KR101822574B1

KR101822574B1 - 고밀도 웨스턴 블롯 어레이 분석 방법

Info

Publication number: KR101822574B1
Application number: KR1020160172742A
Authority: KR
Inventors: 강성현; 윤태성
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2015-12-18
Filing date: 2016-12-16
Publication date: 2018-01-26
Also published as: KR20170073529A; US20180299440A1

Abstract

본 발명은 복수 개의 시료에 대하여 특정 단백질의 존재 여부를 동시에 확인하거나, 또는 단일의 시료에 대하여 복수 개의 단백질의 존재 여부를 동시에 확인할 수 있는 고밀도 웨스턴 블롯 어레이 분석 방법에 관한 것으로서, 본 발명의 분석 방법에 의하면 시료의 체적이 감소되고, 극소량의 항체만으로도 분석이 가능해지며, 시험에 소요되는 시간이 대폭 단축될 뿐만 아니라, 고가의 장비가 필요없이 장치를 콤팩트하게 구성할 수 있고, 실험 포멧의 제약 없이 분석을 진행할 수 있는 장점이 있다.

Description

고밀도 웨스턴 블롯 어레이 분석 방법{High-density western blot array analysis methods}

본 발명은 고밀도 웨스턴 블롯 어레이 분석 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 복수 개의 시료에 대하여 특정 단백질의 존재 여부를 동시에 확인하거나, 또는 단일의 시료에 대하여 복수 개의 단백질의 존재 여부를 동시에 확인할 수 있는 고밀도 웨스턴 블롯 어레이 분석 방법에 관한 것이다.

웨스턴 블롯은 특정 시료의 분석으로 발현된 단백질을 검출하기 위한 연구 기법이다.

웨스턴 블롯은 세포, 조직 내에 단백질의 존재나 전사 후 변형 상태를 검증하는 데 사용된다.

웨스턴 블롯의 과정은 크게 SDS-PAGE, Nitrocellulose 혹은 PVDF 전사 멤브레인으로의 단백질 전사, 목표 단백질에 대한 항체 처리, 항체 표지 분석을 통한 목적 단백질의 검출의 순으로 이루어진다. 웨스턴 블롯을 위한 시료는 주로 세포, 조직 내의 단백질 혼합물들 이용한다. 세포 융해(cell lysis)를 통해 시료를 파쇄한 후에 여러 번의 원심 분리와 정제를 통해 단백질들을 분리하여 이용하게 된다.

극소량의 목표물의 탐지를 효율적으로 진행하기 위해서 시료내 단백질을 넓게 펼쳐줄 필요가 있는데 이 때 흔히 사용하는 방법으로 SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)가 있다. SDS (sodium dodecyl sulfite)는 단백질 시료 내 단백질과 결합하여 단백질들이 2차, 3차, 4차 구조를 잃고 선형이 되도록 하며, 단백질에 높은 밀도의 음전하를 부여하여 전기영동 시 양극을 향해 끌리도록 한다. 즉 SDS 로 변성된 단백질들을 PAG (polyacrylamide gel)상에 전기영동시켜 크기에 따라 분류하는 것이 위에서 언급한 SDS-PAGE 이다.

SDS-PAGE로 분리된 단백질들은 겔 속에 묻혀 있기 때문에 탐침과 단백질의 직접적인 결합을 관찰하는 것이 힘들게 된다.

따라서, 단백질을 얇은 전사 멤브레인 위로 옮겨서 탐침과 쉽게 결합할 수 있도록 하는 전사 작업이 수행된다.

이와 같은 전사 작업 중에서도 가장 널리 이용되는 것이 바로 전기영동 전사방법(electrophoretic transfer)이다.

이는 전기영동과 매우 비슷한 원리를 이용하게 되는데 여기에도 두 가지 방법이 종래에 사용되었다.

하나는 수평으로 겔을 위치시켜 분리하는 반건식 전사(semi-dry transfer)이고, 다른 하나는 수직으로 겔을 세워 버퍼를 채운 상태에서 분리하는 습식전사(wet transfer)방법이다.

이때 전사방법은 전기영동이 끝난 겔을 조심스레 분리해내고 전사멤브레인과 겹쳐주게 된다.

그리고 양쪽으로 필터종이와 패드를 두어 버퍼를 충분히 흡수하게 함과 동시에 겔을 보호하게 되며, 양쪽으로 음극과 양극을 위치시킨다.

이때, 단백질은 양극으로 끌려가므로 전사멤브레인은 양극쪽에 위치시킨다.

전압이 걸리면 단백질들은 겔에서 막으로 천천히 전사를 시작하며 결국 전사멤브레인 위에 붙게 되는 것이다.

전사 멤브레인 위로 단백질이 옮겨지면 또 다른 단백질들이 더 이상 전사멤브레인에 붙지 않게 하기 위한 블록킹 작업이 수행된다.

이는 시료 단백질들이 붙은 자리를 제외한 모든 구역에 이미 알고 있고 탐침과는 반응하지 않는 단백질들을 붙여준다.

탐침인 항체는 단일 클론 림프구들에게서 만들어지며 목표로 하는 단백질에만 특이적으로 결합하는 성질을 갖고 있다.

즉, 탐침은 실험을 위하여 미리 준비되어야 하며 타겟 단백질에 따라 서로 다른 종류를 만들어 사용하여야 한다.

따라서, 종래의 웨스턴 블롯은 필요로 하는 항체가 과다하게 소요되는 문제 및 시료의 양이 과다하게 필요로 한 문제가 있었다.

그에 따라, 한 번에 수행될 수 있는 시료의 개수에도 한계가 있었다.

뿐만 아니라 종래의 웨스턴 블롯 시스템은 전기영동에 소모되는 시간이 많이 소요되었으며, 시료의 이동을 위한 전기영동 거리가 길게 요구되는 문제도 있었다.

한편, 종래기술인 미국 공개특허 제2011-0028339호는 고집적 웨스턴 블롯 기술을 개시하고는 있다.

그러나, 미국 공개특허 제2011-0028339호는 고가의 장비를 요하며, 실험 포멧을 자유롭게 구성할 수 없는, 특히 사실상 한번에 테스트 할 수 있는 시료의 개수나 종류가 제한적일 수 밖에 없는 등 많은 문제를 안고 있었다.

US

2011-0028339

A1

본 발명의 일 목적은 기존 웨스턴 블롯의 한계를 극복하고, 다수의 웨스턴 블롯을 동시에 진행하기 위한 고집적 어레이 기술을 구현하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적을 상기와 같은 기술을 구현하는데 필요한 겔 포머, 시료 주입 유니트, 항체 인큐베이션 챔버들을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 측면은 복수 개의 시료 주입 홈들이 하나 이상의 열을 이루도록 형성된 겔을 제조하는 단계; 상기 겔의 시료 주입 홈들 각각에 시료를 주입하는 단계; 상기 시료가 주입된 겔을 상기 시료 주입 홈들이 이루고 있는 열과 수직인 방향으로 전기영동하는 단계; 상기 전기영동된 겔의 시료를 멤브레인으로 전사하는 단계; 상기 시료가 전사된 멤브레인 전체를, 항체 인큐베이션 챔버에 형성된 하나의 공간부 내에 수용시키고 항체를 처리하는 단계; 및 상기 항체가 처리된 멤브레인을 분석하는 단계;를 포함하는 고밀도 웨스턴 블롯 어레이 분석 방법을 제공한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 다른 측면은 소정의 폭을 갖는 하나 이상의 시료 주입 슬롯이 상기 폭의 길이 방향으로 배열되어 하나 이상의 열을 이루도록 형성된 겔을 제조하는 단계; 상기 겔의 시료 주입 슬롯에 시료를 주입하는 단계; 상기 시료가 주입된 겔을 상기 시료 주입 슬롯이 이루고 있는 열과 수직인 방향으로 전기영동하는 단계; 상기 전기영동된 겔의 시료를 멤브레인으로 전사하는 단계; 상기 시료가 전사된 멤브레인을, 상기 시료 주입 슬롯의 폭의 길이에 맞도록 복수 개의 항체 주입 홈 및 복수 개의 미세유로가 형성된 항체 인큐베이션 챔버에 장착하고, 상기 각각의 항체 주입 홈에 서로 다른 종류의 항체를 주입하여 상기 항체들을 각각의 미세유로를 따라 상기 멤브레인에 전사된 시료에 처리하는 단계; 및 상기 항체가 처리된 멤브레인을 분석하는 단계;를 포함하는 고밀도 웨스턴 블롯 어레이 분석 방법을 제공한다.

이와 같은 본 발명에 따르면 다음과 같은 효과가 있다.

첫째, 고밀도의 웨스턴 블롯이 가능하여 시료의 체적이 감소되는 강점이 있다.

둘째, 극소량의 항체만으로도 분석이 가능해지는 장점이 있다.

셋째, 한 번에 시험 가능한 시료의 개수가 대폭 증대되는 이점이 있다.

넷째, 시험에 소요되는 시간이 대폭 단축되는 강점이 있다.

다섯째, 전기이동 거리가 단축되어 검사 장치가 콤팩트해지는 장점이 있다.

일곱째, 고가의 장비를 요하지 아니하며, 실험 포멧의 제약이 없다는 장점이 있다.

여덟째, 항체 인큐베이션 챔버는 상부 프레임과 하부 프레임 사이에 씰링부재가 마련되기 때문에 기밀이 유지되는 이점이 있다.

도 1은 본 발명의 고밀도 웨스턴 블롯 어레이 분석 방법의 순서를 나타낸 순서도이다.
도 2a 내지 도2c는 본 발명의 제1 분석 방법에 따른 고밀도 웨스턴 블롯 어레이 분석 방법에 이용되는 겔의 예시도이다.
도 3 및 도 4는 각각 본 발명의 제1 분석 방법에 따른 고밀도 웨스턴 블롯 어레이 분석 방법에 이용되는 제1 겔 포머의 사시도 및 정면도이다.
도 5는 본 발명의 제1 분석 방법에 따른 고밀도 웨스턴 블롯 어레이 분석 방법에 이용되는 주입 유닛의 정면도이다.
도 6a 및 도 6b는 본 발명의 제1 분석 방법에 따른 고밀도 웨스턴 블롯 어레이 분석 방법에 이용되는 제1 항체 인큐베이션 챔버의 사시도이다.
도 7은 본 발명의 제2 분석 방법에 따른 고밀도 웨스턴 블롯 어레이 분석 방법에 이용되는 겔의 예시도이다.
도 8 및 도 9는 각각 본 발명의 제2 분석 방법에 따른 고밀도 웨스턴 블롯 어레이 분석 방법에 이용되는 제2 겔 포머의 사시도 및 정면도이다.
도 10a는 본 발명의 제2 분석 방법에 따른 고밀도 웨스턴 블롯 어레이 분석 방법에 이용되는 제2 항체 인큐베이션 챔버의 일 예를 나타낸 사시도이고, 도 10b는 본 발명의 제2 분석 방법에 따른 고밀도 웨스턴 블롯 어레이 분석 방법에 이용되는 제2 항체 인큐베이션 챔버의 다른 예를 나타낸 사시도이다.
도 11a는 상기 일 예에 따른 제2 항체 인큐베이션 챔버의 a-a'를 따라 절단한 단면의 단면도이고, 도 11b는 상기 다른 예에 따른 제2 항체 인큐베이션 챔버의 a-a'를 따라 절단한 단면의 단면도이다.
도 12a는 상기 일 예에 따른 제2 항체 인큐베이션 챔버에 이용되는 주입 유닛의 모식도이고, 도 12b는 상기 다른 예에 따른 제2 항체 인큐베이션 챔버에 이용되는 주입 유닛의 모식도이다.
도 13a는 상기 일 예에 따른 제2 항체 인큐베이션 챔버에 주입 유닛이 삽입된 모습을 나타내는 모식도이고, 도 13b 및 도 13c는 상기 다른 예에 따른 제2 항체 인큐베이션 챔버에 주입 유닛이 삽입된 모습을 나타낸 모식도로서, 도 13b는 주입관가 삽입된 부분의 단면을, 도 13c는 토출관가 삽입된 부분이 단면을 각 나타낸다.

이하 첨부된 도면을 참조하여 본 발명을 상세히 설명한다.

이 과정에서 도면에 도시된 선들의 두께나 구성요소의 크기 등은 설명의 명료성과 편의상 과장되게 도시되어 있을 수 있다. 또한, 후술 되는 용어들은 본 발명에서의 기능을 고려하여 정의된 용어들로서 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 관례에 따라 달라질 수 있다. 그러므로 이러한 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 기술되어야 할 것이다.

[제1 실시예]

본 발명의 일 측면은 복수 개의 시료에 대하여 단일의 항체에 결합하는 단백질의 존재 여부를 동시에 확인하기 위한 고밀도 웨스턴 블롯 어레이 분석 방법(제1 분석 방법)을 제공한다. 상기과 같은 제1 분석 방법은 멀티샘플분석법(multi sample analysis)으로서, 예를 들면 drug, biodrug, RNAi library, antisense RNA library 등을 이용한 분석에 응용 가능하며, in vitro screening에 이용되는 HTS(High Throughput Screening)의 대안으로 사용될 수 있고, 여러 타깃 분자에 대한 스크리닝에 이용될 수 있다.

도 1을 참고하면, 상기 본 발명의 제1 분석 방법은 겔을 제조하는 단계(S1), 시료를 겔에 주입하는 단계(S2), 겔의 시료를 전기영동하는 단계(S3) 전기영동된 겔의 시료를 멤브레인으로 전사하는 단계(S4), 멤브레인에 항체를 처리하는 단계(S5) 및 멤브레인을 분석하는 단계(S6)를 포함한다.

(1-1) 겔 제조 단계(S1)

도 2a 내지 도 2c를 참고하면, 상기 제1 분석 방법의 경우, 먼저 복수 개의 시료 주입 홈들(110)이 하나 이상의 열을 이루도록 형성된 겔(100)을 제조한다(S1).

상기 복수 개의 시료 주입 홈들(110)은 각각 수 ㎕의 부피, 바람직하게는 0.1㎕ 내지 5㎕의 부피, 보다 바람직하게는 0.5㎕ 내지 2㎕의 부피의 시료가 주입될 수 있는 크기를 가진다.

상기 시료 주입 홈들(110)은 서로 수 ㎜의 간격, 바람직하게는 0.5㎜ 내지 5㎜의 간격, 보다 바람직하게는 1㎜ 내지 3㎜의 간격으로 배치되어, 20개 이상, 바람직하게는 50개 이상, 더욱 바람직하게는 100개 이상이 하나의 열을 이루도록 형성될 수 있다.

또한, 상기와 같이 복수 개의 시료 주입 홈들(110)이 이루고 있는 열은 복수 개일 수 있다. 상기 열이 복수 개인 경우, 상기 복수 개의 열들은 시료 주입 홈에 주입된 시료가 전기영동되는 거리보다 넓은 간격을 가지도록 형성되는데, 수 ㎝의 간격, 바람직하게는 0.5㎝ 내지 5㎝의 간격, 보다 바람직하게는 1㎝ 내지 3㎝의 간격으로 배치될 수 있다.

특히, 상기 시료 주입 홈들(110)은 도 2b 및 도 2c에 도시된 바와 같이 시료가 전기영동되는 방향과 반대 방향으로 테이퍼드된 형태일 수 있고, 일 예로 사다리꼴의 형상일 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서는 1㎜의 간격으로 배치된 101개의 시료 주입 홈들이 하나의 열을 형성하고, 이러한 열 4개가 1.2㎝의 간격으로 배치된 12㎝×6㎝ 크기의 겔을 제조하였다.

본 발명의 제1 분석 방법에서 이용되는 상기와 같은 겔은 도 3 및 도 4에 도시된 바와 같은 제1 겔 포머(300)를 이용하여 제조될 수 있다.

도 3 및 도4를 참고하면, 상기 제1 겔 포머는 본체(310) 및 커버 유닛(350)을 포함하여 형성된다.

상기 본체(310)는 편평한 판형의 부재로 이루어지고 직사각 형상으로 마련되는 제1 플레이트(311)와 상기 제1 플레이트 상부면의 가장자리부에 소정의 높이로 마련되는 제2 플레이트(313)로 이루어진다. 상기 제2 플레이트(313)는 'ㄷ'자 형상으로 구비되는 것이 바람직한데, 상기 편평한 판형의 제1 플레이트(311)와 상기 'ㄷ'자 형상의 제2 플레이트(313)에 의해 형성된 내부의 오목한 형상을 갖는 공간이 겔이 주입되는 겔 수용부(330)가 된다. 결국, 상기 제1 플레이트(311)는 상기 겔 수용부(330)의 바닥면을, 상기 제2 플레이트(313)는 상기 겔 수용부(330)의 측면을 각각 제공하는 것이다. 추가적으로, 상기 겔 수용부(330)에는 겔이 외부로 새어 나가지 못하도록 씰링부재(S)가 설치될 수 있고, 상기 제2 플레이트(313)의 상부면에는 복수 개의 클램핑 장치(315)가 수정의 간격으로 마련될 수도 있다.

상기 커버 유닛(350)은 프레임(351)과 복수 개의 성형 돌기(355)가 구비된 성형판(353)을 포함한다. 상기 성형 돌기(355)는 상기 성형판(353)의 일면에 돌출된 형상으로 형성되어, 겔 수용부(330)에 주입된 겔 내부로 적어도 일부가 삽입되어 수 ㎕의 부피의 시료가 주입될 수 있는 크기의 시료 주입 홈(110)을 형성한다. 상기 성형 돌기(355)는 복수 개가 서로 수 ㎜의 간격으로 하나 이상의 열을 이루도록 형성되고, 상기 성형 돌기(355)들이 이루고 있는 열이 복수 개인 경우 각 열들은 수 ㎝의 간격으로 배치될 수 있다. 상기 성형판(353)은 상기 프레임(351)과 일체로 형성될 수 있으나, 보다 바람직하게는 분리 가능하도록 탈착식으로 마련될 수도 있는데, 이는 복수 개의 성형 돌기(355)의 패턴, 간격, 크기, 개수 등을 달리하여 교체 사용하기 위함이다.

상기 커버 유닛(350)은 상기 겔 수용부(330)를 개방하는 제1 위치와 상기 겔 수용부(330)를 밀폐하는 제2 위치 사이에서 이동 가능하도록 상기 본체(310)에 장착될 수 있다. 보다 바람직하게는 상기 커버 유닛(350)은 제1 플레이트(311)의 일측에서 회동 가능하도록 연결될 수 있다. 상기 커버 유닛(350)이 겔 수용부(330)를 밀폐하는 제2 위치에 배치될 때, 상기 겔 수용부(330)에 주입된 겔 내부로 성형판(353)의 성형 돌기(355)의 적어도 일부가 삽입되어 시료 주입 홈이 형성된다.

상기 클램핑 장치(315)는 커버 유닛(350)이 제2 위치에서 겔 수용부(330)을 밀폐한 상태에서 커버 유닛(350)을 본체(310)에 고정시킨다. 상기 클램핑 장치(315)는 커버 유닛(350)이 소정의 시간 동안 겔 수용부(330)를 밀페한 상태를 유지시켜 줌으로써 겔 수용부(330)에 수용되는 겔이 성형 돌기(355)의 형상에 대응되는 시료 주입 홈들(110)을 형성한 채로 굳을 수 있게 한다.

상기 제1 겔 포머(300)는 지지 유닛(370)을 더 구비할 수 있다. 상기 지지유닛(370)은 제1 지지 부재(371) 및 제2 지지 부재(373)를 가지는데, 상기 제1 지지 부재(373)는 본체(310)의 일측 하부를 지지하며, 상기 제2 지지 부재(373)는 본체(310)의 타측 하부를 지지한다. 보다 바람직하게는, 상기 제1 지지 부재(371)는 커버 유닛(350)이 본체(310)에 회동 가능하게 연결된 연결부측 제1 플레이트(311)의 하단에 고정되고, 상기 제2 지지 부재(373)는 상기 제1 지지 부재(371)로부터 이격되어 상기 제1 플레이트(311)의 길이 방향 하단부에 고정된다. 보다 바람직하게는, 상기 제1 지지 부재(371)는 상기 제1 플레이트(311)의 하부 방향으로 연장되고, 상기 제2 지지 부재(373)는 상기 제1 플레이트(311)의 상부 방향 및 하부 방향으로 각각 연장되는데, 상기 하부 방향으로 연장된 것이 제2 지지 부재(373)이며, 상기 상부 방향으로 연장된 것이 제3 지지 부재(375)이다. 상기 제2 지지 부재(373)와 상기 제3 지지 부재(375)는 서로 편평한 판형상을 이루어 상기 본체(310)가 세로 방향으로 세워질 수 있도록 지면에 지지된다. 다시 말해, 상기 커버 유닛(350)이 겔 수용부(330)를 밀폐하는 제2 위치에서 클램핑 장치(315)에 의해 고정된 상태로, 본체(310)는 상기 제2 지지 부재(373) 및 상기 제3 지지 부재(375)에 의해 지면에 대해 수직 방향으로 세워질 수도 있게 되는 것이다. 또한, 상기 제1 지지 부재(371)는 상기 제2 지지 부재(373) 보다 높게 형성되기 때문에 본체(310)가 수평 방향으로 바닥면에 놓일 경우 상기 제1 플레이트(311)가 경사를 갖게 된다. 한편, 상기 제2 플레이트(313)는 'ㄷ'자 형상일 수 있는데, 'ㄷ' 자 형상의 각각의 단부는 커버 유닛(350)과 제1 플레이트(311)이 연결된 부분을 향하도록 형성된다. 다시 말해서, 상기 제2 플레이트(313)는 상기 제1 플레이트(321)의 길이 방향으로 양측 가장자리 상면을 따라 형성되며, 상기 제1 플레이트(321)의 단폭 방향으로 형성되면서 전체적으로 'ㄷ' 자 형상을 하게 되는 것이다.

겔 수용부(330)에 메쉬(mesh) 형태의 겔 고정용의 서포트 필름을 삽입하고, 커버 유닛(350)을 회동시켜 겔 수용부(330)를 밀폐하는 제2 위치에 위치시킨 다음, 상기 클램핑 장치(315)를 이용하여 커버 유닛(350)을 제2 위치에 고정시킨다. 지지 유닛(370)이 바닥에 놓인 상태로 커버 유닛(350)이 겔 수용부(330)를 밀폐시킨 제2 위치에서 겔 수용부(330)와 성형판(353) 사이의 공간으로 유동성의 겔을 주입한다. 제1 지지 부재(371)가 제2 지지 부재(373) 보다 길게 형성되므로 겔은 제1 플레이트(311)의 바닥면을 미끄러지면서 겔 수용부(330)와 성형판(353) 사이의 공간으로 유동성의 겔이 채워진다. 제2 지지 부재(373) 및 제3 지지 부재(375)를 바닥면에 닿게 하여 겔포머 본체(310)을 바닥면에 수직하게 세워둘 수도 있다. 소정의 시간이 경과하여 겔 수용부(330)의 겔이 굳으면 클램핑 장치(315)를 해제하여 커버 유닛(350)을 제1 위치로 이동시켜서 겔 수용부(330)를 개방시킨 다음, 성형 돌기(355)의 형상에 대응되도록 시료 주입 홈들(110)이 성형된 겔(100)을 본체(310)로부터 분리하여, 본 발명의 제1 분석 방법에서 이용되는 상기 도 2에 도시된 바와 같은 겔(100)을 얻는다.

(1-2) 시료 주입 단계(S2)

다음으로, 상기와 같이 제조된 겔의 시료 주입 홈들에 분석할 시료를 주입한다(S2). 상기 복수 개의 시료 주입 홈들 각각에는 서로 다른 시료들이 주입될 수 있고, 각각의 시료는 수 ㎕의 부피, 바람직하게는 0.1㎕ 내지 5㎕의 부피, 보다 바람직하게는 0.5㎕ 내지 2㎕의 부피로 주입될 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서는 겔에 형성된 404개의 시료 주입 홈 중, 384개의 시료 주입 홈 각각에는 서로 다른 시료를 1㎕의 부피로 주입하고, 나머지 20개의 시료주입 홈들에는 각각 사이즈 마커(size marker)를 1㎕의 부피로 주입하였다.

상기와 같이 겔에 복수 개의 시료 주입 홈이 마련되어 있는 경우, 상기 시료 주입 홈에 다수의 시료를 동시에 주입하기 위하여 도 5에 도시된 바와 같은 시료 주입 유니트(400)를 이용할 수 있다.

도 5를 참고하면, 상기 시료 주입 유니트(400)는 봉 유닛(410), 상기 봉 유닛(410)에 연결되어 시료를 이송하는 복수 개의 핀들(430)이 연결된 제2 플레이트(422) 및 상기 제2 플레이트(422)와 소정 간격 이격되어 핀들(430)이 슬라이딩 가능하도록 가이드하는 제1 플레이트(421)를 구비한다.

상기 봉 유닛(410)은 시료 주입유닛(400)를 파지하기 용이하게 형성되어 있다. 상기 핀들(430)은 겔의 시료 주입 홈 내부에 삽입되어, 상기 각각의 시료 주입 홈으로 시료를 주입한다. 이 때, 상기 제1 겔 포머에서 만들어진 겔은 매우 약하기 때문에 겔에 형성된 시료 주입 홈으로 시료를 주입할 때 경우에 따라 핀(430)이 겔(G)을 파괴할 수 있다. 따라서 겔(G)에 형성된 시료 주입 홈에 시료를 주입할 때 소정의 힘을 인가하더라도 복수 개의 핀들(430)이 제2플레이트(422)에서 슬라이딩 이동될 수 있도록 구성되어 겔(G)이 손상되는 일이 없다. 다시 말해, 상기 제1 플레이트(421)와 상기 제2 플레이트(422)가 서로 이격되어 있어서, 상기 이격된 간격 사이(425)에서 상기 복수 개의 핀들(430)이 슬라이딩할 수 있고, 그로 인해 겔(G)이 파괴되지 않을 수 있는 것이다.

(1-3) 전기영동 단계(S3)

상기와 같이 겔의 시료 주입 홈에 시료를 주입하고 나면, 상기 시료가 주입된 겔을 전기영동한다(S3). 상기 전기영동은 각각의 시료 주입 홈에 주입된 시료들의 단백질을 분리하는 과정으로서, 수평 전기영동 장치(미도시)를 이용하여 수행된다. 상기 전기영동은 상기 시료 주입 홈들이 이루고 있는 열과 수직인 방향으로, 수십 분, 바람직하게는 10분 내지 60분, 더욱 바람직하게는 20분 내지 40분의 시간 동안 진행된다.

(1-4) 전사 단계(S4)

상기와 같이 전기영동이 완료되면, 분리된 겔의 시료를 멤브레인으로 전사한다(S4). 상기와 같은 시료의 전사 과정은 당업계에서 통상적으로 이용되는 방법에 따라 수행될 수 있다.

(1-5) 항체 처리 단계(S5)

상기와 같이 시료가 멤브레인으로 전사되고 나면, 상기 멤브레인에 항체를 처리한다(S5).

상기 제1 분석 방법의 경우, 상기 시료가 전사된 멤브레인에는 동일한 하나의 항체가 처리될 수 있다. 즉, 복수 개의 서로 다른 시료들에 대하여 동일한 하나의 항체가 처리될 수 있고, 이를 통해 복수 개의 서로 다른 시료에 대하여 특정 단백질의 존재 여부를 동시에 확인할 수 있는 것이다.

이 때, 상기 멤브레인에 처리되는 항체는 수 ㎕ 내지 수십 ㎕의 부피, 바람직하게는 0.1㎕ 내지 50㎕의 부피, 더욱 바람직하게는 1㎕ 내지 20㎕의 부피로 처리될 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서는 총 384개의 시료에 동일한 하나의 항체를 처리함으로써, 이들 384개의 시료에 대하여 특정 단백질이 존재하는지 여부를 확인하였다.

본 발명의 제1 분석 방법에서는 도 6a 및 도 6b에 도시된 바와 같은 제1 항체 인큐베이션 챔버(500)를 이용하여 항체가 처리될 수 있다.

도 6a 및 도 6b을 참고하면, 상기 제1 항체 인큐베이션 챔버(500)는 통공(512, 511)이 형성된 상부 프레임(510)과 멤브레인이 수용되는 공간부(521)가 마련된 하부 프레임(520)을 포함하여 형성된다.

상기 상부 프레임(510)에는 항체가 공급되는 제1 통공(512)과 반응이 완료된 폐액이 토출되는 제2 통공(511)가 형성되어 있고, 상기 상부 프레임(510)이 상기 하부 프레임(520)과 결합되면 상기 상부 프레임(510)의 제1 및 제2 통공(512, 511)은 상기 하부 프레임(520)의 공간부(521)과 연통된 상태가 된다.

시료가 전사된 멤브레인이 상기와 같은 하나의 공통된 공간부(521)에 수용되면, 상기 제1 통공(512)으로 항체를 포함하는 반응 물질을 주입하여 전사된 멤브레인의 시료를 항체와 반응시키고, 상기와 같은 반응이 종료되면 그 폐액이 상기 제2 통공(511)으로 토출된다. 이후, 상기 제1 및 제2 통공(512, 511)은 블록킹 버퍼나 워싱 버퍼의 주입과 배출을 통한 멤브레인의 블록킹 과정 또는 세척 과정에도 이용될 수 있다.

상기 공간부(521)는 일 측이 제1 통공(512)과 인접된 편평부(550)를 갖고 타 측이 제2 통공(511)과 인접된 모서리부(540)를 갖는다. 상기 모서리부(540)는 서로 소정의 각도를 이루는 제1면(541)과 제2면(542)이 서로 만나 형성되는데, 이는 폐액이나 워싱 버퍼 용액 등을 외부로 배출할 때 모서리부(540)에 고이도록 함으로써 남김없이 배출할 수 있도록 하기 위한 것이다.

한편, 상기 공간부(521)에는 도 6b에 도시된 바와 같은 칸막이(525)가 더 포함될 수 있다. 상기 칸막이(525)는 상기 공간부(521)에 수용되는 멤브레인의 크기에 따라 상기 공간부(521)의 부피를 조절하기 위한 것으로서, 작은 크기의 멤브레인을 수용하여 항체 처리 과정을 진행해야 하는 경우에 시료의 소비를 줄이기 위해 이용된다.

(1-6) 분석 단계(S6)

상기와 같이 멤브레인에 대한 항체 처리가 완료되면, 상기 멤브레인을 분석한다(S6). 상기 멤브레인의 분석 과정은 감광 및 현상의 과정을 거치거나, 형광스캐너로 읽는 등 당업계에서 당업계에서 통상적으로 이용되는 방법에 따라 수행될 수 있다.

[제2 실시예]

본 발명의 다른 측면은 단일의 시료에 대하여 복수 개의 항체 각각에 결합하는 단백질들의 존재 여부를 동시에 확인하기 위한 고밀도 웨스턴 블롯 어레이 분석 방법(제2 분석 방법)을 제공한다. 상기과 같은 제2 분석 방법은 멀티 항체 스크리닝(screening) 시스템으로서, 항체 라이브러리를 이용한 단백체 분석에 적극 적용될 수 있으며, 예로서 단백질 PTM 분석에 적용 가능하고, 수십에서 수백 종의 항체를 동시에 표지자로 이용한 분석을 제공할 수 있다.

도 1을 참고하면, 상기 본 발명의 제2 분석 방법 역시 겔을 제조하는 단계(S1), 시료를 겔에 주입하는 단계(S2), 겔의 시료를 전기영동하는 단계(S3) 전기영동된 겔의 시료를 멤브레인으로 전사하는 단계(S4), 멤브레인에 항체를 처리하는 단계(S5) 및 멤브레인을 분석하는 단계(S6)를 포함한다.

(2-1) 겔 제조 단계(S1)

도 7을 참고하면, 상기 제2 분석 방법의 경우, 먼저 소정의 폭을 갖는 하나 이상의 시료 주입 슬롯(210)이 상기 폭의 길이 방향으로 배열되어 하나 이상의 열을 이루도록 형성된 겔(200)을 제조한다(S1).

상기 하나 이상의 시료 주입 슬롯(210)은 각각 수 ㎕ 내지 수십 ㎕의 부피, 바람직하게는 0.1㎕ 내지 50㎕의 부피, 더욱 바람직하게는 1㎕ 내지 20㎕의 부피의 시료가 주입될 수 있는 크기를 가진다.

상기 시료 주입 슬롯(210)은 소정의 폭을 가지는데, 수십 ㎜의 폭, 바람직하게는 10㎜ 내지 80㎜의 폭, 보다 바람직하게는 30㎜ 내지 60㎜의 폭을 가진다.

상기 시료 주입 슬롯(210)은 하나의 시료 주입 슬롯(210)이 하나의 열을 이루도록 형성될 수도 있고, 2개 이상의 시료 주입 슬롯들(210)이 하나의 열을 이루도록 형성될 수도 있으며, 상기와 같이 복수 개의 시료 주입 슬롯(210)이 하나의 열을 형성하는 경우, 시료 주입 슬롯들(210)은 서로 수 ㎜의 간격, 바람직하게는 0.5㎜ 내지 5㎜의 간격, 보다 바람직하게는 1㎜ 내지 3㎜의 간격으로 배치될 수 있고, 상기와 같은 시료 주입 슬롯(210)의 사이에는 마커를 주입할 수 있는 마커 주입 홈(215)이 추가로 배치될 수 있다.

또한, 상기와 같이 하나 이상의 시료 주입 슬롯(210)이 이루고 있는 열은 복수 개일 수 있다. 상기 열이 복수 개인 경우, 상기 복수 개의 열들은 시료 주입 슬롯(210)에 주입된 시료가 전기영동되는 거리보다 넓은 간격을 가지도록 형성되는데, 수 ㎝의 간격, 바람직하게는 0.5㎝ 내지 5㎝의 간격, 보다 바람직하게는 1㎝ 내지 3㎝의 간격으로 배치될 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서는 45㎜의 폭을 가지는 4개의 시료 주입 슬롯들이 하나의 열을 형성하고, 이러한 열 4개가 1.2㎝의 간격으로 배치된 12㎝×6㎝ 크기의 겔을 제조하였다.

본 발명의 제2 분석 방법에서 이용되는 상기와 같은 겔(200)은 도 8 및 도 9에 도시된 바와 같은 제2 겔 포머(350)를 이용하여 제조될 수 있다.

도 8 및 도 9를 참고하면, 상기 제2 겔 포머(350)는 커버 유닛(350')에 구비된 성형판(353')의 성형 돌기(355')의 패턴과 형상만이 다를 뿐, 나머지 구성은 모두 상기 [제1 실시예]에서 설명한 제1 겔 포머(300)와 동일하다. 따라서 나머지 구성에 대해서는 상기 제1 겔 포머(300)에 대한 설명을 원용하여 생략하고, 제2 겔 포머(350)에 특이적인 성형 돌기(355')의 패턴과 형상에 대해서만 설명한다.

상기 성형 돌기(355')는 수십 ㎜의 폭, 바람직하게는 10㎜ 내지 80㎜의 폭, 보다 바람직하게는 30㎜ 내지 60㎜의 폭을 가지는 직선의 형태로 형성되고, 하나 이상의 직선 형태가 서로 수 ㎜의 간격으로 하나 이상의 열을 이루도록 형성되고, 상기 성형 돌기(355')들이 이루고 있는 열이 복수 개인 경우 각 열들은 수 ㎝의 간격으로 배치될 수 있다. 상기 성형판(355')은 상기 프레임(351')과 일체로 형성될 수 있으나, 보다 바람직하게는 분리 가능하도록 탈착식으로 마련될 수도 있는데, 이는 복수 개의 성형 돌기(355')의 패턴, 간격, 크기, 개수 등을 달리하여 교체 사용하기 위함이다.

상기 제2 겔 포머(350)의 경우에도, 겔 수용부(330)에 메쉬(mesh) 형태의 겔 고정용의 서포트 필름을 삽입하고, 커버 유닛(350')을 회동시켜 겔 수용부(330)를 밀폐하는 제2 위치에 위치시킨 다음, 상기 클램핑 장치(130)를 이용하여 커버 유닛(350')을 제2 위치에 고정시킨다. 지지 유닛(370)이 바닥에 놓인 상태로 커버 유닛(350')이 겔 수용부(330)를 밀폐시킨 제2 위치에서 겔 수용부(330)와 성형판(353') 사이의 공간으로 유동성의 겔을 주입한다. 제1 지지 부재(371)가 제2 지지 부재(373) 보다 길게 형성되므로 겔은 제1 플레이트(311)의 바닥면을 미끄러지면서 겔 수용부(330)와 성형판(353') 사이의 공간으로 유동성의 겔이 채워진다. 제2 지지 부재(373) 및 제3 지지 부재(375)를 바닥면에 닿게 하여 겔포머 본체(310)을 바닥면에 수직하게 세워둘 수도 있다. 소정의 시간이 경과하여 겔 수용부(330)의 겔이 굳으면 클램핑 장치(315)를 해제하여 커버 유닛(350')을 제1 위치로 이동시켜서 겔 수용부(330)를 개방시킨 다음, 성형 돌기(355')의 형상에 대응되도록 시료 주입 슬롯(210) 및 마커 주입 홈(215)이 성형된 겔(200)을 본체(310)로부터 분리하여, 본 발명의 제2 분석 방법에서 이용되는 상기와 같은 겔(200)을 얻는다.

(2-2) 시료 주입 단계(S2)

다음으로, 상기와 같이 제조된 겔의 시료 주입 슬롯에 분석할 시료를 주입한다(S2). 상기 하나 이상의 시료 주입 슬롯에는 시료가 수 ㎕ 내지 수십 ㎕의 부피, 바람직하게는 0.1㎕ 내지 50㎕의 부피, 더욱 바람직하게는 1㎕ 내지 20㎕의 부피로 주입될 수 있고, 상기 시료 주입 슬롯이 복수 개인 경우에는 각각의 시료 주입 슬롯에 서로 다른 시료들이 주입될 수도 있다. 본 발명의 일 구현예에서는 겔에 형성된 16개의 시료 주입 슬롯 각각에는 서로 다른 시료를 20㎕의 부피로 주입하였다.

이러한 제2 분석 방법의 경우에는 시료 주입 슬롯의 개수가 많지 않기 때문에, 상기 제1 실시예에서와 달리 시료 주입 유니트가 사용되지 않을 수 있으며, 일반적으로 사용되는 마이크로파이펫이 이용될 수 있다.

(2-3) 전기영동 단계(S3)

상기와 같이 겔의 시료 주입 슬롯에 시료를 주입하고 나면, 상기 시료가 주입된 겔을 전기영동한다(S3). 상기 전기영동은 각각의 시료 주입 슬롯에 주입된 시료들의 단백질을 분리하는 과정으로서, 수평 전기영동 장치(미도시)를 이용하여 수행된다. 상기 전기영동은 상기 시료 주입 슬롯들이 이루고 있는 열과 수직인 방향으로, 수십 분, 바람직하게는 10분 내지 60분, 더욱 바람직하게는 20분 내지 40분의 시간 동안 진행된다.

(2-4) 전사 단계(S4)

(2-5) 항체 처리 단계(S5)

상기 제2 분석 방법의 경우, 하나의 시료 주입 슬롯에서 분리된 시료에 대하여 복수 개의 서로 다른 항체가 처리될 수 있다. 즉, 하나의 시료에 대하여 복수 개의 항체가 처리됨으로써, 하나의 시료 내에 존재하는 여러 단백질들의 존재 여부를 동시에 확인할 수 있는 것이다.

다만, 시료 주입 슬롯이 복수 개이고, 이러한 복수 개의 시료 주입 슬롯에 각각 서로 다른 시료들을 주입한 경우 복수 개의 시료들 각각에 대하여 그 시료 내에 존재하는 여러 단백질들의 존재 여부를 동시에 확인할 수도 있다.

이 때, 하나의 시료에 처리되는 복수 개의 항체는 각각 수 ㎕의 부피, 바람직하게는 0.1㎕ 내지 5㎕의 부피, 보다 바람직하게는 0.5㎕ 내지 2㎕의 부피로 처리될 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서는 시료 1개에 20개의 서로 다른 항체들을 처리하여 해당 시료에 20개의 특정 단백질들이 존재하는지 확인하였는바, 총 16개의 시료 각각에 대하여 20개의 특정 단백질들의 존재 여부를 동시에 확인하였다.

본 발명의 제2 분석 방법에서는 도 10a, 도 10b 및 도 11에 도시된 바와 같은 제2 항체 인큐베이션 챔버(600)를 이용하여 항체가 처리될 수 있다.

도 10a, 도 10b 및 도 11을 참고하면, 상기 제2 항체 인큐베이션 챔버(600)는 복수 개의 항체 주입 홈(651)과 복수 개의 폐액 토출 홈(653), 그리고 복수 개의 미세유로(655)가 형성된 상부 프레임(610)과 멤브레인이 놓여지는 거치부(621)가 마련된 하부 프레임(620)을 포함하여 형성된다.

도 10a, 도 10b 및 도 11을 참고하면, 상기 상부 프레임(610)의 상부면에는 복수 개의 항체 주입 홈들(651) 및 복수 개의 폐액 토출 홈들(653)이 한 쌍을 이루어 서로 수 ㎜의 간격, 바람직하게는 0.5㎜ 내지 5㎜의 간격, 보다 바람직하게는 1㎜ 내지 3㎜의 간격으로 배치되어, 20개 이상, 바람직하게는 50개 이상, 더욱 바람직하게는 100개 이상이 하나의 열을 이루도록 형성되고, 상기 항체 주입 홈들(651)과 상기 폐액 토출 홈들(653)은 시료가 전기영동되는 방향으로 수 ㎝의 간격, 바람직하게는 0.5㎝ 내지 5㎝의 간격, 보다 바람직하게는 1㎝ 내지 3㎝의 간격으로 서로 쌍을 이루어 대응되도록 배치될 수 있다. 또한, 상기 상부 프레임(610)의 하부면에는 복수 개의 미세유로(655)가 구비된다. 상기 미세유로(655)는 상기 항체 주입 홈(651)이 연장되는 방향(수직 방향)으로 상기 항체 주입 홈(651)과 연결된 제1 미세 유체관(655a), 상기 폐액 토출 홈(653)이 연장되는 방향(수직 방향)으로 상기 폐액 토출 홈(653)과 연결된 제3 미세 유체관(655c) 및 상기 제1 미세 유체관(655a) 및 상기 제3 미세 유체관(655c)을 연결하도록 상기 항체 주입 홈들(651) 또는 폐액 토출 홈들(653) 이루고 있는 열과 수직인 방향(수평 방향)으로 형성된 제2 미세 유체관(655b)으로 구성되고, 상기와 같은 제1 미세 유체관(655a), 제2 미세 유체관(655b) 및 제3 미세 유체관(655c)은 서로 'U'자 형상을 형성한다. 결국, 상기 상부 프레임(610)의 상부면에 형성된 항체 주입 홈(651) 및 폐액 토출 홈(653)이 상기 상부 프레임(610)의 하부면에 형성된 'U'자 형상의 미세유로(655)와 서로 연결되어 전체적으로 큰 'U'자 형상의 유로가 형성되는 것이다. 상기 상부 프레임(610)의 하부면에는, 상기 항체 주입 홈(651)을 통해 주입된 항체가 상기 미세유로(655)를 통과하는 동안 옆의 다른 미세유로로 확산되는 것을 방지하기 위하여, 상기 미세유로의 사이사이에 블록 부재(670)가 더 구비될 수 있다.

상기 하부 프레임(620)에는 멤브레인이 놓여지는 거치부(621)가 마련되고, 상기 하부 프레임(620)은 상기 상부 프레임(610)의 하부면이 상기 거치부(621)에 놓여지는 멤브레인의 상부면과 서로 밀착되도록 상기 상부 프레임(610)과 결합된다. 특히, 상기 거치부(621)는 놓여지는 멤브레인이 소정의 두께를 가지는 경우 별도의 공간부로 형성될 수도 있고, 놓여지는 멤브레인이 매우 얇아 실질적으로 별도의 공간이 필요하지 않은 경우에 상기 거치부(621)은 별도로 형성되는 공간부가 아니라 상기 하부 프레임(620) 상에 존재하는 소정의 부분일 수 있다.

상기 제2 항체 인큐베이션 챔버(600)에는 상기 상부 프레임(610)과 상기 하부 프레임(620)의 결합을 견고히 고정하는 체결구(630)가 더 구비될 수 있다.

시료가 전사된 멤브레인이 상기 하부 프레임(621)의 공간부(621)에 수용되어 상기 상부 프레임(610)의 하부면과 서로 밀착(블록 부재(670)가 있는 경우 블록 부재(670)와 서로 밀착)되면, 상기 복수 개의 항체 주입 홈들(611)로 각각 서로 다른 종류의 항체를 포함하는 반응 물질을 주입하여 전사된 멤브레인의 시료를 항체와 반응시킨다.

상기 항체 주입 홈(651)과 상기 폐액 토출 홈(653)은 항체와 그의 폐액 뿐만 아니라, 멤브레인을 세척하기 위한 세정액을 주입 및 토출하는 용도로도 이용된다. 상기 항체 주입 홈(651)으로의 세정액 주입과 상기 폐액 토출 홈(653)으로의 폐액 흡입은 도 12에 도시된 바와 같은 세척 유닛(700)에 의해 수행된다. 상기 세척 유닛(700)에는 상기 제2 인큐베이션 챔버(600)의 길이 방향으로 복수 개 형성된 항체 주입 홈(651)에 대응되는 주입관(751)과 폐액 토출 홈(653)에 대응되는 토출관(753)이 구비된다. 상기 세척 유닛(700)에 형성된 복수 개의 주입관(751)은 상기 제2 인큐베이션 챔버(600)의 항체 주입 홈(651)에, 그리고 상기 세척 유닛(700)에 형성된 복수 개의 토출관(753)은 상기 제2 인큐베이션 챔버(600)의 폐액 토출 홈(653)에 각각 삽입된다. 상기 복수 개의 주입관(751) 각각은 호스를 통해 외부의 세정액 탱크(미도시)와 연결될 수 있고, 상기 복수 개의 토출관(753) 각각은 호스를 통해 외부의 진공 펌프(미도시) 및 폐액통(미도시)과 연결된다.

항체를 처리하고, 처리된 항체와 멤브레인 상의 시료 간의 반응이 완료되면, 상기 세척 유닛(700)의 주입관들(751)과 토출관들(753)을 상기 상부 프레임(610)에 형성된 항체 주입 홈들(651) 및 폐액 토출 홈들(653)에 삽입한 후, 먼저 진공 펌프를 이용하여 상기 미세유로(655))에 존재하는 항체의 폐액을 상기 폐액 토출 홈(653)에 삽입된 토출관(753)으로 흡입해 낸다(상기와 같이 흡입되어 나온 폐액은 폐액통으로 버려진다). 그런 다음, 세정액 탱크에 저장된 세정액을 각각의 주입관들(751)을 통해 항체 주입 홈들(651)로 주입하면, 상기와 같이 주입된 세정액이 제1 미세 유체관(655a)과 제2 미세 유체관(655b)을 통과하여 제3 미세 유체관(655c)으로 이동하면서 멤브레인 상에 존재하는 결합되지 않은 항체 등을 세척한다. 상기와 같이 세척이 완료되면, 다시 진공 펌프를 이용하여 상기 미세유로(655)에 존재하는 상기 세정액의 폐액을 상기 폐액 토출 홈(653)에 삽입된 토출관(753)으로 흡입해 낸다(상기와 같이 흡입되어 나온 폐액은 폐액통으로 버려진다).

한편, 상기 제2 항체 인큐베이션 챔버(600)의 상부 프레임(610)에는, 도 10의 (b)에 도시된 바와 같이, 상기 세척 유닛(700)이 고정될 수 있는 고정 홈(690)이 더 구비될 수 있고, 상기 고정 홈(690)은 상기 복수 개의 항체 주입 홈들(651) 상에 형성된 제1 고정 홈(691)과 상기 복수 개의 폐액 토출 홈들(653) 상에 형성된 제2 고정 홈(693)으로 이루어진다. 이 경우, 상기 항체 주입 홈(651)과 폐액 토출 홈(653)은 각각 상기 제1 및 제2 고정 홈(691, 693) 내부에 존재하게 된다.

상기 제2 항체 인큐베이션 챔버(600)의 상부 프레임(610)에 상기와 같은 고정 홈(690)이 형성되는 경우, 상기 세척 유닛(700)에는 상기 고정 홈(690)에 삽입되어 상기 세척 유닛(700)을 고정시킬 수 있는 고정단(750)이 구비될 수 있고, 상기 주입관(751) 및 토출관(753)는 상기 고정단(750)의 하부에 구비되거나 또는 내부에 배치될 수 있다. 상기와 같이 세척 유닛(700)이 상기 제1 및 제2 고정 홈(691, 693)에 삽입되어 고정되는 경우, 상기 세척 유닛(700)의 주입관(751) 및 토출관(753)은 그 개수가 상기 항체 주입 홈(651) 및 폐액 토출 홈(653)보다 적을 수 있고, 나아가 각각의 주입관(751) 및 토출관(753)이 상기 항체 주입 홈(651) 및 폐액 토출 홈(653)에 직접 삽입되지 않을 수도 있다. 이러한 경우에는, 상기 세척 유닛(700)이 상기 제1 및 제2 고정 홈(691, 693)에 고정되었을 때, 상기 주입관(751) 및 토출관(753)은 각각 상기 제1 고정 홈(691) 및 제2 고정 홈(693) 내에서 상기 항체 주입 홈(651) 및 폐액 토출 홈(653)과 소정의 간격으로 이격된 상태로 배치된다. 상기 주입관(751)으로 주입된 세정액은 상기 주입관(751)과 항체 주입 홈(651) 간의 이격된 공간을 통해 상기 제1 고정 홈(691) 전체에 존재하는 항체 주입 홈들(651)로 주입되고, 세정액의 폐액 역시 상기 토출관(753)과 폐액 토출 홈(653) 간의 이격된 공간을 통해 상기 제2 고정 홈(693) 전체에 진공 펌프에 의한 흡입력이 가해지게 되고 결국 상기 제2 고정 홈(693) 전체에 존재하는 폐액 토출 홈들(653)로 상기 폐액이 토출된다.

(2-6) 분석 단계(S6)

상기에서는 본 발명의 바람직한 실시 예를 참조하여 설명하였지만, 당업계에서 통상의 지식을 가진 자라면 이하의 특허 청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역을 벗어나지 않은 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.

100: 겔 110: 시료 주입 홈
200: 겔 210: 시료 주입 슬롯 215: 마커 주입 홈
300: 제1 겔 포머 300': 제2 겔 포머 310: 본체
330: 겔 수용부 350, 350': 커버 유닛 370: 지지부재
311: 제1 플레이트 313: 제2 플레이트 315: 클램핑 장치
351: 프레임 353: 성형판 355: 성형 돌기
351': 프레임 353': 성형판 355': 성형 돌기
371: 제1 지지부재 373: 제2 지지부재 375: 제3 지지부재
400: 주입 유닛 410: 봉 유닛
421: 제1 플레이트 422: 제2 플레이트 430 : 핀
500: 제1 항체 인큐베이션 챔버 525: 칸막이
510: 제1 상부 프레임 512, 511: 제1 통공 및 제2 통공
520: 제1 하부 프레임 521: 챔버 공간부
530: 제1 체결구 540: 모서리부
541: 제1면 542: 제2면 550: 평편부
600: 제2 항체 인큐베이션 챔버
610: 상부 프레임 620: 하부 프레임 621: 거치부
650: 홈쌍 651: 항체 주입 홈 653: 폐액 토출 홈
655: 미세유로 655a, 655b, 655c: 제1, 제2, 제3 미세 유체관
630 : 제2 체결구 670: 블록 부재
690: 고정 홈 691: 제1 고정 홈 693: 제2 고정 홈
700: 세척 유닛 710: 프레임 750: 고정단
751: 주입관 753: 토출관
S: 씰링부재

Claims

복수 개의 시료에 대하여 단일의 항체에 결합하는 단백질의 존재 여부를 동시에 확인하기 위한 고밀도 웨스턴 블롯 어레이 분석 방법으로서,
겔 포머를 이용하여, 복수 개의 시료 주입 홈들이 복수 개의 열을 이루도록 형성된 겔을 제조하는 단계;
상기 겔의 시료 주입 홈들 각각에 시료를 주입하는 단계;
상기 시료가 주입된 겔을 상기 시료 주입 홈들이 이루고 있는 열과 수직인 방향으로 전기영동하는 단계;
상기 전기영동된 겔의 시료를 멤브레인으로 전사하는 단계;
상기 시료가 전사된 멤브레인 전체를, 항체 인큐베이션 챔버에 형성된 하나의 공간부 내에 수용시키고 항체를 처리하는 단계; 및
상기 항체가 처리된 멤브레인을 분석하는 단계;를 포함하는 고밀도 웨스턴 블롯 어레이 분석 방법.
청구항 1에 있어서,
상기 겔은 50개 이상의 시료 주입 홈들이 하나의 열을 이루는 것인 고밀도 웨스턴 블롯 어레이 분석 방법.
청구항 1에 있어서,
상기 겔은 100개 이상의 시료 주입 홈들이 하나의 열을 이루는 것인 고밀도 웨스턴 블롯 어레이 분석 방법.
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청구항 1에 있어서,
상기 항체 인큐베이션 챔버는
항체가 공급되는 제1 통공 및 폐액이 토출되는 제2 통공이 각각 형성된 상부 프레임; 및
내부에 시료가 전사된 멤브레인이 수용되는 공간부가 형성되고, 상기 공간부가 상기 제1 통공 및 상기 제2 통공과 각각 연통된 채로 상기 상부 프레임에 결합되는 하부 프레임;을 포함하여 형성되는 고밀도 웨스턴 블롯 어레이 분석 방법.
청구항 5에 있어서,
상기 항체 인큐베이션 챔버는 상기 공간부의 부피를 조절하는 칸막이를 더 포함하는 고밀도 웨스턴 블롯 어레이 분석 방법.
단일의 시료에 대하여 복수 개의 항체 각각에 결합하는 단백질들의 존재 여부를 동시에 확인하기 위한 고밀도 웨스턴 블롯 어레이 분석 방법으로서,
겔 포머를 이용하여, 소정의 폭을 갖는 하나 이상의 시료 주입 슬롯이 상기 폭의 길이 방향으로 배열되어 하나 이상의 열을 이루도록 형성된 겔을 제조하는 단계;
상기 겔의 시료 주입 슬롯에 시료를 주입하는 단계;
상기 시료가 주입된 겔을 상기 시료 주입 슬롯이 이루고 있는 열과 수직인 방향으로 전기영동하는 단계;
상기 전기영동된 겔의 시료를 멤브레인으로 전사하는 단계;
상기 시료가 전사된 멤브레인을, 상기 시료 주입 슬롯의 폭의 길이에 맞도록 복수 개의 항체 주입 홈 및 복수 개의 미세유로가 형성된 항체 인큐베이션 챔버에 장착하고, 상기 각각의 항체 주입 홈에 서로 다른 종류의 항체를 주입하여 상기 항체들을 각각의 미세유로를 따라 상기 멤브레인에 전사된 시료에 처리하는 단계; 및
상기 항체가 처리된 멤브레인을 분석하는 단계;를 포함하는 고밀도 웨스턴 블롯 어레이 분석 방법.
청구항 7에 있어서,
상기 겔은 2개 이상의 시료 주입 슬롯들이 하나의 열을 이루는 것인 고밀도 웨스턴 블롯 어레이 분석 방법.
청구항 8에 있어서,
상기 겔은 복수 개의 열을 구비하는 것인 고밀도 웨스턴 블롯 어레이 분석 방법.
청구항 7에 있어서,
상기 항체 인큐베이션 챔버는
상부면에 복수 개의 항체 주입 홈들 및 복수 개의 폐액 토출 홈들이 쌍을 이루어 하나 이상의 열을 이루도록 형성되고, 하부면에 상기 항체 주입 홈들이 이루고 있는 열과 수직인 방향으로 형성된 복수 개의 미세유로의 일 말단과 타 말단이 각각 상기 항체 주입 홈 및 상기 폐액 토출 홈과 서로 연결되도록 구비되어 있는 상부 프레임; 및
내부에 시료가 전사된 멤브레인이 놓여지는 거치부가 형성되고, 상기 상부 프레임의 하부면이 상기 거치부에 놓여지는 멤브레인의 상부면과 밀착되도록 상기 상부 프레임에 결합되는 하부 프레임(620);을 포함하여 형성되는 고밀도 웨스턴 블롯 어레이 분석 방법.
청구항 10에 있어서,
상기 상부 프레임(610)의 하부면에 형성된 미세유로는 'U'자 형상인 고밀도 웨스턴 블롯 어레이 분석 방법.
청구항 1 또는 청구항 7에 있어서,
상기 겔 포머는
겔 주입을 위한 오목한 겔 수용부를 가진 본체; 및
상기 겔 수용부 내에 주입된 겔에 복수 개의 시료 주입 홈들 또는 하나 이상의 시료 주입 슬롯을 형성하기 위한 복수의 성형 돌기를 가지며, 상기 겔 수용부를 개방하는 제1 위치와 상기 겔 수용부를 밀폐하는 제2 위치 사이에서 이동 가능하도록 상기 본체에 장착되는 커버 유닛;을 포함하여 형성되는 고밀도 웨스턴 블롯 어레이 분석 방법.
청구항 12에 있어서,
상기 커버 유닛이 상기 제2 위치에 배치될 때 상기 겔 수용부에 주입된 겔 안으로 상기 성형 돌기의 적어도 일부가 삽입되는 것인 고밀도 웨스턴 블롯 어레이 분석 방법.
청구항 1 또는 청구항 7의 고밀도 웨스턴 블롯 어레이 분석 방법에서 이용되는 겔을 제조하는 겔 포머로서,
겔 주입을 위한 오목한 겔 수용부를 가진 본체; 및
상기 겔 수용부 내에 주입된 겔에 복수 개의 시료 주입 홈들 또는 하나 이상의 시료 주입 슬롯을 형성하기 위한 복수의 성형 돌기를 가지며, 상기 겔 수용부를 개방하는 제1 위치와 상기 겔 수용부를 밀폐하는 제2 위치 사이에서 이동 가능하도록 상기 본체에 장착되는 커버 유닛;을 포함하는 겔 포머.
청구항 14에 있어서,
상기 커버 유닛은 상기 커버 유닛 본체; 및
상기 커버 유닛 본체에 분리가능하게 장착되며, 상기 복수의 성형 돌기를 가진 성형판;을 포함하는 겔 포머.
청구항 14에 있어서,
상기 커버 유닛이 상기 제2 위치에 배치될 때 상기 겔 수용부에 주입된 겔 안으로 상기 성형 돌기의 적어도 일부가 삽입되는 것인 겔 포머.
청구항 1의 고밀도 웨스턴 블롯 어레이 분석 방법에서 이용되는, 전기영동된 겔의 단백질이 전사된 멤브레인에 항체를 반응시키는 항체 인큐베이션 챔버로서,
항체가 공급되는 제1 통공 및 폐액이 토출되는 제2 통공이 각각 형성된 상부 프레임; 및
내부에 시료가 전사된 멤브레인이 수용되는 공간부가 형성되고, 상기 공간부가 상기 제1 통공 및 상기 제2 통공과 각각 연통된 채로 상기 상부 프레임에 결합되는 하부 프레임;을 포함하는 항체 인큐베이션 챔버.
청구항 17에 있어서,
상기 공간부의 부피를 조절하는 칸막이를 더 포함하는 항체 인큐베이션 챔버.
청구항 7의 고밀도 웨스턴 블롯 어레이 분석 방법에서 이용되는, 전기영동된 겔의 단백질이 전사된 멤브레인에 항체를 반응시키는 항체 인큐베이션 챔버로서,
상부면에 복수 개의 항체 주입 홈들 및 복수 개의 폐액 토출 홈들이 쌍을 이루어 하나 이상의 열을 이루도록 형성되고, 하부면에 상기 항체 주입 홈들이 이루고 있는 열과 수직인 방향으로 형성된 복수 개의 미세유로의 일 말단과 타 말단이 각각 상기 항체 주입 홈 및 상기 폐액 토출 홈과 서로 연결되도록 구비되어 있는 상부 프레임; 및
내부에 시료가 전사된 멤브레인이 놓여지는 거치부가 형성되고, 상기 상부 프레임의 하부면이 상기 거치부에 놓여지는 멤브레인의 상부면과 밀착되도록 상기 상부 프레임에 결합되는 하부 프레임;을 포함하는 항체 인큐베이션 챔버.
청구항 19에 있어서,
상기 상부 프레임의 하부면에 형성된 미세유로는 'U'자 형상인 항체 인큐베이션 챔버.
청구항 19에 있어서,
상기 상부 프레임의 상부면에는 상기 복수 개의 항체 주입 홈들 상에 형성된 제1 고정 홈과 상기 복수 개의 폐액 토출 홈들 상에 형성된 제2 고정 홈을 더 포함하는 항체 인큐베이션 챔버.
청구항 1의 고밀도 웨스턴 블롯 어레이 분석 방법에서 이용되는, 복수 개의 시료 주입 홈에 다수의 시료를 주입하기 위한 시료 주입 유니트로서,
봉 유닛;
상기 봉 유닛에 연결되어 상기 시료를 이송하는 복수 개의 핀들이 연결된 제2 플레이트; 및
상기 제2 플레이트와 소정 간격 이격되어 상기 핀들이 슬라이딩 가능하도록 가이드하는 제1 플레이트;를 포함하는 시료 주입 유니트.
청구항 7의 고밀도 웨스턴 블롯 어레이 분석 방법에서 이용되는, 복수 개의 항체 주입 홈 및 미세유로를 세척하기 위한 세척 유닛으로서,
복수 개의 항체 주입 홈에 대응되는 복수 개의 주입관;
복수 개의 폐액 토출 홈에 대응되는 복수 개의 토출관; 및
상기 주입관 및 토출관에 각각 일 말단이 연결된 복수 개의 호스;를 포함하는 세척 유닛.
청구항 23에 있어서,
상기 세척 유닛은 고정단을 더 포함하고,
상기 주입관 및 토출관의 상부에 상기 고정단의 하부에 구비되거나 또는 내부에 배치되는 세척 유닛.