KR101823301B1 - Primer set for loop-mediated isothermal amplification reaction for detecting V. nashicola and uses thereof - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 배검은별무늬병균 검출을 위한 등온증폭반응용 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 배검은별무늬병균을 특이적으로 검출 또는 진단할 수 있는 등온증폭반응용 프라이머 세트; 이를 포함하는 배 검은별무늬병 진단용 조성물; 진단 키트; 및 이를 이용한 배검은별무늬병균 검출방법에 관한 것이다.More particularly, the present invention relates to a primer set for isothermal amplification reaction capable of specifically detecting or diagnosing germ cell black germs; A composition for the diagnosis of black stigma disease comprising the same; Diagnostic kit; And to a method for detecting germs of black shrimp using the same.
배는 한국, 중국 및 일본 등 동아시아 국가에서 주로 재배되고 있는 작물이다. 배 검은별무늬병은 배 재배상 발생하는 가장 주요한 병해 중 하나이며, 원인균은 Venturia nashicola 이다(Koh et al., 2013). 배 검은별무늬병균(V. nashicola)에 감염되면 잎, 엽병 및 과경에 흑색의 병반이 형성되고, 심하게 발병하면 낙엽 및 낙과를 유발한다. 특히 과실에 발병한 병반은 상품가치를 저하시키므로 재배농가에 막대한 경제적 피해를 일으킨다(Kim et al., 2016).Boats are cultivated mainly in East Asian countries such as Korea, China and Japan. Black stellate disease is one of the major diseases that occur in pear cultivation, and causative bacteria are Venturia It is nashicola (Koh et al., 2013). When infected with V. nashicola , black lesions form on the leaves, petiole, and stomach, and severe onset will cause leaves and fallopian. In particular, the disease caused by the fruit degrades the value of the commodity, causing enormous economic damage to growers (Kim et al., 2016).
국내에서 배 재배면적의 약 83%를 차지하고 있는 '신고'는 배 검은별무늬병에 높은 감수성을 나타내는 품종으로 알려져 있고(Cho et al., 1985; Shin et al., 2004), 방제를 소홀히 할 경우 과실의 안정적인 생산이 어려움이 있다. 또한 배검은별무늬병균은 약 2-3주간의 잠복기를 가지므로(EPPO), 병징이 나타나기 전에 조기에 진단하여 방제하는 것이 매우 중요하다. 배 검은별무늬병의 피해를 입은 배나무는 과실에 병반이 형성되거나 열과하는 등의 직접적인 피해가 발생하여 수확불능 또는 상품가치를 심하게 훼손하며, 병에 걸린 잎은 조기낙엽과 그로 인한 수량저하, 과실 품질저하 등을 초래한다. It is known that 'Shi-shi', which accounts for about 83% of the pear cultivation area in Korea, is a varietal with high susceptibility to Shiitake (Cho et al., 1985; Shin et al., 2004) There is a difficulty in the stable production of fruit. Also, it is very important to diagnose and treat the fungus in the early stage before the symptoms appear, since the fungus of black stellate has a latent period of about 2-3 weeks (EPPO). The pear trees damaged by the black stigma of the pear are damaged by the direct damage such as the formation of lesions in the fruit or heat and the damage to the product value is severely impaired. And the like.
이러한 배 검은별무늬병에 대한 진단은 국내외를 막론하고 지금까지 원인균인 배검은별무늬병균(Venturia nashicola)의 최적배지 조성 및 종 특이적-PCR법, Real-time PCR법, 병원균의 약제저항성을 비롯하여 각종 저항성 품종 개발 등의 연구가 이루어지고 있으나 기존의 방법은 검사 완료까지 2-3 시간이 소요되고 현장 진단은 불가능하다는 단점이 있다. These times diagnosis for black byeolmunui disease regardless of national and international organisms and pear black byeolmunui germs far (Venturia nashicola ), the development of various resistance cultivars including species-specific-PCR, real-time PCR, resistance to pathogens and resistance to pathogens have been conducted. However, conventional methods require 2-3 hours And there is a disadvantage that field diagnosis is impossible.
이에 본 발명자들은 검은별무늬병의 감염을 조기에 신속하고 정확하게 진단할 수 있으며 현장 적용도 가능한 방법을 찾고자 노력하였으며, 그 결과 배검은별무늬병균 증폭을 위한 등온증폭반응용 프라이머 세트를 제작하고 상기 프라이머를 사용하여 적정 온도 범위의 등온에서 증폭하는 경우, 배 검은별무늬병을 정확하고 신속하게 진단할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다. Accordingly, the present inventors have been able to rapidly and accurately diagnose infection of black foliage disease early and to find a method that can be applied in the field. As a result, a primer set for amplification of black fungal infection by black spot was prepared, It is possible to accurately and rapidly diagnose a black stigma bottle when it is amplified at an isothermal temperature in a suitable temperature range. Thus, the present invention has been completed.
따라서 본 발명의 목적은 서열번호 1 내지 서열번호 4로 표시되는 프라이머로 구성되는, 배검은별무늬병균(V. nashicola)을 진단할 수 있는 등온증폭반응용 프라이머 세트를 제공하는 것이다.Accordingly, an object of the present invention is to provide a primer set for isothermal amplification reaction capable of diagnosing V. nashicola consisting of primers represented by SEQ ID NOS: 1 to 4.
본 발명의 다른 목적은 상기 프라이머 세트를 포함하는 배 검은별무늬병 진단용 조성물을 제공하는 것이다. It is another object of the present invention to provide a composition for the diagnosis of black stigma of the present invention comprising the primer set.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 배 검은별무늬병 진단용 키트를 제공하는 것이다. It is still another object of the present invention to provide a kit for the diagnosis of a black stigma of a femur comprising the above composition.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 프라이머 세트를 이용하여 검은별무늬병균을 검출하는 방법을 제공하는 것이다. It is still another object of the present invention to provide a method for detecting black spotted germs using the primer set.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 4로 표시되는 프라이머로 구성되는, 배검은별무늬병균(V. nashicola)을 진단하기 위한 등온증폭반응용 프라이머 세트를 제공한다. In order to achieve the above object, the present invention provides a primer set for isothermal amplification reaction for diagnosing V. nashicola comprising primers represented by SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 4.
본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 배 검은별무늬병 진단용 조성물을 제공한다. The present invention provides a composition for diagnosing intestinal black coloring disease comprising the primer set.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 등온증폭 반응용 DNA 중합효소, dNTPs, 반응버퍼 및 증류수를 더 포함할 수 있다. In one embodiment of the present invention, the composition may further comprise a DNA polymerase for isothermal amplification reaction, dNTPs, a reaction buffer, and distilled water.
본 발명은 상기 조성물을 포함하는 배 검은별무늬병 진단용 키트를 제공한다. The present invention provides a kit for the diagnosis of a black stigma of a flea including the above composition.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 키트는 시료마쇄용 메쉬 백(mesh bag); 균질기; 및 등온증폭반응용 PCR 튜브 용기를 포함할 수 있다. In one embodiment of the invention, the kit comprises a mesh bag for sample milling; Homogenizer; And PCR tube containers for isothermal amplification reactions.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 등온증폭반응용 PCR 튜브 용기는 서열번호 1 내지 서열번호 4로 표시되는 프라이머로 구성되는 배 검은별무늬병을 진단하기 위한 등온증폭반응용 프라이머 세트; 등온증폭 반응용 DNA 중합효소; dNTPs; 반응버퍼 및 증류수를 포함할 수 있다. In one embodiment of the present invention, the PCR tube container for isothermal amplification reaction comprises a primer set for isothermal amplification reaction for diagnosing a black stigma of the follicle comprising the primers represented by SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 4; DNA polymerase for isothermal amplification reaction; dNTPs; Reaction buffer and distilled water.
본 발명은 (a) 식물체 검체로부터 게놈 DNA를 추출하는 단계; (b) 상기 추출된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제1항에 따른 프라이머 세트를 이용하여 등온증폭반응(LAMP; Loop mediated isothermal amplification)을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 (c) 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 배검은별무늬병균을 검출하는 방법을 제공한다. (A) extracting genomic DNA from a plant sample; (b) amplifying the target sequence by performing a loop mediated isothermal amplification (LAMP) using the extracted genomic DNA as a template and using the primer set according to
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 등온증폭반응은 55℃ 내지 65℃에서 수행될 수 있다. In one embodiment of the present invention, the isothermal amplification reaction may be performed at 55 ° C to 65 ° C.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 증폭 산물을 검출하는 단계는 전기영동(electrophoresis) 또는 SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain(10,000X concentrate in DMSO, invitrogen)을 이용하여 증폭된 DNA를 확인할 수 있다. In one embodiment of the present invention, the step of detecting the amplification product can be performed by using electrophoresis or SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain (10,000X concentrate in DMSO, Invitrogen).
나아가 본 발명은 (i) 감염의심 식물체 시료를 마쇄하는 단계; (ⅱ) 제2항의 배 검은별무늬병 진단용 조성물에 상기 (i) 단계에서 제조된 마쇄액을 첨가한 후 55℃ 내지 65℃에서 45분 동안 방치시키는 단계; 및 (ⅲ) 상기 (ⅱ) 단계가 완료된 반응물에 SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain(10,000X concentrate in DMSO, invitrogen)을 처리한 후 육안으로 형광색 발색 유무를 확인하는 단계를 포함하는 배검은별무늬병균을 검출하는 방법을 제공한다. Further, the present invention relates to a method for screening a susceptible plant for infection (i) (Ii) adding the marking solution prepared in step (i) to the composition for diagnosing astringent black stigma of
본 발명은 배검은별무늬병균 검출용 프라이머 세트를 이용하여 LAMP 방법으로 배 검은별무늬병을 진단하므로 기존의 진단 방법인 PCR 방법과는 달리 현장에서 직접 진단이 가능하며, 고가의 장비가 필요 없이, 초보자도 사용이 가능할 만큼 손쉬운 방법으로 배 검은별무늬병을 진단할 수 있으므로 시간과 비용을 획기적으로 절약할 수 있어 매우 유용하다. The present invention uses a primer set for the detection of a black spotted fungus, and diagnoses a fungus with a black streak due to the LAMP method. Thus, unlike the PCR method, which is a conventional diagnostic method, it is possible to directly diagnose in the field, Can be diagnosed as a black streak disease in an easy-to-use manner, which is very useful because it can save time and money.
도 1은 배 검은별무늬병균에서 확보된 RT-like protein gene의 염기서열을 나타낸 것이다.
도 2는 검은별무늬병 진단용 LAMP의 적정온도 설정 시험 결과를 나타낸 사진이다(M: 1kbp DNA ladder, 1: 50℃, 2: 52℃, 3: 54℃, 4: 56℃, 5: 58℃, 6: 60℃).
도 3은 지역별 배검은별무늬병균(Venturia nashicola)의 genomic DNA를 이용한 LAMP 검정 결과를 나타낸 사진이다(1: VN-HD1-17, 2: VN-SJ3, 3: VN-WJ1-7, 4: VN-OC54, 5: VN-NJ1-15, 6: V. nashicola genomic DNA, 7: DDW. HD: Hadong(하동), SJ: Sejong(세종), WJ: Bukwonju(북원주), OC: Occheon(옥천), NJ: Naju(나주)).
도 4는 설계된 LAMP 프라이머를 이용하여 건전 배 잎 및 배에서 발생하는 병원성 곰팡이의 DNA를 이용한 특이성 검정 결과를 나타낸 것이다(Lane 1-7: 배에서 발생하는 병원성 곰팡이의 LAMP 결과, Lane 9-12: 건전 배의 각 부분에 대한 LAMP 결과, M: 1000bp DNA ladder, 1: Alternaria alternata, 2: Alternaria gaisen, 3: Alternaria kikuchiana, 4: Colletotrichum acutatum, 5: Phytophthora cactorum, 6: Penicillium expansum, 7: Venturia nashicola genomic DNA, 9: 배 꽃잎-1, 10: 배 꽃잎-2, 11: 배 신초-1, 12: 배 신초-2, 15: Positive control (Venturia nashicola genomic DNA), 8, 13, 14: Negative control (DDW)).
도 5는 현장 진단용 LAMP 반응용 PCR mixture 제작 모식도를 나타낸 것이다.
도 6은 배 검은별무늬병 진단용 LAMP법 현장 protocol 모식도를 나타낸 것이다. FIG. 1 shows the nucleotide sequence of the RT-like protein gene obtained from a fungus belonging to the genus Dianthus.
FIG. 2 is a photograph showing the results of an appropriate temperature setting test for a black bandage bottle diagnostic LAMP (M: 1 kbp DNA ladder at 1: 50 ° C, 2:52 ° C, 3:54 ° C, 4:56 ° C, 6: 60 C).
FIG. 3 is a photograph showing the result of LAMP assay using genomic DNA of the locus-specific Venturia nashicola (1: VN-HD1-17, 2: VN-SJ3, 3: VN-WJ1-7, 4: VN 5: VN-NJ1-15, 6: V. nashicola genomic DNA, 7: DDW.HD : Hadong, SJ: Sejong, WJ: Bukwonju, OC: Occheon ), NJ: Naju (Naju)).
FIG. 4 shows the result of specificity test using DNA of pathogenic fungus in healthy pear leaves and stomach using designed LAMP primer (Lane 1-7: LAMP result of pathogenic fungus in the stomach, Lane 9-12: LAMP results for each part of the healthy stomach, M: 1000 bp DNA ladder, 1: Alternaria alternata , 2: Alternaria gaisen , 3: Alternaria kikuchiana , 4: Colletotrichum acutatum , 5: Phytophthora cactorum , 6: Penicillium expansum , 7: Venturia nashicola genomic DNA, 9: times petal-1, 10: boat petal-2, 11: boat shoot-1, 12:
Fig. 5 is a schematic diagram of a PCR mixture for LAMP reaction for field diagnosis.
FIG. 6 is a schematic diagram of the LAMP method field protocol for the diagnosis of fowl of black stigma.
본 발명은 배 검은별무늬병(V. nashicola)을 진단할 수 있는 프라이머 세트를 제공함에 그 특징이 있다. 본 발명에 따른 프라이머 세트는 검은별무늬병을 일으키는 검은별무늬병균만을 특이적으로 검출 또는 진단할 수 있다.The present invention is characterized by providing a primer set capable of diagnosing V. nashicola . The primer set according to the present invention can specifically detect or diagnose only the black spotty germ causing black spot disease.
본 발명에서 "특이적"이라는 용어는 배 검은별무늬병을 일으키는 병원체에 해당하는 검은별무늬병균에 해당하는 종만을 표적하는 것을 의미한다.In the present invention, the term "specific" refers to targeting only the species corresponding to a black-bellied germ, which corresponds to a pathogen causing a black streak disease.
본 발명에서 상기 "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 일반적으로 15 내지 30개의 염기로 구성된다. 프라이머 서열은 주형과 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 주형과 혼성화할 정도로 충분히 상보적이어야 한다.In the present invention, the term "primer " refers to a single strand oligonucleotide sequence complementary to a nucleic acid strand to be copied, and may serve as a starting point for synthesis of a primer extension product. The appropriate length of the primer may vary depending on the purpose of use, but is generally comprised of 15 to 30 bases. The primer sequence need not be completely complementary to the template, but should be sufficiently complementary to hybridize with the template.
본 발명에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)을 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)을 포함할 수 있다.In the present invention, the oligonucleotide used as a primer may also include a nucleotide analogue such as phosphorothioate, alkylphosphorothioate, or peptide nucleic acid, or And may include an intercalating agent.
한편, 본 발명에서 제공하는 프라이머 세트는 검은별무늬병균(V. nashicola)의 종 특이적 영역인 RT-like gene 영역을 증폭할 수 있도록 고안된 프라이머이다. 본 발명의 일실시예에서는 서열번호 1 내지 서열번호 4로 표시되는 프라이머로 구성되는, 검은별무늬병을 진단하기 위한 등온증폭반응용 프라이머 세트를 사용하였다.Meanwhile, the primer set provided in the present invention is a primer designed to amplify an RT-like gene region which is a species-specific region of V. nashicola . In one embodiment of the present invention, a primer set for isothermal amplification reaction, which is composed of the primers represented by SEQ. ID. NO. 1 to SEQ.
본 발명의 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 상기 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.The primers of the present invention can be chemically synthesized using the phosphoramidite solid support method, or other well-known methods. Such nucleic acid sequences may also be modified using many means known in the art. Non-limiting examples of such modifications include, but are not limited to, methylation, capping, substitution of one or more natural nucleotides with an analogue, and modification between nucleotides, such as uncharged linkers (e.g., methylphosphonate, phosphotriester, Amidates, carbamates, etc.) or charged linkages (e.g., phosphorothioates, phosphorodithioates, etc.).
본 발명은 또한, 상기 등온증폭반응용 프라이머 세트를 포함하는 검은별무늬병 진단용 조성물을 제공한다.The present invention also provides a composition for diagnosing a black foliage disease comprising the primer set for the isothermal amplification reaction.
본 발명의 일실시예에서, 상기 조성물은 서열번호 1 내지 서열번호 4의 등온증폭반응용 프라이머 세트 이외에 추가로 등온증폭 반응용 DNA 중합효소, dNTPs, 반응버퍼 및 증류수를 더 포함할 수 있다.In one embodiment of the present invention, the composition may further include a DNA polymerase for isothermal amplification reaction, dNTPs, a reaction buffer, and distilled water in addition to the primer set for isothermal amplification reaction of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO:
본 발명은 또한, 상기 서열번호 1 내지 서열번호 4의 등온증폭반응용 프라이머 세트를 포함하는 검은별무늬병 진단을 위한 키트를 제공한다.The present invention also provides a kit for diagnosing a black fox disease comprising the primer set for the isothermal amplification reaction of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 4.
본 발명의 키트는 서열번호 1 내지 서열번호 4의 등온증폭반응용 프라이머 세트뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다.The kit of the present invention may include one or more other component compositions, solutions or devices suitable for the assay method as well as the primer set for the isothermal amplification reaction of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO:
예를 들어, 본 발명의 키트는 PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. PCR 키트는, 본 발명의 서열번호 1 내지 서열번호 4의 등온증폭반응용 프라이머 세트 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, DNA 중합효소, dNTPs, 버퍼 및 멸균증류수 등을 포함할 수 있다.For example, the kit of the present invention may be a kit containing essential elements necessary for performing PCR. The PCR kit may comprise a test tube or other suitable container, DNA polymerase, dNTPs, buffer and sterile distilled water in addition to the primer set for isothermal amplification reaction of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 4 of the present invention.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 키트는 시료마쇄용 mesh bag; 균질기; 및 등온증폭반응용 PCR 튜브 용기를 포함할 수 있다.In one embodiment of the present invention, the kit comprises a mesh bag for sample milling; Homogenizer; And PCR tube containers for isothermal amplification reactions.
본 발명에서 "시료마쇄용 메쉬 백(mesh bag)"이라는 용어는 마쇄 시 식물체 시료를 담을 수 있는 용기를 의미하며, 여기에 시료마쇄용 버퍼(0.2M NaCl 및 0.2M Tris-HCl(pH 8.0))가 포함될 수 있다.In the present invention, the term " mesh bag for sample grinding "refers to a container capable of holding a plant sample at the time of grinding, and a sample-marking buffer (0.2M NaCl and 0.2M Tris- ) May be included.
본 발명에서 "균질기"는 식물체 시료를 마쇄하는 도구를 의미한다.In the present invention, "homogenizer" means a tool for crushing a plant sample.
본 발명에서 "등온증폭반응용 PCR 튜브 용기"는 등온증폭반응을 시행하기 위한 용기를 의미하며, 여기에 본 발명의 서열번호 1 내지 서열번호 4의 등온증폭반응용 프라이머 세트, 등온증폭 반응용 DNA 중합효소, dNTPs, 반응버퍼 및 증류수를 포함할 수 있다.In the present invention, "PCR tube container for isothermal amplification reaction" means a container for carrying out an isothermal amplification reaction. To this end, a primer set for isothermal amplification of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 4, Polymerase, dNTPs, reaction buffer and distilled water.
본 발명은 또한, (a) 식물체 검체로부터 게놈 DNA를 추출하는 단계; (b) 상기 추출된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제1항에 따른 프라이머 세트를 이용하여 등온증폭반응(LAMP; Loop mediated isothermal amplification)을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 (c) 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 배검은별무늬병균을 검출하는 방법을 제공한다. The present invention also provides a method for producing a plant, comprising: (a) extracting genomic DNA from a plant sample; (b) amplifying the target sequence by performing a loop mediated isothermal amplification (LAMP) using the extracted genomic DNA as a template and using the primer set according to
본 발명의 배검은별무늬병균(V. nashicola)만을 특이적으로 검출하는 방법은 기존의 진단 방법인 PCR법과는 달리 현장진단이 가능하며, 고가의 장비 없이 일정한 온도(60℃)를 유지하는 항온수조 장치만 있으면 초보자도 사용이 가능하다는 장점이 있다. The method of specifically detecting V. nashicola according to the present invention is not limited to the PCR method, which is a conventional diagnostic method, and can be diagnosed on-site, and a constant temperature bath (60 ° C) The advantage of having a device is that even a beginner can use it.
하기 표 1에 기존의 진단법(Nested-PCR)과 본 발명의 LAMP 진단법을 비교하여 나타내었다. Table 1 below shows the comparison between the conventional diagnostic method (Nested-PCR) and the LAMP diagnostic method of the present invention.
소요시간Diagnosis
본 발명은 분자유전학적 기법인 등온증폭반응을 이용하여 배검은별무늬병균(V. nashicola) 종 특이적 유전자 영역을 증폭하여 기존의 PCR처럼 온도의 증감 없이 일정한 온도에서 증폭반응을 진행하여 배 검은별무늬병을 신속하고 정확하게 검출하는 방법에 관한 것이다.The present invention amplifies V. nashicola species specific gene region using isothermal amplification reaction, which is a molecular genetic technique, and amplifies at a constant temperature without increasing or decreasing the temperature as in conventional PCR, To a method for rapidly and accurately detecting a bottle.
본 발명의 방법은 식물체 검체로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 상기 식물체 검체는 감염이 의심되는 배 잎을 사용할 수 있다.The method of the present invention comprises isolating genomic DNA from a plant sample. Methods for isolating the genomic DNA can be performed by a method known in the art, and the plant specimen can be used as a pear leaf suspected of being infected.
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 서열번호 1 내지 4의 등온증폭반응용 프라이머 세트를 이용하여 등온증폭반응을 수행하여 배검은별무늬병균(V. nashicola) 종 특이적 유전자 영역의 표적 서열을 증폭할 수 있다. 상기 등온증폭반응은 55℃ 내지 65℃ 범위에서 60분 이내에 수행될 수 있으며, 60℃ 범위에서 45분 이내에 수행되는 것이 가장 바람직하다. Using the separated genomic DNA as a template, the isothermal amplification reaction was performed using the primer set for isothermal amplification of SEQ ID NOS: 1 to 4 of the present invention to obtain a target of the V. nashicola species-specific gene region The sequence can be amplified. The isothermal amplification reaction may be performed within 60 minutes at a temperature of 55 ° C to 65 ° C, and most preferably within 45 minutes at a temperature of 60 ° C.
본 발명은 배 재배 농가에서 보다 신속하고 간편하게 배검은별무늬병균을 검출하기 위하여, (i) 감염의심 식물체 시료를 마쇄하는 단계; (ⅱ) 상기 배 검은별무늬병 진단용 조성물에 상기 (i) 단계에서 제조된 마쇄액을 첨가한 후 55℃ 내지 65℃에서 45분 동안 방치시키는 단계; 및 (ⅲ) 상기 (ⅱ) 단계가 완료된 반응물에 SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain(10,000X concentrate in DMSO, invitrogen)을 처리한 후 육안으로 형광색 발색 유무를 확인하는 단계를 포함하는 배검은별무늬병균을 검출하는 방법을 제공한다. The present invention relates to a method for the rapid and easy detection of fowlbearing fungus in a grower farm, comprising the steps of: (i) crushing a suspect plant sample; (Ii) adding the marking solution prepared in step (i) to the composition for diagnosing malignant glandular streak disease and then allowing to stand at 55 to 65 ° C for 45 minutes; And (iii) subjecting the reaction product obtained in step (ii) to treatment with SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain (10,000X concentrate in DMSO, invitrogen) and then visually confirming whether a fluorescent color is present or not. The method comprising:
본 발명의 일실시예에 따르면, LAMP용 tube에서 형광색으로 발색되면 배검은별무늬병균에 감염된 것으로 판단할 수 있고, LAMP용 tube에서 주황색으로 발색되면 배검은별무늬병균에 감염되지 않은 것으로 판단할 수 있다. According to one embodiment of the present invention, it can be judged that when a fluorescent color is developed in a tube for LAMP, it is infected with a fungus infected with a fungus, and if it is colored orange in a LAMP tube, it can be judged that the fungus is not infected with fungus .
이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. It will be apparent to those skilled in the art that these embodiments are merely illustrative of the present invention and that the scope of the present invention is not limited to these embodiments.
<< 실시예Example 1> 1>
배검은별무늬병균Black spotted germ 특이적 Specific 프라이머primer 제작 making
배검은별무늬병균(V. nashicola)에서 유전체를 추출하여 무작위적인 염기서열을 분석하였다. 획득된 배 검은별무늬병의 염기서열은 미국 국립생물공학정보센터 NCBI (National Center for Biotechnology Information, http://www.ncbi.nlm.nih.gov) database에 등록된 다른 곰팡이의 염기서열과 비교 분석을 실시하였다. 그런 다음 multiple alignment를 통해 검은별무늬병균(V. nashicola)의 종 특이적 염기서열을 획득하였다.The genome was extracted from V. nashicola and analyzed for random base sequences. The nucleotide sequence of the obtained black foxtail bottle was compared with the nucleotide sequence of other fungi registered in the NCBI database of the National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) Respectively. The species-specific base sequence of V. nashicola was then obtained by multiple alignment.
그 결과, 1,470 bp의 RT-like gene 유전자 영역을 확보하였으며, 이 중 배검은별무늬병균(V. nashicola)과 근연한 사과검은별무늬병균(V. inaequalis)을 비교하였다. As a result, a region of 1,470 bp of RT-like gene was secured and V. nashicola and V. inaequalis were compared.
또한, 획득된 배검은별무늬병균(V. nashicola) 특이적인 영역을 확인하고, 해당 염기서열을 이용하여 PrimerExplorer V4 (https://primerexplorer.jp/e/) 프로그램으로 LAMP용 프라이머 쌍을 설계하여 하기 표 2 및 도 1에 나타내었다.In addition, the region specific to the obtained V. nashicola was identified, and the pair of primers for LAMP was designed using PrimerExplorer V4 (https://primerexplorer.jp/e/) using the corresponding nucleotide sequence Table 2 and Fig.
(mer)Length
(mer)
*FIP : forward inner primer, BIP : backward inner primer* FIP: forward inner primer, BIP: backward inner primer
<< 실시예Example 2> 2>
배검은별무늬병균Black spotted germ 진단용 LAMP법의 검정 및 개발 결과 Verification and development results of diagnostic LAMP method
<2-1><2-1> 배검은별무늬병균Black spotted germ 진단용 LAMP법의 검정 Assay of diagnostic LAMP method
국내 하동, 세종, 북원주, 옥천, 및 나주 지역에서 분리한 5종의 배 검은별무늬병균, 건전 배의 서로 다른 4부위, 그리고 배 잎에서 발생하는 곰팡이 6종의 균주에서 추출한 total DNA를 이용하여 LAMP법을 수행하였다. Using total DNA extracted from five different strains of black spotted fungus, four different parts of healthy pear, and six fungal strains from the leaves of Hadong, Sejong, Bukwonju, Okcheon, and Naju LAMP method was performed.
검은별무늬병균 진단용 LAMP법의 조성과 반응조건을 설정한 결과, 조성물의 농도 및 용량은 하기 표 3에 기재하였다. The composition and reaction conditions of the LAMP method for the diagnosis of black spotted germs were set, and the concentrations and the doses of the compositions are shown in Table 3 below.
본 발명에서는 검은별무늬병균 진단용 LAMP법의 현장적용 방법을 모색하기 위해, 검체 사전처리방법 및 장치들을 고안하였다. 개발된 LAMP법의 종 특이성을 확인하기 위해, 배나무에서 발생하는 다른 종의 곰팡이를 이용하여 특이성 검정을 수행하였다. In the present invention, methods and apparatuses for pretreating a sample were devised in order to find a method of applying the LAMP method for the diagnosis of black spotted germs. In order to confirm the species specificity of the developed LAMP method, specificity tests were conducted using fungi of other species occurring in pear trees.
<2-2><2-2> 배검은별무늬병균Black spotted germ 진단용 LAMP법 개발 결과 Development result of diagnostic LAMP method
검은별무늬병 진단용 LAMP법의 적정온도 범위를 설정하기 위해 50℃, 52℃, 54℃, 56℃, 58℃, 60℃의 온도범위에서 동일한 조성으로 45분간 반응시켰다. 52 ℃, 54 ℃, 56 ℃, 58 ℃ and 60 ℃ for 45 minutes in order to set the optimum temperature range of LAMP method for diagnosis of black star pattern.
그 결과, laddering을 보이는 온도는 52℃, 54℃, 56℃, 58℃, 60℃로 확인되었으며, 그 중 60℃에서 laddering이 가장 강하게 확인되어 배 검은별무늬병 진단용 LAMP법의 적정 온도를 60℃로 설정하여 실험을 수행하였다(도 1 참조).As a result, laddering was confirmed at 52 ℃, 54 ℃, 56 ℃, 58 ℃ and 60 ℃. Among them, laddering was most strongly observed at 60 ℃. (See Fig. 1).
또한, 지역별 배검은별무늬병균의 균주에서 추출된 genomic DNA를 이용하여 설정된 조건에서 실험을 수행하고 SYBR green solution I을 이용하여 염색한 결과, 모두 발색되었으며, 전기영동 결과 특이적인 ladder 현상을 확인하였다(도 2 참조).In addition, the experiment was performed using genomic DNA extracted from strains of black-spotted germs in each region, and stained with SYBR green solution I, all of which were developed, and specific ladder phenomenon was confirmed by electrophoresis 2).
하지만 배에서 발생하는 Alternaria alternata , A. gaisen , A. kikuchiana , Colletotrichum acutatum , Phytophthora cactorum , Penicillium expansum, 6종의 다른 곰팡이의 균주에서 추출한 DNA와, 건전 배의 꽃잎과 신초에서 추출한 DNA를 이용하여 동일하게 LAMP를 수행한 결과, 본 발명의 배검은별무늬병균을 제외한 식물체 DNA 및 다른 병원균에서는 특이적인 반응이 관찰되지 않았음을 알 수 있었다(도 3 참조).However, Alternaria alternata , A. gaisen , A. kikuchiana , Colletotrichum acutatum , Phytophthora cactorum , Penicillium expansum , DNA extracted from six different fungal strains, and DNA extracted from healthy fox petals and shoots were subjected to the same LAMP. As a result, the plant DNA and other pathogens of the present invention, (See FIG. 3).
따라서, 상기 개발된 배검은별무늬병균 검출용 등온증폭반응용 프라이머 세트를 이용하여 검정을 수행한 결과, 지역별 배검은별무늬병균 균주의 DNA에서는 모두 특이적인 반응이 확인되었으며, 건전 배의 꽃잎과 신초 및 배에서 발생하는 다른 곰팡이에서는 모두 특이적인 반응이 일어나지 않은 것을 확인하였으므로 본 발명의 배검은별무늬병균 진단용 LAMP는 배검은별무늬병균을 특이적으로 검출할 수 있다. Therefore, the present inventors conducted a test using the primer set for the isochrone amplification reaction for the detection of the above-mentioned black spotted fungus. As a result, specific reactions were confirmed in the DNA of the black fungus isolate of each locus, Since it was confirmed that no specific reaction occurred in all the other fungi occurring in the stomach, the LAMP for the diagnosis of fowl of the present invention can specifically detect the fowl of black stigma.
<< 실시예Example 3> 3>
배 ship 검은별무늬병Black colored bottle 진단용 LAMP법의 현장진단법 개발 Development of field diagnostic method for diagnostic LAMP method
배 검은별무늬병 진단용 LAMP법을 야외 포장에서 적용하기 위해 현장진단에 사용될 kit 구성품을 개발하고, 사용 프로토콜을 작성하였다. Kit components for field diagnosis were developed and used protocols were developed to apply the LAMP method for diagnosis of black streaks in outdoor pavement.
<3-1><3-1> 배 ship 검은별무늬병Black colored bottle 진단용 LAMP법 현장진단법 개발 Development of diagnostic method for LAMP method for diagnosis
시료마쇄용 mesh bag (Agdia, Elkhart, IN), 마쇄용 buffer (0.2 M NaCl 및 0.2 M Tris-HCl (pH 8.0), 균질기(ACC00900, Agdia, Elkhart, IN), 도 4의 조성 및 방법으로 제작된 LAMP 반응용 PCR tube를 준비하였다. The composition and method of FIG. 4 were used for the sample grinding, using a mesh bag (Agdia, Elkhart, IN), a buffer for grinding (0.2 M NaCl and 0.2 M Tris-HCl pH 8.0, homogenizer (ACC00900, Agdia, Elkhart, IN) PCR tube for LAMP reaction was prepared.
<3-2><3-2> 검은별무늬병Black colored bottle 진단용 LAMP법 현장 프로토콜 Diagnostic LAMP Method Field Protocol
검은별무늬병 진단용 LAMP법 현장 프로토콜은 총 4단계로, 시료 준비 > 마쇄 > 반응 (전반응(pre-reaction) 및 후반응(post-reaction)) > 결과확인의 순서로 진행하였으며, 도 4에 기재된 현장 진단용 LAMP 반응용 PCR mixture가 들어있는 LAMP 반응용 PCR tube에 현장에서 채집한 시료를 첨가하여 반응시켜 확인하였다(도 5 참조).The LAMP method field protocol for diagnosis of black streaks was carried out in the order of sample preparation> polish> reaction (pre-reaction and post-reaction)> result confirmation in four steps in total. (See FIG. 5) by adding a sample collected in the field to a PCR tube for LAMP reaction containing a PCR mixture for LAMP reaction for field diagnosis.
보다 구체적으로 설명하면 다음과 같다. More specifically, it is as follows.
1) 시료 준비: 시료 채집 후 70% EtOH를 이용하여 표면 소독 실시;1) Sample preparation: Samples were collected and surface sterilized using 70% EtOH;
2) 마쇄 : 시료마쇄용 mesh bag에 마쇄용 buffer 3 mL 넣고 시료를 첨가 후 균질기로 마쇄;2) Grinding: Put 3 mL of the buffer for grinding in a mesh bag for sample grinding, add the sample and grind with a homogenizer;
3) 반응 : LAMP용 PCR tube(현장 진단용 LAMP 반응용 PCR mixture)에 마쇄액 1 μL 첨가, 60℃에서 5분간 방치, 5분간 방치된 LAMP용 PCR tube에 Bst polymerase 1 μL 첨가, 60℃에서 45분간 방치;3) Reaction:
4) 결과확인 : LAMP용 tube에서 형광색으로 발색되면 배검은별무늬병균에 감염된 것으로 판단, LAMP용 tube에서 주황색으로 발색되면 배검은별무늬병균에 감염되지 않은 것으로 판단4) Confirmation of result: When the fluorescent color of the tube for LAMP is considered to be infected with the black spotted fungus, if it is colored orange in the LAMP tube, it is judged that the fungus is not infected with the black spotted fungus
따라서, 본 발명의 방법으로 제작된 배검은별무늬병균 특이적 프라이머는 병징이 나타나지 않은 상태의 감염된 배 잎에서도 상기 균의 감염여부를 특이적으로 신속하고 경제적으로 진단이 가능하므로, 적절한 살균제 살포를 통한 검은별무늬병균의 감염확산 및 추가적인 피해를 미연에 차단할 수 있는 우수한 효과가 있다.Therefore, it is possible to specifically and rapidly and economically diagnose the infection of the above-mentioned fungus even in an infected pear leaf in which the disease-free black stigma-specific germ-specific primer produced by the method of the present invention is not present, There is an excellent effect that can prevent the spread of the infection of black spotted germs and the additional damage in advance.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.The present invention has been described with reference to the preferred embodiments. It will be understood by those skilled in the art that various changes in form and details may be made therein without departing from the spirit and scope of the invention as defined by the appended claims. Therefore, the disclosed embodiments should be considered in an illustrative rather than a restrictive sense. The scope of the present invention is defined by the appended claims rather than by the foregoing description, and all differences within the scope of equivalents thereof should be construed as being included in the present invention.
<110> Kyungpook National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Primer set for loop-mediated isothermal amplification reaction for detecting V. nashicola and uses thereof <130> PN1707-239 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RT-F3 primer <400> 1 ccactaacgt catgtagagc 20 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RT-B3 primer <400> 2 cctttctttt ttgtccgaag g 21 <210> 3 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RT-FIP primer <400> 3 cgctacttta aacagatttt tcgcattttt cattaaagct agagctgcta ag 52 <210> 4 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RT-BIP primer <400> 4 tgaacaaaga tcttgataac cccatttttt gcggtattct tttttatagc gtag 54 <110> Kyungpook National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Primer set for loop-mediated isothermal amplification reaction for detecting V. nashicola and uses thereof <130> PN1707-239 <160> 4 <170> KoPatentin 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RT-F3 primer <400> 1 ccactaacgt catgtagagc 20 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RT-B3 primer <400> 2 cctttctttt ttgtccgaag g 21 <210> 3 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RT-FIP primer <400> 3 cgctacttta aacagatttt tcgcattttt cattaaagct agagctgcta ag 52 <210> 4 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RT-BIP primer <400> 4 tgaacaaaga tcttgataac cccatttttt gcggtattct tttttatagc gtag 54
Claims (10)
상기 조성물은 등온증폭 반응용 DNA 중합효소, dNTPs, 반응버퍼 및 증류수를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 배 검은별무늬병 진단용 조성물.3. The method of claim 2,
Wherein the composition further comprises a DNA polymerase for isothermal amplification reaction, dNTPs, a reaction buffer, and distilled water.
상기 키트는 시료마쇄용 메쉬백(mesh bag); 균질기; 및 등온증폭반응용 PCR 튜브 용기를 포함하는 것을 특징으로 하는 배 검은별무늬병 진단용 키트.5. The method of claim 4,
The kit includes a mesh bag for sample milling; Homogenizer; And a PCR tube container for isothermal amplification reaction.
상기 등온증폭반응용 PCR 튜브 용기는 서열번호 1 내지 서열번호 4로 표시되는 프라이머로 구성되는 배 검은별무늬병을 진단하기 위한 등온증폭반응용 프라이머 세트; 등온증폭 반응용 DNA 중합효소; dNTPs; 반응버퍼 및 증류수를 포함하는 것을 특징으로 하는 배 검은별무늬병 진단용 키트.6. The method of claim 5,
The PCR tube container for the isothermal amplification reaction comprises a primer set for isothermal amplification reaction for diagnosing a black spotted follicle comprising the primers represented by SEQ ID NOS: 1 to 4; DNA polymerase for isothermal amplification reaction; dNTPs; A reaction buffer, and distilled water.
(b) 상기 추출된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제1항에 따른 프라이머 세트를 이용하여 등온증폭반응(LAMP; Loop mediated isothermal amplification)을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
(c) 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 배검은별무늬병균을 검출하는 방법.(a) extracting genomic DNA from a plant sample;
(b) amplifying the target sequence by performing a loop mediated isothermal amplification (LAMP) using the extracted genomic DNA as a template and using the primer set according to claim 1; And
(c) detecting the amplification product.
상기 등온증폭반응은 55℃ 내지 65℃에서 수행되는 것을 특징으로 하는 배검은별무늬병균을 검출하는 방법.8. The method of claim 7,
Wherein the isothermal amplification reaction is performed at 55 to 65 ° C.
상기 증폭 산물을 검출하는 단계는 전기영동(electrophoresis) 또는 SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain (10,000X concentrate in DMSO, invitrogen)을 이용하여 증폭된 DNA를 확인하는 것을 특징으로 하는 배검은별무늬병균을 검출하는 방법.8. The method of claim 7,
Wherein the step of detecting the amplification product comprises detecting DNA amplified using electrophoresis or SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain (10,000X concentrate in DMSO, invitrogen). Way.
(ⅱ) 제2항의 배 검은별무늬병 진단용 조성물에 상기 (i) 단계에서 제조된 마쇄액을 첨가한 후 55℃ 내지 65℃에서 45분 동안 방치시키는 단계; 및
(ⅲ) 상기 (ⅱ) 단계가 완료된 반응물에 SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain(10,000X concentrate in DMSO, invitrogen)을 처리한 후 육안으로 형광색 발색 유무를 확인하는 단계를 포함하는 배검은별무늬병균을 검출하는 방법.(i) grinding the suspect plant sample;
(Ii) adding the marking solution prepared in step (i) to the composition for diagnosing astringent black stigma of claim 2, and then allowing it to stand at 55 ° C to 65 ° C for 45 minutes; And
(Iii) treating the reactant after completion of the step (ii) with SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain (10,000X concentrate in DMSO, invitrogen) and then confirming whether or not the fluorescent coloration is visually observed How to.
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| KR1020170096032A KR101823301B1 (en) | 2017-07-28 | 2017-07-28 | Primer set for loop-mediated isothermal amplification reaction for detecting V. nashicola and uses thereof |
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| KR (1) | KR101823301B1 (en) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20150099142A (en) * | 2014-02-21 | 2015-08-31 | 경북대학교 산학협력단 | Primer set for loop-mediated isothermal amplification reaction for detecting of Marssonina coronariae, and uses thereof |
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2017
- 2017-07-28 KR KR1020170096032A patent/KR101823301B1/en active IP Right Grant
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant |