ ID NO: The botulinum toxin type A may have a heavy chain C-terminal (Hc) domain represented by the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7.

아울러 본 발명의 보툴리눔 독소 A형 유전자는 상기 서열번호 5 내지 서열번호 7로 기재된 보툴리눔 독소 A형의 중쇄 C말단(Heavy Chain C-terminal, Hc) 도메인을 코팅하는 핵산서열을 가질 수 있다.In addition, the botulinum toxin type A gene of the present invention may have a nucleic acid sequence for coating the heavy chain C-terminal (Hc) domain of botulinum toxin type A described in SEQ ID NOS: 5 to 7 above.

보툴리눔 독소 A형 유전자는 예를 들면, 서열번호 5로 기재된 보툴리눔 독소 A형의 중쇄 C말단(Heavy Chain C-terminal, Hc) 도메인을 코팅하는 서열번호 8로 기재된 핵산 서열을 가질 수 있고, 서열번호 6으로 기재된 보툴리눔 독소 A형의 중쇄 C말단(Heavy Chain C-terminal, Hc)을 코팅하는 서열번호 9로 기재된 핵산 서열을 가질 수 있다. 그리고 서열번호 7로 기재된 보툴리눔 독소 A형의 중쇄 C말단(Heavy Chain C-terminal, Hc)을 코팅하는 서열번호 10으로 기재된 핵산 서열을 가질 수 있다.The botulinum toxin type A gene may have, for example, a nucleic acid sequence as shown in SEQ ID NO: 8 coating a heavy chain C-terminal (Hc) domain of botulinum toxin type A described in SEQ ID NO: 9, which coats the heavy chain C-terminal (Hc) of the botulinum toxin type A as described in SEQ ID NO: 6. And a nucleic acid sequence as shown in SEQ ID NO: 10 for coating the heavy chain C-terminal (Hc) of botulinum toxin type A described in SEQ ID NO: 7.

또한, 상기와 같은 목적으로 보툴리눔 백신을 제조하기 위해 상기 중쇄 C말단(Heavy Chain C-terminal, Hc)을 코딩하는 서열번호 8 내지 서열번호 10 중 어느 하나의 핵산 서열을 가지는 보툴리눔 A형 독소의 중쇄 C말단(Heavy Chain C-terminal, Hc) 유전자를 포함하는 발현벡터를 재조합하여 준비한다.In order to achieve the above-mentioned object, a botulinum toxin type heavy chain having a nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 8 to SEQ ID NO: 10 encoding the heavy chain C-terminal (Hc) An expression vector containing the C-terminal heavy chain C-terminal (Hc) gene is prepared by recombination.

본 발명의 보툴리눔 백신의 제조방법은 상기 발현벡터로 형질전환된 원핵세포 형질전환체를 배양하는 단계, 및 상기 형질전환체로부터 발현된 목적 단백질을 분리 및 정제하는 단계를 포함한다. 이때, 상기 원핵세포는 대장균인 것이 바람직하다.The method for producing a botulinum vaccine of the present invention comprises culturing a prokaryotic cell transformant transformed with the expression vector, and isolating and purifying the target protein expressed from the transformant. At this time, the prokaryotic cell is preferably E. coli.

또한, 상기와 같은 목적을 달성하기 위해 보툴리눔 독소 A형에 의해 유발되는 질환 예방 및 치료용 조성물은 서열번호 5 내지 서열번호 7 중 어느 하나의 아미노산 서열을 가지는 보툴리눔 독소 A형의 중쇄 C말단(Heavy Chain C-terminal, Hc) 도메인을 포함하여 이루어진 보툴리눔 독소 A형 백신을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a composition for preventing and treating disease caused by botulinum toxin type A, comprising a heavy chain C terminal of a botulinum toxin type A having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 to SEQ ID NO: 7 Chain C-terminal, Hc) domain as an active ingredient.

상기 보툴리눔 독소 A형 백신은 보툴리눔 독소 A형의 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 1269번째 아미노산, 또는 1117번째, 1253번째 및 1266번째 아미노산, 또는 1203번째, 1253번째 및 1266번째 아미노산은 알라닌(Alanine, Ala)을 포함하고, 보툴리눔 독소 A형의 중쇄 C말단(Heavy Chain C-terminal, Hc) 도메인이 서열번호 5 내지 서열번호 7 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진다.The botulinum toxin type A vaccine has the amino acid sequence of the 1269th amino acid, the 1117th, 1253th and 1266th amino acids from the N-terminal, or the 1203th, 1253th and 1266th amino acids of the botulinum toxin type A, ), And the heavy chain C-terminal (Hc) domain of the botulinum toxin type A comprises the amino acid sequence of any one of SEQ ID NO: 5 to SEQ ID NO: 7.

이때, 상기 보툴리눔 독소 A형 백신은 상기 설명된 보툴리눔 독소 A형 백신의 제조방법과 동일한 방법으로 제조한 것이다.The botulinum toxin type A vaccine was prepared in the same manner as the botulinum toxin type A vaccine described above.

이러한 본 발명의 보툴리눔 독소 A형에 의해 유발되는 질환 예방 및 치료용 조성물은 콜레라톡신, 알루미늄 하이드록사이드, 카보폴(carbopol), 광물성 오일 및 생분해성(biodegradable) 오일 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 면역증강제를 추가로 포함할 수 있다.The composition for prevention and treatment of diseases caused by the botulinum toxin type A of the present invention may further comprise at least one immunostimulant selected from cholerotoxin, aluminum hydroxide, carbopol, mineral oil and biodegradable oil . ≪ / RTI >

또한, 본 명세서에서 사용된 '치료'라는 용어는 보툴리눔 독소의 중독에 의해 유발된 질환의 억제 및 보툴리눔 독소 중독에 의해 유발된 질환의 병적 상태를 경감하는 모든 행위를 의미한다.In addition, the term " treatment ", as used herein, refers to any act that reduces the disease caused by the poisoning of the botulinum toxin and alleviates the pathological condition of the disease caused by botulinum toxin poisoning.

본 발명의 조성물은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가지나 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라 약학적으로 허용되는 담체 및 또는 부형제츨 이용하여 제제화됨으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다.The composition of the present invention may be prepared in a unit dose form by being formulated using pharmaceutically acceptable carriers and / or excipients according to a method which can be readily carried out by a person having ordinary knowledge in the technical field to which the present invention belongs, As shown in FIG.

상기 조성물이 포함되는 약학적으로 허용되는 담체는 제제화 시 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토소, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럼, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것이 아니다.The pharmaceutically acceptable carrier in which the composition is contained is a material conventionally used in the formulation, and includes lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia rubber, calcium phosphate, alginate, gelatin, calcium silicate, But are not limited to, crystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methylcellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.

여기서, 상기 '약학적으로 허용되는 담체'란 생물체를 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 의미한다.Herein, the term "pharmaceutically acceptable carrier" means a carrier or diluent which does not irritate the organism and does not inhibit the biological activity and properties of the administered compound.

또한, 본 발명의 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.In addition, the composition of the present invention may further contain additives such as a lubricant, a wetting agent, a sweetening agent, a flavoring agent, an emulsifying agent, a suspending agent, a preservative, etc. in addition to the above components to form a parenteral, Tablets can be formulated.

본 발명의 약학적 조성물은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및 부형제를 이용하여 제제화 됨으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수도 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질 중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수도 있다.The pharmaceutical composition of the present invention may be prepared in a unit dose form by being formulated using a pharmaceutically acceptable carrier and excipient according to a method which can be easily carried out by a person having ordinary skill in the art to which the present invention belongs It may be manufactured by inserting it into a multi-capacity container. The formulations may be in the form of solutions, suspensions or emulsions in oils or aqueous media, or in the form of excipients, powders, granules, tablets or capsules, and may additionally contain dispersing or stabilizing agents.

본 발명에 따라 제작된 백신은 효과적으로 보툴리눔 독소 중에서 특히, 보툴리눔 독소 A형에 대한 중독을 억제할 뿐만 아니라 백신의 발현, 수용액에서의 용해성을 안정적으로 유지하는데 효과적으로써 보툴리눔 독소 A형에 의한 질병의 예방 및 치료에 사용될 수 있다.The vaccine prepared according to the present invention effectively inhibits poisoning of the botulinum toxin type A, particularly, among the botulinum toxin types, and is effective in stably maintaining the expression of the vaccine and the solubility in the aqueous solution, thereby preventing the disease caused by the botulinum toxin type A And can be used for treatment.

도 1 내지 도 3은 각각 본 발명의 실시예 따른 제1 보툴리눔 독소 A형 백신 내지 제3 보툴리눔 독소 A형 백신의 유전자 및 이에 상응하는 단백질 서열을 나타낸 모식도이다.
도 4는 본 발명에 실시예 따른 보툴리눔 독소 A형 백신 중쇄 C말단(Heavy Chain C-terminal, Hc)의 세포결합부위를 삼차원 구조 가상 시뮬레이션을 통해 모델링한 결과이다.
도 5는 본 발명에 따른 제1 보툴리눔 독소 A형 백신과 제2 보툴리눔 독소 A형 백신의 발현 벡터를 나타낸 모식도이다.
도 6은 본 발명에 따른 제3 보툴리눔 독소 A형 백신의 발현 벡터를 나타낸 모식도이다.
도 7a 내지 도 7c는 본 발명의 실시예에 따른 크기 배제 크로마토그래피의 크로마토그램을 나타낸 것이다.
도 8a 내지 도 8c는 본 발명의 실시예에 따른 크기 배제 크로마토그래피로 정제한 보툴리눔 독소 A형 백신을 SDS-PAGE로 분석한 결과이다.
도 9는 크기 배제 크로마토그래피 방법을 통해 최종정제를 마친 보툴리눔 독소 A형 백신을 SDS-PAGE로 분석한 결과이다.
도 10 내지 도 12는 본 발명의 생체 내 실험(in vivo)을 통해 그룹별로 보툴리눔 독소 A형을 20LD50의 양으로 투여한 뒤 생존율 나타낸 결과이다.FIGS. 1 to 3 are schematic views showing genes of the first botulinum toxin type A vaccine to the third botulinum toxin type A vaccine according to the embodiment of the present invention, and the corresponding protein sequences. FIG.
FIG. 4 is a result of modeling a cell binding site of a botulinum toxin type A vaccine heavy chain C-terminal (Hc) according to an embodiment of the present invention through a virtual simulation of a three-dimensional structure.
5 is a schematic diagram showing the expression vectors of the first botulinum toxin type A vaccine and the second botulinum toxin type A vaccine according to the present invention.
6 is a schematic diagram showing an expression vector of a third botulinum toxin type A vaccine according to the present invention.
Figures 7a-7c show chromatograms of size exclusion chromatography according to an embodiment of the present invention.
8A to 8C are results of SDS-PAGE analysis of a botulinum toxin type A vaccine purified by size exclusion chromatography according to an embodiment of the present invention.
FIG. 9 shows the result of SDS-PAGE analysis of the final purified botulinum toxin type A vaccine through the size exclusion chromatography method.
FIGS. 10 to 12 show the results of survival rates after administration of botulinum toxin type A in an amount of 20 LD 50 per group through in vivo experiments of the present invention.

본 명세서에서 사용되는 기술적 용어는 본 발명에서 특별히 다른 의미로 정의되지 않는 한, 본 발명의 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 의미로 해석되어야 하며, 과도하게 포괄적인 의미로 해석되거나, 과도하게 축소된 의미로 해석되지 않아야 한다. 또한, 본 발명에서 사용되는 일반적인 용어는 사전에 정의되어 있는 바에 따라, 또는 전후 문맥상에 따라 해석되어야 한다.Technical terms used herein should be interpreted in a sense that is generally understood by a person skilled in the art to which the present invention belongs, unless otherwise defined with special meaning in the present invention, And shall not be construed as an oversimplified meaning. In addition, the general terms used in the present invention should be construed in accordance with the predefined or prior context.

또한, 본 명세서에서 사용되는 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 즉, 본 명세서에서, '구성된다', '이루어진다' 또는 '포함한다' 등의 용어는 명세서상에 기재된 여러 구성 요소들, 또는 여러 단계 들을 반드시 모두 포함하는 것으로 해석되지 않아야 하며, 그 중 일부 구성 요소들 또는 일부 단계들은 포함되지 않을 수도 있고, 또는 추가적인 구성 요소 또는 단계들을 더 포함할 수 있는 것으로 해석되어야 한다.Also, the singular forms "as used herein include plural referents unless the context clearly dictates otherwise. In other words, in the present specification, terms such as "consisting of", "consisting of" or "including" shall not be construed as necessarily including the various components or steps described in the specification, Elements or some steps may not be included, or may be interpreted to include additional components or steps.

본 발명은 보툴리눔 독소 A형의 중쇄 C말단(Heavy Chain C-terminal, Hc)에 대한 단백질 구조를 이용해 삼차원 구조 모델링 프로그램으로 세포 결합 부위를 예측한 후, 세포 결합 부위에 해당하는 아미노산 중 알지닌(Arginine, Arg) 1269번, 타이로신(Tyrosine, Tyr) 1117번, 히스티딘(Histidine, His) 1253번, 트립토판(Tryptophan, Trp) 1266번, 글루탐산(Glutamate, Glu) 1203번을 선정하고, 이를 세 가지 형태로 조합하여 가상의 보툴리눔 백신 구조를 설계하고 이를 바탕으로 유전자를 합성하였다.The present invention uses a protein structure for the heavy chain C-terminal (Hc) of the botulinum toxin type A to predict cell binding sites using a three-dimensional structure modeling program, Arginine, Arg) 1269, Tyrosine (Tyr) 1117, Histidine, His 1253, Tryptophan Trp 1266 and Glutamate Glu 1203 were selected and classified into three types , And designed a virtual botulinum vaccine structure and synthesized genes based on this design.

이렇게 합성된 유전자는 트레오닌(Threonine, Thr) 876번부터 루신(Leusine, Leu) 1296번까지 한정하여 제작하고, 또한 합성 유전자는 히스티딘 표지(His tag) 또는 글루타티온 S-전달효소(Glutathione S-transferase, GST) 표지(tag) 결합의 형태로 발현시킬 수 있는 벡터에 클로닝하여 발현시켰다. 발현된 보툴리눔 백신은 친화도 크로마토그래피와 크기 배제 크로마토그래피를 통해 순수 분리하였으며, 최종 정제 과정을 마친 보툴리눔 백신은 생체 외(in vitro), 생체 내(in vivo) 실험을 통해 중화항체 생성 및 보툴리눔 독소 A형에 대한 중화능을 갖는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.Synthesized genes were synthesized from threonine (Thr) 876 to leucine (Leusine, Leu) 1296, and the synthetic genes were histidine tagged or glutathione S-transferase GST) tagged in the form of a linkage. Expressed botulinum vaccines were purified by affinity chromatography and size exclusion chromatography, and the botulinum vaccine after the final purification was in vitro , The present inventors completed the present invention by confirming that they have neutralizing antibody production and botulinum toxin type A neutralizing ability through in vivo experiments.

이하 실시예에서 본 발명의 보툴리눔 백신과 이의 제조방법을 보다 상세하게 설명되며, 이는 본 발명의 구체적 이해에 도움을 주기위한 것이며 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the botulinum vaccine of the present invention and its preparation method will be described in more detail. It is to be understood that the scope of the present invention is not limited thereto.

실시예 1은 보툴리눔 백신의 설계에 관한 것으로, 본 발명의 보툴리눔 백신을 설계하기 위해서 보툴리눔 독소 A형에 대한 아미노산 및 유전자 서열을 현재까지 문헌상으로 알려져 있는 중화항체 결합부위를 분석하고, 이를 이용하여 보툴리눔 독소 A형 단백질의 3차원 구조를 가지고 이 중화항체 결합부위가 구조적 영향을 미치지 않는지 재확인하여 백신을 설계한다.Example 1 relates to the design of a botulinum vaccine. In order to design a botulinum vaccine of the present invention, the amino acid and gene sequence for the botulinum toxin type A were analyzed for neutralizing antibody binding sites, The vaccine is designed by confirming that the neutralizing antibody binding site has no structural effect with the three-dimensional structure of the toxin A type protein.

구체적으로 실시예 1은 보툴리눔 독소 A형에 대한 단백질 서열(P10845)을 ExPASy Bioinformatics Resource Portal 웹사이트(http://expasy.org/)를 이용하여 유전자 및 단백질 서열을 분석하고, 분석한 서열을 이용하여 단백질 데이터 은행인 RCSB PDB(Research Collaboratory for Structural Bioinformatics Protein Data Bank, http://www.rcsb.org/pdb)에서 수록된 데이터베이스로부터 보툴리눔 독소 A형의 삼차원 구조파일인 PDB code로 3BTA를 제공받아 구조 분석을 실시한다. 이때, 단백질의 삼차원 구조 정보는 RCSB PDB 뿐만 아니라 공지의 다양한 데이터베이스를 통하여 제공받을 수 있으며, 이에 제한되지는 않는다.Specifically, in Example 1, the protein sequence (P10845) for the botulinum toxin type A was analyzed by using the ExPASy Bioinformatics Resource Portal website (http://expasy.org/) to analyze the gene and protein sequence and using the analyzed sequence 3BTA was provided from PDB code, which is a three-dimensional structure file of botulinum toxin type A, from the database recorded in RCSB PDB (Research Collaboratory for Structural Bioinformatics Protein Data Bank, http://www.rcsb.org/pdb) Analysis is performed. At this time, the three-dimensional structure information of the protein can be provided through various known databases as well as RCSB PDB, but is not limited thereto.

이후, 공지의 3차원 구조 데이터베이스로부터 제공받은 보툴리눔 독소 A형의 3차원 구조 정보는 3차원 분자 시각화 프로그램인 Discovery Studio 4.5 단백질 모델링 프로그램을 이용하여 분석하며, 이를 통해 보툴리눔 독소 A형의 중쇄 C말단(Heavy Chain C-terminal, Hc) 도메인에서 세포 결합 부위에 해당하는 아미노산을 정의하고, 정의된 아미노산을 알라닌(Alanine, Ala)으로 치환하여 보툴리눔 백신을 설계한다.The 3D structure information of the botulinum toxin type A provided from the known three-dimensional structure database is analyzed using Discovery Studio 4.5 protein modeling program, which is a three-dimensional molecular visualization program, whereby the heavy chain C terminal of the botulinum toxin type A The amino acid corresponding to the cell binding site is defined in the Heavy Chain C-terminal (Hc) domain, and the defined amino acid is replaced with alanine (Alanine, Ala) to design the botulinum vaccine.

여기서, 상기 세포 결합 부위는 앞서 배경기술에서 설명한 바와 같이 보툴리눔 독소 A형의 단백질 구조는 중쇄 C말단(Heavy Chain C-terminal, Hc), 중쇄 N말단(Heavy Chain N-terminal, Hn), 경쇄(Light Chain, LC) 세 가지의 도메인으로 나뉘며, 이 중에서 중쇄 C말단(Heavy Chain C-terminal, Hc) 도메인은 보툴리눔 독소가 신경 세포 내로 들어가도록 하여 독성을 일으키는 역할을 한다.As described in the Background section, the protein structure of the botulinum toxin type A includes heavy chain C-terminal (Hc), heavy chain N-terminal (Hn), light chain Light Chain, and LC). Among them, the heavy chain C-terminal (Hc) domain plays a role of causing the botulinum toxin to enter the nerve cell to cause toxicity.

바람직하게 상기 보툴리눔 독소 A형의 중쇄 C말단(Heavy Chain C-terminal, Hc) 도메인은 보툴리눔 독소 A형의 아미노산 서열로 서열번호 1의 아미노산 서열 중 N-말단으로부터 876번 트레오닌(Threonine, Thr)부터 1296번 루신(Leusine, Leu)까지의 아미노산 서열로 표시되는 것이다.Preferably, the heavy chain C-terminal (Hc) domain of the botulinum toxin type A is an amino acid sequence of the botulinum toxin type A and is selected from the group consisting of Threonine (Thr) 876 from the N-terminal end of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1296 Leucine (Leusine, Leu).

본 발명에서는 보툴리눔 독소 A형의 중쇄 C말단(Heavy Chain C-terminal, Hc) 도메인에서 아미노산 치환 및 단백질 발현 서열 부위에 대해 현재까지 문헌상으로 알려져 있는 중화항체 결합부위를 확인하여 결정하였다. 따라서 상기 보툴리눔 독소 A형의 중쇄 C말단(Heavy Chain C-terminal, Hc) 도메인에서 세포 결합 부위에 해당하는 아미노산인 독성활성부위를 알라닌(Alanine, Ala)으로 치환하여 독성 활성을 제거한 보툴리눔 독소 A형 백신을 설계한다.In the present invention, the amino acid substitution and protein expression sequence regions of the heavy chain C-terminal (Hc) domain of the botulinum toxin type A were confirmed by confirming the neutralizing antibody binding sites known to date in the literature. Therefore, the toxic active site, which is the amino acid corresponding to the cell binding site in the heavy chain C-terminal (Hc) domain of the botulinum toxin type A, is replaced with alanine (Alanine, Ala) Design the vaccine.

도 1 내지 도 3은 보툴리눔 독소 A형의 중쇄 C말단(Heavy Chain C-terminal, Hc) 도메인에서 독성활성부위에 해당하는 아미노산을 알라닌(Alanine, Ala)으로 치환하여 설계된 보툴리눔 독소 A형 백신에 대한 보툴리눔 독소 A형의 중쇄 C말단의 아미노산 서열과 해당 아미노산 서열에 따라 정의된 유전자 서열을 나타낸 것이다.FIGS. 1 to 3 show the results of a botulinum toxin type A vaccine designed by replacing an amino acid corresponding to a toxic active site with alanine (Alanine, Ala) in the heavy chain C-terminal (Hc) domain of the botulinum toxin type A The amino acid sequence of the heavy chain C terminal of the botulinum toxin type A and the gene sequence defined according to the corresponding amino acid sequence.

일 구체예로서 서열번호 1의 아미노산 서열 중 N-말단으로부터 1269번째 알지닌(Arginine, Arg)이 알라닌(Alanine, Ala)으로 치환하여 서열번호 2로 기재된 독성이 제거된 보툴리눔 독소 A형으로서, 도 1에 도시된 바와 같이 중쇄 C말단의 아미노산 서열과 아미노산을 설정하여 보툴리눔 독소 A형 백신을 설계하고, 이를 본 발명에서 '제1 보툴리눔 독소 A형 백신' 또는 '보툴리눔 독소 A형 백신 #1'이라 명칭한다.In one embodiment, the toxin-free botulinum toxin type A as set forth in SEQ ID NO: 2 is substituted with alanine (Alanine, Ala) at position 1269 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 from Arginine As shown in FIG. 1, the botulinum toxin type A vaccine is designed by setting the amino acid sequence of the heavy chain C terminal and the amino acid, and this is referred to as 'first botulinum toxin type A vaccine' or 'botulinum toxin type A vaccine # 1' .

다른 구체예로서 도 2는 서열번호 1의 아미노산 서열 중 N-말단으로부터 1117번째 타이로신(Tyrosine, Tyr), 1253번째 히스티딘(Histidine, His) 및 1266번째 트립토판(Tryptophan, Trp)을 알라닌(Alanine, Ala)으로 치환하여 서열번호 3로 기재된 독성이 제거된 보툴리눔 독소 A형으로, 도 2에 도시된 바와 같이 중쇄 C말단의 아미노산 서열과 아미노산을 설정하여 보툴리눔 독소 A형 백신을 설계하고, 이를 본 발명에서 '제2 보툴리눔 독소 A형 백신' 또는 '보툴리눔 독소 A형 백신 #2'이라 명칭한다.In another embodiment, FIG. 2 shows the results of tyrosine tyrosine tyrosine tyrosine tyrosine tyrosine tyrosine tyrosine tyrosine tyrosine tyrosine tyrosine tyrosine tyrosine tyrosine tyrosine tyrosine tyrosine tyrosine tyrosine tyrosine tyrosine tyrosine tyrosine tyrosine tyrosine tyrosine Tyrosine Tyrosine ) To design the botulinum toxin type A vaccine by setting the amino acid sequence of the heavy chain C terminal and the amino acid as shown in Fig. 2 as the toxin-free botulinum toxin type A as shown in SEQ ID NO: 3, The second botulinum toxin type A vaccine " or " botulinum toxin type A vaccine # 2 ".

또 다른 구체예로 서열번호 1의 아미노산 서열 중 N-말단으로부터 1203번째 글루탐산(Glutamate, Glu), 1253번째 히스티딘(Histidine, His) 및 1266번째 트립토판(Tryptophan, Trp)을 알라닌(Alanine, Ala)으로 치환하여 서열번호 4로 기재된 독성이 제거된 보툴리눔 독소 A형으로, 도 3에 도시된 바와 같이 중쇄 C말단의 아미노산 서열과 아미노산을 설정하여 보툴리눔 독소 A형 백신을 설계하고, 이를 '제3 보툴리눔 독소 A형 백신' 또는 '보툴리눔 독소 A형 백신 #3'이라 명칭하였다.(Glutamate, Glu), 1253th Histidine (His), and 1266th tryptophan (Trp) from the N-terminus of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 into alanine The toxin-free botulinum toxin type A as set forth in SEQ ID NO: 4 was substituted with the amino acid sequence of the heavy chain C terminal and amino acid as shown in FIG. 3 to design a botulinum toxin type A vaccine, A type vaccine " or " Botulinum toxin type A type vaccine # 3 ".

도 4 는 상기 실시예 1에 따라 설계된 보툴리눔 독소 A형 백신이 보툴리눔 독소 A형 단백질과 유사성과 설계된 보툴리눔 독소 A형 백신의 구조형성의 안정성을 확인하기 위해 설계된 보툴리눔 독소 A형 백신의 중쇄 C말단 도메인에서의 세포결합부위를 삼차원 구조 가상 시물레이션을 통해 모델링하여 확인하였다. FIG. 4 is a graph showing the similarity between the botulinum toxin type A protein and the heavy chain C terminal domain of the botulinum toxin type A vaccine designed to confirm the stability of the structure formation of the designed botulinum toxin type A vaccine, Were identified by modeling the three - dimensional structure through virtual simulation.

실시예 2는 보툴리눔 독소 A형 백신 발현 균주의 제조에 관한 것으로, 상기 실시예 1에서 설계된 제1 보툴리눔 독소 A형 백신과 제2 보툴리눔 독소 A형 백신의 경우는 독성활성이 제거된 보툴리눔 독소 A형의 중쇄 C말단(Heavy Chain C-terminal, Hc) 도메인에 대한 유전자(서열번호 7, 8)를 pET28a 발현벡터에 제한효소 NdeI 및 NotI를 사용하여 삽입한 뒤 대장균(E.coli) BL21 균주에 클로닝하여, 최종적으로 보툴리눔 독소 A형의 중쇄 C말단(Heavy Chain C-terminal, Hc) 도메인 유전자가 클로닝된 재조합 벡터로써 보툴리눔 독소 A형 백신의 발현벡터를 포함하는 보툴리눔 독소 A형 백신 발현 균주를 제작한다. 이처럼 제1 보툴리눔 독소 A형 백신과 제2 보툴리눔 독소 A형 백신이 삽입된 발현벡터는 도 5에 도시된 바와 같다.Example 2 relates to the preparation of a botulinum toxin type A vaccine expression strain. In the case of the first botulinum toxin type A vaccine and the second botulinum toxin type A vaccine designed in Example 1, the botulinum toxin type A (SEQ ID NOS: 7 and 8) for the heavy chain C-terminal (Hc) domain of E. coli was inserted into pET28a expression vector using restriction enzymes NdeI and NotI and cloned into E. coli strain BL21 , A botulinum toxin type A vaccine expression strain containing an expression vector of a botulinum toxin type A vaccine is finally prepared as a recombinant vector in which a heavy chain C-terminal (Hc) domain gene of botulinum toxin type A is cloned . The expression vectors in which the first botulinum toxin type A vaccine and the second botulinum toxin type A vaccine are inserted are shown in FIG.

또 다른 보툴리눔 독소 A형 백신 발현 균주의 제조 방법으로 상기 실시예 1를 통해 설계된 제3 보툴리눔 독소 A형 백신의 경우는 독성활성이 제거된 보툴리눔 독소 A형의 중쇄 C말단(Heavy Chain C-terminal, Hc) 도메인에 대한 유전자(서열번호 9)를 pGEX4T3 발현벡터에 제한효소 BamHI 및 NotI를 사용하여 삽입한 뒤 대장균(E.coli) BL21 균주에 클로닝하여, 최종적으로 보툴리눔 독소 A형의 중쇄 C말단(Heavy Chain C-terminal, Hc) 도메인 유전자가 클로닝된 재조합 벡터로써 제3 보툴리눔 독소 A형 백신의 발현벡터를 포함하는 보툴리눔 독소 A형 백신 발현 균주를 제작한다. 이렇게 제 3 보툴리늄 독소 A형 백신이 삽입된 발현벡터는 도 6에 나타낸 바와 같다.In the case of the third botulinum toxin type A vaccine designed through Example 1 as a method of producing another botulinum toxin type A vaccine expression strain, the heavy chain C-terminal of botulinum toxin type A with toxic activity removed, Hc) domain (SEQ ID NO: 9) was inserted into pGEX4T3 expression vector using restriction enzymes BamHI and NotI and cloned into E. coli BL21 strain to finally obtain the botulinum toxin type A heavy chain C terminal A botulinum toxin type A vaccine expression vector comprising the expression vector of the third botulinum toxin type A vaccine is produced as a recombinant vector in which the heavy chain C-terminal, Hc) domain gene is cloned. The expression vector in which the third botulinum toxin type A vaccine is inserted is shown in Fig.

그리고 제1 보툴리눔 독소 A형 백신 내지 제3 보툴리눔 독소 A형 백신의 발현벡터를 포함하는 백신 발현 균주만 선별하기 위해, 선별 항생제로 카나마이신(Kanamycine)이 포함된 LB배지(1% 트립톤, 0.5% 효모추출물, 1% 염화나트륨)에 상기 백신 발현 균주를 접종한 다음 37℃에서 배양하여 카나마이신에 저항성을 가지는 최종 균주를 선별함으로써 보툴리눔 독소 A형 백신 발현 균주를 제조한다.(1% tryptone, 0.5% trypsin) containing kanamycin as a selective antibiotic to isolate only the vaccine expression strain containing the expression vectors of the first botulinum toxin type A vaccine to the third botulinum toxin type A vaccine. Yeast extract, 1% sodium chloride), followed by incubation at 37 ° C. to select a final strain resistant to kanamycin, thereby producing a botulinum toxin type A vaccine expression strain.

실시예 3은 상기 실시예 2를 통해 제조된 보툴리눔 백신 발현 균주로부터 보툴리눔 백신을 발현하고 정제하는 방법에 관한 것으로, 발현벡터의 따라 보툴리눔 독신 A형 백신의 발현과 정제를 수행한다.Example 3 relates to a method for expressing and purifying a botulinum vaccine from the botulinum vaccine expression strain prepared in Example 2, and the expression and purification of the botulinum toxin type A vaccine are performed according to the expression vector.

제1 보툴리눔 독소 A형 백신 및 제2 보툴리눔 독소 A형 백신의 경우는 상기 클로닝된 대장균 균주를 선별 항생제로 카나마이신(Kanamycine)이 포함된 LB배지(1% 트립톤, 0.5% 효모추출물, 1% 염화나트륨)에 접종한 다음 37℃에서 한밤동안 진탕 배양하여, 배양한 배양액의 OD600(600 nm에서의 흡광도)값이 0.5 내지 0.6 사이이면, 유도 발현물질인 이소프로필 1-티오-β-D-갈락토시드(isopropyl 1-thio-β-D-galactoside, IPTG)를 최종 1mM 농도로 넣고 다시 3시간 동안 추가 배양하여 본 발명의 보툴리눔 백신의 발현을 유도한다. 그 다음 배양액으로부터 대장균 균주는 15000 rpm의 속도로 4℃ 온도에서 10분 동안 원심분리를 통하여 수확하였으며, 펠렛(pellet)형태로 수확한 대장균 균주에서 단백질을 정제하기 위해 20 mM Tris-HCl(pH8.0), 200mM NaCl 완충용액에 부유시킨 후, 초음파 파쇄(sonication)방법으로 초음파 파쇄기를 이용하여 균체를 파쇄하고 다시 원심분리하여 상등액만 얻는다.In the case of the first botulinum toxin type A vaccine and the second botulinum toxin type A vaccine, the cloned Escherichia coli strains were cultured in LB medium (kanamycin containing 1% tryptone, 0.5% yeast extract, 1% sodium chloride ) And incubated overnight at 37 ° C with shaking, and when the OD 600 (absorbance at 600 nm) value of the cultured medium is between 0.5 and 0.6, isopropyl 1-thio-β-D-gal The final concentration of 1 mM of isopropyl 1-thio-β-D-galactoside (IPTG) was further added for another 3 hours to induce the expression of the botulinum vaccine of the present invention. The E. coli strain was then harvested by centrifugation at 4 ° C for 10 minutes at a rate of 15000 rpm and then diluted with 20 mM Tris-HCl (pH 8) to purify the protein from the E. coli strain harvested in the form of a pellet. 0) and suspended in 200 mM NaCl buffer. The cells are disrupted by sonication using an ultrasonic wave crusher and centrifuged again to obtain only the supernatant.

이렇게 얻은 상등액은 친화도 크로마토그래피(Affinity chromatography)방법으로 미리 평형화시킨 금속 친화성(immobilized metal affinity) 컬럼인 니켈-NTA(Ni-NTA)컬럼에 첨가하여 컬럼 레진에 히스티딘(histidine)이 붙여진 과다 발현된 보툴리눔 독소 A형 백신을 결합시킨 후 트롬빈(Thrombin)을 처리하여 보툴리눔 백신을 1차 정제한다.The supernatant thus obtained is added to a nickel-NTA (Ni-NTA) column, which is an immobilized metal affinity column pre-equilibrated by affinity chromatography, and the column resin is over-expressed with histidine The botulinum toxin type A vaccine is bound and treated with thrombin to purify the botulinum vaccine first.

그 다음, 상기 1차 정제한 리신 백신에 대해 2차 정제 방법으로 크기배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography)를 이용 통해 정제한다. 본 발명에서 크기 배제 크로마토그래피는 120ml 부피의 HiLoad 16/60 superdex 200 column(GE healthcare 사)를 사용하여 크기 배제 크로마토그래피를 pH7.4의 20mM 인산완충용액(phosphate buffer saline, PBS)를 완충용액 조건에서 수행하여 보툴리눔 백신을 최종 정제한다.Then, the primary purified lysine vaccine is purified through size exclusion chromatography using a secondary purification method. In the present invention, size exclusion chromatography was carried out by using 20ml volume of HiLoad 16/60 superdex 200 column (GE Healthcare) in 20mM phosphate buffer saline (PBS) at pH 7.4 in buffer solution condition To perform final purification of the botulinum vaccine.

제3 보툴리눔 독소 A형 백신경우에는 상기 클로닝된 대장균 균주를 선별 항생제로 카나마이신(Kanamycine)이 포함된 LB배지(1% 트립톤, 0.5% 효모추출물, 1% 염화나트륨)에 접종한 다음 37℃에서 한밤동안 진탕 배양하여, 배양한 배양액의 OD600(600 nm에서의 흡광도)값이 0.4 내지 0.5 사이이면, 유도 발현물질인 이소프로필 1-티오-β-D-갈락토시드(isopropyl 1-thio-β-D-galactoside, IPTG)를 최종 0.5mM 농도로 넣고 다시 20℃ 온도에서 12시간 동안 추가 배양하여 본 발명의 보툴리눔 백신의 발현을 유도한다. 그 다음 배양액으로부터 대장균 균주는 15000 rpm의 속도로 4℃ 온도에서 10분 동안 원심분리를 통하여 수확하였으며, 펠렛(pellet)형태로 수확한 대장균 균주에서 단백질을 정제하기 위해 20 mM Tris-HCl(pH8.0), 200mM NaCl 완충용액에 부유시킨 후, 초음파 파쇄(sonication)방법으로 초음파 파쇄기를 이용하여 균체를 파쇄하고 다시 원심분리하여 상등액만 얻는다.In the case of the third botulinum toxin type A vaccine, the cloned E. coli strain was inoculated into LB medium (1% tryptone, 0.5% yeast extract, 1% sodium chloride) containing kanamycin as a selective antibiotic, (OD 600) (absorbance at 600 nm) of the cultured culture medium is 0.4 to 0.5, isopropyl 1-thio-β-galactoside -D-galactoside, IPTG) at a final concentration of 0.5 mM and further cultured at 20 ° C for 12 hours to induce the expression of the botulinum vaccine of the present invention. The E. coli strain was then harvested by centrifugation at 4 ° C for 10 minutes at a rate of 15000 rpm and then diluted with 20 mM Tris-HCl (pH 8) to purify the protein from the E. coli strain harvested in the form of a pellet. 0) and suspended in 200 mM NaCl buffer. The cells are disrupted by sonication using an ultrasonic wave crusher and centrifuged again to obtain only the supernatant.

이렇게 얻은 상등액은 GST 친화 크로마토그래피(Affinity chromatography)방법으로 미리 평형화시킨 GST 컬럼(Glutathione S-transferase binding resin column)을 사용하여 GST(Glutathion S-transferase) 태그가 붙여진 제3 보툴리늄 독소 A형 백신을 결합시킨 후 트롬빈(Thrombin)을 처리하여 보툴리눔 백신을 1차 정제한다.The supernatant thus obtained was combined with a third botulinum toxin type A vaccine tagged with Glutathione S-transferase (GST) using a GST column (Glutathione S-transferase binding resin column) pre-equilibrated by GST Affinity Chromatography After treatment with thrombin, the botulinum vaccine is firstly purified.

그 다음, 상기 1차 정제한 리신 백신에 대해 2차 정제 방법으로 크기배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography)를 이용 통해 정제한다. 본 발명에서 크기 배제 크로마토그래피는 120ml 부피의 HiLoad 16/60 superdex 200 column(GE healthcare 사)를 사용하여 크기 배제 크로마토그래피를 pH7.4의 20mM 인산완충용액(PBS)를 완충용액 조건에서 선택적 분리 및 정제를 하였다.Then, the primary purified lysine vaccine is purified through size exclusion chromatography using a secondary purification method. In the present invention, size exclusion chromatography was performed by using size-exclusion chromatography using a HiLoad 16/60 superdex 200 column (GE Healthcare, Inc.) in a volume of 120 ml by selective isolation and separation of 20 mM phosphate buffer (PBS) And purified.

그리고 앞서 설명한 바와 같이 최종 정제를 마친 단백질을 Agilent사의 Bio-analyzer 장비를 이용해 분자량, 순도 및 농도를 분석하였다. 이때 분석 키트(kit)로는 agilent protein 230 reagent와 chip를 사용하여 분석을 수행하였다.Finally, the final purified proteins were analyzed for molecular weight, purity and concentration using a Bio-analyzer kit from Agilent. At this time, analysis was performed using an agilent protein 230 reagent and a chip as an assay kit.

도 7a 내지 도 7c는 크기 배제 크로마토그래피의 크로마토그램을 나타낸 것으로 도 7a에 도시된 바와 같이 완충용액으로부터 용출시켜 나온 제1 보툴리눔 독소 A형 백신과 제2 보툴리눔 독소 A형 백신 단백질의 피크(peak)가 분획번호 E1 내지 E9 사이에서 확인되고, 제3 보툴리눔 독소 A형 백신 단백질의 피크는 분획번호 E2 내지 E10 사이에서 존재함을 확인할 수 있었다.FIGS. 7A to 7C show chromatograms of size exclusion chromatography. As shown in FIG. 7A, the peaks of the first botulinum toxin type A vaccine and the second botulinum toxin type A vaccine protein eluted from the buffer solution, Was found between fractions E1 to E9, and a peak of the third botulinum toxin type A vaccine protein was present between fractions E2 to E10.

그리고 도 8a 내지 도 8c는 크기 배제 크로마토그래피를 진행한 후 피크에서 확인된 보툴리눔 백신 A형의 분획물을 정성 및 정량적으로 확인하기 위해 SDS-PAGE(Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) 분석을 실시한 것으로, 각 레인(lane)에 나타난 숫자는 상기 도 7a 내지 도 7c에서 분획된 분획물(fraction)에 해당하는 시료를 나타내며, 약 49kDa의 위치의 보툴리눔 독소 A형은 대부분이 컬럼에 결합하여 용출되어 나온 피크의 분획에 존재하는 것을 확인하였다.8A to 8C are SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) analysis to qualitatively and quantitatively confirm fractions of the botulinum type A vaccine identified at the peak after size exclusion chromatography, The number in the lane represents a fraction corresponding to the fractions fractioned in FIGS. 7A to 7C. The botulinum toxin type A at about 49 kDa is mostly fractionated from the fraction eluted from the column, . ≪ / RTI >

도 9는 최종 정제를 마친 제1 보툴리눔 독소 A형 백신, 제2 보툴리눔 독소 A형 백신 내지 제3 보툴리눔 독소 A형 백신을 SDS-PAGE로 확인한 결과를 나타내며, 세 가지 보툴리눔 독소 A형 백신의 분자량은 약 49kDa 위치에서 단백질 밴드를 확인할 수 있었고, 순도는 제1 보툴리눔 독소 A형 백신과 제2 보툴리눔 독소 A형 백신의 경우에는 약 99%, 제3 보툴리눔 독소 A형 백신의 경우에는 85% 정도 순도를 갖는 것을 확인하였다.FIG. 9 shows the results of SDS-PAGE of the first botulinum toxin type A vaccine, the second botulinum toxin type A vaccine, and the third botulinum toxin type A vaccine after final purification, and the molecular weights of the three botulinum toxin type A vaccines were Protein bands were confirmed at about 49 kDa. The purity was about 99% for the first botulinum toxin type A vaccine and the second botulinum toxin type A vaccine, and about 85% for the third botulinum toxin type A vaccine .

앞서 설명한 바와 같이 본 발명의 일 실시예에 따라 분리된 보툴리눔 독소 A형 백신에 대한 생체내실험(in vivo)을 수행하여 보툴리눔 독소 A형 백신의 효능 평가를 하였다. 생체내실험(in vivo)에서 사용한 ICR 마우스는 실험군당 5마리로 그룹을 나누었다. 보툴리눔 독소 A형 백신 투여군은 앞서 실시예에서 제조된 제1 보툴리눔 독소 A형 백신 내지 제3 보툴리눔 독소 A형 백신 투여군으로 나눈 뒤, 각각의 보툴리눔 독소 A형 백신을 0, 2, 4 주에 10 ug/마리 및 20 ug/마리의 양으로 피하투여(subcutaneous injection, 이하, 'SC'라고도 명명함) 및 근육내투여(intramuscular injection, 이하, 'IM'이라고도 명명함) 하고, 음성대조군으로 인산완충용액(phosphate buffer saline, PBS)를 동일용량으로 피하투여 하였다. 백신 투여 5주째에 보툴리눔 독소 A형을 각각 20LD50의 용량으로 복강투여(intraperitoneal injection)하였다. 이때 상기 보툴리눔 독소 A형 20LD50의 투여량은 2.5 ng/마리의 농도로 하여 투여하였다.As described above, the efficacy of the botulinum toxin type A vaccine was evaluated by in vivo experiments on the isolated botulinum toxin type A vaccine according to one embodiment of the present invention. ICR mice used in in vivo experiments were divided into 5 mice per experimental group. The botulinum toxin type A vaccine administration group was divided into the first botulinum toxin type A vaccine to the third botulinum toxin type A vaccine administration group prepared in the previous example, and each botulinum toxin type A vaccine was administered at 10, Subcutaneous injection (hereinafter also referred to as 'SC') and intramuscular injection (hereinafter also referred to as 'IM') in an amount of 20 μg / mouse and 20 μg / (phosphate buffer saline, PBS) were subcutaneously administered at the same dose. At 5 weeks after vaccination, botulinum toxin type A was intraperitoneally injected at a dose of 20 LD 50 each (intraperitoneal injection). At this time, the dose of the botulinum toxin type 20 LD 50 was administered at a concentration of 2.5 ng / mouse.

도 10 내지 도 12는 본 발명의 생체내실험(in vivo)을 통해 그룹별 각각 보툴리눔 독소 A형을 20LD50의 양으로 투여한 뒤 생존율을 나타낸 것이다. 도 10 내지 도 12에 도시된 바와 같이 보툴리눔 독소 A형 투여 후 인산완충식염수를 투여한 음성 대주군은 전수 폐사하였고, 이와 달리 본 발명의 제1 보툴리눔 독소 A형 백신 내지 제3 보툴리눔 독소 A형 백신을 10 ug/마리 피하투여한 군에서 전수 생존하였으며, 20 ug/마리 피하투여한 군에서 100% 생존율을 보였으며, 10 ug/마리 근육내투여한 군과, 20 ug/마리 근육내 투여한 군에서도 100%의 생존율을 보였다.FIGS. 10 to 12 show survival rates after administration of botulinum toxin type A in an amount of 20 LD 50 , respectively, in vivo in the in vivo experiment of the present invention. As shown in FIGS. 10 to 12, the negative control group administered with phosphate buffered saline after administration of botulinum toxin type A was totally killed. In contrast, the first botulinum toxin type A vaccine to the third botulinum toxin type A vaccine The survival rate was 100% in the group treated with 20 ug / mouse subcutaneously, and the survival rate in the group treated with 10 ug / mouse intramuscularly and 20 ug / mouse administered intramuscularly And 100% survival rate.

본 발명의 보툴리눔 독소 A형 백신에 대한 항체역가를 측정하고자 보툴리눔 독소 A형 백신 투여 3주와 5주째에는 안와채혈을 통하여 각 그룹의 혈액을 채취하여, 채취된 혈액에서 보툴리눔 독소 A형 백신의 항체역가(antibody titer)를 분석하여, 그 결과를 아래 표 1 내지 표 3에 순서대로 나타내었다. 항체역가 분석은 효소결합면역흡착측정법(Enzyme Linked immunosorbent assay, ELISA)를 이용하였으며, 이때, 항체역가의 정량방법은 종점희석기법(end point dilution)을 시행하여 450nm에서 흡광도를 측정하였다.To measure the antibody titer of the botulinum toxin type A vaccine of the present invention, the blood of each group was collected through the orbital blood collection at the 3rd and 5th weeks of the botulinum toxin type A vaccine administration, and the blood of the botulinum toxin type A vaccine The antibody titer was analyzed and the results are shown in Tables 1 to 3 below. Antibody titers were measured by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). At this time, end point dilution method was used for quantification of antibody titers. Absorbance was measured at 450 nm.

그룹group 제1 보툴리눔 독소 A형 백신The first botulinum toxin type A vaccine 평균 항체역가Mean antibody titer 3주3 weeks SC, 10 ug/마리SC, 10 ug / milliliter < 50<50 SC, 20 ug/마리SC, 20 ug / grains < 50<50 IM, 10 ug/마리IM, 10 ug / milliliter < 50<50 IM, 20 ug/마리IM, 20 ug / mari < 50<50 5주5 weeks SC, 10 ug/마리SC, 10 ug / milliliter 2121 SC, 20 ug/마리SC, 20 ug / grains 47314731 IM, 10 ug/마리IM, 10 ug / milliliter 179179 IM, 20 ug/마리IM, 20 ug / mari 886886

그룹group 제2 보툴리눔 독소 A형 백신The second botulinum toxin type A vaccine 평균 항체역가Mean antibody titer 3주3 weeks SC, 10 ug/마리SC, 10 ug / milliliter < 50<50 SC, 20 ug/마리SC, 20 ug / grains < 50<50 IM, 10 ug/마리IM, 10 ug / milliliter < 50<50 IM, 20 ug/마리IM, 20 ug / mari < 50<50 5주5 weeks SC, 10 ug/마리SC, 10 ug / milliliter 559559 SC, 20 ug/마리SC, 20 ug / grains 10541054 IM, 10 ug/마리IM, 10 ug / milliliter 16911691 IM, 20 ug/마리IM, 20 ug / mari 30173017

그룹group 제3 보툴리눔 독소 A형 백신The third botulinum toxin type A vaccine 평균 항체역가Mean antibody titer 3주3 weeks SC, 10 ug/마리SC, 10 ug / milliliter 20492049 SC, 20 ug/마리SC, 20 ug / grains 28512851 IM, 10 ug/마리IM, 10 ug / milliliter 17411741 IM, 20 ug/마리IM, 20 ug / mari 50655065 5주5 weeks SC, 10 ug/마리SC, 10 ug / milliliter 45844584 SC, 20 ug/마리SC, 20 ug / grains 1776117761 IM, 10 ug/마리IM, 10 ug / milliliter 96049604 IM, 20 ug/마리IM, 20 ug / mari 56865686

상기 표 1에 나타난 바와 같이, 제1 보툴리눔 독소 A형 백신의 경우 투여 3주째 항체역가는 백신 용량에 관계없이 피하 및 근육 투여에서 50이하로 낮게 측정되었다. 이는 3주째에는 항체가 형성이 미약하다는 것을 보여준다. 그리고 5주째에는 3주째보다 증가한 양상을 보였다. 특히, 백신 용량을 20 ug/마리, 피하 투여한 경우 항체역가는 급격히 증가하였고 근육 투여보다 높은 항체역가를 나타내었다. As shown in Table 1 above, antibody titers at the third week of administration for the first botulinum toxin type A vaccine were measured to be as low as 50 or less in subcutaneous and muscular administration regardless of the vaccine dose. This shows that antibody formation is weak at 3 weeks. And at 5th week, it increased more than 3 weeks. Especially, when the vaccine dose was 20 ug / mouse, subcutaneously administered antibody titer increased sharply and showed higher antibody titer than muscle administration.

상기 표 2에 나타난 바와 같이, 제 2 보툴리눔 독소 A형 백신의 경우 3주째에는 항체 형성이 50 이하로 미약하였지만 5주째는 급격히 증가하였다. 특히, 백신 용량을 20 ug/마리, 근육 투여한 경우 항체역가는 급격히 증가하였고 피하 투여 보다 높은 항체역가를 나타내었다. As shown in Table 2, the antibody formation was weak to 50 or less at the third week in the case of the second botulinum toxin type A vaccine, but increased sharply at the fifth week. Especially, when the vaccine dose was 20 ug / mouse, the antibody titre increased rapidly and showed higher antibody titer than subcutaneous administration.

상기 표 3에 나타난 바와 같이, 제 3 보툴리눔 독소 A형 백신의 경우 제1, 2형과는 다르게 3주째에서 항체역가는 1500 이상의 수치를 보였다. 이는 3주째에도 항체가 형성이 왕성하게 이루어진 것이다. 5주째에는 10 ug/마리, 피하 투여의 경우 3주째보다 약 2배 이상 증가하였고, 20 ug/마리, 피하 투여에서는 약 6배 이상 증가하여 백신과 항체역가 형성에 용량 상관성을 보였다. 10 ug/마리, 근육 투여의 경우 백신과 항체가 형성이 용량 상관성을 보였지만, 20 ug/마리, 근육 투여의 경우에서는 3주와 5주의 항체역가는 유사한 수치를 나타내었다.As shown in the above Table 3, in the case of the third botulinum toxin type A vaccine, antibody titers were more than 1,500 at 3 weeks, unlike types 1 and 2. This is because the formation of antibodies is made vigorous even at 3 weeks. At the 5th week, the dose was increased by more than 2 times at 10 ug / mouse and at 3 weeks by subcutaneous administration. The dose was 20 ug / mouse in the subcutaneous administration and increased about 6 times in the subcutaneous administration. In the case of 10 ug / mouse, the vaccine and antibody formation showed a dose - related correlation, but in the case of muscle administration, antibody titers at 3 and 5 weeks showed similar values.

전술된 바와 같이, 본 발명의 실시예에 따라 컴퓨터 시뮬레이션을 기반으로 하여 보툴리눔 독소 A형의 중쇄 C말단(Heavy Chain C-terminal, Hc) 삼차원구조를 주형으로 다양한 아미노산 변이를 시도함으로써 제조된 보툴리눔 독소 A형 백신은 생체외실험(in vitro), 생체내실험(in vivo)을 통해 중화능을 확인한 결과, 보툴리눔의 독성제거하고, 단백질 안정화, 중화항체 결합부위 유지 등을 가짐을 확인할 수 있었다. 따라서 본 발명은 새로운 형태의 보툴리눔 독소 백신으로 보툴리눔 독소 A형에 의해 유발되는 질환 예방 및 치료 조성물로 이용될 수 있음을 알 수 있다.As described above, according to the embodiment of the present invention, botulinum toxin produced by attempting various amino acid mutations using the heavy chain C-terminal (Hc) three-dimensional structure of botulinum toxin type A as a template based on computer simulation As a result of confirming the neutralizing ability of the A type vaccine through in vitro and in vivo experiments, it was confirmed that toxin of botulinum toxin was removed and protein stabilization and maintenance of neutralizing antibody binding site were maintained. Therefore, the present invention is a new type of botulinum toxin vaccine, which can be used as a preventive and therapeutic composition for diseases caused by botulinum toxin type A.

앞서 살펴본 실시예는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자 당업자가 본 발명을 용이하게 실시할 수 있도록 하는 바람직한 실시예일 뿐, 전술한 실시예 및 첨부한 도면에 한정되는 것은 아니므로 이로 인해 본 발명의 권리범위가 한정되는 것은 아니다. 따라서, 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 여러 가지 치환, 변형 및 변경이 가능하다는 것이 당업자에게 있어 명백할 것이며, 당업자에 의해 용이하게 변경 가능한 부분도 본 발명의 권리범위에 포함됨은 자명하다.It is to be understood that both the foregoing general description and the following detailed description of the present invention are exemplary and explanatory and are intended to provide further explanation of the invention as claimed. The scope of the present invention is not limited thereto. It will be apparent to those skilled in the art that various substitutions, modifications and variations are possible within the scope of the present invention, and it is obvious that those parts easily changeable by those skilled in the art are included in the scope of the present invention .

<110> AGENCY FOR DEFENSE DEVELOPMENT <120> BOTULINUM TOXIN TYPE A VACCINE COMPRISING HEAVY CHAIN C-TERMINAL OF BOTULINUM TOXIN TYPE A MUTANT INHIBITING TOXIC ACTIVITY AND METHOD THEREOF <130> AD160038 <160> 10 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1296 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Botulinum Toxin Type A <400> 1 Met Gln Phe Val Asn Lys Gln Phe Asn Tyr Lys Asp Pro Val Asn Gly 1 5 10 15 Val Asp Ile Ala Tyr Ile Lys Ile Pro Asn Ala Gly Gln Met Gln Pro 20 25 30 Val Lys Ala Phe Lys Ile His Asn Lys Ile Trp Val Ile Pro Glu Arg 35 40 45 Asp Thr Phe Thr Asn Pro Glu Glu Gly Asp Leu Asn Pro Pro Pro Glu 50 55 60 Ala Lys Gln Val Pro Val Ser Tyr Tyr Asp Ser Thr Tyr Leu Ser Thr 65 70 75 80 Asp Asn Glu Lys Asp Asn Tyr Leu Lys Gly Val Thr Lys Leu Phe Glu 85 90 95 Arg Ile Tyr Ser Thr Asp Leu Gly Arg Met Leu Leu Thr Ser Ile Val 100 105 110 Arg Gly Ile Pro Phe Trp Gly Gly Ser Thr Ile Asp Thr Glu Leu Lys 115 120 125 Val Ile Asp Thr Asn Cys Ile Asn Val Ile Gln Pro Asp Gly Ser Tyr 130 135 140 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tggaaagcag caaaattgag gtgatcctga aaaacgccat tgtgtataat 180 agcatgtacg agaatttctc gaccagcttt tggattcgta tcccgaaata ctttaacagc 240 attagcctga acaacgagta caccattatt aactgcatgg aaaacaatag cggttggaaa 300 gtgagcctga attatggtga aattatctgg accctgcagg atacccaaga aatcaaacag 360 cgtgttgtgt tcaaatacag ccagatgatt aacatcagcg attacattaa ccgctggatc 420 tttgtgacca ttaccaataa tcgtctgaac aatagcaaaa tctacatcaa cggtcgtctg 480 attgaccaga aaccgattag caatctgggt aatattcatg cgagcaacaa catcatgttt 540 aaactggatg gttgtcgtga tacccatcgt tatatttgga tcaaatactt caacctgttt 600 gataaagaac tgaacgaaaa agaaattaaa gacctgtatg ataaccagag caatagcggc 660 atcctgaaag atttttgggg tgattatctg cagtatgata aaccgtatta catgctgaat 720 ctggccgatc cgaacaaata tgtggatgtg aataatgtgg gtatccgtgg ctatatgtat 780 ctgaaaggtc cgcgtggtag cgttatgacc accaacattt atctgaatag cagcctgtat 840 cgtggcacca aattcatcat caaaaaatac gccagcggca acaaagataa tattgtgcgt 900 aataatgacc gcgtgtatat taacgttgtg gtgaaaaaca aagaatatcg cctggcaacc 960 aatgcaagcc aggcaggcgt tgaaaaaatt ctgagcgcac tggaaattcc ggatgttggt 1020 aatctgagcc aggttgttgt tatgaaatcc aaaaatgatc agggcatcac caacaaatgc 1080 aaaatgaatc tgcaggacaa taacggcaac gatattggtt ttattggctt tgcccagttc 1140 aacaacattg caaaactggt tgcaagcaat gcctataatc gtcagattga acgtagcagc 1200 cgtaccctgg gttgtagctg ggaatttatt ccggttgatg atggttgggg tgaacgtccg 1260 ctgtaa 1266 <210> 10 <211> 1266 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy Chain C-Terminal of Botulinum Toxin Type A #3 <400> 10 accagcattc tgaatctgcg ttatgaaagc aaccatctga ttgatctgag ccgttatgcc 60 agcaaaatca atattggtag caaagtgaac ttcgatccga tcgataaaaa tcagatccag 120 ctgtttaatc tggaaagcag caaaattgag gtgatcctga aaaacgccat tgtgtataat 180 agcatgtacg agaatttctc gaccagcttt tggattcgta tcccgaaata ctttaacagc 240 attagcctga acaacgagta caccattatt aactgcatgg aaaacaatag cggttggaaa 300 gtgagcctga attatggtga aattatctgg accctgcagg atacccaaga aatcaaacag 360 cgtgttgtgt tcaaatacag ccagatgatt aacatcagcg attacattaa ccgctggatc 420 tttgtgacca ttaccaataa tcgtctgaac aatagcaaaa tctacatcaa cggtcgtctg 480 attgaccaga aaccgattag caatctgggt aatattcatg cgagcaacaa catcatgttt 540 aaactggatg gttgtcgtga tacccatcgt tatatttgga tcaaatactt caacctgttt 600 gataaagaac tgaacgaaaa agaaattaaa gacctgtatg ataaccagag caatagcggc 660 atcctgaaag atttttgggg tgattatctg cagtatgata aaccgtatta catgctgaat 720 ctgtatgatc cgaacaaata tgtggatgtg aataatgtgg gtatccgtgg ctatatgtat 780 ctgaaaggtc cgcgtggtag cgttatgacc accaacattt atctgaatag cagcctgtat 840 cgtggcacca aattcatcat caaaaaatac gccagcggca acaaagataa tattgtgcgt 900 aataatgacc gcgtgtatat taacgttgtg gtgaaaaaca aagaatatcg cctggcaacc 960 aatgcaagcc aggcaggcgt tgcaaaaatt ctgagcgcac tggaaattcc ggatgttggt 1020 aatctgagcc aggttgttgt tatgaaatcc aaaaatgatc agggcatcac caacaaatgc 1080 aaaatgaatc tgcaggacaa taacggcaac gatattggtt ttattggctt tgcccagttc 1140 aacaacattg caaaactggt tgcaagcaat gcctataatc gtcagattga acgtagcagc 1200 cgtaccctgg gttgtagctg ggaatttatt ccggttgatg atggttgggg tgaacgtccg 1260 ctgtaa 1266 <110> AGENCY FOR DEFENSE DEVELOPMENT <120> BOTULINUM TOXIN TYPE A VACCINE COMPRISING HEAVY CHAIN C-TERMINAL          OF BOTULINUM TOXIN TYPE MUTANT INHIBITING TOXIC ACTIVITY AND          METHOD THEREOF <130> AD160038 <160> 10 <170> Kopatentin 2.0 <210> 1 <211> 1296 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Botulinum Toxin Type A <400> 1 Met Gln Phe Val Asn Lys Gln Phe Asn Tyr Lys Asp Pro Val Asn Gly   1 5 10 15 Val Asp Ile Ala Tyr Ile Lys Ile Pro Asn Ala Gly Gln Met Gln Pro              20 25 30 Val Lys Ala Phe Lys Ile His Asn Lys Ile Trp Val Ile Pro Glu Arg          35 40 45 Asp Thr Phe Thr Asn Pro Glu Glu Gly Asp Leu Asn Pro Pro Pro Glu      50 55 60 Ala Lys Gln Val Val Ser Ser Tyr Tyr Asp Ser Thr Tyr Leu Ser Thr  65 70 75 80 Asp Asn Glu Lys Asp Asn Tyr Leu Lys Gly Val Thr Lys Leu Phe Glu                  85 90 95 Arg Ile Tyr Ser Thr Asp Leu Gly Arg Met Leu Leu Thr Ser Ile Val             100 105 110 Arg Gly Ile Pro Phe Trp Gly Gly Ser Thr Ile Asp Thr Glu Leu Lys         115 120 125 Val Ile Asp Thr Asn Cys Ile Asn 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aatattcatg cgagcaacaa catcatgttt 540 aaactggatg gttgtcgtga tacccatcgt tatatttgga tcaaatactt caacctgttt 600 gataaagaac tgaacgaaaa agaaattaaa gacctgtatg ataaccagag caatagcggc 660 atcctgaaag atttttgggg tgattatctg cagtatgata aaccgtatta catgctgaat 720 ctgtatgatc cgaacaaata tgtggatgtg aataatgtgg gtatccgtgg ctatatgtat 780 ctgaaaggtc cgcgtggtag cgttatgacc accaacattt atctgaatag cagcctgtat 840 cgtggcacca aattcatcat caaaaaatac gccagcggca acaaagataa tattgtgcgt 900 aataatgacc gcgtgtatat taacgttgtg gtgaaaaaca aagaatatcg cctggcaacc 960 aatgcaagcc aggcaggcgt tgaaaaaatt ctgagcgcac tggaaattcc ggatgttggt 1020 aatctgagcc aggttgttgt tatgaaatcc aaaaatgatc agggcatcac caacaaatgc 1080 aaaatgaatc tgcaggacaa taacggcaac gatattggtt ttattggctt ccaccagttc 1140 aacaacattg caaaactggt tgcaagcaat tggtataacg cacagattga acgtagcagc 1200 cgtaccctgg gttgtagctg ggaatttatt ccggttgatg atggttgggg tgaacgtccg 1260 ctgtaa 1266 <210> 9 <211> 1266 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy Chain C-Terminal of Botulinum Toxin Type A # 2 <400> 9 accagcattc tgaatctgcg ttatgaaagc aaccatctga ttgatctgag ccgttatgcc 60 agcaaaatca atattggtag caaagtgaac ttcgatccga tcgataaaaa tcagatccag 120 ctgtttaatc tggaaagcag caaaattgag gtgatcctga aaaacgccat tgtgtataat 180 agcatgtacg agaatttctc gaccagcttt tggattcgta tcccgaaata ctttaacagc 240 attagcctga acaacgagta caccattatt aactgcatgg aaaacaatag cggttggaaa 300 gtgagcctga attatggtga aattatctgg accctgcagg atacccaaga aatcaaacag 360 cgtgttgtgt tcaaatacag ccagatgatt aacatcagcg attacattaa ccgctggatc 420 tttgtgacca ttaccaataa tcgtctgaac aatagcaaaa tctacatcaa cggtcgtctg 480 attaccccaga aaccgattag caatctgggt aatattcatg cgagcaacaa catcatgttt 540 aaactggatg gttgtcgtga tacccatcgt tatatttgga tcaaatactt caacctgttt 600 gataaagaac tgaacgaaaa agaaattaaa gacctgtatg ataaccagag caatagcggc 660 atcctgaaag atttttgggg tgattatctg cagtatgata aaccgtatta catgctgaat 720 ctggccgatc cgaacaaata tgtggatgtg aataatgtgg gtatccgtgg ctatatgtat 780 ctgaaaggtc cgcgtggtag cgttatgacc accaacattt atctgaatag cagcctgtat 840 cgtggcacca aattcatcat caaaaaatac gccagcggca acaaagataa tattgtgcgt 900 aataatgacc gcgtgtatat taacgttgtg gtgaaaaaca aagaatatcg cctggcaacc 960 aatgcaagcc aggcaggcgt tgaaaaaatt ctgagcgcac tggaaattcc ggatgttggt 1020 aatctgagcc aggttgttgt tatgaaatcc aaaaatgatc agggcatcac caacaaatgc 1080 aaaatgaatc tgcaggacaa taacggcaac gatattggtt ttattggctt tgcccagttc 1140 aacaacattg caaaactggt tgcaagcaat gcctataatc gtcagattga acgtagcagc 1200 cgtaccctgg gttgtagctg ggaatttatt ccggttgatg atggttgggg tgaacgtccg 1260 ctgtaa 1266 <210> 10 <211> 1266 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy Chain C-Terminal of Botulinum Toxin Type A # 3 <400> 10 accagcattc tgaatctgcg ttatgaaagc aaccatctga ttgatctgag ccgttatgcc 60 agcaaaatca atattggtag caaagtgaac ttcgatccga tcgataaaaa tcagatccag 120 ctgtttaatc tggaaagcag caaaattgag gtgatcctga aaaacgccat tgtgtataat 180 agcatgtacg agaatttctc gaccagcttt tggattcgta tcccgaaata ctttaacagc 240 attagcctga acaacgagta caccattatt aactgcatgg aaaacaatag cggttggaaa 300 gtgagcctga attatggtga aattatctgg accctgcagg atacccaaga aatcaaacag 360 cgtgttgtgt tcaaatacag ccagatgatt aacatcagcg attacattaa ccgctggatc 420 tttgtgacca ttaccaataa tcgtctgaac aatagcaaaa tctacatcaa cggtcgtctg 480 attaccccaga aaccgattag caatctgggt aatattcatg cgagcaacaa catcatgttt 540 aaactggatg gttgtcgtga tacccatcgt tatatttgga tcaaatactt caacctgttt 600 gataaagaac tgaacgaaaa agaaattaaa gacctgtatg ataaccagag caatagcggc 660 atcctgaaag atttttgggg tgattatctg cagtatgata aaccgtatta catgctgaat 720 ctgtatgatc cgaacaaata tgtggatgtg aataatgtgg gtatccgtgg ctatatgtat 780 ctgaaaggtc cgcgtggtag cgttatgacc accaacattt atctgaatag cagcctgtat 840 cgtggcacca aattcatcat caaaaaatac gccagcggca acaaagataa tattgtgcgt 900 aataatgacc gcgtgtatat taacgttgtg gtgaaaaaca aagaatatcg cctggcaacc 960 aatgcaagcc aggcaggcgt tgcaaaaatt ctgagcgcac tggaaattcc ggatgttggt 1020 aatctgagcc aggttgttgt tatgaaatcc aaaaatgatc agggcatcac caacaaatgc 1080 aaaatgaatc tgcaggacaa taacggcaac gatattggtt ttattggctt tgcccagttc 1140 aacaacattg caaaactggt tgcaagcaat gcctataatc gtcagattga acgtagcagc 1200 cgtaccctgg gttgtagctg ggaatttatt ccggttgatg atggttgggg tgaacgtccg 1260 ctgtaa 1266

Claims (14)

서열번호 5 내지 서열번호 7 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어지는 보툴리눔 독소 A형의 중쇄 C말단(Heavy Chain C-terminal, Hc) 도메인을 포함하는 보툴리눔 독소 A형 백신으로,
상기 보툴리눔 독소 A형 백신은,
서열번호 1의 아미노산 서열 중 N-말단으로부터 1269번째 아미노산이 알라닌(Alanine, Ala)으로 치환되어 서열번호 2로 기재된 아미노산 서열;
서열번호 1의 아미노산 서열 중 N-말단으로부터 1117번째, 1253번째 및 1266번째 아미노산이 알라닌(Alanine, Ala)으로 치환되어 서열번호 3으로 기재된 아미노산 서열; 및
서열번호 1의 아미노산 서열 중 N-말단으로부터 1203번째, 1253번째 및 1266번째 아미노산이 알라닌(Alanine, Ala)으로 치환되어 서열번호 4로 기재된 아미노산 서열; 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 독성이 제거된 보툴리눔 독소 A형으로 이루어진 것을 특징으로 하는 보툴리눔 독소 A형 백신.A botulinum toxin type A vaccine comprising a heavy chain C-terminal (Hc) domain of botulinum toxin type A comprising the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 5 to 7,
The botulinum toxin type A vaccine,
An amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 in which the 1269th amino acid from the N-terminus of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is substituted with alanine (Alanine, Ala);
An amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 substituted with Alanine (Alanine, Ala) at the 1117th, 1253rd and 1266th amino acids from the N-terminus of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1; And
The amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is substituted with Alanine (Alanine, Ala) at positions 1203, 1253, and 1266 from the N-terminus of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1; Wherein the botulinum toxin type A vaccine has a toxin-free botulinum toxin type A having an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 삭제delete 삭제delete 삭제delete 제1항의 서열번호 5로 기재된 보툴리눔 독소 A형의 중쇄 C말단(Heavy Chain C-terminal, Hc) 도메인을 코팅하는 서열번호 8로 기재된 핵산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 보툴리눔 독소 A형 유전자.8. A botulinum toxin type A gene having a nucleic acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 8 which coat the heavy chain C-terminal (Hc) domain of botulinum toxin type A described in SEQ ID NO: 5 of claim 1. 제1항의 서열번호 6으로 기재된 보툴리눔 독소 A형의 중쇄 C말단(Heavy Chain C-terminal, Hc)을 코팅하는 서열번호 9로 기재된 핵산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 보툴리눔 독소 A형 유전자.9. A botulinum toxin type A gene having a nucleic acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 9 which coat the heavy chain C-terminal (Hc) of the botulinum toxin type A according to SEQ ID NO: 6 of claim 1. 제1항의 서열번호 7로 기재된 보툴리눔 독소 A형의 중쇄 C말단(Heavy Chain C-terminal, Hc)을 코팅하는 서열번호 10으로 기재된 핵산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 보툴리눔 독소 A형 유전자.10. A botulinum toxin type A gene having a nucleic acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 10 which coat the heavy chain C-terminal (Hc) of the botulinum toxin type A described in SEQ ID NO: 7 of claim 1. 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 보툴리눔 독소 A형 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 발현벡터.9. An expression vector comprising the botulinum toxin type A gene according to any one of claims 5 to 7. 제8항의 발현벡터로 형질전환된 원핵세포 형질전환체를 배양하는 단계; 및
상기 원핵세포 형질전환체로부터 발현된 목적 단백질인 보툴리눔 독소 A형을 분리 정제하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 보툴리눔 독소 A형 백신의 제조방법.Culturing a prokaryotic cell transformant transformed with the expression vector of claim 8; And
And isolating and purifying a botulinum toxin type A protein expressed as a target protein expressed from the prokaryotic cell transformant. 제9항에 있어서,
상기 원핵세포가 대장균인 것을 특징으로 하는 보툴리눔 독소 A형 백신의 제조방법.10. The method of claim 9,
Wherein the prokaryotic cell is Escherichia coli. 서열번호 5 내지 서열번호 7 중 어느 하나 항의 아미노산 서열을 가지는 보툴리눔 독소 A형의 중쇄 C말단(Heavy Chain C-terminal, Hc) 도메인을 포함하여 이루어진 보툴리눔 독소 A형 백신을 유효성분으로 포함하며,
상기 보툴리눔 독소 A형 백신은,
서열번호 1의 아미노산 서열 중 N-말단으로부터 1269번째 아미노산이 알라닌(Alanine, Ala)으로 치환되어 서열번호 2로 기재된 아미노산 서열;
서열번호 1의 아미노산 서열 중 N-말단으로부터 1117번째, 1253번째 및 1266번째 아미노산이 알라닌(Alanine, Ala)으로 치환되어 서열번호 3으로 기재된 아미노산 서열; 및
서열번호 1의 아미노산 서열 중 N-말단으로부터 1203번째, 1253번째 및 1266번째 아미노산이 알라닌(Alanine, Ala)으로 치환되어 서열번호 4로 기재된 아미노산 서열; 중 어느 하나의 이루어진 것을 특징으로 하는 보툴리눔 독소 A형에 의해 유발되는 질환의 예방 및 치료용 조성물.A botulinum toxin type A vaccine comprising a heavy chain C-terminal (Hc) domain of a botulinum toxin type A having an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 5 to 7 as an active ingredient,
The botulinum toxin type A vaccine,
An amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 in which the 1269th amino acid from the N-terminus of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is substituted with alanine (Alanine, Ala);
An amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 substituted with Alanine (Alanine, Ala) at the 1117th, 1253rd and 1266th amino acids from the N-terminus of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1; And
The amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is substituted with Alanine (Alanine, Ala) at positions 1203, 1253, and 1266 from the N-terminus of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1; Wherein the botulinum toxin type A is at least one kind of botulinum toxin type A. 삭제delete 삭제delete 제11항에 있어서,
상기 보툴리눔 독소 A형에 의해 유발되는 질환의 예방 및 치료용 조성물은 콜레라톡신, 알루미늄 하이드록사이드, 카보폴(carbopol), 광물성 오일 및 생분해성(biodegradable) 오일 중에서 선택되는 어느 1종 이상의 면역증강제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 보툴리눔 독소 A형에 의해 유발되는 질환의 예방 및 치료용 조성물.

12. The method of claim 11,
The composition for the prevention and treatment of diseases caused by the botulinum toxin type A may further comprise at least one immunostimulant selected from cholorotoxin, aluminum hydroxide, carbopol, mineral oil and biodegradable oil Wherein the composition further comprises a botulinum toxin type A inhibitor.

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