KR101818887B1

KR101818887B1 - Microalgae culture medium composition and method for producing polyunsaturated fatty acid using the same

Info

Publication number: KR101818887B1
Application number: KR1020170090790A
Authority: KR
Inventors: 정해진; 장세현; 임안숙; 권지은
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2017-07-18
Filing date: 2017-07-18
Publication date: 2018-01-16
Also published as: JP2019017379A; JP6397556B1

Abstract

The present invention relates to a microalgae culture medium composition and method thereof. The microalgae culture medium composition includes one or more feed species selected from a group including Amphidinium carterae, Heterosigma akashiwo, and Teleaulax sp. for improving the polyunsaturated fatty acid production in microalgae. The composition and the method can produce polyunsaturated fatty acids, such as omega-3 fatty acids, in microalgae at high concentrations.

Description

Technical Field The present invention relates to a microalgae culture medium composition and method for producing polyunsaturated fatty acids,

본원은 미세조류를 이용한 다중불포화지방산 생산의 향상을 위한 미세조류 배양 배지 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a microalgae culture medium composition for improving polyunsaturated fatty acid production using microalgae.

다중불포화지방산(Polyunsaturased fatty acids, PUFAs)은 진핵생물에게 필수적인 성분이다. 이중에서 특히, 오메가-3 지방산으로 알려져 있는 EPA(eicosapentaenoic acid) 및 DHA(Docosahexaenoic acid)는 인류 건강에 핵심적인 요소이다. 이 두 종류의 지방산은 태아 발달에 중요하게 작용하는 것으로 알려져 있다. 더욱이, 이 물질들은 다양한 심혈관질환, 몸무게, 알츠하이머 병과 관련된 인지 작용 등에 관여하는 것으로 알려져 있다. Polyunsaturated fatty acids (PUFAs) are essential components of eukaryotes. Among them, EPA (eicosapentaenoic acid) and DHA (Docosahexaenoic acid), which are known as omega-3 fatty acids, are a key element in human health. These two fatty acids are known to play an important role in fetal development. Moreover, these substances are known to be involved in various cardiovascular diseases, weight, cognitive function related to Alzheimer's disease.

그러나, 인간에게 충분한 양의 오메가-3를 제공하기 위해서는 다른 생물로부터의 획득이 필요하다. 왜냐하면, 이들 오메가-3 지방산은 인간 스스로 효율적으로 합성할 수 없기 때문이다. 이에 따라, 오메가-3 지방산이 풍부한 어류 등 생물들의 소비량이 전 세계적으로 증가하고 있다.However, acquiring sufficient amounts of omega-3 from humans requires acquisition from other organisms. This is because these omega-3 fatty acids can not be efficiently synthesized on their own. As a result, the consumption of living things such as fishes rich in omega-3 fatty acids is increasing worldwide.

어류의 오일에 상기 EPA 및 DHA가 풍부한 것으로 알려져 있으며, 제한된 종류의 몇몇 식물 기름 등이 다른 다중불포화지방산의 좋은 소스로 알려져 있다. 현재 대부분의 EPA 및 DHA의 공급이 어류의 오일로부터 이루어지고 있으나, 어류의 경우에 인류 식량자원 및 생물 고갈, 그리고 해양오염물질 농축 등의 문제로 인하여 오메가-3 지방산 대체 자원이 필요한 실정이다.Fish oils are known to be rich in EPA and DHA, and a limited variety of plant oils and the like are known to be good sources of other polyunsaturated fatty acids. Currently, most EPA and DHA feeds are made from fish oils, but in the case of fish, omega-3 fatty acid replacement resources are needed due to human food resources, bio-depletion, and enrichment of marine pollutants.

일부 해양 원생생물은 높은 양의 EPA 또는 DHA를 함유하고 있는 것으로 알려져 있다. Eustimatophyte에 속하는 Nannochloropsis spp., 규조류에 속하는 Phaeodactylum spp.와 Thalassiosira spp. 등은 높은 함유량의 EPA를 가지고 있는 것으로 알려져 있으며, Thraustochytrids에 속하는 Thraustochytrium spp.와 Schizochytrium spp., 그리고 와편모류 Crypthecodinium spp.는 높은 함유량의 DHA를 가지고 있는 것으로 알려져 있다. Crypthecodinium cohnii의 경우 실제 대량 규모로 DHA 상업적 생산이 이루어지고 있는 상태이다.Some marine protists are known to contain high amounts of EPA or DHA. Nannochloropsis spp. Belonging to Eustimatophyte, Phaeodactylum spp. And Thalassiosira spp. Belonging to diatoms. Are known to have a high content of EPA. Thraustochytrium spp. And Schizochytrium spp. Belonging to Thraustochytrids and Crypthecodinium spp. Are known to have a high content of DHA. In the case of Crypthecodinium cohnii, commercial production of DHA is in actual mass scale.

이러한 상업적 이용가능성 때문에, 오메가-3 지방산 함유량을 증가시키고자 이들 생합성 경로에 대한 연구도 증가하고 있는 상황이다. EPA와 DHA를 포함한 다중불포화지방산 합성에는 지방산 사슬의 연속적인 불포화(desaturation) 및 신장(elongation)이 요구된다. EPA는 일반적으로 delta-5, delta-6 불포화효소(desaturase) 및 delta-6 신장 효소(elongase)를 사용하여, ALA 전구물질로부터 SDA 및 ETA를 거쳐 전환되는 것으로 알려져 있다. 또는 LA로부터 GLA 및 DGLA, ARA를 거쳐 생산되는 기작도 알려져 있다. Because of this commercial availability, studies on these biosynthetic pathways have been on the rise to increase omega-3 fatty acid content. The synthesis of polyunsaturated fatty acids, including EPA and DHA, requires continuous desaturation and elongation of the fatty acid chain. EPA is generally known to be converted from ALA precursors via SDA and ETA using delta-5, delta-6 desaturase and delta-6 elongase. Or from LA through GLA, DGLA, and ARA.

미세조류의 경우 DHA는 delta-5 elongase 및 delta-4 desaturase 유전자를 이용하여 EPA로부터 DPA를 거쳐 바로 생산될 수 있다는 사실이 알려져 있다. 와편모류에서 또한 DHA 함량을 늘리고자 이러한 유전적 특성 파악 및 생물공학에 대한 연구의 관심이 증가되고 있는 추세이다. 그러나, 다음과 같은 EPA 및 DHA 합성 관여 유전자들은 아직 와편모류 종주로부터 발굴된 바 없는 상태이다. 그러므로, 생물공학에서 다양한 다중불포화지방산의 합성에 관여하는 유전자들을 상업적으로 이용하기 위해서도, 이들 유전자의 발굴을 위한 연구는 매우 중요한 가치를 지닌다. In the case of microalgae, it is known that DHA can be produced directly from EPA via DPA using delta-5 elongase and delta-4 desaturase genes. In order to increase the DHA content in the western hemisphere, there is a growing interest in the study of genetic characterization and biotechnology. However, the following EPA and DHA synthetic genes have yet to be unearthed from the hippocampus. Therefore, in order to commercially use genes involved in the synthesis of various polyunsaturated fatty acids in biotechnology, research for the discovery of these genes is of great value.

와편모류 파라짐노디니움 시화엔스(Paragymnodinium shiwhaense)는 2010년에 새로이 명명된 신속 신종 와편모류로서, 비록 엽록체를 가지고는 있으나 광합성만으로는 분열하지 못하며, 먹이로부터 유기물을 획득하여야만 성장하는 특징을 지닌 혼합영양성 와편모류이다.Wapyeon hair flow para Jim nodi nium Ethoxylated Enschede (Paragymnodinium shiwhaense ) is a newly named rapid new brecciated mass , which is a mixed natu- ral mollusc , with chloroplasts but not enough to divide by photosynthesis, and grows only after acquiring organic matter from food.

대한민국 등록특허 제1492402호는 ‘FAB２ 유전자를 과발현하는 형질전환 미세조류에서 총 지방산 함량 및 유용지방산 비율을 증가시키는 방법’에 관한 것으로, FAB2 유전자 과발현되도록 하는 미세조류 형질전환에 의해 총 지방산 및 유용지방산인 올레산 등의 비율을 증가시키는 방법이 개시되어 있다.Korean Patent No. 1492402 relates to a method for increasing total fatty acid content and useful fatty acid ratio in transgenic microalgae overexpressing the FAB2 gene. In the microalgae transforming to overexpress the FAB2 gene, total fatty acid and useful fatty acid A method of increasing the proportion of oleic acid or the like is disclosed.

대한민국 등록특허 제1187813호는 ‘미세조류로부터 고도불포화지방산을 생산하는 방법’에 관한 것으로, 배지에 전단응력 보호제를 첨가시켜 미세조류 배양속도를 증가시키고 배양시간을 단축시킴으로써 지방산을 생산하는 방법이 개시되어 있다.Korean Patent No. 1187813 relates to a method for producing polyunsaturated fatty acids from microalgae and a method for producing fatty acids by increasing the microalgae culture rate and shortening the culture time by adding a shear stress protective agent to the medium is disclosed .

하지만, 먹이종의 첨가에 의해 미세조류 내 지방산 함량을 증가시키는 것에 대하여는 알려져 있지 않다.However, it is not known to increase the fatty acid content in microalgae by the addition of food species.

본 발명은 먹이종을 포함하는 다중불포화지방산 생산용 미세조류 배양 배지 조성물을 이용하여 미세조류인 와편모류의 지방산 생성을 촉진하는 기술에 관한 것이다. The present invention relates to a microalgae culture medium composition for producing polyunsaturated fatty acids containing a food species and a technique for promoting fatty acid production in microalgae.

한 양태에서 본원은 고도다중불포화지방산 생산능 향상을 위한, 앰피디니움 카르테레(Amphidinium carterae ), 헤테로시그마 아카시우 ( Heterosigma akashiwo ) 또는 텔레아우락스 종(Teleaulax sp.) 중 하나 이상의 먹이종을 포함하는 와편모류 미세조류 배양 배지 조성물을 제공한다. In one embodiment the present application is highly polyunsaturated fatty acid-producing ability for improving, Am PD nium carboxylic terephthalate (Amphidinium carterae), heteroaryl Sigma Akashi right (Heterosigma and at least one food species selected from the group consisting of akashiwo ) or teleaulax sp. (Teleaulax sp.) .

본원에 따른 조성물은 와편모류 미세조류, 특히 혼합영양성 와편모류 미세조류의 배양에 사용되어 고도다중불포화지방산의 생산능을 향상시킬 수 있다. The composition according to the present invention can be used for the cultivation of the granule microalgae, especially the mixed nutritional granule microalgae, to improve the production ability of highly polyunsaturated fatty acids.

본원에 따른 조성물은 혼합영양성 와편모류 미세조류로서 파라짐노디니움 시 화엔스(Paragymnodinium shiwhaense ), 짐노디니움 스메이데(Gymnodinium smaydae) 또는 자이로디니엘룸 시화엔스(Gyrodiniellum shiwhaense)의 배양에 사용되어 고도다중불포화지방산의 생산능을 향상시킬 수 있다. The composition according to the present application is para luggage nodi nium as algae nutrient mix hair flow wapyeon When angry Enschede (Paragymnodinium shiwhaense), Jim nodi nium Meyide's (Gymnodinium smaydae ) or Gyrodinilum Ethoxylated Enschede (Gyrodiniellum shiwhaense ) to improve the ability to produce highly polyunsaturated fatty acids.

본원에 따른 조성물을 사용하는 경우 미세조류에서 고도다중불포화지방산, 특히 오메가-3 불포화지방산, 더욱 특히 도코사헥사엔산(Docosahexaenoic acid: DHA), 에이코사펜타엔산(Eicosapentaenoic acid: EPA), 도코사펜타엔산(Docosapentaenoic acid: DPA) 및 α-리놀렌산(ALA)으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 다중불포화지방산의 생산능이 향상된다. The use of the composition according to the present invention makes it possible to use highly polyunsaturated fatty acids, especially omega-3 unsaturated fatty acids, more particularly docosahexaenoic acid (DHA), eicosapentaenoic acid (EPA) The ability to produce at least one polyunsaturated fatty acid selected from the group consisting of docosapentaenoic acid (DPA) and alpha-linolenic acid (ALA) is enhanced.

본원에 따른 조성물에 포함되는 먹이종은 앰피디니움 카르테레 , 헤테로시그마 아카시우 또는 텔레아우락스 종. 대 상기 파라짐노디니움 시화엔스의 개체수 기준 농도비는 5~20 : 1의 비로 포함된다. The food species included in the composition according to the present invention are Ampodinium Carter , Heterosigma Akashiu or Tela Aurox species. versus remind Para gymnodinium The concentration ratio based on the population of Sihwaens is 5 to 20: 1.

본원에 따른 조성물에 포함되는 먹이종은 일 구현예에서 상기 앰피디니움 카르테레 대 파라짐노디니움 시화엔스의 개체수 기준 농도비는 8 : 1이고, 상기 헤테로시그마 아카시우 대 파라짐노디니움 시화엔스의 개체수 기준 농도비는 9 : 1이고, 상기 텔레아우락스 종. 대 파라짐노디니움 시화엔스의 개체수 기준 농도비는 14 : 1로서, 고도불포화지방산 생산을 위한 배양체가 오염되지 않고, 고효율로 고도불포화지방산을 수득할 수 있다. Feeding species contained in the composition according to the present application is the PD amplifier nium In one embodiment Carteret vs Parajim Nodinium Shihwaens Population based on the concentration ratio is 8: 1, and said heteroaryl Sigma Akashio vs. Parajim Nodinium The concentration ratio of Shihwaens is 9: 1 on the basis of the number of species, and the teleaurex species. Great Parajim Nodinium The concentration ratio of Sihwaens is 14: 1 on the basis of the number of individuals, so that the culture for polyunsaturated fatty acid production is not contaminated and high-purity polyunsaturated fatty acid can be obtained.

또 다른 양태에서 본원은 본원에 따른 배양 배지 조성물을 이용하여 미세조류로서 파라짐노디니움 시화엔스를 배양하는 단계를 포함하는 미세조류를 이용한 다중불포화지방산을 생산하는 방법을 제공한다. In another aspect, the present application is based on the discovery that para-gymnodinium The present invention provides a method for producing a polyunsaturated fatty acid using microalgae comprising the step of cultivating a polyunsaturated fatty acid.

또 다른 양태에서 본원은 본원에 따른 배양 배지 조성물을 이용하여 미세조류로서 파라짐노디니움 시화엔스를 배양하는 단계를 포함하는 상기 미세조류를 이용하여 다중불포화지방산 생산능을 향상시키는 방법을 제공한다. In another aspect, the present application is based on the discovery that para-gymnodinium And a step of culturing the microalgae. The present invention also provides a method for enhancing the polyunsaturated fatty acid producing ability using the microalgae.

본원에 따른 앰피디니움 카르테레 ( Amphidinium carterae ), 헤테로시그마 아 카시우(Heterosigma akashiwo ) 또는 텔레아우락스 종( Teleaulax sp .)을 포함하는 미세조류 배양용 조성물은 특히 파라짐노디니움 시화엔스 ( Paragymnodinium shiwhaense) 배양시, 이에 포함된 고도다중불포화지방산 특히 오메가-3 지방산인 EPA 및 DHA의 함량 및/또는 비율을 더욱 증가시킬 수 있다. 따라서 본원에 따른 조성물을 이용하면 미세조류에서 오메가-3 지방산 등의 다중불포화지방산을 효율적으로 고농도로 생산할 수 있다. Ampodinium < RTI ID = 0.0 > Carboxylic terephthalate (Amphidinium carterae), heteroaryl Sigma Ah Ka Siu (Heterosigma akashiwo) or Tele Augustus Locks species (Teleaulax The composition for culturing microalgae, including sp.), especially p-load nodi nium Ethoxylated Enschede (Paragymnodinium shiwhaense) it is possible to further increase the high polyunsaturated fatty acids, especially omega-3 fatty acid EPA and the content and / or the ratio of DHA included in the culture, this. Therefore, using the composition according to the present invention, it is possible to efficiently produce polyunsaturated fatty acids such as omega-3 fatty acids at a high concentration in microalgae.

구체적으로 파라짐노디니움 시화엔스의 고도다중불포화지방산 조성을 다른 시중의 또는 개발 중인 지방산을 소유한 미세조류 종주들과 비교한 결과 파라짐노 디니움 시화엔스는 EPA 및 DHA의 함량 및/또는 비율이 높고, 동시에 연관된 유전자들을 가지고 있어, 다중불포화지방산 생산을 위한 상업적 개발이 가능한 것으로 나타났다. Specifically, para gymnodinium Compared with a microalgae-racist owns a high polyunsaturated fatty acid composition of other commercially available or being developed fatty acids, ethoxylated Enschede para jimno di nium Shihwa Enschede has a high content and / or the ratio of EPA and DHA, simultaneously with the associated genes , Indicating that commercial development for the production of polyunsaturated fatty acids is possible.

도 1은 본원의 일 실시예에 따른, 지방산 소립(알갱이)이 관찰되는 P. 시화엔스 (shiwhaense) 및 그 먹이종들의 광학현미경 관찰 이미지를 나타낸 것이다. (A 및 B) 먹이종 A. 카르테레(carterae); (C 및 D) A. 카르테레를 섭식한 P. 시화엔스; (E 및 F) 먹이종 H. 아카시우(akashiwo); (G 및 H) H. 아카시우를 섭식한 P. 시화엔스; (I 및 J) 먹이종 텔레아우락스 종(Teleaulax sp.); (K 및 L) 텔레아우락스 종을 섭식한 P. 시화엔스. A, C, E, G, I, 및 K는 광학현미경, 그리고 B, D, F, H, J, 및 L은 형광현미경 하에 관찰한 이미지다. 스케일 바 = 10㎛.
도 2는 본원의 일 실시예에 따른, 먹이로부터 굶은 시간에 따른 P. 시화엔스 세포 내의 지방산 소립 관찰 사진을 나타낸 것이다. 상기 세포는 0 (A 및 B), 1 (C 및 D), 5 (E 및 F), 및 20 일(G and H) 동안 굶었다. 스케일 바 = 10㎛.
도 3은 본원의 일 실시예에 따른, 먹이종 A. 카르테레, H. 아카시우, 및 텔 레아우락스 종과 포식자 P. 시화엔스가 각 먹이종을 섭식하였을 때의 각 지방산 조성을 나타낸 것이다.; P. 시화엔스가 각 먹이종을 섭식하였을 때의 지방산 ALA(alpha-linolenic acid), EPA(eicosapentaenoic acid) 및 DHA(docosahexaenoic acid)는 각각의 먹이종의 그것의 조성과 큰 차이를 보이며, 이를 비율(%)과 배수(fold)값으로 표시하였다.
도 4는 본원의 일 실시예에 따른, LA(linolenic acid) 및 ALA(alpha -linolenic acid)로부터 전환되는 EPA와 DHA에 대한 생합성 경로를 보여주는 간단한 모식도를 나타낸 것이다. 파란색으로 표시되었으며 contig 번호가 표시된 유전자(unigene: transcriptome data로부터 추정한 유전자; 즉 Δ4, 5, 및 6-불포화효소 유전자 및 Δ5 및 6-신장 효소 유전자)는 P. 시화엔스에서 발견된 것이며, contig 번호가 없는 빨간색으로 표시된 유전자(Δ8-불포화효소 유전자 및 Δ9-신장 효소 유전자)는 P. 시화엔스에서 발견되지 않은 부분이다.
도 5는 본원의 일 실시예에 따른 P. 시화엔스 및 다른 미세조류들의 EPA 및 DHA 생성 관여 불포화효소 유전자(Δ4, Δ5, 및 Δ8-불포화효소)들을 포함하여 그린 계통수를 나타낸 것이다. 왼쪽에 표기된 수치는 0.5 이상의 의미있는 베이스 사후 확률(Bayesian posterior probability)이며, 오른쪽에 표기된 수치는 50% 이상의 최대우도 부트스트랩 수치(maximum-likelihood bootstrap value)를 표기하였다.
도 6은 본원의 일 실시예에 따른 P. 시화엔스 및 다른 미세조류들의 EPA 및 DHA 생성 관여 신장 효소 유전자(Δ5 및 Δ9 신장효소)들을 포함하여 그린 계통수. 왼쪽에 표기된 수치는 0.5 이상의 의미있는 베이스 사후 확률이며, 오른쪽에 표기된 수치는 50% 이상의 최대우도 부트스트랩 수치를 표기하였다.
도 7은 본원의 일 실시예에 따른, 각 원생생물의 DHA 조성(%)과 최대 수영속도(maximum swimming speed = MSS, μm/s)의 상관성을 보여주는 데이터를 나타낸 그래프이다; 선형회귀 방정식, MSS (μm s^-1) = 26.332 (DHA composition) -7.672, r² = 0.419 (n = 32, p < 0.05). 닫힌 원: 혼합영양성 원생생물(Mixotrophic protists), 열린 원: 종속영양성 원생생물(Autotrophic protists), 열린 세모: 자가영양성 원생생물(Heterotrophic protists).
도 8은 본원의 일 실시예에 따른, 각 먹이종의 ALA+EPA+DHA와 TFA의 조성 비율(%)과 그 먹이종을 섭식하였을 때의 P. 시화엔스의 성장 효율을 의미하는 {성장률(growth rate=GR)/섭식률(ingestion rate=IR) 절대값}의 상관성을 보여주는 데이터를 나타낸 그래프이다; P. 시화엔스의 성장률 및 섭식률은 비슷한 농도의 각 먹이종을 투입한 상태로 측정되었다. 선형회귀 방정식, (MGR/MIR) = 0.089 (the ratio of ALA + EPA + DHA relative to TFA) -2.376, r² = 0.844 (n = 6, p < 0.05). Tel: Teleaulax sp. Ac: Amphidinium carterae. Ha: Heterosigma akashiwo. Rs: Rhodomonas salina. Hr: Heterocapsa rotundata. Ig: Isochrysis galbana. Figure 1 shows an ethoxylated P. Enschede (shiwhaense) and light microscopy images of the prey species are observed, a fatty acid granules (pellets), according to one embodiment of the present application. (A and B) feeding species A. carterae ; (C and D) A. P. thalassaens feeding on carteres ; (E and F) feeding species H. akashiwo ; (G and H) P. schwhaens eating E. acacia ; (I and J) feeding species Teleaulax sp .; (K and L) P. thalassaens who fed telaerox species . A, C, E, G, I, and K are optical microscopes, and B, D, F, H, J, and L are images observed under a fluorescence microscope. Scale bar = 10 탆.
FIG. 2 is a photograph of fatty acid partial micrographs in P. shhhwhaens cells according to the time of starvation from prey according to one embodiment of the present invention. The cells starved for 0 (A and B), 1 (C and D), 5 (E and F), and 20 days (G and H). Scale bar = 10 탆.
Figure 3 illustrates the composition of each fatty acid when, according to one embodiment of this disclosure, the prey species A. terephthalic acid, Akashi H. Wu, and tell the LEA right flux predator species and P. ethoxylated Enschede the hayeoteul feeding each prey species. ; The fatty acid ALA (alpha-linolenic acid), EPA (eicosapentaenoic acid) and DHA (docosahexaenoic acid) were significantly different from P. aeruginosa , (%) And folds.
Figure 4 is a simplified schematic diagram illustrating biosynthetic pathways for EPA and DHA that are converted from LA (linolenic acid) and ALA (alpha -linolenic acid), according to one embodiment of the invention. The genes indicated in blue and with contig numbers (genes deduced from unigene: transcriptome data; i.e., Δ4, 5, and 6-desaturase genes and Δ5 and 6-kinase genes) were found in P. schwaneens and contig genes in red-free number (Δ8- unsaturated enzyme gene and gene Δ9- kidney) is the part that is not found in P. Shihwa Enschede.
Figure 5 shows a phylogenetic tree, including the Green P. ethoxylated Enschede, and EPA and DHA generate involved unsaturated gene (Δ4, Δ5, and Δ8- unsaturated enzyme) other micro-algae, in accordance with an embodiment of the present application. The numbers on the left indicate a significant Bayesian posterior probability of 0.5 or greater, and the numbers on the right indicate the maximum-likelihood bootstrap value of 50% or greater.
FIG. 6 is a graphical representation of the green tree stem including EPA and DHA-producing kinase genes (Δ5 and Δ9 renal enzymes) of P. thalia and other microalgae according to one embodiment of the present invention. The numbers on the left indicate a significant posterior probability of 0.5 or greater, and the values on the right indicate the maximum likelihood bootstrap values of 50% or greater.
Figure 7 is a graph showing data showing the correlation between the DHA composition (%) and the maximum swimming speed (MSS, μm / s) of each protist, according to one embodiment of the present invention; The linear regression equation, MSS (μm s ^-1 ) = 26.332 (DHA composition) -7.672, r ² = 0.419 (n = 32, p <0.05). Closed circles: Mixotrophic protists, open circles: Autotrophic protists, open triangles: Heterotrophic protists.
FIG. 8 is a graph showing the relationship between the composition ratio (%) of ALA + EPA + DHA and TFA of each food species and the growth efficiency of P. shimaensis fed on the food species according to one embodiment of the present invention growth rate = GR) / ingestion rate (IR = absolute value)}; Growth rate and feeding rate of P. siegens were measured with each feeding species of similar concentration. Linear regression equations, (MGR / MIR) = 0.089 (the ratio of ALA + EPA + DHA relative to TFA) -2.376, r 2 = 0.844 (n = 6, p <0.05). Tel: Teleaulax sp. Ac: Amphidinium carterae Ha: Heterosigma akashiwo . Rs: Rhodomonas salina . Hr: Heterocapsa rotundata . Ig: Isochrysis galbana

본원은 미세조류인 혼합영양성 와편모류(dinoflagellate), 특히 파라짐노디니움 시화엔스(Paragymnodinium shiwhaense )의 배양 배지에 특정 먹이종을 공급하면 P.시화엔스의 총 지방산 생산이 증가하며, 특히 오메가 3의 생산이 증가한다는 발견에 근거한 것이다. Herein microalgae nutritional mix wapyeon hair flow (dinoflagellate), in particular para Jim nodi nium Ethoxylated Enschede (Paragymnodinium shiwhaense ) is based on the discovery that the total fatty acid production of P. shimaensis is increased, especially the production of omega-3.

본원에서는 와편모류 앰피디니움 카르테레 ( Amphidinium carterae ), 침편모류(Raphidophyte) 헤테로시그마 아카시우(Heterosigma akashiwo ), 은편모류(Cryptophte) 텔레아우락스 종( Teleaulax sp .)이 상기 P. 시화엔스의 먹이종으로 사용되어, 다중불포화지방산의 함량을 높이며, 또한 이에 미세조류의 델타-5 및 델타-6 불포화효소(desaturase)와 델타-6 신장효소(elongase)가 관여한다는 것을 밝혔다. Present in the hair flow wapyeon Am PD nium Carboxylic terephthalate (Amphidinium carterae), needle flagella acids (Raphidophyte) heteroaryl Sigma Akashi right (Heterosigma akashiwo), eunpyeon hair flow (Cryptophte) tele brother flux species (Teleaulax sp .) is used as a food species of P. shiwhaens to increase the content of polyunsaturated fatty acids, and the delta-5 and delta-6 desaturase and delta-6 elongase .

이에 한 양태에서 본원은 미세조류를 이용한 다중불포화지방산 생산능 향상을 위한, 앰피디니움 카르테레 ( Amphidinium carterae ), 헤테로시그마 아카시 우(Heterosigma akashiwo ) 또는 텔레아우락스 종( Teleaulax sp .) 중 하나 이상의 먹이종을 포함하는, 혼합영양성 와편모류 미세조류 배양 배지 조성물에 관한 것이다. In one embodiment, the present invention provides a method for improving polyunsaturated fatty acid production using microalgae,Ampidinium Carteret ( Amphidinium carterae ),Heterosigma Akashi Right(Heterosigma akashiwo )orTele Aurox Bell( Teleaulax sp .)medium The present invention relates to a mixed nutritional full-scale microalgae culture medium composition comprising at least one food species.

본원에 따른 배양 배지 조성물은 미세조류의 배양에 사용된다. 미세조류(microalgae)는 현미경으로 관찰할 수 있는 단세포성 조류로서, 대부분의 식물성 플랑크톤이 이에 속한다. 미세조류는 건강식품 및 대체에너지원으로 잘 알려져 있으며, 수산양식용 사료, 의약원료물질의 생산, 생화학물질의 생산 등으로 그 이용성이 확대되고 있다. The culture medium composition according to the present invention is used for culturing microalgae. Microalgae are unicellular algae that can be observed under a microscope, most of which are phytoplankton. Microalgae are well known as health foods and alternative energy sources, and their availability is increasing due to feed for aquaculture, production of pharmaceutical raw materials, and production of biochemical materials.

미세조류는 생물학적 특징에 따라 남세균(Cyanonacteria), 회조류(Glaucophyte), 클로르라라크니오류(Chlororarachniophte), 유글레나류(Euglenoid), 은편모조류(Cryptomonad), 착편모조류(Haptophyte), 와편모류(Dinoflagellate), 침편모조류를 포함하는 광합성 대롱 편모생물(Photosynthetic stramenopiles), 홍조류(red alage), 녹조류(green algae) 등으로 분류된다. Microalgae are classified according to their biological characteristics as Cyanonacteria, Glaucophyte, Chlororarachniophte, Euglenoid, Cryptomonad, Haptophyte, Dinoflagellate, Photosynthetic stramenopiles, red algae, and green algae, which contain migratory birds.

이러한 미세조류는 또한 영양을 취득하는 방법에 따라서, 광합성을 하는 식물성의 독립영양성, 다른 생물체를 섭식하는 동물성의 종속영양성, 다른 생물체에 기생하는 기생성 또는 식물성과 동물성이 혼합된 혼합영양성 미세조류로 구분될 수 있다. These microalgae can also be used as nutritional nutrients for the photosynthesis of plants, for animal nutrition for animals feeding on other organisms, for parasitic parasites in other organisms, or for mixed nutritional microalgae Can be distinguished.

본원에 따른 배양 조성물은, 먹이종을 포함하기 때문에, 먹이종의 섭식이 가능한 미세조류 즉 종속영양성인 동물성 미세조류, 또는 종속 및 독립영양성이 혼합된 혼합영양성 미세조류의 배양에 사용될 수 있다. 본원의 일 구현예에서 본원에 따른 조성물은 와편모류, 특히 종속영양성 또는 혼합영양성 와편모류의 배양에 사용되며, 이는 예를 들면 파라짐노디니움 시화엔스(Paragymnodinium shiwhaense), 짐노디니움 스메이데(Gymnodinium smaydae), 또는 자이로디니엘룸 시화엔 스(Gyrodiniellum shiwhaense)를 포함하나, 이로 제한하는 것은 아니다. The culture composition according to the present invention can be used for culturing microalgae capable of feeding food species, that is, heterotrophic animal microalgae, or mixed nutrient microalgae mixed with dependent and autotrophic, because they contain food species. The composition according to the present application in one embodiment of the present example is wapyeon hair flow, in particular depend nutritional or mixed nutrient used for the culture of wapyeon hair flow, which for example para luggage nodi nium ethoxylated Enschede (Paragymnodinium shiwhaense), luggage nodi nium's meyide (Gymnodinium smaydae ), or Gyrodinilum Ethoxylated yen including one switch (Gyrodiniellum shiwhaense), are not intended to limit thereto.

본원에 따른 일 구현예에서 본원에 따른 조성물은 혼합영양성 와편모류로서 파라짐노디니움 시화엔스(Paragymnodinium shiwhaense )의 배양에 사용된다. 상기 P. 시화엔스는 2010년에 새로이 명명된 신속 신종 와편모류로서, 비록 엽록체를 가지고는 있으나 광합성만으로는 분열하지 못하며, 먹이로부터 유기물을 획득하여야만 성장하는 특징을 지닌 혼합영양성이다.In one embodiment according to the present composition according to the present application is as a mixed nutritional wapyeon hair flow para luggage nodi nium ethoxylated Enschede (Paragymnodinium shiwhaense ) in the culture Is used. The P. shhhwainens is a newly named rapid newborn domesticated species, which is a mixed nourishment with the characteristics of growing only if it has chloroplasts but does not divide by photosynthesis and acquires organic matter from food.

본원에 따른 조성물을 이용하여 미세조류에서 생산되며, 생산능이 향상되는 “고도다중불포화지방산”은 탄소수 18개 이상의 2개 이상의 이중결합(π)을 포함하는 불포화지방산을 의미한다.&Quot; Highly polyunsaturated fatty acid " produced in microalgae using the composition according to the present invention and having improved productivity means an unsaturated fatty acid containing at least two double bonds (π) having at least 18 carbon atoms.

특히 본원에 따른 일 구현예에서 고도다중불포화지방산은 오메가-3 불포화지방산이며, 보다 바람직하게는 도코사헥사엔산(Docosahexaenoic acid: DHA), 에이코사펜타엔산(Eicosapentaenoic acid: EPA), 도코사펜타엔산(Docosapentaenoic acid: DPA) 또는 α-리놀렌산(ALA)이고, 보다 더 바람직하게는 DHA 또는 EPA이다. In particular, in one embodiment according to the present application the highly polyunsaturated fatty acids are omega-3 unsaturated fatty acids, more preferably docosahexaenoic acid (DHA), eicosapentaenoic acid (EPA), docosa Docosapentaenoic acid (DPA) or? -Linolenic acid (ALA), and even more preferably DHA or EPA.

본원에 따른 배양 배지 조성물은 종속 또는 종속/혼합 영양성 미세조류의 고도다중불포화지방산 생산능을 증가시킨다. The culture medium composition according to the present invention increases the ability to produce highly polyunsaturated fatty acids of the dependent or mixed / mixed nutrition microalgae.

본원에서 생산능이란 미세조류 단위 개체수 또는 단위 중량 당 총 지방산 양 증가, 고도불포화지방산의 양의 증가, 오메가-3 양의 증가, DHA 또는 EPA 양의 증가, 또는 생산된 지방산 중 고도불포화지방산의 상대적 비율 증가, 생산된 총 지방산 또는 고도불포화지방산 중 오메가-3의 상대적 비율 증가, 생산된 오메가-3 중 DHA 및 EPA의 상대적 비율 증가를 포함한다. 상술한 것 중 어느 하나라도 목적하는 지방산의 생산증가로 이어질 수 있으며, 예를 들면 상대적 비율이 증가하는 경우에는 목적하는 지방산 량의 증가는 물론, 농도가 높아지게 되어, 분리가 용이해질 수 있다.The ability to produce in this context means an increase in the total fatty acid content per unit number or unit weight of the algae, an increase in the amount of polyunsaturated fatty acids, an increase in the amount of omega-3, an increase in the amount of DHA or EPA, Increase in the relative proportion of omega-3 in total fatty acids or polyunsaturated fatty acids produced, and an increase in the relative proportions of DHA and EPA in the produced omega-3. Any one of the above may lead to an increase in production of the desired fatty acid. For example, when the relative ratio is increased, the desired fatty acid amount may be increased as well as the concentration may be increased, so that the separation can be facilitated.

본원에 따른 배지 조성물은 먹이종으로서, 앰피디니움 카르테레 ( Amphidinium carterae), 헤테로시그마 아카시우(Heterosigma akashiwo ), 또는 텔레아우락스 종(Teleaulax sp .) 중 하나 이상의 먹이종을 포함한다. Medium composition according to the present application is a prey species, Am PD nium Carboxylic terephthalate (Amphidinium carterae), heteroaryl Sigma Akashi right (Heterosigma It includes akashiwo), or tele brother flux species (Teleaulax sp.) at least one of the feed species.

본원에 따른 조성물은 이러한 먹이종을 사용함으로서, 생산능이 증가된다.The composition according to the present invention increases the productivity by using such a food species.

일 구현예 따르면 앰피디니움 카르테레는 총지방량의 증가, 총 지방 중 고도다중불포화지방산 비율의 증가, 오메가-3 양의 증가, 그리고 EPA 및 DHA의 증가를 가져온다. According to one embodiment, the PD-Am nium Terephthalic acid results in the increase of total fat, total fat altitude of multiple increase in the percentage of unsaturated fatty acids increase the amount of omega-3, and the increase of EPA and DHA.

다른 구현예에 따르면 헤테로시그마 아카시우가 사용되며, 총 지방, 또는 고도다중불포화지방 중 오메가 3 비율의 증가, 오메가-3 중 EPA 및 DHA의 증가를 가져온다. According to another embodiment heteroaryl Sigma Acacia is used, leading to an increase in omega 3 ratios in total fat, or highly polyunsaturated fat, and an increase in EPA and DHA in omega-3.

또 다른 구현예에 따르면 텔레아우락스 종이 사용되며 총 지방량의 증가 및 오메가-3 중 DHA 및 EPA의 비율이 증가한다. 텔레아우락스 종은 단일 종이나, 종까지는 규명이 되지 않은 상태이나, 본원의 실시예를 포함한 명세서의 기재로부터 명확한 파악이 가능하다. According to yet another embodiment tele brother Lax Paper is used and increases in total fat mass and proportion of DHA and EPA in omega-3. Tele Aurox The species is not identified to a single species or species, but can be clearly identified from the description of the specification including the embodiments of the present application.

본원에 따른 먹이종으로 사용되는 미세조류는 단독 또는 조합으로 사용될 수 있다. 본원에 따르면, 먹이종으로 사용되는 각 미세조류간에 서로 섭식을 하거나, 또는 사멸을 유도하지 않는 것으로 나타나, 다양한 조합으로 사용될 수 있으며, 조합으로 사용시, 그 효과가 서로 보완적으로 또는 상승적으로 작용할 수 있다. The microalgae used as food species according to the present invention may be used singly or in combination. According to the present application, it is shown that each microalga used as a feeding species does not interfere with each other, or induce death, and can be used in various combinations, and when used in combination, the effects can act complementarily or synergistically have.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에 의하여 배양 배지 조성물에 포함될 수 있는 먹이종은 앰피디니움 카르테레 , 또는 이와 다른 두 종류의 먹이종의 조합이다. According to a preferred embodiment of the present invention, the food species that can be contained in the culture medium composition according to the present invention are Ampodinium Carter , or a combination of two other food species.

본 발명의 배지 조성물에 첨가되는 먹이종은 미세조류로부터 다중불포화지방산을 고효율로 수득할 수 있도록 배양에 적합한 형태로 첨가될 수 있다. 상기 먹이종의 형태는 배양 조건에 따라 당업자에 따라 최적의 형태로 첨가될 수 있으며, 본원의 일 구현예에서는 지수성장 상태 혹은 이른 stationary 상태의 배양물을 포함할 수 있다. The food species to be added to the medium composition of the present invention may be added in a form suitable for culture so as to obtain polyunsaturated fatty acids from microalgae with high efficiency. The form of the food species may be added in an optimal form according to the culturing conditions according to those skilled in the art, and in one embodiment of the present invention may include a culture in an exponential growth state or an early stationary state.

본 발명은 미세조류 배지에 상기 먹이종을 첨가하여 배양함으로써 다중불포화지방산 생산능을 향상시켜 미세조류로부터 다중불포화지방산을 고효율로 수득하는 것을 특징으로 하며, 미세조류 배지에 첨가하는 먹이종의 농도는 제한되지 아니한다. 그러나, 미세조류의 배양 배지에 첨가되는 먹이종은 배양 조건에 따라 당업자에 의하여 최적의 농도를 선택하여 배지에 첨가되는 것이 바람직하다.The present invention is characterized in that a polyunsaturated fatty acid is obtained from a microalgae with high efficiency by enhancing the polyunsaturated fatty acid production ability by adding the food species to the microalgae culture medium, It is not limited. However, the food species to be added to the microalgae culture medium is preferably added to the medium by selecting the optimum concentration according to the culture conditions by the person skilled in the art.

본원의 배양 배지 조성물에는 상기 먹이종과 P. 시화엔스의 농도비(개체수 기준)가 특정 비율로 되도록 혼합된다. 상기 먹이종은 배양 배지 조성물에서 실질적으로 성장(분열)하지 않으며, 실질적이란 배지에 접종 후 개체수가 넣어준 개체 수 보다 약 10% 이상 증가하지 않는 것이다. 상기 먹이종 제공 후 배지내에 수 시간 내지 수 일 이내에 먹이종이 섭식에 의해 제거되도록 할 수 있도록 하였다. 먹이종이 제거가 되지 않고 그대로 유지 혹은 성장하는 경우 전체 배양체의 양에서 먹이종이 차지하는 비율이 일정 이상 유지되거나 증가되어, 먹이종에 의한 배양액의 오염 및 이로 인한 생산능의 저하가 될 수 있고, 본원에서는 이러한 점을 또한 해결하였다. 즉 섭식되지 않은 먹이종으로 배양체가 오염이 되면, 이들은 P. 시화엔스에 비해 총지방량이나 omege-3, 또는 EPA+DHA의 양이 적기 때문에 섞여 있는 경우 지방산 생산량이 저하될 수 있다. 일 구현예에서는 먹이종 대 P. 시화엔스는 농도비가 약 5~20 : 1이 되도록 포함된다, 다른 구현예에서 상기 농도비는 앰피디니움 카르테레 대 P. 시화엔스는 약 8 : 1이고, 헤테로시그마 아카시우 대 P. 시화엔스는 약 9 : 1이고, 텔레아우락스 종 대 P. 시화엔스는 약 14 : 1이다. Culture medium composition of the present application, the concentration ratio (population standard) of the feed and the species P. ethoxylated Enschede are mixed at a specific ratio. The food species do not substantially grow (divide) in the culture medium composition, and substantially do not increase by more than about 10% from the number of the population after the inoculation in the medium. After the feeding of the food species, the food can be removed by feeding the food within several hours to several days within the medium. If the feed is not retained and is maintained or grown, the proportion of the total amount of the feed in the total amount of the cultures may be maintained or increased over a certain level, resulting in contamination of the culture medium by the feed species and the resulting decrease in productivity. This has also been solved. In other words, if the cultures are contaminated with undifferentiated food species, the amount of fatty acid production may be lowered if they are mixed with total amount of fat, omege-3, or EPA + DHA compared to P. shhhwaneens. In one embodiment, the prey species against P. ethoxylated Enschede the concentration ratio is about 5-20: 1 are included such that the concentration ratio in other embodiments amplifier PD nium Carter versus P. schwaense is about 8: 1, and Heterosigma Akashi-Uta vs. P. Shihwaens is about 9: 1, teleroulax The species P. thalassaensis is about 14: 1.

본 발명의 미세조류의 다중불포화지방산 생산능 향상을 위해 사용되는 미세조류(microalgae) 배양 배지 조성물은, 본원에 따른 효과를 달성하는 한, 미세조류의 배양에 사용되는 다양한 배지와 함께 사용될 수 있다. The microalgae culture medium composition used for improving the polyunsaturated fatty acid producing ability of the microalgae of the present invention can be used together with various media used for culturing microalgae so long as the effect according to the present invention is attained.

바람직하게는, 본 발명에서 이용되는 배지는 탄소원 및 질소원을 포함하고 해수 및 염화나트륨을 포함하는 배지에서 수행되는 것이 바람직하며, 상기 탄소원으로는 포도당, 과당, 갈락토스, 글루코스, 글리세롤 또는 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고, 상기 질소원으로는 글루타민산나트륨, 펩톤, 트립톤, 효모 추출물, 옥수수 침지액, 질산나트륨, 황산암모늄, 구연산 암모늄 또는 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. Preferably, the medium used in the present invention is carried out in a culture medium containing a carbon source and a nitrogen source and containing seawater and sodium chloride, and the carbon source may be glucose, fructose, galactose, glucose, glycerol or a mixture thereof And the nitrogen source may be selected from the group consisting of sodium glutamate, peptone, tryptone, yeast extract, corn steep liquor, sodium nitrate, ammonium sulfate, ammonium citrate or a mixture thereof.

바람직하게는, 상기 배지에 포함된 탄소원은 2-20 (중량/부피)%, 보다 바람직하게는 9-15 (중량/부피)%의 농도로 함유된다. 또한, 상기 배지에 포함된 질소원은 0.1-5 (중량/부피)%로 포함되는 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 1-2.5 (중량/부피)%의 농도로 함유될 수 있다.Preferably, the carbon source contained in the culture medium is contained at a concentration of 2-20 (weight / volume)%, more preferably 9-15 (weight / volume)%. In addition, the nitrogen source included in the culture medium is preferably contained at a concentration of 0.1-5 (weight / volume)%, more preferably 1-2.5 (weight / volume)%.

본원의 일 구현예에 이용될 수 있는 배지는 해양성 와편모류의 배양에 사용되는 f/2 배지가 사용된다 (Guillard, R.R.L. 1975. Culture of phytoplankton for feeding marine invertebrates. pp 26-60. In Smith W.L. and Chanley M.H (Eds.) Culture of Marine Invertebrate Animals. Plenum Press, New York, USA 참조). The medium that can be used in one embodiment of the present invention is f / 2 medium used for the culture of marine mollusc populations (Guillard, RRL 1975. Culture of phytoplankton for feeding marine invertebrates. Pp 26-60. In Smith WL and Chanley MH (Eds.) Culture of Marine Invertebrate Animals, Plenum Press, New York, USA).

본원의 상기 배양 배지 조성물이 포함된 배지에서 P. 시화엔스를 배양하였을 때 다중불포화지방산의 생산능이 향상되었으며, 이는 본 이론으로 한정하는 것은 아니나, P. 시화엔스의 EPA 및 DHA 생합성 경로(biosynthetic pathway)에 불포화효소 및 신장효소 유전자 델타-5 및 델타-6 불포화효소(desaturase)와 델타-6 신장효소(elongase)로 인한 것이다. Improved ability of producing polyunsaturated fatty acids when the cultured P. ethoxylated Enschede in the culture media containing the compositions of the present culture medium, which, but are by no means limited to this theory, P. ethoxylated Enschede of EPA and DHA biosynthesis (biosynthetic pathway ) Due to the unsaturated and renal enzyme genes delta-5 and delta-6 desaturase and delta-6 elongase.

본원의 상기 배양 배지 조성물은 P. 시화엔스로부터 다중불포화지방산을 생산하는 방법에 이용될 수 있다.The culture medium composition of the present application can be used in a method for producing polyunsaturated fatty acids from P. shirasense .

이런 측면에서, 다른 양태에서 본원은 본원에 따른 조성물을 이용한 혼합영양성 와편모류 미세조류를 이용한 다중불포화지방산, 특히 고도다중불포화지방산 더욱 특히 오메가-3 생산 방법 또는 상기 미세조류에서 상기 지방산의 생산능을 향상시키는 방법에 관한 것이다. In this aspect, in another aspect, the present invention provides a method for producing a polyunsaturated fatty acid, particularly a highly polyunsaturated fatty acid, more particularly an omega-3 production method using the composition according to the present invention or the production ability of the fatty acid in the microalgae And the like.

이러한 방법은 본원에 개시된 어느 하나의 배양 배지 조성물에 혼합영양성 와편모류 미세조류를 접종하여 배양하는 단계를 포함한다. This method comprises culturing and inoculating a mixed nutritional patchy algae microalgae into any one of the culture medium compositions disclosed herein.

본원에 따른 방법에 사용되는 조성물, 배양 배지, 및 조건은 앞서 기재된 내용 및 본원 실시예에 기재된 방법을 참고할 수 있다. The composition, culture medium, and conditions used in the method according to the present application can refer to the contents described above and the methods described in the present Examples.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해서 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, embodiments are provided to facilitate understanding of the present invention. However, the following examples are provided only for the purpose of easier understanding of the present invention, and the present invention is not limited to the following examples.

실시예Example

실시예Example 1: One: 와편모류Wisteria 혼합영양성 미세조류 Mixed nutrient microalgae P. P. 시화엔스Shihwaens (( shiwhaenseshiwhaense ))

와편모류 P. 시화엔스(shiwhaense)는 2006년 5월 한국의 시화호 연안에서 단일 분리 되었는데 (N.S. Kang et al Description of a new planktonic mixotrophic dinoflagellate Paragymnodinium shiwhaense n. gen., n. sp. from the coastal waters off western Korea: morphology, pigments, and ribosomal,DNA gene sequence, J. Eukaryot.Microbiol. 57 (2) (2010) 121144) 당시의 온도 및 염분 조건은, 각 18.8도 및 30.4였다. P. 시화엔스 세포는 연속되는 단일분리를 통하여 확보하였다. 하기 표 1은 P. shiwhaense 및 EPA 또는 DHA에 대한 상업적 생산이 진행되거나 준비중인 다른 미세조류들의 EPA, DHA, 그리고 EPA+DHA 각각의 양적 정보 (mg/g)를 나타낸 것이며, 하기 표 2는 P. shiwhaense 및 다른 각 미세조류들의 전체지방산 대비 ALA, EPA, DHA, EPA+DHA, 오메가-3 지방산, 오메가-6 지방산의 조성 정보(%)를 나타낸 것이다. 하기 표에 기재된 Reference 정보는 본원 명세서의 마지막에 표시되어 있다. Wapyeon hair flow P. Shihwa Enschede (shiwhaense) in May 2006, was separated from the single Sihwaho coast of Korea (NS Kang et al Description of a new planktonic mixotrophic dinoflagellate Paragymnodinium shiwhaense n. Gen., N. Sp. From the coastal waters off The temperature and salinity conditions at that time were 18.8 ° and 30.4 °, respectively, for western Korea: morphology, pigments, and ribosomal, DNA gene sequence, J. Eukaryot.Microbiol. 57 (2) (2010) 121144. The P. sieboldes cells were obtained through continuous single separation. Table 1 below will showing the EPA, DHA, and EPA + respective quantitative information (mg / g) of DHA and EPA, or the P. shiwhaense the other microalgae progress or preparing commercial production of the DHA, the following Table 2 is P . shows the composition data (%) of total fatty acids, compared to ALA, EPA, DHA, EPA + DHA, the omega-3 fatty acids, omega-6 fatty acids from each other and shiwhaense microalgae. The reference information shown in the following table is shown at the end of this specification.

[표 1][Table 1]

[표 2][Table 2]

실시예Example 2: 2: 먹이종Feeding species 선별 Selection

먹이종으로서 와편모류 앰피디니움 카르테레(Amphidinium carterae (strain: ACUSA))는 미국의 스크립스 해양연구소에서 획득한 종주이다. 침편모류 헤테로시그 마 아카시우(Heterosigma akashiwo (HAKS9905))는 1999년 5월, 한국의 군산 연안에서 단일 분리된 종주이다(Y.D. Yoo, et al., Feeding by the newly described mixotrophic dinoflagellate Paragymnodinium shiwhaense: feeding mechanism, prey species, and effect of prey concentration, J. Eukaryot. Microbiol. 57 (2) (2010) 145158). 은편모류 텔레아우락스 종(Teleaulax sp. (TSGS0202))은 2002년 2월, 한국 제주도 곰소지역에서 단일 분리된 종주이다(Y.D. Yoo et al., Ibid.).As a prey species wapyeon hair flow amplifier PD nium Terephthalic acid (Amphidinium carterae (strain: ACUSA) ) is a racist obtained from the Scripps Institution of Oceanography in the US. Acupuncture flagella flow hetero Sigma Akashi right (Heterosigma akashiwo (HAKS9905)) is a single-detached racism in May 1999, Gunsan coast of Korea (YD Yoo, et al, Feeding by the newly described mixotrophic dinoflagellate Paragymnodinium shiwhaense:. Feeding mechanism, prey species, and effect of prey concentration, J. Eukaryot. Microbiol. 57 (2) (2010) 145158). Gypsy mothers Tele Aurox The species Teleaulax sp. (TSGS0202) is a single isolated species in Gomso area, Jeju island, Korea, in February 2002 (YD Yoo et al., Ibid .).

배양조건: 하루 14시간(빛제공): 10시간(빛없음) 주기의 약 20 μEm^-2s^-1, 광, 온도: 20도, 배지: f/2 medium 조건에서 배양하였다. 실험에 사용된 먹이종주는 지수성장 상태 혹은 이른 stationary 상태의 컬쳐를 사용하였다.Culturing conditions: 14 hours / day (light provided): 10 hours (no light) cycle of about 20 μEm ^-2 s ^-1 , light, temperature: 20 degrees, medium: f / 2 medium. The feeding trains used in the experiment were cultured in exponential growth state or early stationary state.

P. 시화엔스에게, A. 카르테레를 먹이로 하여 매 2-3일마다 농도에 맞는 적정량을 제공하였다. P. 시화엔스 세포의 농도가 올라가면, 컬쳐를 32, 270, 그리고 500mL 볼륨의 폴리카르보네이트(PC) 병(bottle)에 옮겨주며 배양을 진행하였다. 각 병은 20도 조건 및 먹이종 배양과 같은 조건에서 배양을 진행하였다. P. Shihwa to Enschede, A. terephthalic acid in the fed and provided the right amount for the concentration of each one 2-3 pieces. When the concentration of P. shhhwans cells was increased, the cultures were transferred to polycarbonate (PC) bottles of 32, 270, and 500 mL volumes. Each bottle was incubated under conditions of 20 ° C and feeding culture.

본 실험에서, 먹이별 P. 시화엔스에 제공되는 세포 농도는 다음과 같았다 (A. 카르테레: P. 시화엔스= 8:1, H. 아카시우: P. 시화엔스= 9:1, 텔레아우락스 종: P. 시화엔스= 14:1). 다음과 같은 비율은 먹이종의 성장률 및 탄소량을 고려하여 결정되었다(Y.D. Yoo et al., Ibid.). 이 비율을 통하여 P. 시화엔스의 적절한 성장률(0.03-0.04 /hour)을 유지되고, 2-3일 뒤의 모든 먹이가 제거되도록 하였다. In this experiment, cell density is provided in P. ethoxylated Enschede specific feed was as follows (A. terephthalic acid: P. ethoxylated Enschede = 8: 1, Akashi H. Wu: P. ethoxylated Enschede = 9: 1, tele brother Lax species : P. sihwaens = 14: 1). The following ratios were determined considering the growth rate and carbon content of the food species (YD Yoo et al., Ibid .). Through this ratio it was adjusted to maintain an appropriate growth rate (0.03-0.04 / hour) of P. ethoxylated Enschede is, all food is removed after the three days.

하기 표 3에 포식자 P. 시화엔스 및 각 먹이종 A. 카르테레, H. 아카시우 및 텔레아우락스 종의 배양 조건에 대한 정보를 나타내었다. 하기 표에 기재된 Reference 정보는 본원 명세서의 마지막에 표시되어 있다. To predators in Table 3 P. ethoxylated Enschede And information on the culture conditions of each feeding species A. carteres , H. acaciu, and teleraxes . The reference information shown in the following table is shown at the end of this specification.

[표 3][Table 3]

실시예Example 3. 3. 먹이종Feeding species 섭식에On feeding 따라 미세조류 내 Within the microalgae 지방산 양Fatty acid content 증가 확인 (지방산 Increased confirmation (fatty acid 소small 립 관찰) Lip observation)

본 실험은 P. 시화엔스가 3 종류의 각 먹이를 섭식하였을 때, 세포질 내 지방산 소립을 시각적으로 확인하고자 진행되었다. P. 시화엔스가 포함된 PC bottle에서 약 1-2 ml의 액체를 취해, 유리 글라스 위에 놓았다. 그리고 세포가 포함된 액체에 약 10㎕의 녹색의 형광을 띄는 지방산 염색 시약인 BODIPY ^505/515를 혼합시켰다. 이 때, 이 BODIPY 용액은 2㎍ 당, 20㎖의 무수 디메틸 설폭사이드(DMSO)에 혼합하여 미리 제작되었다. 유리 슬라이드 글라스 위에 세포액체를 올려놓고 커버글라스로 덮은 상태로, 10분간 암상태에서 염색을 진행하였다. 이 후, 형광현미경 (Zeiss Axiovert 200 M; Carl Zeiss Ltd, Germany)을 사용하여 관찰을 진행하였으며, P. 시화엔스 세포 내의 지방산 소립(알갱이)들의 사진을 AxioVision Imaging v.8.0.을 이용하여 이미지 촬영하였다.This experiment was carried out to visually confirm the lipid peroxidation of cytoplasm when P. schwannes fed each of three different foods. About 1-2 ml of liquid was taken from a PC bottle containing P. syringes and placed on a glass glass. To the liquid containing the cells, about 10 μl of a green fluorescing fatty acid staining reagent, BODIPY ^505/515, was mixed. At this time, this BODIPY solution was prepared in advance by mixing 20 ml of anhydrous dimethyl sulfoxide (DMSO) per 2 μg. The cell liquid was placed on a glass slide glass, covered with a cover glass, and stained in a dark state for 10 minutes. After that, observation was carried out using a fluorescence microscope (Zeiss Axiovert 200 M; Carl Zeiss Ltd, Germany), and photographs of fatty acid granules (pellets) in P. schwann cells were photographed using AxioVision Imaging v.8.0 Respectively.

BODIPY ^505/515시약을 먹이종 A. 카르테레, H. 아카시우, 텔레아우락스 종. 그리고 P. 시화엔스의 컬쳐에 투입하였을 때, 광학현미경 하에서 각각의 지방산 알갱이(소립)가 밝은 노란색으로, 그리고 형광현미경 하에서 녹색의 형광색으로 세포질 내에서 관찰되었다. 특히, A. 카르테레의 세포질 내에서 지방산 소립은 규칙없이 랜덤하게 세포질내에 분포하였다. H. 아카시우의 세포질 내의 지방산 소립은 세포의 중앙 부분에 모여 있었다. 그러나, 텔레아우락스 종의 경우에는 오로지 1-2개의 지방산 소립이 세포질 내에서 관찰되었다. 전체적으로, 3개의 먹이종의 세포질 내 지방산 소립 입자의 크기에는 큰 차이가 없었다.Feeding ^505/515 BODIPY reagent species A. terephthalic acid, Akashi H. Wu, tele brother Lax Bell. When added to the culture medium of P. schwanezens , each fatty acid granule (granule) was observed in the cytoplasm in a bright yellow color under a light microscope and a green fluorescent color under a fluorescence microscope. In particular, A. pellets were fatty acids in the cytoplasm of terephthalic acid are randomly distributed in the cytoplasm without rules. The fatty acid granules in the cytoplasm of H. akashiu were concentrated in the central part of the cell. However, in the case of tele Augustus Locks species they are small - only one or two fatty acids were observed in the cytoplasm. Overall, there was no significant difference in the size of the lipid particle in the cytoplasm of the three prey species.

각각의 먹이종을 섭식 후에 하루의 굶긴 상태에 도달한 P. 시화엔스의 경우, 세포질 내에서 분포의 규칙 없이 많은 양의 지방산 소립들이 관찰되었다. 그러나 세포의 중앙 부분은 핵이 위치하고 있어 지방산 염색 형광이 관찰되지 않았다. 먹이종 A. 카르테레, H. 아카시우, 그리고 텔레아우락스 종을 각각 섭식한 P. 시화엔스의 세포 내 지방산 소립의 입자 지름은 각각, 0.5-3.0, 0.5-2.5, 그리고 0.5-2.0 ㎛로 확인되었다. A. 카르테레를 섭식한 후 굶은지 0, 1, 5, 20일이 지난 시점의 P. 시화엔스 세포질을 관찰하였을 때, 모든 시기에서 큰 차이없이 많은 양의 지방산 소립을 확인할 수 있었다.In the case of a P. Shihwa Enschede reached the fasting state of a day for each kind of food after eating, pellets are a large amount of fatty acids without the rules of distribution were observed in the cytoplasm. However, the nucleus was located in the central part of the cell, and no fatty acid - stained fluorescence was observed. Feeding species A. Carteret , H. Akashiu , and Tele Aurox Cell pellets of particle size of the fatty acid, respectively feeding a P. Enschede ethoxylated species has been confirmed by, respectively, 0.5 to 3.0, 0.5 to 2.5, and 0.5-2.0 ㎛. A large amount of fatty acid granules could be identified at all times when P. thalidaceae cytoplasm was observed at 0, 1, 5, 20 days after starvation of A. carteres.

실시예Example 4. 4. 먹이종Feeding species 섭식에On feeding 따라 미세조류 내 총 Therefore, 지방산 양Fatty acid content 증가 확인 (지방산추출) Increase confirmation (fatty acid extraction)

본 실험은 P. 시화엔스가 다른 종류의 먹이를 섭식하였을 때의, 지방산 조성 및 양을 확인하기 위해 진행되었다. 먹이종 A. 카르테레, H. 아카시우 그리고 텔레 아우락스 종 각각을 제공한 후에 굶은지 하루가 지난 진한 농도의 P. 시화엔스 컬쳐를 원심분리 방법을 사용(1952 x g 회전속도, 5분)하여 수확하였다. 세포를 수확하기 전에 컬쳐 내에 먹이종이 남아있을 경우를 가정하여 현미경 관찰을 통해 그렇지 않음을 확인하였다. 이 후, 수확한 펠렛 형태의 세포는 건조된 바이오매스를 획득하기 위하여 -110도에서 하루동안 동결건조 진행하였다. 이 후, 동결건조된 샘플로부터 획득한 전체 Fatty Acid Methyl Esters (FAME)는 가수분해, 추출 및 메티레이션 절차를 진행하였다.This experiment was carried out to determine the composition and amount of fatty acids when P. schwannezes fed different kinds of food. Prey species A. terephthalic acid, by H. Wu and Akashi telephone brother flux species using a centrifugal separation if the day is the last P. ethoxylated Enschede culture dark concentration gumeun method after each service (1952 xg speed, 5 min.) And harvested. Before harvesting the cells, it was confirmed by microscopic observation that there was still food in the culture. Afterwards, harvested pellet-shaped cells were lyophilized for one day at -110 degrees to obtain dried biomass. Subsequently, the entire Fatty Acid Methyl Esters (FAME) obtained from the lyophilized sample underwent hydrolysis, extraction and metering procedures.

가스 크로마토그래피를 사용하여 FAME를 분석하였다. 추출된 FAME 약 1㎕를, 가스 크로마토그래피 기계 내의 모세관 컬럼에 수소불꽃이온화검출기(flame ionization detector)와 함께, 20:1 비율의 split ratio로 분사하였다. 온도 프로그램은 다음과 같다; 시작 온도=50도, 1분; 130도 까지 분당 15도 속도로 증가; 170도까지 분당 8도 속도로 증가; 215도까지 분당 2도 속도로 증가; 이후 10분 유지. 인젝터와 검출기 온도는 각 250도, 280도 이다. 다양한 FAME 피크의 동정은 Supelco 37-component FAME mix의 reference standard의 retention time과 비교하여 이루어졌다. 모든 지방산 양은 두 번의 샘플 측정 및 평균을 통해 진행되었다.FAME was analyzed using gas chromatography. About 1 [mu] l of the extracted FAME was injected into a capillary column in a gas chromatography machine with a hydrogen flame ionization detector at a split ratio of 20: 1. The temperature program is as follows; Starting temperature = 50 degrees, 1 minute; Increased by 15 degrees per minute up to 130 degrees; Increased by 8 degrees per minute to 170 degrees; Increased by 2 degrees per minute up to 215 degrees; Then stay for 10 minutes. The injector and detector temperatures are 250 degrees and 280 degrees, respectively. Identification of the various FAME peaks was done in comparison with the retention time of the reference standard of the Supelco 37-component FAME mix. All fatty acid quantities were conducted through two sample measurements and averages.

하기 표 4는 먹이종 와편모류 앰피디니움 카르테레(Amphidinium carterae ), 침편모류 헤테로시그마 아카시우(Heterosigma akashiwo ), 그리고 은편모류 텔레아 우락스 종(Teleaulax sp.)의 전체 지방산 대비 각 지방산의 비율(%) 및 양(mg/g)을 나타낸 것이다. 각 실험은 2회 반복하여 평균 ± 표준편차로 나타내었다.Table 4 prey species wapyeon hair flow amplifier PD nium Carboxylic terephthalate (Amphidinium carterae), needle flagella flow hetero Sigma Akashi right (Heterosigma akashiwo), and shows the hair flow eunpyeon telephone Oh right ratio (%) and the total amount of fatty acids compared to each of the longitudinal flux (Teleaulax sp.) (mg / g). Each experiment was repeated twice and expressed as mean ± standard deviation.

[표 4][Table 4]

먹이종 A. 카르테레의 전체 지방산(Total fatty acid, TFA)은 56.6mg/g으로, 이는 세포 건중량의 약 5.7%를 차지한다. A. 카르테레가 함유하고 있는 가장 많은 조성의 지방산은 순서대로, EPA (18.6mg/g, 32.9%), DHA (18.1mg/g, 32.0%), 그리고 palmitic acid (12.3mg/g, 21.8%)였다.Species A. feeding overall fatty acid of the carboxylic terephthalate (Total fatty acid, TFA) is to 56.6mg / g, which accounted for about 5.7% of the cell dry weight. A. As fatty acids are the order of the highest composition containing a terephthalic acid, EPA (18.6mg / g, 32.9 %), DHA (18.1mg / g, 32.0%), and palmitic acid (12.3mg / g, 21.8 % ).

먹이종 H. 아카시우의 전체 지방산(Total fatty acid, TFA)은 86.1mg/g으로, 이는 세포 건중량의 약 8.6%를 차지한다. H. 아카시우가 함유하고 있는 가장 많은 조성의 지방산은 순서대로, palmitic acid (25.0mg/g, 27.2%), EPA (25.0mg/g, 27.1%), 그리고 palmitoleic acid (15.6mg/g, 16.9%)였다.The total fatty acid (TFA) of H. acacia is 86.1 mg / g, which is about 8.6% of the cell dry weight. The highest fatty acids contained in H. acacia were palmitic acid (25.0 mg / g, 27.2%), EPA (25.0 mg / g, 27.1%) and palmitoleic acid %).

먹이종 텔레아우락스 종의 전체 지방산(Total fatty acid, TFA)은 41.2mg/g으로, 이는 세포 건중량의 약 4.1%를 차지한다. 텔레아우락스 종이 함유하고 있는 가장 많은 조성의 지방산은 순서대로, ALA (13.0mg/g, 31.5%), EPA (10.3mg/g, 25.0%), 그리고 palmitic acid (7.8mg/g, 19.0%)였다.Feeding Bell Teleax The total fatty acid (TFA) of the species is 41.2 mg / g, which accounts for about 4.1% of the cell dry weight. Tele Aurox The highest amounts of fatty acids in the diet were ALA (13.0mg / g, 31.5%), EPA (10.3mg / g, 25.0%) and palmitic acid (7.8mg / g, 19.0%).

하기 표 5는 P. 시화엔스가 각 먹이종을 섭식하였을 때의, 전체지방산 대비 각 지방산의 비율(%) 및 양(mg/g)을 나타낸 것이다. 각 실험은 2회 반복하여 평균 ± 표준편차로 나타내었다.Table 5 shows the ratio (%) and the amount (mg / g) of each fatty acid relative to the total fatty acids when P. shhhwhaens fed on each food species. Each experiment was repeated twice and expressed as mean ± standard deviation.

[표 5][Table 5]

A. 카르테레를 섭식한 후 하루 굶은 상태에서의 P. 시화엔스의 전체 지방산 양은 96.0mg/g으로, 이는 세포 건중량의 9.6%를 차지한다. 이 때의 P. 시화엔스가 함유하고 있는 가장 많은 조성의 지방산은 순서대로 DHA (34.3mg/g, 35.7%), palmitic acid (30.5mg/g, 31.8%), 그리고 EPA (18.1mg/g, 18.8%)였다. A. After feeding the carboxylic terephthalate day as the total amount of fatty acid 96.0mg / g of P. ethoxylated Enschede in gumeun state, which accounted for 9.6% of the cell dry weight. At this time, the fatty acids of P. The number of the composition containing the ethoxylated Enschede is DHA (34.3mg / g, 35.7% ) in the order, palmitic acid (30.5mg / g, 31.8%), and EPA (18.1mg / g, 18.8%).

H. 아카시우를 섭식한 후 하루 굶은 상태에서의 P. 시화엔스의 전체 지방산 양은 45.3mg/g으로, 이는 세포 건중량의 4.5%를 차지한다. 이 때의 P. 시화엔스가 함유하고 있는 가장 많은 조성의 지방산은 순서대로 DHA (19.4mg/g, 42.9%), palmitic acid (14.9mg/g, 33.0%), 그리고 EPA (3.1mg/g, 6.9%)였다.After feeding the H. Wu Akashi day as the total amount of fatty acid 45.3mg / g of P. ethoxylated Enschede in gumeun state, which accounted for 4.5% of the cell dry weight. Fatty acid composition of most, which contains the P. ethoxylated Enschede at this time is DHA (19.4mg / g, 42.9% ) in the order, palmitic acid (14.9mg / g, 33.0%), and EPA (3.1mg / g, 6.9%).

텔레아우락스 종을 섭식한 후 하루 굶은 상태에서의 P. 시화엔스의 전체 지방산 양은 53.4mg/g으로, 이는 세포 건중량의 5.3%를 차지한다. 이 때의 P. 시화엔 스가 함유하고 있는 가장 많은 조성의 지방산은 순서대로 palmitic acid (21.2mg/g, 39.7%), DHA (16.3mg/g, 30.5%), 그리고 ALA (5.3mg/g, 9.8%)였다. Tele Aurox After eating the entire fatty acid species of P. ethoxylated Enschede at day gumeun state amount to 53.4mg / g, which accounted for 5.3% of the cell dry weight. The P. ethoxylated fatty yen in most compositions, which are contained in the scan time it is in order palmitic acid (21.2mg / g, 39.7 %), DHA (16.3mg / g, 30.5%), and ALA (5.3mg / g , 9.8%).

오메가-3 생합성 경로에서 EPA는 ALA로부터 합성될 수 있으며, 오메가-6 생합성 경로에서 EPA는 LA로부터 합성될 수 있다. A. 카르테레의 ALA 및 LA 지방산 함량은 각 (0.04mg/g, 0.1%), (0.4mg/g, 0.7%)로 낮았다. 비슷하게, A. 카르테레를 섭식한 P. 시화엔스의 ALA 및 LA 지방산 함량 또한 (0.4mg/g, 0.5%), (1.7mg/g, 1.7%)로 낮았다.EPA can be synthesized from ALA in the omega-3 biosynthetic pathway, and EPA can be synthesized from LA in the omega-6 biosynthetic pathway. A. ALA and LA fatty acid content of the terephthalic acid was low in each (0.04mg / g, 0.1%) , (0.4mg / g, 0.7%). Similarly, A. ALA and LA fatty acid content of the ethoxylated feeding carboxamide terephthalate P. Enschede also (0.4mg / g, 0.5%) was as low as, (1.7mg / g, 1.7% ).

H. 아카시우의 ALA 및 LA 지방산 함량은 각 (4.5mg/g, 4.9%), (0.7mg/g, 0.8%)로 낮았다. 그러나, ALA로부터 EPA가 합성되는 또다른 오메가-3 생합성 대체 경로의 중간 물질에 해당하는 eicosatrienoic acid (ETrA)의 경우는 발견되지 않았다. H. 아카시우를 섭식한 P. 시화엔스의 ALA 및 LA 지방산 함량 또한 (1.1mg/g, 2.5%), (0.3mg/g, 0.7%)로 낮았다. The contents of ALA and LA fatty acids in H. acacia were low (4.5 mg / g, 4.9%), (0.7 mg / g, 0.8%). However, no case of eicosatrienoic acid (ETrA), an intermediate of another omega-3 biosynthetic alternative pathway in which EPA was synthesized from ALA, was found. The content of ALA and LA fatty acids in P. acutissima fed on H. acacia was also low (1.1 mg / g, 2.5%), (0.3 mg / g, 0.7%).

텔레아우락스 종의 ALA 및 LA 지방산 함량은 각 (13.0mg/g, 31.5%), (0.8mg/g, 2.0%)로 낮았다. 그러나, ALA로부터 EPA가 합성되는 또다른 오메가-3 생합성 대체경로의 중간 물질에 해당하는 eicosatrienoic acid (ETrA)의 경우는 발견되지 않았다. Teleaulax sp.를 섭식한 P. 시화엔스의 ALA 및 LA 지방산 함량 또한 (5.3mg/g, 9.8%), (1.6mg/g, 3.1%)로 낮았다. Tele Aurox The ALA and LA fatty acid contents of the species were low (13.0 mg / g, 31.5%), (0.8 mg / g, 2.0%). However, no case of eicosatrienoic acid (ETrA), an intermediate of another omega-3 biosynthetic alternative pathway in which EPA was synthesized from ALA, was found. Teleaulax sp. ALA and LA fatty acid content of P. ethoxylated Enschede feeding an addition (5.3mg / g, 9.8%) was as low as, (1.6mg / g, 3.1% ).

즉, 본 연구에서 P. 시화엔스의 절대적 EPA 및 DHA 함량이 특히 A. 카르테레를 섭식한 경우 A. 카르테레의 절대적 EPA 및 DHA 함량에 비해 43%나 증가하였음을 확인하였다. 더욱이, 텔레아우락스 종을 섭식함으로써, 텔레아우락스 종의 절대적 EPA 및 DHA 함량에 비해서도 P. 시화엔스 그것은 약 16% 정도 증가하였음을 확인하였다. 그러나, H. 아카시우를 섭식하였을 때는, H. 아카시우의 그것에 비교하였을 때 P. 시화엔스의 경우 20% 정도 감소함였음을 확인하였다. 이러한 증거들은 P. 시화엔스의 EPA 및 DHA 함량은 섭식하는 먹이의 종류에 영향을 받을 수 있음을 의미한다. 또한, P. 시화엔스를 통한 EPA 및 DHA 생산을 위해서, 텔레아우락스 종 및/또는 A. 카르테레 , 특히 A. 카르테레가 최적의 먹이로 사용될 수 있음을 의미한다. P. 시화엔스가 A. 카르테레를 섭식하였을 때의 최대 성장률은 텔레아우락스 종과 H. 아카시우를 섭식하였을 때보다 확연히 높다. 이것은 먹이종 A. 카르테레가 P. 시화엔스의 EPA 및 DHA 생성을 위한 물질 및 성장에 관여하는 최적의 물질들을 공급해줌을 말한다. A. 카르테레를 섭식하였을 때의 P. 시화엔스의 EPA 및 DHA 양은, DHA 생산 상업적 이용이 진행되고 있는 와편모류 Crypthecodinium cohnii의 EPA 및 DHA 양 (31-78 mg/g), 그리고 다른 종속영양성 와편모류인 oxyrrhis marina (47-89 mg/g)의 EPA 및 DHA 양과도 비견할 만 하다. 그러나 와편모류 Gyrodinium dominans (19-27 mg/g)에 비해서는 월등히 많은 편이다. 더욱이, P. 시화엔스의 EPA 및 DHA 양을 와편모류 외에 다른 미세조류와 비교하면, DHA 상업화가 완료된 종속영양성 thraustochytrids인 Traustochytrium spp. (27.4-79.7 mg/g)와 비견할 만 했으며, Schizochytrium spp. (45.0-201.5 mg/g)보다는 낮은 편이었다. In other words, the absolute amount of DHA and EPA in particular P. ethoxylated Enschede in this study A. If the feeding carboxamide A. terephthalate was confirmed that it has increased by 43% compared to the absolute EPA and DHA content of the terephthalic acid. Moreover, the tele brother Lux By feeding the species, tele brother Lax Compared with the absolute EPA and DHA contents of P. horseradishes, it was confirmed that it increased by about 16%. However, it was confirmed that when the feeding hayeoteul Akashi H. Wu, hayeoteul when compared to that of H. P. Wu Akashi ethoxylated Enschede reduction of 20% in box yeoteum. These evidences suggest that the EPA and DHA contents of P. schwannensee may be affected by the type of food they feed on. In addition, for EPA and DHA production through P. ethoxylated Enschede, tele brother Lax Species and / or A. carteres , especially A. carteres It can be used as an optimal food. P. ethoxylated maximum growth rate at the time the Enschede A. hayeoteul feeding carboxamide terephthalate is tele brother Lux It is considerably higher than when I fed Jong and H. Akashiu . This refers to the haejum supplying optimal material feeding the kind A. terephthalate acid involved in the matter and growth for EPA and DHA production of P. Shihwa Enschede. A. The amount of EPA and DHA in P. ethoxylated Enschede at the time when the feeding terephthalic acid, DHA production commercial use is in progress wapyeon hair flow Crypthecodinium cohnii EPA and DHA in an amount of (31-78 mg / g), and the other dependent nutritional wapyeon It is also comparable to the amount of EPA and DHA in the parent oxyrrhis marina (47-89 mg / g). However, it is much higher than that of Gyrodinium dominans (19-27 mg / g). Furthermore, if the amount of EPA and DHA P. Shihwa Enschede compared with other algae in addition wapyeon hair flow, Traustochytrium a dependent nutrient DHA thraustochytrids the commercialization completed spp. (27.4-79.7 mg / g), and Schizochytrium spp. (45.0-201.5 mg / g).

상술한 표 1에서와 같이 높은 함량의 DHA를 가진 종주의 top-4는 모두 종속영양성 종주이다. P. 시화엔스가 5번째로, 이 종주 또한 혼합영양성이긴 하나 성장에 먹이가 필수적으로 필요함으로써 종속영양성에 가까운 종주라고 말할 수 있겠다.As shown in Table 1 above, all of the top-4 strains with a high content of DHA are heterotrophic strains. P. sihwaens is fifth, and this breed is also mixed nutrition, but it can be said that it is close to dependent nutrition because it is necessary to feed for growth.

또한, P. 시화엔스의 EPA 및 DHA 함유량은, EPA 상업적 생산에 사용되고 있는 종주 Nannochloropsis spp. (2.6-62.5 mg/g) 및 Phaeodactylum spp. (10.2-62.3 mg/g)과도 비견할 만 했다. P. 시화엔스의 전체 지방산(TFA) 함량 대비 EPA 및 DHA 지방산 조성의 비율(55%)은 dinoflagellate(와편모류)의 A. carterae, C. cohnii, 그리고 thraustochytrids의 Aurantiochytrium spp.를 제외하면 가장 높았다. 그러므로, P . 시화엔스는 EPA 및 DHA 생산 상업화를 위한 잠재적 강한 후보군이라고 평가할 수 있겠다.In addition, EPA and DHA content of P. ethoxylated Enschede, the longitudinal used in commercial production of EPA Nannochloropsis spp. (2.6-62.5 mg / g) and Phaeodactylum spp. (10.2-62.3 mg / g). Total fatty acids (TFA) rate (55%) compared to the content of EPA and DHA fatty acid composition of P. Shihwa Enschede was the highest Except spp Aurantiochytrium. Of A. carterae, C. cohnii, and thraustochytrids of dinoflagellate (wapyeon hair flow). Therefore, P. Shihwaens is a potent candidate for commercialization of EPA and DHA production.

종합하면, A. carterae를 섭식한 P. 시화엔스의 경우, 전체 지방산 조성 (TFA)중 EPA의 함량이 18.8%로 가장 높았으며, H. akashiwo를 섭식한 P. shiwhaense의 경우, 6.9%, 그리고 Teleaulax sp.를 섭식한 P. 시화엔스의 경우는 2.9%로 낮았다. 그러나 A. carterae, H. akashiwo, 그리고 Teleaulax sp. 3종의 먹이 자체는 모두 25.0-32.9%로 높은 함량의 EPA를 소유하였다. 즉, 먹이종의 EPA 함량은 P. 시화엔스에 섭식되면서 줄어든 경향을 보였는데, 구체적으로 Teleaulax sp.는 25.0%에서 2.9%로, H. akashiwo는 27.1%에서 6.9%로, A. carterae는 32.9%에서 18.8%로 줄어들었다. 대조적으로, DHA의 함량은 먹이종에서부터 P. 시화엔스를 비교하였을 때 모두 증가하였다. 구체적으로, H. akashiwo 먹이종의 DHA 비율은 3.4%에서 이를 섭식한 P. 시화엔스는 42.9%로, Teleaulax sp. 먹이종의 DHA 비율은 12.4%에서 이를 섭식한 P. 시화엔스는 30.5%로, A. carterae 먹이종의 DHA 비율은 32.0%에서 이를 섭식한 P. 시화엔스는 35.7%로 증가하였다. 이러한 자료는 먹이종의 EPA가 P. 시화엔스 체내로 흡수되어 DHA로 전환되었음을 보여준다. 그러나, DHA로 전환 정도는 먹이종마다 다를 수 있음을 보여준다. In summary, A. In the case of one feeding the carterae P. Shihwa Enschede, was the content of EPA of total fatty acid composition (TFA) was highest with 18.8%, in the case of P. shiwhaense eating the H. akashiwo, 6.9%, and Teleaulax sp. in the case of feeding a P. ethoxylated Enschede is as low as 2.9%. However, A. carterae , H. akashiwo , and Teleaulax sp. All three prey possessed high content of EPA (25.0-32.9%). In other words, EPA content of the feed beam species was a tendency to decrease as eating P. ethoxylated Enschede, specifically Teleaulax sp. From 25.0% to 2.9%, H. akashiwo from 27.1% to 6.9%, is 32.9 A. carterae % To 18.8%. In contrast, the content of DHA increased in all species compared to P. shhhwaens . Specifically, the DHA ratio of H. akashiwo prey was 3.4%, and P. sihwa ence was 42.9%, and Teleaulax sp. The DHA ratio of the prey species was 12.4%, and that of P. shhwaensensis was 30.5%. The proportion of DHA of A. carterae was 32.0% and that of P. shhwaens was 35.7%. These data show that the EPA of the feeding species was absorbed into P. sissans and converted to DHA. However, the degree of conversion to DHA may vary from species to species.

실시예Example 5. 미세조류 내에 오메가-3 지방산 합성에 관련된 유전자 동정 5. Identification of genes involved in omega-3 fatty acid synthesis in microalgae

P. 시화엔스의 발현 시퀀스는 454 GS-FLX titanium pyrosequencing 플랫폼을 사용하여 진행되었다. 시퀀싱에 대한 자세한 내용 및 관련된 데이터는 NCBI 데이터베이스에, BioProject accession number: PRJNA357511, 등록되었다. 다른 미세조류의 유사한 유전자로부터 P. 시화엔스의 지방산 불포화효소 및 신장효소 아미노산 시퀀스를 동정하기 위해, P. 시화엔스의 전사체 데이터를 tBLASTn 방법으로 매칭시켰다. 이 때, CLC genomic workbench (version 9.0) 프로그램을 사용하여 과정이 진행되었다. BLAST 방법으로 획득한 P. 시화엔스의 관련 유전자는 CLC genomic workbench 프로그램의 BLOSUM-62 substitution matrix 및 default조건 하에, NCBI 데이터베이스에 BLASTx 하여 재확인 하였다.Expressed sequence of P. ethoxylated Enschede was carried out using the 454 GS-FLX titanium pyrosequencing platform. More details on sequencing and related data were registered in the NCBI database, BioProject accession number: PRJNA357511. For from similar genes from other microalgae to identify the fatty acid unsaturation enzyme and kidney enzyme amino acid sequence of the P. ethoxylated Enschede, was matched to the data transfer member P. ethoxylated Enschede the tBLASTn method. At this time, the process was performed using the CLC genomic workbench (version 9.0) program. The BLSST-related genes of P. schizophylls were confirmed by BLASTx in the NCBI database under the BLOSUM-62 substitution matrix and default conditions of the CLC genomic workbench program.

하기 표 6은 P. 시화엔스로부터 발굴된 EPA 및 DHA 생합성에 관여하는 오메가-3 지방산 불포화효소(desaturase) 및 신장효소(elongase) 유전자 정보를 나타낸 것이다.Table 6 shows the omega-3 fatty acids, unsaturated enzyme (desaturase) enzymes and elongation (elongase) genetic information involved in biosynthesis of EPA and DHA from the excavation P. ethoxylated Enschede.

[표 6][Table 6]

NCBI non-redundant (nr) 데이터베이스에서 시퀀스 유사성을 기반하여, P. 시화엔스로부터 6개의 지방산 불포화효소 및 5개의 지방산 신장효소 유전자를 발굴하였다. 6개의 불포화효소 유전자 중에, 3개의 contig들은 다른 생물의 알려져있는 불포화효소 유전자와 시퀀스 유사성이 거의 동일 하였다. 나머지 3개의 불포화효소 유전자들도 델타-5 및 델타-6 불포화효소 유전자와 매우 유사한 시퀀스를 가지고 있었다. 다섯개의 신장효소 유전자 중에, 2개의 contig들은 알려져있는 다른 신장효소 유전자와 거의 동일 하였다. 하지만, P. 시화엔스로부터 오메가-3 생합성 대체 경로에 관여하는 불포화효소 및 신장효소 유전자들은 발굴되지 않았다.Based on the sequence similarity in the NCBI non-redundant (nr) database, six fatty acid desaturases and five fatty acid renal enzymes genes were isolated from P. schwannes . Of the six unsaturated enzyme genes, the three contigs were nearly identical in sequence similarity to the known unsaturated enzyme genes of other organisms. The remaining three unsaturated enzyme genes also had sequences very similar to the delta-5 and delta-6 desaturase genes. Of the five renal enzyme genes, the two contigs were almost identical to other known renal enzyme genes. However, unsaturated enzymes and renal enzymes involved in the omega-3 biosynthetic pathway have not been identified from P. schwannes .

실시예Example 6. 유전자의 계통수 분석을 통해, 미세조류 내에 오메가-3 지방산 합성에 관련하여 델타-5 및 델타-6-불포화효소 및 델타-6 신장효소 관여 규명 6. Identification of delta-5 and delta-6-unsaturated enzymes and delta-6 renal enzymes involved in the synthesis of omega-3 fatty acids in microalgae through gene phylogenetic analysis

P. 시화엔스의 불포화효소 및 신장효소 유전자의 존재를 조금 더 확실히 확인하기 위해서, NCBI에서 제공된 ORF finder를 사용하여 open reading frames (ORFs)을 예측하였으며, MEGA (version 7.0) 프로그램을 사용하여 유사종과의 아미노산 시퀀스 재배열(alignment)을 진행하였다. 재배열이 완료된 유전자는 WAG+G 트리 모델 하에, maximum-likelihood (ML) 및 Bayesian analysis 분석을 통해 계통수 작성을 진행하였다. ML 분석을 위해서는 RaxML 7.0.3. 프로그램을 사용하였으며, Bayesian 분석을 위해서는 MrBayes (version 3.1) 프로그램을 사용하였다.To check a little more sure of unsaturated enzymes and the presence of kidney gene of P. Shihwa Enschede, using the ORF finder from NCBI provided was predicted open reading frames (ORFs), similar species using MEGA (version 7.0) program And amino acid sequence rearrangement (alignment) with amino acid sequence. Genes that have been rearranged have been subjected to maximum-likelihood (ML) and bayesian analysis analysis under the WAG + G tree model. For ML analysis, RaxML 7.0.3. Program, and MrBayes (version 3.1) program for Bayesian analysis.

시퀀스 유사성에 기반하여 발굴해 낸 P. 시화엔스의 불포화효소 및 신장효소 유전자의 더 높은 수준의 확인을 위해, 계통수 분석을 진행하였다. 불포화효소 유전자들을 기반하여 작성한 계통수에서, P. 시화엔스의 delta-4 불포화효소 유전자의 경우 다른 원생생물들의 delta-4 불포화효소와 묶였으며, P. 시화엔스의 delta-5 불포화효소 유전자의 경우에도 다른 그것들의 delta-5 불포화효소와 묶이는 것을 확인함으로, P. 시화엔스의 유전자들의 정확성을 재차 확인하였다.A phylogenetic analysis was conducted to identify higher levels of the enzymes and renal enzymes of P. schwannensee, which were discovered based on sequence similarity. In the phylogenetic tree created on the basis of unsaturated gene, the P. ethoxylated Enschede delta-4 For the unsaturated gene was enclosed and delta-4 unsaturated enzyme other protists, P. ethoxylated Enschede of delta-5 gene in the case of an unsaturated Confirming that they are bound to other delta-5 unsaturation enzymes, reaffirming the correctness of the genes of P. schwannes .

신장효소 유전자 기반 계통수에서, P. 시화엔스로부터 발굴된 2개의 delta-5 신장효소 유전자의 경우, 8종의 원생생물들의 delta-5 신장효소 유전자와 그룹을 이루었다. 이 2개의 delta-5 신장효소 유전자의 경우 서로 함께 묶였는데, 이는 아마 서로가 각각 isoform의 같은 유전자일 수도 있음을 암시한다. 그러나, 계통수 작성에서 P. 시화엔스로부터 발굴된 유전자들 중에, 오메가-3 생합성 대체경로의 중간물질에 속하는 delta-9 신장효소와 그룹을 이루는 유전자는 존재하지 않았다. In the renal enzyme gene-based phylogenetic tree, two delta-5 renal enzyme genes isolated from P. schwaneens were grouped with the delta-5 renal enzyme genes of eight protozoa. These two delta-5 renal enzyme genes were tied together, suggesting that perhaps they are each the same gene in isoform. However, among the genes extracted from P. schwannes in the phylogenetic tree, there was no gene grouping with the delta-9 renal enzyme belonging to the intermediate of the omega-3 biosynthetic pathway.

본원의 표에 기재된 Reference 정보는 다음과 같다. The reference information shown in the table of this application is as follows.

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이상에서 본원의 예시적인 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본원의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본원의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본원의 권리범위에 속하는 것이다.While the present invention has been described in connection with what is presently considered to be the preferred embodiments, it is to be understood that the invention is not limited to the disclosed embodiments, but, on the contrary, .

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다. All technical terms used in the present invention are used in the sense that they are generally understood by those of ordinary skill in the relevant field of the present invention unless otherwise defined. The contents of all publications referred to herein are incorporated herein by reference.

Claims

The present invention relates to a method for improving the production of highly nutritious fatty acids, including at least one food species of Amphidinium carterae, Heterosigma akashiwo or Teleaulax sp. (Paragymnodinium shiwhaense) culture medium composition which is a microorganism of the epididymis .

The method according to claim 1,
The highly polyunsaturated fatty acids omega-3 unsaturated fatty acid, para luggage nodi nium ethoxylated Enschede culture medium composition.

3. The method of claim 2,
The omega-3 unsaturated fatty acids may be selected from the group consisting of docosahexaenoic acid (DHA), eicosapentaenoic acid (EPA), docosapentaenoic acid (DPA) and alpha-linolenic acid Wherein the composition is at least one polyunsaturated fatty acid selected from the group consisting of:

The method of claim 3,
The omega-3 unsaturated fatty acid is DHA or EPA in the para luggage nodi nium ethoxylated Enschede culture medium composition.

The method according to claim 1,
Wherein said food species is selected from the group consisting of ampicillin carcere, heterosigma acacia, or teleaurox species. versus The parasiticidinium siphosphate culture medium composition according to claim 1, wherein the concentration ratio of the parazimonodinium siphosphate to the population is 5 to 20: 1.

6. The method of claim 5,
The above-mentioned Ampidinium carthere versus para-gymnodinium sulphate The concentration ratio by population was 8: 1,
The concentration ratio of the above-mentioned heterosigma-acacia to para-gymnodinium siphosphate is 9: 1,
The telerax species. The parasiticidium siphosphate culture medium composition according to claim 1, wherein the concentration ratio of the parasitic nematicidium sihwasense is 14: 1.

8. A method for producing polyunsaturated fatty acids using microalgae comprising culturing parazimonodinium siphase as microalgae using the culture medium composition according to any one of claims 1 to 6.

A method for enhancing polyunsaturated fatty acid producing ability using microalgae comprising culturing parasimidonidium sesquiterene as microalgae using the culture medium composition according to any one of claims 1 to 6.

9. The method of claim 8,
The production capacity enhancement improves the polyunsaturated fatty acid-producing ability using phosphorus, algae is due to delta-5 and delta-unsaturated -6 enzyme (desaturase) and Delta -6 kidney enzymes (elongase) of the para Jim nodi nium Shihwa Enschede How to do it.

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