KR101823337B1 - 벌의 독낭에서 독을 분리하는 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 분리된 벌의 독낭을 원심분리하여 벌의 독낭에서 벌의 독액을 분리하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 벌의 독액의 성분 변화를 최소화하고, 최대한의 수율로 벌의 독액을 분리할 수 있어, 벌의 독액을 원료로 하는 식의약품 개발에 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명에 따르면, 벌의 독액의 성분 변화를 최소화하고, 최대한의 수율로 벌의 독액을 분리할 수 있어, 벌의 독액을 원료로 하는 식의약품 개발에 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 벌의 독낭에서 독액을 분리하는 방법에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 분리된 벌의 독낭을 원심분리하여 벌의 독낭에서 벌의 독액을 분리하는 방법에 관한 것이다.
생물체의 항상성(homeostasis)을 유지하기 위한 과정에서 중요한 역할을 담당하고 있는 물질들 중 일부가 각종 생물체 유래의 생리 활성 물질이다. 지금까지 수많은 생리 활성 물질에 대해 많은 연구가 진행되고 있으며, 그 중, 항균 및 항암 등에 효과가 있는 벌의 독액 연구는 생명과학 및 의학 분야에서 매우 중요한 영역이다.
최근에는 살아있는 벌로부터 다량의 벌 독을 채취할 수 있는 봉독 채집 장치의 보급으로 양봉 농가에서도 자체적으로 봉독을 채취하여 사용하고 있다. 봉독 채집과 관련한 특허로는 특허 제10-1368341호 봉독채집방법, 특허 제10-0579899호 봉독채집장치, 특허 제10-1073122호 봉독 채집장치 등의 특허가 있다.
그러나, 상기와 같은 전기적 자극에 따라 독을 분비토록 하여 채취하는 원리의 봉독 채집 장치는 그 구성이 복잡하고 순수한 벌의 독액만을 효과적으로 분리하는 데에 어려움이 많았다.
특히, 봉독 채집 장치로부터 채취한 벌 독은 양봉장에서 채취하기 때문에 먼지나 흙과 같은 불순물이 다량 혼입되어 있으며, 꿀벌의 몸에 묻어 있던 벌꿀, 화분, 프로폴리스와 같은 이물질이 함께 채취된다. 이와 같은 이물질의 첨가로 인해 벌 독의 성분이 변화를 야기하여 벌 독의 생리 활성능이 저하될 수 있다.
또한, 상기 봉독 채집장치는 양봉 농가에서 꿀벌의 봉독을 채취하는데 주안점으로 두어 꿀벌의 생태와 생리적인 현상을 응용하기 때문에 꿀벌 이외의 다른 벌류, 특히, 포식성을 갖는 말벌류 등의 독액을 채취하는 방법으로 사용하는데 어려움이 있었다.
이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 순수한 벌 독액을 간편하고 효과적으로 분리할 수 있는 방법을 찾기 위해 예의 노력한 결과, 벌의 독낭에 인산완충식염수를 처리하고 원심분리하는 경우 벌 독액의 활성에 영향을 주지 않으면서도 최대한의 수율로 벌의 독액을 분리할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 주된 목적은 벌 독액의 활성에 영향을 주지 않으면서도 최대한의 수율로 벌의 독액을 분리할 수 있는 방법을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 벌의 독침을 잡아당겨 독침과 연결된 독낭, 독선, 및 소화기관을 벌의 몸체에서 분리하는 단계; 상기 분리된 독낭, 독선, 및 소화기관에서 상기 독낭을 재분리 한 후, 재분리된 독낭을 인산완충식염수(phosphate buffered saline, PBS)로 처리하여 안정화시키는 단계; 상기 인산완충식염수를 처리하여 안정화된 독낭을 원심분리 튜브에 넣고 원심분리 하여 독액을 분리하는 단계; 및 분리된 독액을 동결보존하는 단계;를 포함하는 벌의 독낭에서 독액을 분리하는 방법을 제공한다.
본 발명의 벌 독낭에서 독액을 분리하는 방법에서, 상기 원심분리 튜브는 하면에 구멍이 형성되고, 상기 인산완충식염수를 처리하여 안정화된 독낭이 배치되는 제1튜브; 및 상기 제1튜브의 외주면에 밀착하여 결합되며, 원심분리시 상기 제1튜브의 하면에 형성된 구멍을 통하여 전달되는 독액을 수납하는 제2튜브;로 구성되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 벌 독낭에서 독액을 분리하는 방법에서, 상기 벌은 이에 구속되지는 않으나, 전기충격방식의 봉독채집 장치를 사용하기 어려운 일반 벌에 비해 큰 체적을 갖는 포식성 벌일 수 있으며, 그 예로는 말벌 속에 속하는 말벌을 들 수 있고, 더욱 상세하게는 말벌 속에 속하는 좀말벌, 큰홑눈말벌, 등무늬말벌, 말벌, 꼬마장수말벌, 검정말벌, 장수말벌, 털보말벌 및 황말벌 등을 들 수 있다.
본 발명의 벌 독낭에서 독액을 분리하는 방법에서, 상기 안정화시키는 단계의 인산완충식염수는 pH 6.5 내지 8.0의 인산완충식염수가 사용될 수 있다.
본 발명의 벌 독낭에서 독액을 분리하는 방법에서, 상기 제1튜브의 하면에 형성된 구멍은 0.2 내지 0.6um 지름 사이즈를 갖는 하나 이상의 구멍이 형성될 수 있다.
본 발명의 벌 독낭에서 독액을 분리하는 방법에서, 상기 원심분리는 2 내지 6 온도에서 10,000 내지 15,000g 조건으로 수행될 수 있다.
본 발명의 벌 독낭에서 독액을 분리하는 방법에서, 상기 원심분리 하는 단계의 상기 PBS 용액이 처리된 상기 독낭은 일 측면 및 반대 측면이 각각 1회 이상 절개되어 원심분리될 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 벌의 독낭에서 독액을 분리하는 원심분리 튜브에 있어서, 상기 원심분리 튜브는 하면에 구멍이 형성되고, 상기 독낭이 배치되는 제1튜브; 및 상기 제1튜브의 외주면에 밀착하여 결합되며, 원심분리시 상기 제1튜브의 하면에 형성된 구멍을 통하여 전달되는 독액을 수납하는 제2튜브;로 구성되는 것을 특징으로 하는 벌 독 분리용 원심분리 튜브을 제공한다.
본 발명의 원심분리 튜브에서, 상기 제1튜브의 하면에 형성된 구멍은 0.2 내지 0.6um 지름 사이즈를 갖는 하나 이상의 구멍일 수 있다.
이하, 본 발명의 벌의 독낭에서 독액을 분리하는 방법을 단계별로 보다 구체적으로 설명한다.
도 1은 본 발명의 실시예에 따른 벌 독낭에서 독액을 분리하는 방법의 흐름도이다.
도 1에 도시된 바와 같이, 본 발명의 실시예에 따른 벌 독낭에서 독액을 분리하는 방법은 분리단계; 안정화 단계; 독액 원심분리 단계; 및 동결보존 단계;를 포함하여 이루어진다.
먼저, 제1단계는 분리단계로, 벌의 독침을 잡아당겨 독침과 연결된 독낭, 독선, 및 소화기관을 벌의 몸체에서 분리하는 단계이다.
살아있는 벌의 경우 분리의 편의를 위해 5 내지 10 초 동안 CO2를 분사하여 마취한 벌을 사용한다. 또한, 급속 냉동시킨 벌은 서서히 녹여 충분하게 해동된 벌을 사용한다. 벌의 벌침 부분을 핀셋으로 고정하고 서서히 잡아당기면, 독침과 연결된 독낭과 독선 그리고 소화기관을 한꺼번에 몸체에서 분리할 수 있다.
제2단계는 상기 분리된 독낭, 독선, 및 소화기관에서 상기 독낭을 재분리 한 후, 재분리된 독낭을 인산완충식염수(phosphate buffered saline, PBS)로 처리하여 조직을 안정화시키는 단계이다.
상기 처리되는 인산완충식염수는 분리된 독낭 조직에서 수분이 증발되어 조직이 손상되는 것을 방지하는 역할을 수행한다. 또한, 이후 원심분리단계에서 발생하는 물리적인 스트레스에 기인하는 조직 파괴로 인한 급격한 pH 변화와 이로 인해 발생하는 독액 내에 독 단백질의 변성을 최소화하는 역할을 수행한다. 그리고, 독액을 장기 보관하기 위하여 동결보존한 후, 이를 다시 해동하여 사용하는 경우에 독액 내에 포함된 인산완충식염수는 급격한 온도 변화에서 발생할 수 있는 독액 단백질의 변성을 방지하는 효과가 있다.
상기 인산완충식염수는 벌 독액의 pH 특성 및 버퍼링 효과의 극대화를 고려하여 pH 6.5 내지 8.0의 인산완충식염수를 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 상기 사용되는 인산완충식염수 용액은 상기 분리된 독낭 조직의 부피에 대략 5 내지 10배 부피를 사용할 수 있다.
제3단계는 상기 인산완충식염수를 처리하여 적출된 독낭을 원심분리 튜브에 넣고 원심분리 하여 독액을 분리하는 단계이다.
이 때, 상기 독낭에 존재하는 독액을 한 번의 원심분리 과정으로 효과적으로 분리하기 위해 하면에 구멍이 형성된 제1튜브와 독액을 수납하는 제2튜브로 구성되는 원심분리 튜브를 이용할 수 있다. 상기 제1튜브에 상기 인산완충식염수를 처리하여 안정화된 독낭을 넣고, 상기 제1튜브의 외주면에 밀착하여 제2튜브를 배치한 후 원심분리 과정을 수행하면, 상기 제1튜브의 독낭에 있는 독액이 상기 제1튜브의 하면에 형성된 구멍을 통해 상기 제2튜브로 수납되게 된다(도 2 참조).
또한, 상기 PBS 용액이 처리된 상기 독낭은 독액 추출의 효율을 높이기 위해 일 측면 및 반대 측면을 각각 1회 이상 절개한 후, 원심분리 튜브에 넣고 원심분리할 수 있다.
상기 제1튜브는 하면에 다수 개의 구멍을 갖는데, 상기 구멍의 지름 크기는 0.2 내지 0.6μm인 것이 벌의 독액을 분리하는데 적합하다. 상기 구멍의 지름 크기가 0.2μm 미만인 경우에는 일부 벌 독액단백질이 원활하게 분리되지 않는 단점이 있고, 상기 구멍의 지름 크기가 0.6μm를 초과하는 경우에는 파쇄된 독낭 조직이나 일부 불순물들이 여과되지 않고, 독액과 함께 원심분리되는 단점이 있다.
상기 원심분리는 독액 단백질의 변성을 억제하기 위해 2 내지 6℃ 온도의 저온에서 수행되는 것이 바람직하며, 10,000 내지 15,000g 조건에서 충분하게 원심분리되는 것이 바람직하다.
제4단계는 분리된 독액을 장기간에 걸쳐 사용하기 위해 동결보존 하는 단계이다. 분리된 독액은 -180℃ 이하의 액체질소 탱크에 보관하여 독액의 활성을 보존하면서 장기간에 걸쳐 사용할 수 있다.
이상의 단계를 통해, 정제된 벌의 독액이 준비된다. 이와 같은 단계를 통해 정제된 독액을 액체크로마토그래피를 사용하여 분석하면, 도 3 및 도 4에 도시된 바와 같은 그래프를 얻을 수 있다.
본 발명의 벌의 독낭에서 독액을 분리하는 원심분리 튜브와 관련된 기타 사항은 상술한 벌의 독낭에서 독액을 분리하는 방법에 상세히 기술되어 있으므로 이에 대한 설명은 생략한다.
이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면 벌 독액의 활성에 영향을 주지 않으면서도 최대한의 수율로 벌의 독액을 분리할 수 있다.
이에 따라, 벌의 독액의 성분 변화를 최소화하고, 최대한의 수율로 벌의 독액을 분리할 수 있어, 벌의 독액을 원료로 하는 식의약품 개발에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 벌의 독액의 분리 방법의 흐름도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 원심분리튜브의 사진이다.
도 3은 본 발명의 방법에 따라 분리된 독액의 펩타이드 서열을 정리한 표이다.
도 4는 본 발명의 방법에 따라 분리된 독액에 존재하는 Pre-Mastoparan의 Mass Spectrum 이다.
도 5는 본 발명의 방법에 따라 분리된 독액에 존재하는 Vespid chemotactic peptide의 Mass spectrum 이다.
도 6은 본 발명의 방법에 따라 분리된 독액에 존재하는 Mastoparan-C의 Mass spectrum 이다.
도 7은 본 발명의 방법에 따라 분리된 독액에 존재하는 Vespakinin-M의 Mass Spectrum 이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 원심분리튜브의 사진이다.
도 3은 본 발명의 방법에 따라 분리된 독액의 펩타이드 서열을 정리한 표이다.
도 4는 본 발명의 방법에 따라 분리된 독액에 존재하는 Pre-Mastoparan의 Mass Spectrum 이다.
도 5는 본 발명의 방법에 따라 분리된 독액에 존재하는 Vespid chemotactic peptide의 Mass spectrum 이다.
도 6은 본 발명의 방법에 따라 분리된 독액에 존재하는 Mastoparan-C의 Mass spectrum 이다.
도 7은 본 발명의 방법에 따라 분리된 독액에 존재하는 Vespakinin-M의 Mass Spectrum 이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예. 제1튜브 및 제2튜브의 원심분리 방법을 이용한 독액 채취방법
독액의 분리에 사용된 벌은 경기도 광주 태화산, 경기도 군포시 수리산, 강원도 치악산, 경상북도 안동시 송천동 등지에서 좀말벌을 채집하여 사용하였다. 경기도 광주 태화산에서 채집된 좀말벌 암컷을 살아있는 상태로 실험실로 운반을 하여 바로 CO2로 마취를 한 후에 사용하였다.
마취된 좀말벌은 벌침을 핀셋으로 고정한 후 벌침을 잡아당겨 독낭, 독선, 및 소화기관을 몸체와 분리하였다. 독선, 독침, 및 소화기관을 독낭과 재분리하여 독낭만을 회수하였다.
타지역에서 채집된 좀말벌 암컷은 바로 급속 냉동을 한 후 실험실로 운반하여 독낭의 채취 전까지 80℃에서 보관하였다. 급속 냉동 보관된 좀말벌은 얼음 위에서 서서히 녹인 후, 상기와 같은 방법으로 독낭만을 회수하였다.
상기 회수된 독낭에 pH 7.5의 인산완충식염수 용액을 처리하여 상기 독낭이 인산완충식염수 용액을 충분히 흡수하게 한 후, 상기 인산완충식염수 용액을 흡수한 독낭을 0.45um 지름 크기의 다수개의 구멍을 갖는 0.5mL 용량의 제1튜브에 넣고, 상기 제1튜브를 다시 1.5mL 용량의 제2튜브에 넣은 후, 4℃, 12,000g 조건에서 2분 동안 원심분리를 수행하였다.
상기와 같은 방법을 통해 총 100개체의 좀말벌에서 124.5ml의 독액을 추출하였고, 회수된 독액은 -180의 액체질소 탱크에 보관하였다.
비교예
1. 수동식 독액 추출 방법
상기 실시예 1과 같은 방법으로 회수된 좀말벌의 독낭을 눌러짜서 독액을 수집하였다. 총 100개체의 좀말벌에서 50.0μl의 독액을 추출하였다.
비교예 2. 미니컬럼을 이용한 원심분리 방법을 이용한 독액 채취방법
상기 실시예 1과 같은 방법으로 회수된 좀말벌의 독낭을 DNA-binding resin이 충진되지 않은 Wizard Minicolumn(Promega)에 모은 후, 4℃, 12,000g 조건에서 2분간 원심분리하여 독낭 조직은 컬럼 상단에 거르고 독액만 컬럼 아래의 1.5ml 튜브에 모이도록 하였다. 총 100개체의 좀말벌에서 70.0μl의 독액을 추출하였다.
실험예
. 채취된 독액의 크로마토그래피
상기 실시예에서 추출된 5ml의 좀말벌 독액을 이용하여 펩타이드의 분리를 수행하였다. 우선 50mmol Tris-HCl buffer(pH7.4) 조건에서 size exclusion chromatography column(Superdex peptide-10/300GL column)을 이용하여 두 개의 분획으로 1차 분리한 후, 2번째 low MW 분획을 50 mmol Tris-HCl buffer(pH7.4) 조건에서 다시 5 ~ 8개의 분획으로 분리하였다.
분리된 각각의 분획은 먼저 nano LC-ESI-tandem MS를 이용하여 MSE 분석을 통해 MS와 MS/MS 데이터를 얻고, UniProtKB의 hymenoptera 관련 단백질 데이터베이스 또는 6 frame translation 단백질 데이터베이스를 이용하여 peptide profiling을 실시하여 제1차 펩타이드 동정을 실시하였다.
또한, 제1차 펩타이드 동정에서 동정되지 않은 펩타이드에 대해서는 nanoAQUILTY(C18 RP column) ESI-Tandem (Q-TOF) 질량분석기의 positive mode를 이용하여 venome peptide의 분자량을 측정하고, MS/MS 분석을 통해 얻어지는 a+, b+와 y+-type의 단편(fragments)과 immonium 이온들을 이용하여 de novo peptide sequence를 실시하였다.
그리고, LC-MALDI-TOF/TOF MS를 이용하여 펩타이드의 분자량 정보를 얻어내고, de novo peptide sequencing을 실시하여 최종 17개의 활성 펩타이드의 서열 및 종류를 동정하였다(도 3 내지 도 7).
또한, 각각 Pre-Mastoparan, Vespid chemotactic peptide, Mastoparan-C, 및 Vespakinin-M의 MS/MS 데이터를 얻을 수 있었다.
동정된 독액의 주요 성분은 비교예 1의 수동식 방법에 의해 회수된 독액의 성분과 동일하였다. 또한, 수동식 방법이나 미니컬럼 방식에 의해 추출된 독액과는 달리 분리과정에서 발생하는 조직 부스러기 등의 불순물이 거의 없는 순도 높은 독액을 얻을 수 있었다. 이러한 결과를 통하여, 본 발명의 벌의 독낭에서 독을 분리하는 방법은 벌 독액의 분리 및 추출 과정에서 단백질의 손실 및 활성변화 없이 최대한의 수율로 벌의 독액을 분리할 수 있음을 확인할 수 있었다.
이상으로 본 발명의 실시예를 첨부된 도면을 참조로 기술하였다. 그러나 본 발명은 전술된 실시예에만 특별히 한정되는 것은 아니며, 필요에 따라, 당업자에 의해, 첨부된 청구범위의 정신과 사상 내에서 다양한 수정 및 변경이 가능함에 유의해야 한다.
Claims (9)
- 벌의 독침을 잡아당겨 독침과 연결된 독낭, 독선, 및 소화기관을 벌의 몸체에서 분리하는 단계;
상기 분리된 독낭, 독선, 및 소화기관에서 상기 독낭을 재분리 한 후, 재분리된 독낭을 인산완충식염수(phosphate buffered saline, PBS)로 처리하여 안정화시키는 단계;
상기 인산완충식염수를 처리하여 안정화된 독낭을 측면 및 반대 측면을 각각 1회 이상 절개하고, 원심분리 튜브에 넣고 원심분리 하여 독액을 분리하는 단계; 및 분리된 독액을 동결보존하는 단계;를 포함하되,
상기 원심분리 튜브는
하면에 다수 개의 구멍이 형성되고, 상기 인산완충식염수를 처리하여 안정화된 독낭이 배치되는 제1튜브; 및
상기 제1튜브의 외주면에 밀착하여 결합되며, 원심분리시 상기 제1튜브의 하면에 형성된 구멍을 통하여 전달되는 독액을 수납하는 제2튜브;로 구성되고,
상기 구멍은 0.2 내지 0.6um 지름 크기를 갖는 것을 특징으로 하는 벌의 독낭에서 독액을 분리하는 방법. - 제1항에 있어서, 상기 벌은 말벌 속에 속하는 말벌인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 벌은 말벌 속에 속하는 좀말벌, 큰홑눈말벌, 등무늬말벌, 말벌, 꼬마장수말벌, 검정말벌, 장수말벌, 털보말벌 및 황말벌로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 말벌인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 안정화시키는 단계의 인산완충식염수는 pH 6.5 내지 8.0인 것을 특징으로 하는 방법.
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 원심분리는 2℃ 내지 6℃ 온도에서 10,000 내지 15,000g 조건으로 원심분리 하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 삭제
- 벌의 독낭에서 독액을 분리하는 원심분리 튜브에 있어서,
상기 원심분리 튜브는
하면에 다수 개의 구멍이 형성되고, 상기 독낭이 배치되는 제1튜브; 및
상기 제1튜브의 외주면에 밀착하여 결합되며, 원심분리시 상기 제1튜브의 하면에 형성된 구멍을 통하여 전달되는 독액을 수납하는 제2튜브;
로 구성되고,
상기 구멍은 0.2 내지 0.6um 지름 크기를 갖는 것을 특징으로 하는 벌의 독액 분리용 원심분리 튜브. - 삭제
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